SYNTHESE VAN
METHIONUNE BEVATTENDE PEPTIDEN
VIA DE SULFOXIDEN:
SUBSTANCE P EN MOTILINE
E. Izeboud
SYNTHESE VAN METHIONINE BEVATTENDE PEPTIDEN
VIA DE SULFOXIDEN: SUBSTANCE P EN MOTTLINE
-O O o o u i a B I B L I O T H E E K T U Delft P 1616 5555 C 461964
SYNTHESE VAN
METHIONINE BEVATTENDE PEPTIDEN
VIA DE SULFOXIDEN:
SUBSTANCE P EN MOTILINE
PROEFSCHRIFT ter verkrijging van
de graad van doctor in de
technische wetenschappen
aan de Technische Hogeschool Delft,
op gezag van de rector magnificus
prof. dr. ir. F.J. Kievits,
voor een commissie aangewezen
door het college van dekanen
te verdedigen op
woensdag 28 mei 1980
te 16.00 uur door
EVERT IZEBOUD
scheikundig ingenieur
geboren te Vlissingen
üUELtNïIR.iül ^ ' \ •:•>, > 'Dit proefschrift is goedgekeurd door de promotor
PROF. DR. H.C. BEYERMAN
Aan mijn ouders
Voor Linda
Ik ben h e t D e l f t s H o g e s c h o o l Fonds z e e r e r k e n t e l i j k v o o r een f e l l o w s h i p i n 1975.
I k bedank mevr. M.A.A. van de K o o i j - v a n Leeuwen v o o r h a a r b i j d r a g e aan h e t typewerk.
Inhoud
NOMENCLATUUR EN AFKORTINGEN
INLEIDING EN DOELSTELLING 1 1. ALGEMENE INLEIDING 3
1.1 S y n t h e s e v a n p e p t i d e n met b e h u l p v a n gemengde a n h y d r i d e n 3 1.2 De r e p e t i t i e v e overmaat gemengd a n h y d r i d e methode; h e t REMA-concept 6
1.3 S y n t h e s e v a n m e t h i o n i n e b e v a t t e n d e p e p t i d e n 9 L i t e r a t u u r 11 2. SUBSTANCE P 15 2.1 N a t u u r l i j k s u b s t a n c e P 15 2.2 S y n t h e s e n van s u b s t a n c e P 17 L i t e r a t u u r 19 3. DE REMA-SYNTHESE VAN SUBSTANCE P VIA DE SULFOXIDEN 23
3.1 I n l e i d i n g 23 3.2 S y n t h e s e v a n beschermd s u b s t a n c e P - ( R , S ) - s u l f o x i d e 25 3.3 V e r w i j d e r i n g v a n de beschermende groepen en z u i v e r i n g 28 3.4 K a r a k t e r i s e r i n g van REMA-substance P 29 3.5 D i s c u s s i e en c o n c l u s i e s 31 3.6 E x p e r i m e n t e e l g e d e e l t e 32 L i t e r a t u u r 41 4. MOTILINE 43 4.1 N a t u u r l i j k m o t i l i n e 43 4.2 S y n t h e s e n v a n m o t i l i n e en a n a l o g a 46 L i t e r a t u u r 50 5. SYNTHESE VAN MOTILINE (VIA DE SULFOXIDEN) 53
5.1 I n l e i d i n g 53 5.2 S y n t h e s e v a n beschermd [ 1 - 8 ] - m o t i l i n e 56
V I I I
5.2.2 S y n t h e s e van beschermd [ 1 - 8 ] - m o t i l i n e d o o r k o p p e l i n g van
[ l - 3 ] - 0 H met H-L4-8] 57 5.3 S y n t h e s e van beschermd [ 9 - 2 2 ] - m o t i l i n e v i a de s u l f o x i d e n ;
[ 9 - 2 2 ( 0 ) ] - m o t i l i n e 58 5.4 S y n t h e s e van beschermd [ 9 - 2 2 ] - m o t i l i n e 60
5.4.1 S y n t h e s e van beschermd [ 9 - 1 3 ] - m o t i l i n e 60 5.4.2 K o p p e l i n g van de segmenten [9-13]-OH en H-[14-22] 61
5.5 S y n t h e s e van beschermd m o t i l i n e 62 5.5.1 K o p p e l i n g v o l g e n s de overmaat gemengd a n h y d r i d e methode;
beschermd m o t i l i n e - ( R , S ) - s u l f o x i d e 62 5.5.2 K o p p e l i n g v o l g e n s de DCCI/HOBt-methode; beschermd m o t i l i n e 63 5.6 V e r w i j d e r i n g van de beschermende g r o e p e n en z u i v e r i n g 64 5.7 K a r a k t e r i s e r i n g van m o t i l i n e 66 5.7.1 Chemische- en f y s i s c h e k a r a k t e r i s e r i n g 66 5.7.2 S e q u e n t i e a n a l y s e 69 5.7.3 B i o l o g i s c h e a c t i v i t e i t van m o t i l i n e en van m o t i l i n e - { R , S ) - s u l f o x i d e 69 5.8 D i s c u s s i e en c o n c l u s i e s 71
5.8.1 S y n t h e s e van de beschermde segmenten van m o t i l i n e 71 5.8.2 De k o p p e l i n g van de beschermde segmenten [ l - 8 ] - O H en H-[9-22] 73
5.8.3 A f s p l i t s i n g van de beschermende g r o e p e n en z u i v e r i n g 73 5.8.4 De e i n d p r o d u k t e n 75 5.8.5 Hoge d r u k v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e (HPLC) 76 5.8.6 S e q u e n t i e b e p a l i n g van p e p t i d e n met b e h u l p v a n g a s c h r o m a t o -g r a f i e - m a s s a s p e c t r o m e t r i e - c o m p u t e r (GC-MS-C) a n a l y s e 76 5.9 E x p e r i m e n t e e l g e d e e l t e 77 L i t e r a t u u r 92 6. REDUCTIE VAN PEPTIDESULFOXIDEN 95
6.1 I n l e i d i n g 95 6.2 R e d u c t i e van p e p t i d e s u l f o x i d e n met b e h u l p van t h i o l e n 97
6.3 R e d u c t i e van p e p t i d e s u l f o x i d e n met j o d i d e i n z u u r m i l i e u 98 6.4 D i s c u s s i e en c o n c l u s i e s 101 6.5 E x p e r i m e n t e e l g e d e e l t e 102 L i t e r a t u u r 104 SAMENVATTING 107 SUMMARY 111
Nomenclatuur en afkortingen
I n d i t p r o e f s c h r i f t w o r d t de g r o o t t e van een p e p t i d e aangegeven z o a l s v o o r g e -s t e l d door Bodan-szky ( 1 ) . De G r i e k -s e v o o r v o e g -s e l -s worden h i e r b i j v e r v a n g e n door numerieke: 1 1 - p e p t i d e , 2 2 - p e p t i d e e t c . V o o r t s z i j n de termen 'fragment' en 1f r a g m e n t k o p p e l i n g ' v e r v a n g e n door 'segment' e n ' s e g m e n t k o p p e l i n g1 ( 2 ) .
Wanneer k o r t h e i d s h a l v e g e s p r o k e n w o r d t o v e r een p e p t i d e s u l f o x i d e dan h e e f t d i t b e t r e k k i n g op een p e p t i d e d a t een m e t h i o n i n e - ( R , S ) - s u l f o x i d e r e s i d u b e v a t . De g e b r u i k t e aminozuren, b e h a l v e g l y c i n e , hebben de L - c o n f i g u r a t i e . I n de ge-b r u i k t e a f k o r t i n g e n worden z o v e e l m o g e l i j k de a a n ge-b e v e l i n g e n van de IUPAC-IUB Commissie v o o r B i o c h e m i s c h e N o m e n c l a t u u r g e v o l g d ( 3 ) . A l a : a l a n i n e A r g : a r g i n i n e Asn : a s p a r a g i n e Asp : a s p a r a g i n e z u u r Aoc : t e r t - a m y l o x y c a r b o n y l Boe : t e r t - b u t y l o x y c a r b o n y l iBuOCOCl : i s o b u t y l o x y c a r b o n y l c h l o r i d e B z l : b e n z y l 2-C1-Z : 2 - c h l o o r b e n z y l o x y c a r b o n y l Cys : c y s t e i n e DCCI : N,N'-dicyclohexylcarbodiimide DCHA : d i c y c l o h e x y l a m i n e DLC : d u n n e l a a g c h r o m a t o g r a f i e DMF : N,W-dimethylformamide
EMA : e x c e s s mixed a n h y d r i d e , overmaat gemengd a n h y d r i d e G l y : g l y c i n e
G i n : g l u t a m l n e G l u : g l u t a m i n e z u u r H i s : h i s t i d i n e
X HPLC : h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d chromatography, hoge druk v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e i s o l e u c i n e l e u c i n e l y s i n e m e t h i o n i n e m e t h i o n i n e - ( R , S ) - s u l f o x i d e n o r l e u c i n e W - m e t h y l m o r f o l i n e 4 - n i t r o f e n y l p e n t a c h l o o r f e n y l f e n y l a l a n i n e p r o l i n e p y r i d i n e r e p e t i t i v e e x c e s s mixed a n h y d r i d e , r e p e t i t i e v e overmaat gemengd a n h y d r i d e Ser : s e r i n e TFA : t r i f l u o r a z i j n z u u r THF : t e t r a h y d r o f u r a n Thr : t h r e o n i n e Tos : 4 - t o l u e e n s u l f o n y l , t o s y l T r p : t r y p t o f a a n T y r : t y r o s i n e V a l : v a l i n e Z : b e n z y l o x y c a r b o n y l Leu L y s Met Met (0) N l e NMM Np Pep Phe P r o P y r REMA LITERATUUR
1. M. Bodanszky, i n 'Peptides, Proceedings of the 5^ American Peptide
Symposium', M. Goodman en J . M e i e n h o f e r ( e d s . ) , J o h n W i l e y and Sons,
New Y o r k (1977) 1.
2. G.R. P e t t i t , 'Synthetic Peptides, Vol. 4', E l s e v i e r , Amsterdam (1976) 22. 3. IUPAC Commission, J . Biol. Chem. 247, 979 (1972); ibid., 250, 3215 (1975).
Inleiding en doelstelling
De g e d e e l t e l i j k i n D e l f t o n t w i k k e l d e r e p e t i t i e v e overmaat gemengd a n h y d r i d e methode v o o r h e t s y n t h e t i s e r e n van p e p t i d e n i s i n h e t v e r l e d e n op ons L a b o r a t o r i u m * met v e e l s u c c e s t o e g e p a s t . De s y n t h e s e van h e t 27 aminozuren b e v a t t e n -de g a s t r o i n t e s t i n a l e hormoon s e c r e t i n e , g e h e e l v o l g e n s -de ' r e p e t i t i v e e x c e s s mixed a n h y d r i d e ' (KEMA) methode door Van Zon ( p r o e f s c h r i f t , D e l f t , 1974), b e -tekende een d o o r b r a a k i n de sequentiële o f s t a p s g e w i j z e p e p t i d e s y n t h e s e .
Ten e i n d e meer bekend t e r a k e n met de m o g e l i j k h e d e n e n b e p e r k i n g e n van de REMA-methode i s h e t n o d i g om p e p t i d e n t e s y n t h e t i s e r e n met aminozuren w e l k e n i e t i n s e c r e t i n e en andere met b e h u l p van de bovengenoemde methode g e s y n t h e -t i s e e r d e p e p -t i d e n voorkomen. Een aminozuur d a -t aan d i -t c r i -t e r i u m v o l d o e -t i s h e t m e t h i o n i n e , d a t i n v e l e b i o l o g i s c h b e l a n g r i j k e p e p t i d e n voorkomt. D i t zwa-v e l b e zwa-v a t t e n d e aminozuur l e g t e c h t e r b e p e r k i n g e n op met b e t r e k k i n g t o t de t e v o l g e n s y n t h e s e . B i j de s y n t h e s e van m e t h i o n i n e b e v a t t e n d e p e p t i d e n kunnen n e -v e n r e a c t i e s o p t r e d e n , onder andere t e n g e -v o l g e -van h e t n u c l e o f i e l e k a r a k t e r van de t h i o e t h e r f u n c t i e . T i j d e n s de a c i d o l y s e van beschermende groepen kunnen a l k y l e r i n g e n s p l i t s i n g o p t r e d e n , t e r w i j l gedurende de g e h e l e s y n t h e s e r e k e -n i -n g gehoude-n d i e -n t t e worde-n met o x i d a t i e t o t d i a s t e r e o i s o m e r e s u l f o x i d e -n .
Om a l k y l e r i n g t e voorkomen werd b i j de i n d i t p r o e f s c h r i f t b e s c h r e v e n s y n t h e sen van de nood een deugd gemaakt door h e t m e t h i o n i n e a l s de s u l f o x i d e n t e b e -schermen. De b e s c h e r m i n g a l s s u l f o x i d e n h e e f t a l s c o n s e q u e n t i e d a t e r aan h e t e i n d van de s y n t h e s e een r e d u c t i e moet p l a a t s v i n d e n . H e t i s van b e l a n g d a t e e n d e r g e l i j k e r e d u c t i e q u a n t i t a t i e f v e r l o o p t , omdat de a a n w e z i g h e i d van m e t h i o n i n e s u l f o x i d e n i n b i o l o g i s c h werkzame p r e p a r a t e n a a n l e i d i n g kan geven t o t v e r a n -d e r i n g o f v e r l i e s van -de a c t i v i t e i t . Om-dat -de i n -de l i t e r a t u u r v o o r t h i o l e n b e s c h r e v e n r e d u c t i e m e t h o d e n n i e t v o l d e d e n werd de t o e p a s b a a r h e i d van de r e d u c
2
t i e van m e t h i o n i n e - ( R , S ) - s u l f o x i d e b e v a t t e n d e p e p t i d e n met b e h u l p v a n j o d i d e i n z u u r m i l i e u o n d e r z o c h t . Om aan de voornoemde, d o e l s t e l l i n g t e v o l d o e n worden i n d i t p r o e f s c h r i f t s y n t h e s e n b e s c h r e v e n van s u b s t a n c e P en m o t i l i n e .
Substance P, een 1 1 p e p t i d e met C t e r m i n a a l m e t h i o n i n e ( f i g u u r 1) i s een b i o -l o g i s c h b e -l a n g r i j k p e p t i d e , behorend t o t de k -l a s s e van de t a c h y k i n i n e n . Het onderzoek naar de f y s i o l o g i s c h e f u n c t i e v a n s u b s t a n c e P i s nog i n v o l l e gang en s p i t s t z i c h t o e op een m o g e l i j k e f u n c t i e a l s n e u r o t r a n s m i t t e r . S i n d s k o r t b e s t a a n e r a a n w i j z i n g e n d a t s u b s t a n c e P ook i n t e r a c t i e met o p i a a t r e c e p t o r e n v e r t o o n t .
H - A r g - P r o - L y s - P r o - G l n - G l n - P h e - P h e - G l y - L e u - M e r - N H2
1 1 1
Figuur 1 De aminozuursequentie van substance P
M o t i l i n e , een 2 2 - p e p t i d e met m e t h i o n i n e i n de k e t e n ( f i g u u r 2 ) , b e h o o r t t o t een s e r i e v a n p e p t i d e n welke v o o r n a m e l i j k i n h e t maag-darmkanaal voorkomen
( g a s t r o i n t e s t i n a l e p e p t i d e n ) . Ook van d i t p e p t i d e i s de f y s i o l o g i s c h e f u n c t i e s l e c h t s t e n d e l e o p g e h e l d e r d . Men v e r o n d e r s t e l t d a t h e t een r e g e l e n d e f u n c t i e b i j de m o t o r i s c h e a c t i v i t e i t ( m o t i l i t e i t ) v a n h e t s p i j s v e r t e r i n g s k a n a a l h e e f t . HPheVq I P r o l l e P h e T h r T y r G i y G l u L e u G i n -1 -1-1 - A r g - M e f - G I n - G l u - L y s - G l u - A r g - A s n - L y s - G l y - G l n - O H 12 22
Figuur 2 De aminozuursequentie van motiline
Voor de w i n n i n g van z o w e l s u b s t a n c e P a l s m o t i l i n e z i j n de n a t u u r l i j k e bronnen g e h e e l o n t o e r e i k e n d , z o d a t s y n t h e s e de e n i g e m a n i e r i s v o o r h e t v e r k r i j g e n v a n een v o l d o e n d e h o e v e e l h e i d z u i v e r m a t e r i a a l v o o r f y s i o l o g i s c h , f a r m a c o l o g i s c h -en f y s i s c h onderzoek -en v o o r k l i n i s c h e t o e p a s s i n g .
B i j een e e r d e r op ons L a b o r a t o r i u m u i t g e v o e r d e v a s t e - f a s e s y n t h e s e v a n s u b s t a n c e P door Syriër ( p r o e f s c h r i f t , D e l f t , 1975) b l e e k de b e s c h e r m i n g van m e t h i o n i n e a l s de s u l f o x i d e n m o e i l i j k h e d e n t e geven. Het l e e k dus z i n v o l de s y n t h e s e van d i t p e p t i d e , mede vanwege de i n h e t v e r l e d e n hiermee a l h i e r op-gedane g u n s t i g e e r v a r i n g e n , ook met b e h u l p v a n de REMA-methode u i t t e v o e r e n .
1. Algemene inleiding
#
1.1 SYNTHESE VAN PEPTIDEN MET BEHULP VAN GEMENGDE ANHYDRIDEN
De op ons L a b o r a t o r i u m t o e g e p a s t e methode v o o r h e t s y n t h e t i s e r e n v a n p e p t i d e n v i a gemengde a n h y d r i d e n v a n h e t t y p e z o a l s i n f i g u u r 1.1 i s weergegeven b e r u s t op e e n i n 1951 door Wieland en Bernhard ( 1 ) , Boissonnas (2) en Vaughan (3) o n -a f h -a n k e l i j k v -a n e l k -a -a r o n t w i k k e l d e p r o c e d u r e , w -a -a r b i j v o o r de v o r m i n g v -a n gemengde a n h y d r i d e n a l k y l c h l o o r c a r b o n a t e n g e b r u i k t worden. I s o b u t y l c h l o o r c a r b o n a a t , v o o r g e s t e l d door Vaughan ( 3 ) , wordt h e t meest b i j de s y n t h e s e v a n p e p t i -den g e b r u i k t . De v o r m i n g v a n een gemengd a n h y d r i d e , i n a a n w e z i g h e i d v a n een t e r t i a i r e b a s e , wordt de activering genoemd ( f i g u u r 1.1).
R2 g
R1- N H - i H - C - 0 " I H N ( A l k y [ )3l *
iBu-O-C-Cl 5
Figuur 1.1 Vorming van een gemengd anhydride van een beschermd aminozuur en
isobutylcarbonaat
V o o r a l i n h e t b e g i n h a d men t e kampen met h e t p r o b l e e m v a n r a c e m i s a t i e t e n ge-v o l g e ge-v a n de z e e r s t e r k e a c t i ge-v e r i n g ge-v a n de c a r b o x y l g r o e p ge-v a n h e t beschermde aminozuur. A l s g e v o l g h i e r v a n was h e t g e b r u i k v a n de a c t i v e r i n g a l s gemengd a n h y d r i d e u i t s l u i t e n d voorbehouden a a n a m i n o z u r e n waarvan de aminogroep b e -schermd was met een r a c e m i s a t i e o n d e r d r u k k e n d e groep v a n h e t u r e t h a a n - t y p e .
* Voor e e n u i t g e b r e i d o v e r z i c h t v a n de chemie v a n gemengde a n h y d r i d e n en hun t o e p a s s i n g b i j de s y n t h e s e v a n p e p t i d e n w i l i k v e r w i j z e n naar Albertson ( 4 ) ,
Schröder' en Lübke (5) , Tarbell (6) , Wünsch en Stelzel (7) , F i n n e n Hofmann
(8) en Meienhof er (9)
R1- N H - C H - C .
-4
Systematisch onderzoek door Anderson en medewerkers leidde i n 1967 t o t het op-s t e l l e n van r i c h t l i j n e n voor het uitvoeren van gemengd anhydride koppelingen, waarbij speciaal g e l e t werd op het r a c e m i s a t i e - v r i j e verloop b i j koppelingen van W-acylaminozuren en JV-acylpeptiden ( 1 0 ) . Ook Wieland en medewerkers ont-wikkelden voor gemengd anhydride koppelingen een reeks condities waarbij de c h i r a l i t e i t van het a-koolstofatoom van het geactiveerde aminozuur gewaar-borgd b l e e f ( 1 1 , 1 2 ) . B i j het volgen van de r i c h t l i j n e n zoals vermeld i n t a b e l
1.1 b l i j k t de gemengd anhydride methode voor het synthetiseren van peptiden
goed te voldoen.
Tabel 1.1 Optimale reactiecondities (minimale racemisatie} volgens Anderson
et al. (10) I hulpzuur isobutylcarbonaat t e r t i a i r e base ff-methylmorfoline reactietemperatuur -15° a c t i v e r i n g s t i j d 30-120 s oplosmiddel DMF, THF
De meest k r i t i s c h e f a c t o r b i j de gemengd anhydride procedure i s de keuze van de t e r t i a i r e base. D i t komt doordat de base twee v e r s c h i l l e n d e processen beïn-vloedt, namelijk de vorming van het gemengd anhydride en de racemisatie. Experimenten van Anderson en medewerkers leidden t o t de bevinding dat het t e r t i -a i r e -amine n i e t -a l l e e n fungeert -a l s zoutzuur-acceptor m-a-ar d-at het ook re-ageert met het alkylchloorcarbonaat t o t een alkyloxycarbonylammoniumion complex, dat op z i j n beurt reageert met de carboxylcomponent. Zowel sterische factoren a l s b a s i c i t e i t van het t e r t i a i r e amine bleken h i e r b i j een r o l te spelen. De bevin-dingen van Anderson werden door Kemp en medewerkers bevestigd ( 1 3 ) .
Een nevenreactie welke b i j de a c t i v e r i n g ook kan optreden i s de disproport i o n e r i n g van hedisproport gemengd anhydride disproport o disproport een symmedisproportrisch anhydride en een d i a l -kylpyrocarbonaat. Door toepassing van een korte a c t i v e r i n g s t i j d en een lage reactietemperatuur kan de d i s p r o p o r t i o n e r i n g voldoende onderdrukt worden ( 1 4 ) . Het enige aminozuur dat b i j de a c t i v e r i n g problemen geeft i s het asparagine met onbeschermde amidefunctie. H i e r b i j kan een intramoleculaire nevenreactie (dehydratering) optreden welke t o t de vorming van g-cyanoalanine l e i d t ( 1 5 ) . Deze r e a c t i e treedt n i e t op wanneer de amidefunctie van asparagine beschermd wordt met b i j v o o r b e e l d de 4,4'-dimethoxybenzhydryl (Mbh) groep ( 1 6 , 1 7 ) . B i j de i n d i t p r o e f s c h r i f t beschreven synthese van m o t i l i n e (Asn op p l a a t s 19) wordt deze nevenreactie vermeden door asparagine a l s p - n i t r o f e n y l e s t e r te a c t i v e r e n .
Na a c t i v e r i n g van de c a r b o x y l c o m p o n e n t w o r d t d o o r t o e v o e g i n g van de aminocom-ponent de koppeling - v o r m i n g van de p e p t i d e b i n d i n g - b e w e r k s t e l l i g d ( f i g u u r 1.2), R7- N H - C H - C ?2 S ?3 8 . R ' - N H - C H - C - N H - C H - C - R4 2H N - C H - C - RI> 0 i B u - O - C - N H - C H - C - R1 -II 0 R3 0 R1- N H - C H - C - 0 H I, II R2 0
Figuur 1.2 Vorming van de peptidebinding (aminolyse)
Figuur 1.2 toont eveneens een mogelijke nevenreactie, welke z i c h b i j de synthe-se van peptiden met behulp van gemengde anhydriden kan voordoen. Deze nevenre-a c t i e - nevenre-anomnevenre-ale koppeling - i s de n u c l e o f i e l e nevenre-anevenre-anvnevenre-al vnevenre-an de nevenre-aminocomponent op het carbonylkoolstof van het hulpzuur (gestippelde p i j l e n ) , hetgeen l e i d t t o t de vorming van een urethaan. In de p r a k t i j k b l i j k t echter dat de anomale kop-p e l i n g slechts i n geringe mate okop-ptreedt. De grote mate van r e g i o s e l e c t i v i t e i t waarmee de aminolyse gepaard gaat i s ondermeer te verklaren doordat het carbo-nylkoolstof atoom van het hulpzuur, ten gevolge van de r u i m t e l i j k e eigenschap-pen van de isobutylgroep, m o e i l i j k e r toegankelijk voor n u c l e o f i e l e aanval i s . Voorts z i j n ook sterische factoren met betrekking t o t de aminocomponent van invloed op de urethaanvorming. In het bijzonder wanneer aan p r o l i n e of aan pro-l y pro-l p e p t i d e n gekoppepro-ld werd bpro-leek er i n a a n z i e n pro-l i j k e mate anomapro-le koppepro-ling op te treden. In paragraaf 1.2 wordt hierop nader ingegaan.
De gemengd anhydride procedure wordt het meest gebruikt b i j het koppelen van OL Ct
N -benzyloxycarbonyl- of N -tert-butyloxycarbonylaminozuren. De gemengd
anhy-dride methode voor het koppelen van peptidesegmenten i s door Zahn en medewer-kers voor het eerst toegepast b i j de synthese van i n s u l i n e (18). Om racemisa-t i e racemisa-te voorkomen werden carboxylcomponenracemisa-ten meracemisa-t C-racemisa-terminaal glycine of p r o l i n e gekozen. B i j deze segmentkoppelingen werd triëthylamine gebruikt a l s t e r t i a i r e base. B i j segmenten met C-terminaal glycine kan echter beter ff-methylmorfoline gebruikt worden omdat Dzieduszycka en medewerkers hebben aangetoond dat de vor-ming van een oxazolon h i e r aanleiding kan geven t o t racemisatie van het voor-l a a t s t e aminozuur ( 1 9 ) .
Hoewel Anderson z i j n r a c e m i s a t i e v r i j e r e a c t i e c o n d i t i e s voor het koppelen van N-acylpeptiden aanbevolen heeft, wordt er i n de p r a k t i j k v r i j w e l geen ge-bruik van gemaakt. Een uitzondering geldt h i e r voor Wieland en medewerkers, die
6
b i j de synthesen van het c y c l i s c h e 1O-peptide antanamide gebruik maakten van gemengde anhydriden b i j het koppelen van segmenten (20,21,22). Ook Ivanov en medewerkers voerden b i j hun synthese van het a-bungarotoxine een segmentkoppe-l i n g met behusegmentkoppe-lp van een gemengd anhydride u i t ( 2 3 ) . De koppesegmentkoppe-ling v e r segmentkoppe-l i e p zon-der noemenswaardige racemisatie en met een rendement van 84%.
U i t het voorgaande i s het d u i d e l i j k dat de gemengd anhydride methode voor segmentkoppelingen w e l l i c h t ten onrechte te weinig gebruikt wordt.
1.2 DE REPETITIEVE OVERMAAT GEMENGD ANHYDRIDE METHODE; HET REMA-CONCEPT
B i j het uitvoeren van een sequentiële synthese van peptiden moeten de koppe-l i n g s r e a c t i e s binnen een r e d e koppe-l i j k e t i j d v o koppe-l koppe-l e d i g verkoppe-lopen. Om de v e r e i s t e quan t i t a t i e v e omzetting te bewerkstelligen kan gebruik worden gemaakt van een over maat acylerend agens ( 2 4 ) . D i t houdt i n dat er i n het algemeen een maximale be scherming van de functionele groepen i n de z i j k e t e n s van de aminozuren toege-past dient t e worden ( 8 , 5 0 ) . Weygand en medewerkers maakten i n 1967 a l s eer-sten van d i t p r i n c i p e gebruik b i j koppelingen met symmetrische anhydriden van tert-butyloxycarbonylaminozuren ( 2 6 , 2 7 ) . Z i j verkregen met de overmaat symme-t r i s c h e anhydride mesymme-thode een s n e l l e en quansymme-tisymme-tasymme-tieve a c y l e r i n g . Hun mesymme-thode heeft, ten gevolge van de t o e n t e r t i j d moeilijke toegankelijkheid van symmetri-sche anhydriden, t o t voor kort weinig opgang gemaakt.
In 1970 verkreeg Tilak (28,29) b i j koppelingen door toepassing van een over-maat gemengd anhydride van benzyloxycarbonyl- en tert-butyloxycarbonylaminozu-ren en isobutylcarbonaat eveneens een s n e l l e en quantitatieve omzetting. Op basis hiervan ontwikkelde h i j een procedure welke r e p e t i t i e f toegepast kon worden. E s s e n t i e e l bleek h i e r b i j dat de overmaat gemengd anhydride, na afloop van de koppelingsreactie, met waterig bicarbonaat ontleed kon worden. De op-brengsten per koppelingsstap en de zuiverheid van de tussenprodukten waren zo hoog dat tussentijdse zuiveringen n i e t meer nodig waren. De synthetische cy-c l u s , ontscy-cherming gevolgd door a cy-c y l e r i n g door middel van een gemengd anhydri-de, kon op deze wijze r e p e t i t i e f worden toegepast. De bruikbaarheid van deze methode werd voor het eerst aangetoond met de synthese van een beschermd 9-peptide, het glucagonsegment 7-15 (tabel 1.2).
Tilak (29) noemde a l s beperking van de methode het koppelen van beschermd
h i s t i d i n e (racemisatie) en van beschermd g l y c i n e ( d i a c y l e r i n g ) . U i t een op ons Laboratorium uitgevoerd onderzoek bleek dat, b i j de keuze van een geschikte
Wim-beschermende groep (bijvoorbeeld t o s y l ) , ook h i s t i d i n e zonder
P e p t i d e ( s e g m e n t ) Beschermde s e q u e n t i e L i t e r a t u u r
G l u c a g o n 7-15
M e n s e l i j k g r o e i h o r m o o n 1-10
S e c r e t i n e ( 2 7 - p e p t i d e )
tBu t B u OtBu tBu t B u Boe t B u OtBu
I I I I I I I I Z-Thr-Ser-Asp - T y r - S e r - L y s - T y r - L e u - A s p - O E t B z l I B z l NO„ I I ' B o c - P h e - P r o - T h r - I l e - P r o - L e u - S e r - A r g - L e u - P h e - O M e Z B z l O B z l B z l B z l B z l O B z l I I I I I I I Z H i s S e r A s p G l y T h r P h e T h r S e r G l u -B z l NO„ NO,. O -B z l -B z l NO„
I I 2 H I I I2 L e u S e r A r g L e u A r g A s p S e r A l a A r g -NO» I2 - L e u - G l n - A r g - L e u - L e u - G l n - G l y - L e u - V a l - N H G o n a d o l i b e r i n e ( 1 0 - p e p t i d e ) S u b s t a n c e P ( 1 1 - p e p t i d e ) M e n s e l i j k c a l c i t o n i n e ( 3 2 - p e p t i d e ) M o t i l i n e ( 2 2 - p e p t i d e ) V a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p e p t i d e (VIP) ( 2 8 - p e p t i d e ) Tos B z l B z l NO„ , I I I I2 p - G l u - H i s - T r p - S e r - T y r - G l y - L e u - A r g - P r o - N H , . NO„ Z O I2 I I Z-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH,. d i v e r s e segmenten d i v e r s e segmenten ( z i e h o o f d s t u k 5) d i v e r s e segmenten Tilak (28,29) Beyerman, e.m. (30,31) Van Zon (32)
Van Zon en Beyerman (33,34)
Beyerman, e.m. (35)
Izeboud en Beyerman (36)
Hirt ( 3 7 ) ; Hirt, e.m. (38)
Izeboud en Beyerman (53)
( 5 1 ) . Eveneens op ons Laboratorium en l a t e r ook door Tilak en Hoffmann (52)
werd aangetoond dat zowel het koppelen van glycine a l s het koppelen aan g l y c i ne zonder d i a c y l e r i n g v e r l i e p (32) . De l i m i e t voor het stapsgewijze s y n t h e t i -seren van peptiden volgens de overmaat gemengd anhydride methode zonder dat daarbij t u s s e n t i j d s gezuiverd wordt l i g t b i j de grotere oligopeptiden (~ 30 aminozuren).
Op ons Laboratorium werd de praktische toepassing van d i t concept door Beuerman en medewerkers verder uitgewerkt. In 1971 werd h i e r de naam REMA
(re-p e t i t i v e excess mixed anhydride) voor deze methode geïntroduceerd. Sedertdien z i j n er i n D e l f t verscheidene succesvolle REMAsynthesen van b i o l o g i s c h a c t i e -ve peptiden en segmenten daarvan uitgevoerd. Wanneer van de r i c h t l i j n e n van Anderson en medewerkers gebruik wordt gemaakt (tabel 1.1), b l i j k t de
REMA-me-thode een efficiënte manier voor de synthese van peptiden i n oplossing. D i t wordt ondermeer geïllustreerd met de i n t a b e l 1.2 weergegeven succesvolle toe-passingen van de REMA-methode.
Een eerder i n paragraaf 1.1 genoemde nevenreactie i s de koppeling aan de ongewenste kant van het gemengde anhydride, hetgeen l e i d t t o t de vorming van een urethaan. De urethaanvorming i s ondermeer afhankelijk van s t e r i s c h e f a c -toren met betrekking t o t het te acyleren aminozuur of peptide. B i j koppelingen aan p r o l i n e of aan prolylpeptiden kan deze r e a c t i e z e l f s overheersen (30,31) . B i j de synthese van het segment 110 van het menselijk groeihormoon en b i j a l -l e vo-lgende synthesen van p r o -l i n e bevattende peptiden op ons Laboratorium werd d i t probleem opgelost door dipeptiden met C-terminaal p r o l i n e te koppelen. Bo-danszky en Tolle toonden i n 1977 aan dat er b i j iedere gemengd anhydride
kop-p e l i n g k l e i n e hoeveelheden nevenkop-produkten van het urethaan-tykop-pe gevormd kunnen worden (25) . B i j de op ons Laboratorium uitgevoerde synthese van het 27-pepti-de secretine wer27-pepti-den i n het eindprodukt a a n z i e n l i j k e hoeveelhe27-pepti-den getermineer27-pepti-de sequenties aangetoond ( 3 4 ) . Om te komen t o t een fundamentele oplossing voor d i t probleem suggereren Bodanszky en Tolle het gebruik van symmetrische anhy-driden. Hoge druk vloeistofchromatografie (high-performance l i q u i d chromato-graphy, HPLC) s t e l t ons nu echter i n staat, wanneer de accumulering van ure-thaanpeptiden ontoelaatbaar wordt, een eenvoudig u i t te voeren tussentijdse z u i v e r i n g toe te passen.
Het f e i t dat de synthese van een peptide met behulp van de REMA-methode op ieder gewenst moment afgebroken kan worden om een tussenprodukt te zuiveren en de mogelijkheid op de controle van de omzettingsgraad (fluorescamine) z i j n a l -t i j d beschouwd a l s aan-trekkelijke aspec-ten van de me-thode. Na de i n -t r o d u c -t i e van reverse-phase HPLC voor het vervolgen van de synthese en voor het zuiveren van beschermde en onbeschermde peptiden werd aan deze aspecten een nieuwe d i
-mensie toegevoegd. Deze f l e x i b i l i t e i t en de goede mogelijkheid t o t schaalver-groting z i j n voordelen ten opzichte van de synthese van peptiden aan een vas-te drager. Het f e i t dat de REMA-methode het i n snelheid moet afleggen vas-tegen de vaste-fase methode wordt mijns inziens hierdoor v o l l e d i g gecompenseerd.
1.3 SYNTHESE VAN METHIONINE BEVATTENDE PEPTIDEN
Zoals eerder genoemd kunnen b i j de synthese van methionine bevattende peptiden nevenreacties optreden welke toe te s c h r i j v e n z i j n aan de r e a c t i v i t e i t van de-t h i o e de-t h e r f u n c de-t i e van hede-t mede-thionine. Mede-t name de a f s p l i de-t s i n g van beschermende groepen kan problemen geven. De a f s p l i t s i n g van beschermende groepen - i n het bijzonder van de benzyloxycarbonyl (Z) groep - door middel van k a t a l y t i s c h e hydrogenolyse i s ten gevolge van v e r g i f t i g i n g van de katalysator n i e t zonder meer mogelijk (39,40). Het verdient daarom aanbeveling om, wanneer methionine i n een te synthetiseren peptide voorkomt, gebruik te maken van beschermende groepen welke a c i d o l y t i s c h verwijderd kunnen worden. B i j de acidolyse van de b i j de REMA-methode v e e l toegepaste tert-butyloxycarbonyl(Boe) groep dient echter rekening gehouden te worden met a l k y l e r i n g van de t h i o e t h e r f u n c t i e van het methionine t o t een tert-butylsulfoniumzout (41,42). Ook benzylkationen, gevormd b i j de a f s p l i t s i n g van beschermende groepen op benzylbasis, kunnen me-thionine a l k y l e r e n . Een andere nevenreactie, welke t i j d e n s de gehele synthese kan plaatsvinden, i s de oxidatie van methionine t o t diastereoisomere s u l f o x i -den. De o x i d a t i e wordt geacht p l a a t s te vinden door zuurstof en door i n oplos-middelen aanwezige peroxiden. De mate waarin sulfoxiden gevormd worden i s af-hankelijk van het gebruikte oplosmiddel en van de r u i m t e l i j k e bouw van het peptide.
A l k y l e r i n g van methionine (sulfoniumzoutvorming) kan grotendeels worden voorkomen door een 'scavenger' voor kationen (anisool, ethylmethylsulfide, etc.) aan het reactiemengsel toe te voegen. De sulfoxidevorming kan worden . verhinderd door de synthese van van methionine bevattende peptiden i n een , s t i k s t o f - of argonatmosfeer u i t te voeren en daarbij tevens gebruik te maken van zuurstof- en p e r o x i d e v r i j e oplosmiddelen. In de p r a k t i j k b l i j k t echter dat enige o x i d a t i e van het methionine v r i j w e l n i e t te vermijden i s .
Om van de nood een deugd te maken werd b i j de i n d i t p r o e f s c h r i f t beschreven synthesen het methionine - naar analogie van Iselin (43) - beschermd a l s de sulfoxiden. D i t heeft a l s voordeel dat b i j de afsplitsingsprocedures geen a l -k y l e r i n g meer -kan optreden, t e r w i j l oo-k de zuiverheidscontrole met behulp van chromatografische technieken eenvoudiger wordt. Een nadeel i s de sterk
ver-10
hoogde w a t e r o p l o s b a a r h e i d van m e t h i o n i n e - ( R , S ) - s u l f o x i d e b e v a t t e n d e p e p t i d e n . D i t h e e f t t o t g e v o l g d a t v o o r de i s o l e r i n g van v o o r a l de k l e i n e p e p t i d e n v e e l -a l v-an e x t r -a c t i e g e b r u i k moet worden gem-a-akt. V o o r t s k-an h e t werken met een d i a s t e r e o i s o m e r e n m e n g s e l p r o b l e m e n geven met b e t r e k k i n g t o t z u i v e r i n g e n d o o r m i d d e l van k r i s t a l l i s a t i e .
De b e s c h e r m i n g van m e t h i o n i n e a l s de s u l f o x i d e n h e e f t a l s b e l a n g r i j k e con-s e q u e n t i e d a t de con-s u l f o x i d e f u n c t i e aan h e t e i n d van de con-s y n t h e con-s e g e r e d u c e e r d d i e n t t e worden. Deze r e d u c t i e d i e n t q u a n t i t a t i e f en zonder n e v e n r e a c t i e s t e v e r l o p e n . I n h o o f d s t u k 6 w o r d t h i e r o p nader i n g e g a a n .
De o x i d a t i e van de t h i o e t h e r f u n c t i e van m e t h i o n i n e o f van m e t h i o n i n e b e v a t t e n -de p e p t i d e n kan op v e l e m a n i e r e n p l a a t s v i n d e n . I n -de p e p t i d e c h e m i e w o r d t h e t meest g e b r u i k gemaakt van de o x i d a t i e met w a t e r s t o f p e r o x i d e (43,44). De o x i -d a t i e i s g e v o e l i g v o o r z u r e k a t a l y s e en w o r -d t g e a c h t v o l g e n s h e t i n f i g u u r 1.3 v e r m e l d e r e a c t i e s c h e m a t e v e r l o p e n . R' \ S — 0 » HoO * HZ / L R
Figuur 1.3 De zuurgekatalyseerde oxidatie van een thioetherfunctie (45)
A l s p r o t o n d o n o r (HZ i n f i g u u r 1.3) w o r d t m e e s t a l a z i j n z u u r g e b r u i k t . Een mog e l i j k e n e v e n r e a c t i e b i j de o x i d a t i e van de t h i o e t h e r f u n c t i e i s de v e r d e r mog a a n -de o x i d a t i e t o t h e t s u l f o n . Vanwege -de v e r l a a g d e n u c l e o f i l i c i t e i t van h e t zwa-v e l a t o o m zwa-v e r l o o p t de zwa-v o l g r e a c t i e t o t h e t s u l f o n 100-1000 m a a l langzamer dan de o x i d a t i e t o t h e t s u l f o x i d e ( 4 6 ) . De v o r m i n g van een s u l f o n moet vermeden wor-den omdat b i j de r e d u c t i e e r v a n ook de p e p t i d e k e t e n a a n g e t a s t w o r d t .
Om de o x i d a t i e t o t h e t sulfóxide v o l l e d i g t e l a t e n v e r l o p e n w o r d t e r ge-b r u i k gemaakt van een g e r i n g e overmaat aan w a t e r s t o f p e r o x i d e . De overmaat wordt na h e t a f l o p e n van de r e a c t i e d i r e c t v e r n i e t i g d . U i t o n d e r z o e k d o o r
Sy-riër b l e e k d a t 5% p l a t i n a op k o o l h i e r b i j h e t b e s t v o l d e e d ( 4 9 ) .
Hoewel de s u l f o x i d e f u n c t i e v o l d o e n d e b e s c h e r m i n g b i e d t t e g e n a l k y l e r i n g van h e t zwavelatoom d i e n t ook r e k e n i n g gehouden t e worden met n e v e n r e a c t i e s , w e l -ke b i j h e t t o e p a s s e n van de REMA-methode v o o r h e t s y n t h e t i s e r e n van p e p t i d e n zouden kunnen o p t r e d e n . Onder b e p a a l d e o m s t a n d i g h e d e n kunnen s u l f o x i d e n met a n h y d r i d e n r e a g e r e n . Deze r e a c t i e s t a a t b e k e n d a l s de r e a c t i e van Pummerer
R \ iSi / R HZ s--*-o*J fz / Y~v
V
R 0--H ../( 5 4 ) . B i j i n t e r a c t i e v a n m e t h i o n i n e s u l f o x i d e met a z i j n z u u r a n h y d r i d e b i j v e r -hoogde t e m p e r a t u u r o n s t o n d , na h y d r o l y s e , h o o f d z a k e l i j k h o m o c y s t e i n e ( 4 7 ) . On-d e r m i l On-d e omstanOn-digheOn-den (40°) b l e e k On-deze r e a c t i e s l e c h t s i n z e e r g e r i n g e mate op t e t r e d e n . A a n g e z i e n b i j t o e p a s s i n g v a n de REMA-methode r e a c t i e t e m p e r a t u r e n beneden -10° g e b r u i k t worden i s h e t a a n n e m e l i j k d a t Pummerer-achtige r e a c t i e s n i e t z u l l e n p l a a t s v i n d e n . Ook de bekende r e a c t i e v a n i s o b u t y l c h l o o r c a r b o n a a t met s u l f o x i d e n (48) w o r d t door de b i j de REMAmethode g e b r u i k t e r e a c t i e c o n d i -t i e s g e h e e l o n d e r d r u k -t .
LITERATUUR
1. T. W i e l a n d en H. B e r n h a r d , Ann. 572, 190 (1951) 2. R.A. B o i s s o n n a s , Helv. Chim. Acta 34_, 874 (1951) 3. J.R. Vaughan J r . , J. Am. Chem. Soc. T3_,3547 d 96 2)
4. N.F. A l b e r t s o n , Organic Reactions 12, 157 (1962)
5. E. Schröder en K. Lübke, 'The Peptides, Vols. I & II', Academie P r e s s , New York (1965)
6. D.S. T a r b e l l , Ace. Chem. Res. 2, 296 (1969)
7. E. Wünsch en P. S t e l z e l , i n 'Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie', E. M u l l e r ( e d . ) , Thieme S t u t t g a r t (1974), 15/2, 171
8. F.M. F i n n en K. Hofmann, 'Proteins Vol. 2', Academie P r e s s , New York (1976) 105
9. J . M e i e n h o f e r , i n 'The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology', E. G r o s s en J . M e i e n h o f e r ( e d s . ) , Academic P r e s s , New Y o r k , San F r a n c i s c o , London,
(1979), V o l . 1, h o o f d s t u k 6
10. G.W. A n d e r s o n , J . E . Zimmerman en F.M. C a l l a h a n , J. Am. Chem. Soc. 89, 5012 (1967)
11. T. W i e l a n d , G. Lüben en H. O t t e n h e i m , Justus Liebig's Ann. Chem. 722, 173 (1969)
12. T. W i e l a n d , H. F a u l s t i c h en F. F a h r e n h o l z , Justus Liebig's Ann. Chem. 743 77 (1971)
13. D.S. Kemp, Z. B e r n s t e i n en J . Rebek J r . , J. Am. Chem. Soc. 9_2, 4756 (1970) 14. T. W i e l a n d , B. H e i n k e , K. V o g e l e r en H. M o r i m o t o , J u s t u s Liebig's Ann.
Chem. 655, 189 (1962)
15. L. K i s f a l u d i , J . Schön, M. R e n y e i en S. Görög, J . Am. Chem. Soc. 97, 5588 (1975)
16. W. König en R. G e i g e r , Chem. Ber. 103, 788 (1970)
17. A.W. B u i j e n v a n Weelderen, proefschrift, D e l f t , i n b e w e r k i n g 18. H. Zahn, H. Bremer en R. Z a b e l , Z. Naturforsch., 20B, 653 (1965)
12
19. M. D z i e d u s z i e c k a , M. S u l k o w s k i en E. T a s c h n e r , i n 'Peptides 1972', H. Han-son en H.-D. Jakubke ( e d s . ) , N o r t h - H o l l a n d P u b l . , Amsterdam (1973) 103 20. T. W i e l a n d , J . F a e s e l en W. Konz, Justus Liebig's Ann. Chem. 722, 197
(1969)
21. T. W i e l a n d , L. L a p a t s a n i s , J . F a e s e l en W. Konz, Justus Liebig's Ann.
Chem. 1A1, 197 (1969)
22. T. W i e l a n d , C. B i r r , W. Bürgermeister, P. T r i e t s c h en G. Rohr, Justus
Lie-big's Ann. Chem. (1974) 24
23. V.T. I v a n o v , J . J . M i k h a l e v a , O.M. V o l p i n a , M.A. Myakova en V . l . D e i g i n , i n
'Peptides 1976', A. L o f f e t ( e d . ) , E d i t i o n s de 1' Université de B r u x e l l e s ,
(1976) 219
24. M. Bodanszky, i n 'Prebiotic and Biochemical Evolution', A.P. K i m b a l l en J . Oro ( e d s . ) , N o r t h - H o l l a n d P u b l . , Amsterdam (1971 217
25. M. Bodanszky en J.C. T o i l e , J n t . J . P e p t . Protein Res. _1_0, 380 (1977) 26. F. Weygand, P. Huber en K. W e i s s , Z. Naturforsch. 22B,1084 (1967) 27. F. Weygand en C. D i B e l l o , Z. Naturforsch. 24B, 314 (1969) 28. M.A. T i l a k , Tetrahedron Lett. (1970) 849
29. M.A. T i l a k , M.L. H e n d r i c k s en D.S Wedel, i n 'Progress in Peptide Research,
Vol. 2', S. Lande ( e d . ) , Gordon and B r e a c h , New Y o r k (1972)
30. H.C. Beyerman, i n 'Chemistry and Biology of Peptides', J . M e i e n h o f e r (ed.), Ann. A r b o r S e i . P u b l . , Ann A r b o r , M i c h i g a n (1972), 351
31. H.C. Beyerman, E.W.B, de L e e r en J . F l o o r , Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 92_ 481 (1973)
32. A. v a n Zon, proefschrift, D e l f t (1974)
33. A. v a n Zon en H.C. Beyerman, Helv. Chim. Acta 56_, 1729 (1973) 34. A. v a n Zon en H.C. Beyerman, Helv. Chim. Acta 59_, 1112 (1976)
35. H.C. Beyerman, T. Rammeloo, J.F.M. R e n i r i e , J.L.M. S y r i e r en A. v a n Zon,
Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 9_5_, 143 (1976)
36. E. I z e b o u d e n H.C. Beyerman, Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 97, 1 (1978) 37. J . H i r t , proefschrift, D e l f t (1978)
38. J . H i r t , P. K r a n e n b u r g en H.C. Beyerman, Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 98, 143 (1979)
39. K. M e d z i h r a d s k y en H. M e d z i h r a d s k y - S c h w e i g e r , Acta Chim. Acad. Sei. Hung. 44, 14 (1965)
'40. E. Wünsch, i n 'Houben-Weyl, Methoden de Organischen Chemie', E. Müller ( e d . ) , Georg Thieme V e r l a g , S t u t t g a r t (1974), 15/1, 728
41. P. S i e b e r , i n 'Peptides 1968', E. B r i c a s ( e d . ) , N o r t h - H o l l a n d P u b l . , Am-s t e r d a m (1968) 162
43. B. I s e l i n , Helv. Chim. Acta 44, 61 (1961) 44. T.F. L a v i n e , J . Biol. Chem. 169, 477 (1947)
45. S.N. L e w i s , i n 'Oxidation, Vol.1', R.L. A u g u s t i n e ( e d . ) , M a r c e l Dekker I n c . , New York (1969) 245
46. J . Boeseken en E. A r r i a s , Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 54, 711 (1935) 47. S. Oae, T. K i t a o en S. Kawamura, Tetrahedron 19_, 1783 (1963)
48. D.H.R. B a r t o n , B . J . G a r n e r en R.G. Wightman, J . Chem. Soc. (1964) 1855 49. J.L.M. S y r i e r , proefschritt, D e l f t (1975)
50. M. Bodanszky, M.L. F i n k , Y.S. K l a u s n e r , S. N a t a r a j a n , K. Tatemoto, A.E. Y i o t a k i s en A. Bodanszky, J . Org. Chem. 4_2_, 149 (1977)
51. H.C. Beyerman, J . H i r t , P. K r a n e n b u r g , J.L.M. S y r i e r en A. v a n Zon, Reel.
Trav. Chim. Pays-Bas 93, 256 (1974)
52. J.A. Hoffmann en M.A. T i l a k , Org. Prep. Proced. Int. ]_, 215 (1975)
53. E. I z e b o u d en H.C. Beyerman, Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 99_ (1980), i n d r u k 54. L. H o r n e r en P. K a i s e r , Justus Liebig's Ann. Chem. 626, 19 (1959) en h i e r
2. Substance P
2.1 NATUURLIJK SUBSTANCE P
Substance P werd i n 1931, t i j d e n s een onderzoek naar de aanwezigheid van ace-t y l c h o l i n e i n alcoholische exace-tracace-ten van hersen- en darmweefsel van paarden, door Von Euler en Gaddum (1) ontdekt. Na intraveneuze toediening van deze ex-tracten i n geanesthetiseerde konijnen trad hypotensie op, t e r w i j l de contrac-t i e van darmweefsel in vicontrac-tro bevorderd werd. De accontrac-tieve verbinding i n deze ex-tracten onderscheidde z i c h van acetylcholine doordat de werking ervan n i e t door atropine geremd werd. De naam substance P (P = Powder)' werd i n 1934 door Gaddum en Schild ingevoerd ( 2 ) . In 1936 onderkende Von Euler het 'eiwitachtige
karakter'van substance P (3) . Het onderzoek dat, t o t aan de i s o l e r i n g i n 1970, aan substance P v e r r i c h t werd i s door hembeek en Z e t l e r (4,5) u i t g e b r e i d s a -mengevat.
Verscheidene pogingen om substance P i n zuivere vorm te i s o l e r e n faalden vanwege problemen welke optraden b i j het bepalen van s p e c i f i e k e substance P a c t i -v i t e i t -van de f r a c t i e s -verkregen -na di-verse zui-veringsprocedures. De meest s p e c i f i e k e biologische methode om substance P - a c t i v i t e i t q u a n t i t a t i e f te bepa-len bleek de meting van de contractie van glad spierweefsel - i n het bijzonder van het ileum van de r a t - i n een p r o e f o p s t e l l i n g te z i j n ( 6 ) . Een doorbraak kwam i n 1967 toen Leeman en Hammerschlag een speekselproduktie bevorderende factor i n peptiden bevattende extracten van runderhypothalami ontdekten ( 7 ) . Chang en ook Lembeck merkten de overeenkomst van deze f a c t o r met substance P
op ( 8 , 9 ) . De bepaling van het volume aan afgescheiden speeksel b i j r a t t e n bleek een eenvoudige en quantitatieve bepaling voor een hoeveelheid i n t r a v e -neus geïnjecteerd substance P te z i j n . Mede dank z i j deze bepalingsmethode slaagden Chang en Leeman er i n 1970 i n om uitgaande van 20 kg runderhypothala-mi ongeveer 150 ug v r i j w e l zuiver substance P te i s o l e r e n ( 1 0 ) . In 1971 werd door Chang en medewerkers de aminozuursequentie van het geïsoleerde peptide opgehelderd. Z i j maakten h i e r b i j gebruik van s p l i t s i n g met behulp van
chymo-16
t r y p s i n e , Edman-afbraak, deamidering en afbraak door middel van
carboxypeptida-se A ( 1 1 ) . Substance P bleek een l i n e a i r 11-peptide te z i j n (figuur 2 . 1 ) .
HN NH; I I NH CH¡ NH2 NH; CH3 I I I I I CH¡ CH¡ C = 0 C=0 u r ru S i i i i n i n \ / 1 CH, CH¡ CH¡ CH, W y CH CH2 I I I I T T I I CH¡ CHZ CH2 CH¡ CH¡ CH¡ H CH¡ CH¡ N O I N O I I I I I I I ( / 3 4 5 6 7 8 9 10 11 N H ¡
Lys - Pro - Gin - Gin - Phe — Pne - Gly - Leu - Met — NH;
Figuur 2.1 De aminozuurseguentie van substance P*
Met betrekking t o t de primaire stuctuur behoort substance P t o t de klasse van de tachykininen en bombesine-achtige peptiden welke, voor zover bekend, a l l e
C-terminaal methionine bevatten ( 1 2 , 1 3 - 1 7 ) . In hetzelfde jaar ( 1 9 7 1 )
beschre-ven Tregear en medewerkers een vaste-fase synthese van een peptide met de voor substance P voorgestelde sequentie ( 1 8 ) . Zowel chemisch a l s b i o l o g i s c h
was het synthetische produkt identiek met het n a t u u r l i j k e . In 1 9 7 3 werd natuur-substance P door Studer en medewerkers u i t extracten van paardedarm geïsoleerd
( 1 9 ) . De aminozuursequentie bleek identiek aan die van substance P, geïsoleerd
u i t runderhypothalami. Het beschikbaar komen van zuiver substance P leidde i n
1 9 7 3 t o t een door Powell en medewerkers ontwikkelde gevoelige en s p e c i f i e k e
radioimmunoassay ( 2 0 ) .
Hoewel substance P i n vele b i o l o g i s c h e bepalingen een farmacologische werking
vertoont, z i j n onderzoekingen naar de f y s i o l o g i s c h e f u n c t i e van d i t peptide
nog i n v o l l e gang. Momenteel i s men van mening dat de meest w a a r s c h i j n l i j k e f y s i o l o g i s c h e f u n c t i e van substance P die van een neurotransmitter i s . Met
be-hulp van radioimmunoassay heeft men aangetoond dat substance P i n synaptoso-m a l f r a c t i e s van zenuwweefsel voorkosynaptoso-mt ( 2 0 ) . Isynaptoso-msynaptoso-munohistochesynaptoso-misch onderzoek
naar de l o k a l i s e r i n g van substance P bevestigde deze r e s u l t a t e n ( 2 1 , 2 2 ) . Door
Otsuka en medewerkers i s onderzoek v e r r i c h t naar de postsynaptische werking
van substance P ( 2 3 - 2 9 ) . De r e s u l t a t e n wijzen a l l e sterk i n de r i c h t i n g van
een neurotransmitterfunctie. Recentelijk i s aangetoond dat de v e r d e l i n g van substance P i n de ruggemerg r e d e l i j k overeenkomt met de p l a a t s van
c e p t o r e n ( 3 0 ) . A l s g e v o l g h i e r v a n h o u d t men t h a n s r e k e n i n g met een m o g e l i j k e i n t e r a c t i e van s u b s t a n c e P met de e n d o r f i n e n (endogene o p i a t e n ) , temeer omdat men aangetoond h e e f t d a t s u b s t a n c e P ook a n a l g e t i s c h e a c t i v i t e i t b e z i t (31-33) .
Met b e h u l p van i m m u n o f l u o r e s c e n t i e h e e f t men aangetoond d a t s u b s t a n c e P i n muc o s a van h e t maagdarmkanaal voorkomt. Het i s g e l o k a l i s e e r d i n e n t e r o muc h r o m a f -f i n e c e l l e n van h e t EC^-type (22,34-37) . S u b s t a n c e P i s h e t e e r s t e van een hel e r e e k s p e p t i d e n w e hel k e z o w e hel i n de h e r s e n e n a hel s i n h e t maagdarmkanaahel v o o r -komen ( 3 8 ) . Over de w i j z e waarop s u b s t a n c e P i n de c e l wordt g e s y n t h e t i s e e r d , o p g e s l a g e n , v r i j g e m a a k t en a f g e b r o k e n wordt i s nog w e i n i g bekend. Lembeck en medewerkers w i j z e n op de m o g e l i j k e b i n d i n g van s u b s t a n c e P aan een l i p i d e , w a a r s c h i j n l i j k f o s f a t i d y l s e r i n e ( 3 9 ) . Kato en medewerkers vonden r e c e n t e l i j k d a t h e t enzym X-Pro d i p e p t i d y l - a m i n o p e p t i d a s e i n s t a a t was a c h t e r e e n v o l g e n s de d i p e p t i d e n A r g - P r o en L y s - P r o a f t e s p l i t s e n . H i e r d o o r komt h e t C-terminale 7 - p e p t i d e Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH v r i j , waarvan bekend i s d a t h e t een tweemaal zo hoge a c t i v i t e i t b e z i t dan s u b s t a n c e P z e l f ( 4 0 , 4 1 ) . Z i j vermoeden d a t h e t enzym b e t r o k k e n i s b i j de a c t i v e r i n g en v r i j m a k i n g van s u b s t a n c e P.
Het i n de v o r i g e a l i n e a ' s b e s c h r e v e n onderzoek i s e e r s t m o g e l i j k geworden na-d a t e r z u i v e r s y n t h e t i s c h m a t e r i a a l b e s c h i k b a a r kwam. Voorheen moest men werken met p r e p a r a t e n w e l k e , naar l a t e r b l e e k , v o o r meer dan 98% u i t v e r o n t r e i n i g i n g e n b e s t o n d e n . Een en ander o n d e r s t r e e p t h e t b e l a n g van goede s y n t h e t i -sche p r e p a r a t e n t e n behoeve van m e d i s c h - b i o l o g i s c h o n d e r z o e k .
2.2 SYNTHESEN VAN SUBSTANCE P
De s e q u e n t i e van s u b s t a n c e P, z o a l s v o o r g e s t e l d door Chang en medewerkers, werd i n 1971 b e v e s t i g d door een v a s t e - f a s e s y n t h e s e van Tregear en medewerkers
( 1 8 ) . De s y n t h e s e vond p l a a t s aan b e n z h y d r y l a m i n o p o l y s t y r e e n . De Boc-aminozu-r e n weBoc-aminozu-rden met b e h u l p van d i c y c l o h e x y l c a Boc-aminozu-r b o d i i m i d e (DCCI) g e k o p p e l d , b e h a l v e B o c g l u t a m i n e d a t a l s p n i t r o f e n y l e s t e r g e k o p p e l d werd. De z i j k e t e n s van l y -s i n e en a r g i n i n e werden met r e -s p e c t i e v e l i j k de b e n z y l o x y c a r b o n y l ( Z ) - en de n i t r o g r o e p beschermd. Na a f s p l i t s i n g van h e t p o l y m e e r , v e r w i j d e r i n g van de be-schermende groepen met v l o e i b a a r w a t e r s t o f f l u o r i d e en z u i v e r i n g door m i d d e l van g e l p e r m e a t i e c h r o m a t o g r a f i e werd een p r e p a r a a t v e r k r e g e n met een b i o l o g i -sche a c t i v i t e i t i d e n t i e k aan d i e van h e t n a t u u r l i j k e p r o d u k t . Fi-scher en mede-w e r k e r s (42) en Syriër (43) b e s c h r e v e n i n 1974 r e s p e c t i e v e l i j k 1975 v a s t e - f a s e s y n t h e s e n van s u b s t a n c e P, w e l k e i n g r o t e l i j n e n overeenkwamen met de h i e r b o -ven b e s c h r e v e n s y n t h e s e .
18
De eerste synthese i n oplossing werd i n 1973 door Yajima en Kitagawa beschreven (41,44). Voor de synthese van de segmenten 1-4 en 5-11 werd hoofdzakelijk ge-bruik gemaakt van actieve ester koppelingen (figuur 2.2).
Z - A r g ( N 02) - P r o - O H H - L y s ( Z ) - P r o - O H — Z ( 0 M e ) - G l n - 0 H Z ( 0 M e ) - G l n - 0 H Z ( 0 M e ) - P h e - 0 H OPcp Z ( 0 M e ) - P h e - G l y - 0 H H - L e u - M e t - N H2 -1.0CC/HOBt 1. ONp 1.0Np 1. ONp 2.TFA 2.TFA 2. TFA 2.TFA D C C / H O B t Z - A r g ( N 02) - P r o - L y s ( Z ) - P r o - G l n - G l n - P h e - P n e - G l y - L e u - M e t - N H2 H F / a n i s o o l H - A r g - P r o - L y s - P r o - G l n - G l n - P h e - P h e - G l y - L e u - M e t - N H2
Figuur 2.2 Synthese van substance P volgens Yajima en Kitagawa
De koppeling van de segmenten geschiedde volgens de DCCI/l-hydroxybenzotria-zool (HOBt) methode (46). Na a f s p l i t s i n g van de beschermende groepen met vloeibaar waterstoffluoride en z u i v e r i n g door ionenwisselingschromatografie had het op deze manier verkregen substance P een goede biologische a c t i v i t e i t .
In 1974 beschreven Bayer en Mutter hun synthese van substance P met behulp van de vloeibare-fase methode (45). E e r s t werd Boc-methionine veresterd aan poly-ethyleenglycol en vervolgens werden de beschermde aminozuren door middel van a c t i v e r i n g a l s symmetrische anhydriden gekoppeld. Na a f s p l i t s i n g van de be-schermende groepen met behulp van vloeibaar w a t e r s t o f f l u o r i d e en z u i v e r i n g door middel van continue hoogspanningselektroforese, bezat het op deze manier gesynthetiseerde substance P een biologische a c t i v i t e i t welke v e r g e l i j k b a a r was met d i e van het n a t u u r l i j k substance P.
In 1975 beschreef Syriër een synthese van substance P, welke g e d e e l t e l i j k met behulp van de vaste-fase methode en g e d e e l t e l i j k volgens methoden i n oplossing uitgevoerd werd (43). E e r s t werd het beschermde segment 1-9 door toepassing van de vaste-fase methode bereid (figuur 2.3). De koppelingen van de bescherm-de aminozuren werbescherm-den volgens bescherm-de DCCI/HOBt methobescherm-de uitgevoerd. Na a f s p l i t s i n g
van het polymeer met een mengsel van triëthylamine, methanol en dimethylforma-mide werd de methylester van beschermd 1-9 verkregen. Na a l k a l i s c h e verzeping van de methylester werd het segment 1 0 - 1 1 gekoppeld (figuur 2.3). De koppeling
1 Arg
2
P r o Lys 3 P r o 5ln 5 Gin 6 7 Phe 8 Gly 9
N02 OH Boe ,N 02 Bot Boc-KOH Boe Boc+OH Boe Boe OH Boe Boe OH Boe Boe OH Boe Boe OHBoc OH Boe 10 Leu Met 11 Boe-OH Boc]-NH2 N H2 OMe OH H -NH2 - N H2 -NH2 Figuur 2.3 Synthese van substance P volgens S y r i e r
van de segmenten met behulp van de ondermaat gemengd anhydride methode bleek h i e r b i j het meest succesvol. De a f s p l i t s i n g van de beschermende groepen vond plaats door acidolyse met vloeibaar w a t e r s t o f f l u o r i d e i n aanwezigheid van a n i -sool en methionine. Na ionenwisselings- en gelpermeatiechromatografie werd een produkt verkregen dat zowel chemisch a l s b i o l o g i s c h van goede k w a l i t e i t was.
LITERATUUR
1. U.S. von Euler en J.H. Gaddum, J. Physiol. 72.'74 (1931)
2. J.H. Gaddum en H. S c h i l d , J . Physiol. 83, 1 (1934)
3. U.S. von Euler, Arch. Exp. Path. Pharmak. 181, 181 (1936) 4. F. Lembeck en G. Z e t l e r , Int. Rev. Neurobiol. A, 159 (1962)
5. F. Lembeck en G. Zetler, i n 'Pharmacology of Naturally occurring Polypeptides and Lipid-soluble Acids, Vol. 1', J-M. Walker (ed.), Pergamon
Press, New York (1972) 29
6. J . Cleugh, J.H. Gaddum, A.A. M i t c h e l l , M.W. Smith en V.P. Whittaker, J . Physiql. 170, 69 (1964)
20
7. S.E. Leeman en R. Hammerschlag. Endocrinology 81, 803 (1967) 8. S.E. Leeman en E. Mroz, Life Sci. 15, 2033 (1974)
9. F. Lembeck en K. Starke, Arch. Exp. Path. Pharmak. 259, 375 (1968) 10. M.M. Chang en S.E. Leeman, J . Biol. Chem. 245, 4784 (1970)
11. M.M. Chang, S.E. Leeman en H.D. N i a l l , Nature (London) New Biol. 232, 86 (1971)
12. V. Erspamer, Annu. Rev. Pharmacol. 11_, 327 (1971)
13. V. Erspamer en P. M e l c h i o r r i , Pure Appl. Chem. 35, 463 (1973) 14. J.L.M. Syrier, p r o e f s c h r i f t . D e l f t (1975) 16
15. A. Anastasi en G. Falconieri-Erspamer, Experientia 26, 866 (1970) 16. V. Erspamer, G. De Caro en R. Endean, Experientia 22, 738 (1966) 17. A. Anastasi, V. Erspamer en M. Bucci, Experientia 27, 166 (1971) 18. G.W. Tregear, H.D. N i a l l , J.T. Potts J r . , S.E. Leeman en M.M. Chang,
Nature (London) New Biol. 232, 87 (1971)
19. R.O. Studer, A. Trzeciak en W. Lergier, Helv. Chim. Acta 5£, 860 (1973) 20. D. Powell, S.E. Leeman, G.W. Tregear, H.D, N i a l l en J.T. Potts J r . ,
Nature (London) New Biol. 241, 252 (1973)
21. T. Hockfeldt, J.O. K e l l e r t h , G. Nilson en B. Pernow, Brain Res. 100, 235 (1975)
22. A.G.E. Pearse en J.M. Polak, Histochemistry 373 (1975)
23. M. Otsuka, S. Konishi en T. Takahashi, Proc. Japan. Acad. 48, 342 (1972) 24. M. Otsuka, S. Konishi en T. Takahashi, Proc. Japan. Acad. 48, 747 (1972) 25. S. Konishi en M. Otsuka, Brain Res. 6_5, 397 (1974)
26. T. Takahashi, S. Konishi, D. Powell, S.E. Leeman en M. Otsuka, Brain Res. 73_, 59 (1974)
27. S. Konishi en M. Otsuka, Jap. J . Pharmacol. 24_, 104 (1974)
28. M. Otsuka, S. Konishi en T. Takahashi, Fed. Proc. 34, 1922 (1975) 29. M. Otsuka en S. Konishi, Nature (London) 264, 83 (1976)
30. C. Lamotte, C.B. Pert en S.H. Snyder, Brain Res. 112, 407 (1976)
31. J.M. Stewart, C.J. Getto, K. Nelder, E.B. Reeve, W.A. Krivoy en E. Zimmer-man, Nature (London) 262, 784 (1976)
32. J . Davies en A. Dray, Brain Res. 107, 623 (1976) 33. J . Davies en A. Dray, Nature (London) 263, 351 (1977)
34. - G. Nilsson, L.I. Larsson en R. Hakanson, Histochemistry 43_, 97 (1975) 35. P.H. Heitz, J.M Polak en CM. Timson, Histochemistry 49_, 343 (1976) 36. J.M. Polak, P.H. Heitz en A.G.E. Pearse, Scand. J. Gastroenterol. 11,
Suppl. 39, 39 (1976)
37. P.H. Heitz, M. Kasper, G. Krey, J.M. Polak en A.G.E. Pearse, Gastro-enterology 74, 713 (1978)
38. Ä.G.E. P e a r s e , Nature (London) 262, 92 (1976)
39. F. Lembeck, i n 'Centrally acting Peptides', J . Hughes ( e d . ) , The M c M i l l a n P r e s s L t d . , London (1978) 119
40. T. K a t o , T. N a g a t s u , K. Fukawasu, M. Harada, I . N a g a t s u en S. S a k a k i b a r a ,
Biochim. et Biophys. Acta 525, 417 (1978)
41. H. Y a j i m a , K. K i t a g a w a en T. Segawa, Chem. Pharm. Bull. 21_, 2500 (1973) 42. G.H. F i s h e r , J . Humphries, K. F o l k e r s , B. Pernow en C.Y. Bowers, J. Med.
Chem. r7_, 843 (1974)
43. Ref. 14, h o o f d s t u k 5
44. H. Y a j i m a en K. K i t a g a w a , Chem. Pharm. Bull. 2 1 , 682 (1973) 45. E. B a y e r en M. M u t t e r , Chem. Ber. 107, 1344 (1974)
3. De REMA synthese van substance P via de sulfoxiden
3.1 INLEIDING
B i j een op ons L a b o r a t o r i u m door Syriër u i t g e v o e r d onderzoek naar de t o e p a s -s i n g van de v a -s t e - f a -s e methode v o o r h e t -s y n t h e t i -s e r e n van p e p t i d e n met
C - t e r m i n a a l m e t h i o n i n e werd s u b s t a n c e P a l s m o d e l p e p t i d e gekozen ( 1 ) . Vanwege de i n p a r a g r a a f 1.3 u i t e e n g e z e t t e problemen, w e l k e b i j de s y n t h e s e v a n
m e t h i o n i n e b e v a t t e n d e p e p t i d e n kunnen o p t r e d e n , werd m e t h i o n i n e a l s de s u l f o x i d e n beschermd. U i t g a a n d e van aan h e t M e r r i f i e l d - p o l y m e e r v e r e s t e r d B o c - m e t h i o n i n e - ( R , S ) - s u l f o x i d e werd de g e h e l e s e q u e n t i e s t a p s g e w i j s opgebouwd. De wabeschermde aminozuren werden v o l g e n s de d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e / 1
-- h y d r o x y b e n z o t r i a z o o l (DCCl/HOBt) methode g e k o p p e l d . B i j h e t u i t v o e r e n van deze s y n t h e s e b l e e k d a t v r i j w e l a l h e t m e t h i o n i n e s u l f o x i d e o n t l e e d d e . Het was n i e t d u i d e l i j k wat p r e c i e s de o o r z a k e n van de o n t l e d i n g waren. U i t de r e s u l -t a -t e n van deze s y n -t h e s e werd g e c o n c l u d e e r d d a -t de b e s c h e r m i n g van m e -t h i o n i n e a l s de s u l f o x i d e n n i e t g e s c h i k t was v o o r de v a s t e f a s e van s u b s t a n c e P, u i t -gaande van Boe-Met(O)-polymeer.
Om h e t c o n c e p t van de s u l f o x i d e b e s c h e r m i n g n i e t d i r e c t t e l a t e n v a r e n werd b e s l o t e n om s u b s t a n c e P met b e h u l p van de overmaat gemengd a n h y d r i d e methode t e s y n t h e t i s e r e n ( 2 ) . D i t was ook z i n v o l omdat h i e r t o t nu t o e geen m e t h i o n i n e b e v a t t e n d e p e p t i d e n met b e h u l p van de REMAmethode waren g e s y n -t h e -t i s e e r d . Ook o v e r h e -t g e d r a g van m e -t h i o n i n e s u l f o x i d e n onder c o n d i -t i e s z o a l s d i e w e l k e b i j de REMA-methode g e b r u i k t worden was nog n i e t s bekend. De s y n t h e s e van s u b s t a n c e P zou dus een b i j d r a g e kunnen z i j n t o t h e t op ons L a b o r a t o r i u m lopende onderzoek naar de t o e p a s s i n g en b e p e r k i n g e n van de REMA-methode.
B i j de i n d i t h o o f d s t u k b e s c h r e v e n s y n t h e s e van s u b s t a n c e P werd, i n v e r b a n d met m o g e l i j k e o p w e r k i n g s p r o b l e m e n , de o x i d a t i e van m e t h i o n i n e t o t de s u l -f o x i d e n e e r s t u i t g e v o e r d n a d a t B o c - m e t h i o n i n e geamideerd was. De o x i d a t i e
2 4
WERD M E T E E N G E R I N G E O V E R M A A T W A T E R S T O F P E R O X I D E I N A Z I J N Z U U R U I T G E V O E R D ( 3 ) . VOOR D E « " - B E S C H E R M I N G V A N D E T E K O P P E L E N A M I N O Z U R E N E N V A N H E T D I P E P T I D E L Y S - P R O WERD D E B O E G R O E P G E B R U I K T . VOOR D E A - A M I N O G R O E P V A N A R G I N I N E WAS D I T D E Z G R O E P . D E Z I J K E T E N S V A N L Y S I N E E N A R G I N I N E , W E R D E N M E T R E S P E C T I E V E L I J K D E Z- E N D E N I T R O G R O E P B E S C H E R M D . D E K E U Z E V A N D E B E S C H E R M E N D E G R O E P E N WAS Z O D A N I G D A T A A N H E T E I N D V A N D E S Y N T H E S E B E S C H E R M D R E M A - S U B S T A N C E P V E R G E L E K E N K O N WORDEN M E T E E N DOOR Syriër G E S Y N T H E T I S E E R D V A S T E - F A S E P R O D U K T . DE B O E G R O E P E N W E R D E N V E R W I J D E R D DOOR A C I D O L Y S E M E T T R I F L U O R A Z I J N Z U U R I N M E T H Y L E E N -C H L O R I D E . DE A A N W E Z I G H E I D V A N M E T H I O N I N E S U L F O X I D E N M A A K T E H E T G E B R U I K V A N V L O E I B A A R W A T E R S T O F F L U O R I D E B I J D E A F S P L I T S I N G V A N D E B E I D E Z G R O E P E N E N D E N I T R O G R O E P N O O D Z A K E L I J K . B I J H E T O P S T E L L E N V A N D E T A K T I E K B I J D E S Y N T H E S E V A N S U B S T A N C E P V I A D E S U L F O X I D E N WERD E R V A N U I T G E G A A N D A T S U B S T A N C E P (I?, S) S U L F O X I D E O P E E N E E N -V O U D I G E W I J Z E T E R E D U C E R E N Z O U Z I J N . I N D E P R A K T I J K WORDT -VOOR E E N D E R G E L I J K E R E D U C T I E M E E S T A L E E N T H I O L , Z O A L S 2 - M E R C A P T O E T H A N O L O F M E R C A P T O A Z I J N Z U U R , G E B R U I K T ( 3 ) . B I J H E T T O E P A S S E N V A N D E Z E M E T H O D E B I J D E R E D U C T I E V A N S U B S T A N C E P — ( R , S ) - S U L F O X I D E B L E E K D E O M Z E T T I N G L A N G Z A A M E N O N V O L L E D I G T E V E R L O P E N . D I T WAS E E N A A N L E I D I N G OM N A T E G A A N O F OOK A N D E R E M E T H O D E N I N A A N M E R K I N G K O M E N VOOR H E T R E D U C E R E N V A N M E T H I O N I N E S U L F O X I D E B E V A T T E N D E P E P T I D E N . V O O R U I T L O P E N D O P H E T G E E N I N H O O F D S T U K 6 B E S C H R E V E N S T A A T , W I L I K M I J H I E R B E P E R K E N M E T T E V E R M E L D E N D A T D E R E D U C T I E V A N S U B S T A N C E P ( R , S ) S U L F O X I D E G O E D M E T A M M O N I U M -J O D I D E I N W A T E R I G T R I F L U O R A Z I -J N Z U U R K O N WORDEN U I T G E V O E R D . D E S T R A T E G I E V A N D E S Y N T H E S E V A N S U B S T A N C E P V I A D E S U L F O X I D E N I S I N F I G U U R 3.1 W E E R G E G E V E N . D E A M I N O Z U U R S E Q U E N T I E V A N S U B S T A N C E P B E V A T O P D E P L A A T S E N a 2 E N 4 P R O L I N E . OMDAT D E K O P P E L I N G V A N ¡V - B E S C H E R M D P R O L I N E M E T B E H U L P V A N D E G E M E N G D A N H Y D R I D E M E T H O D E A A N L E I D I N G K A N G E V E N T O T U R E T H A A N V O R M I N G ( P A R A G R A A F 1 . 2 ) WERD VOOR D E V O L G E N D E S T R A T E G I E G E K O Z E N : 1. S Y N T H E S E V A N H E T B E S C H E R M D E 7 - P E P T I D E 5 - 1 1 G E V O L G D DOOR 2 . A C H T E R E E N V O L G E N S K O P P E L E N V A N D E D I P E P T I D E N B O C - L Y S ( Z ) - P R O - O H E N Z - A R G ( N 02) - P R O - O H D E O V E R M A A T G E M E N G D A N H Y D R I D E K O P P E L I N G E N W E R D E N U I T G E V O E R D V O L G E N S D E I N P A R A G R A A F 3.6 B E S C H R E V E N A L G E M E N E W E R K W I J Z E . B I J D E K O P P E L I N G V A N D E B E I D E D I P E P T I D E N WERD G E B R U I K G E M A A K T V A N E E N T W E E V O U D I G E O V E R M A A T G E M E N G D A N H Y D R I D E . D E S Y N T H E S E V A N D E D I P E P T I D E N WERD DOOR M I D D E L V A N D E D C C L / H O B T M E T H O D E U I T -G E V O E R D ( 2 1 ) .
1 A r g Pro 2 N0„ N O , .L 3 L y s
Boc-K
OH Boe L L u P r o 5 Gtn 6 Gin 7 P h e P h e 9 Gly 10 Leu Met 11 Boc-l-OHBoC' OH Boe B o c + O H B o c Boc4-OH B o e B o e B o c + O H B o e B o e OH B o eFiguur 3.1 REMA-synthese van substance P via de sul 1'oxiden
3.2 DE SYNTHESE VAN BESCHERMD SUBSTANCE P-(R,S)-SULFOXIDE
Boc-methionineamide werd bereid door ammoniak toe te voegen aan een oplossing van het gemengd anhydride van Boc-methionine en isobutylcarbonaat i n dimethyl-formamide. Boc-methionineamide werd u i t het reactiemengsel geïsoleerd door e x t r a c t i e met ethylacetaat gevolgd door k r i s t a l l i s a t i e .
De o x i d a t i e van Boc-methionineamide t o t de diastereoisomere sulfoxiden v e r l i e p q u a n t i t a t i e f met een 0,1voudige overmaat waterstofperoxide i n a z i j n -zuur. De overmaat waterstofperoxide werd, i n navolging van Syriër (4), ontleed met 5% p l a t i n a op k o o l . Na de opwerking was het eerst n i e t mogelijk het produkt te k r i s t a l l i s e r e n . D i t gelukte echter wel nadat de resten azijnzuur door t r i t u r e r e n met ether verwijderd waren. U i t de o p s p l i t s i n g van het methyl-s u l f i n y l methyl-s i g n a a l i n het NMR methyl-spectrum volgde dat we te maken hadden met een diastereoisomerenmengsel. Met NMR en DLC werd geconstateerd dat er geen s u l f o n vorming was opgetreden. Na acidolyse van de Boc-groep met t r i f l u o r a z i j n z u u r i n methyleenchloride, gevolgd door t r i t u r e r e n met ether, werd methioninesulfoxide amide a l s een o l i e verkregen. Het op deze wijze gesynthetiseerde H-Met(0)-NH diende a l s uitgangsmateriaal voor de REMA-synthese van beschermd substance P
