Małe RNA Małe RNA

(1)

Małe RNA Małe RNA

i mechanizmy epigenetycznej i mechanizmy epigenetycznej

regulacji ekspresji genów regulacji ekspresji genów

dr Monika Zakrzewska-Płaczek dr Monika Zakrzewska-Płaczek

monika.z@ibb.waw.pl

(2)

2 Małe RNA (small RNAs, sRNAs, smRNAs)

sRNA – 21-30 nt

wyciszanie ekspresji genów:

(gene silencing, RNA silencing)

•

post-transkrypcyjne

(post-transcriptional gene silencing, PTGS) degradacja mRNA, inhibicja translacji

•

transkrypcyjne

(transcriptional gene silencing, TGS) epigenetyczne modyfikacje chromatyny

AAAAAAAAAA

RNAP

modyfikacja histonów, metylacja DNA modyfikacja histonów, metylacja DNA

Specyficzność wyciszenia Specyficzność wyciszenia

określonych sekwencji zapewniona jest dzięki określonych sekwencji zapewniona jest dzięki komplementarności zasad między wyciszającym komplementarności zasad między wyciszającym

sRNA, a RNA ulegającym wyciszeniu sRNA, a RNA ulegającym wyciszeniu

Wyciszanie genów za pośrednictwem małych

Wyciszanie genów za pośrednictwem małych RNA RNA odgrywa odgrywa istotną rolę zarówno w

istotną rolę zarówno w regulacji ekspresji regulacji ekspresji, jak i w , jak i w zachowaniu integralności genomów

zachowaniu integralności genomów organizmów żywych. organizmów żywych.

Za pośrednictwem

Za pośrednictwem siRNA siRNA wyciszane są m.in. regiony bogatej wyciszane są m.in. regiony bogatej w powtórzenia DNA heterochromatyny, sekwencje

w powtórzenia DNA heterochromatyny, sekwencje transpozonowe, wirusy i inne patogeny.

transpozonowe, wirusy i inne patogeny.

miRNA

miRNA i i tasiRNA tasiRNA regulują m.in. ekspresję genów związanych regulują m.in. ekspresję genów związanych z zegarem biologicznym, rozwojem, reakcją na stres.

z zegarem biologicznym, rozwojem, reakcją na stres.

(3)

3 Białka

Białka Dicer Dicer i i Argonaute Argonaute (AGO): (AGO):

główne elementy szlaku wyciszania RNA główne elementy szlaku wyciszania RNA

Dwuniciowy RNA Dwuniciowy RNA

(double-stranded RNA ( double-stranded RNA, , dsRNA dsRNA) )

jest cięty przez

jest cięty przez Dicer Dicer

na krótkie dwuniciowe cząsteczki RNA, na krótkie dwuniciowe cząsteczki RNA, które są wiązane

które są wiązane przez jedno z białek przez jedno z białek rodziny

rodziny ARGONAUTE ARGONAUTE. .

DICER

AGO

wyciszenie

(4)

4 PAZ

RIII

MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.., Adams, P.D., and Doudna, J.A. (2006) Science MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.., Adams, P.D., and Doudna, J.A. (2006) Science

Podczas biogenezy siRNA i miRNA, białka Dicer lub Dicer-like (DCL) tną długie dsRNA lub RNA o

strukturze spinki (hairpin) na fragmenty ~ 21 – 25nt.

Podczas biogenezy siRNA i miRNA, białka Dicer lub Dicer-like (DCL) tną długie dsRNA lub RNA o

strukturze spinki (hairpin) na fragmenty ~ 21 – 25nt.

Struktura białka

Struktura białka Dicer Dicer umożliwia umożliwia równomierne

równomierne rozcinanie rozcinanie RNA RNA na na fragmenty o takiej samej długości.

fragmenty o takiej samej długości.

Dicer

Dicer i i Dicer-like Dicer-like

2 domeny typu 2 domeny typu

RNazy III RNazy III

aktywność endonukleolityczna aktywność endonukleolityczna 5’P / 3’OH

5’P / 3’OH

PAZ PAZ

konserwowana domena wiążąca konserwowana domena wiążąca dsRNA

dsRNA

(dsRBD- dsRNA-binding domain) (dsRBD- dsRNA-binding domain)

oddziałuje z końcem 3’ dsRNA

(5)

5 Argonaute Argonaute

Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., and Benning, C. (1998) EMBO Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., and Benning, C. (1998) EMBO J. Song, J.-J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor, L. (2004) Science J. Song, J.-J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor, L. (2004) Science

Białka ARGONAUTE wiążą sRNA i mRNA

A. thaliana A . thaliana ago1 ago1 Nazwa ARGONAUTE pochodzi od mutanta

argonaute1 A. thaliana; który swoim kształtem przypomina ośmiornicę żeglarka (Argonauta).

Argonauta argo Argonauta argo

PAZ

PIW I N- MID

te rm

PAZ PAZ

oddziałuje z końcem 3’ sRNA oddziałuje z końcem 3’ sRNA

MID MID ^(middle) ^(middle)

oddziałuje z nukleotydem na końcu oddziałuje z nukleotydem na końcu 5’ sRNA

5’ sRNA

PIWI PIWI

struktura podobna do RNazyH struktura podobna do RNazyH w niektórych białkach Ago:

w niektórych białkach Ago:

cięcie RNA zwiazanego z sRNA cięcie RNA zwiazanego z sRNA (slicer activity)

(slicer activity)

(6)

6 Wyciszanie ekspresji genów Wyciszanie ekspresji genów

DCL

MIR

RNAP

AGO

_AAAn AAAn

RNAP

miRNA

(micro RNA)

-inhibicja translacji, cięcie mRNA

AAAn

mRNA

AGO

DCL

AGO _AAAn

AGO

RNAP

AGO

siRNA

(small interferring RNA)

-post-transkrypcyjne lub transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów

AGO

AAAn

(7)

7 miRNA

(microRNA)

rośliny, zwierzęta, wirusy, Protista

20–

25nt

Drosha

(u zwierząt)

+ Dicer

Transkrypcja przez Pol II/Pol III

Regulacja stabilności mRNA (cięcie mRNA), inhibicja translacji

mirtrony – pochodzące z intronów prekursorów mRNA genów kodujących białka; występują u zwierząt; niezależne od Drosha

siRNA

(small interferring RNA) – większość działa in cis, za wyjątkiem tasiRNA

exo-siRNA

(pochodzenia egzogennego)

rośliny, grzyby, zwierzęta, Protista

21-24nt Dicer Transgeniczny, wirusowy lub inny egzogenny RNA

Post-transkrypcyjna

regulacja ekspresji genów, obrona przeciwwirusowa

endo-siRNA

(pochodzenia endogennego)

rośliny, grzyby, zwierzęta, Protista

~21nt Dicer

Transkrypcja

dwukierunkowa lub

zbieżna, wiązanie mRNA z transkryptami

pseudogenów o przeciwnej orientacji

Post-transkrypcyjna i transkrypcyjna regulacja ekspresji genów, regulacja aktywności transpozonów

tasiRNA

(trans-acting

siRNA) rośliny 21nt DCL4 TAS RNA cięte przez

miRNA Regulacja post-

transkrypcyjna natsiRNA

(natural antisense transcripts-derived siRNA)

rośliny 24nt

21nt DCL2

DCL1

Transkrypcja dwukierunkowa indukowana stresem

Regulacja genów odpowiedzi na stres

PTGS: post-transkrypcyjne wyciszanie genów

Klasy małych RNA:

(8)

8 siRNA

(small interferring RNA)

endo-siRNA

(pochodzenia endogennego)

rośliny, grzyby, zwierzęta, Protista

~21nt Dicer

Transkrypcja

dwukierunkowa lub

zbieżna, wiązanie mRNA z transkryptami

pseudogenów o przeciwnej orientacji

Post-transkrypcyjna i transkrypcyjna regulacja ekspresji genów, regulacja aktywności transpozonów

hc-siRNA

(heterochromatic siRNA)

rośliny,

S. pombe 24-26nt DCL3 Transpozony, powtórzenia Modyfikacja chromatyny

piRNA

(Piwi-interacting RNA)

Drosophila, C. elegans, ssaki, Danio rerio

24–

30nt niezależne

od Dicer Długie pierwotne

transkrypty (?) Wyciszanie transpozonów, inne nieznane funkcje

TGS: transkrypcyjne wyciszanie genów

Klasy małych RNA:

(9)

9 Species

Species Argonaute-PIWI-like Argonaute-PIWI-like

Dicer-like

Dicer-like RdRP RdRP Argonaute

Argonaute PIWI PIWI

Plantae Arabidopsis thaliana 10 (AGO1-10) - 4 (DCL 1-4) 6

Oryza sativa 18 - 5 5

Fungi Fungi

Saccharomyces cerevisiae - - - -

Schizosaccharomyces pombe 1 - 1 1

Neurospora crassa 1 - 1 3

Aspergillus nidulans 1 - 1 2

Metazoa Metazoa

Caenorhabditis elegans 5 3 2 (Dicer + Drosha) 4

Drosophila melanogaster 2 3 3 (2 Dicers + Drosha) -

Danio rerio 4 4 2 (Dicer + Drosha) -

Homo sapiens 4 4 2 (Dicer + Drosha) -

Dicer

Dicer i i Argonaute Argonaute

u różnych organizmów

(10)

10 U roślin w biogenezie

U roślin w biogenezie miRNA miRNA i i siRNA siRNA uczestniczą różne białka

uczestniczą różne białka DCL DCL

Margis, R., Fusaro, A.F., Smith, N.A., Curtin, S.J., Watson, J.M., Finnegan, E.J., and Waterhouse, P.M. (2006) FEBS Lett.

Rośliny mają 4 (i więcej) białek DCL: większa niż u innych Rośliny mają 4 (i więcej) białek DCL: większa niż u innych organizmów liczba białek DCL umożliwia roślinom bardziej organizmów liczba białek DCL umożliwia roślinom bardziej precyzyjną i skuteczną obronę przed patogenami.

precyzyjną i skuteczną obronę przed patogenami.

AtDCL1

AtDCL1 miRNA miRNA

AtDCL2 - 4

AtDCL2 - 4 siRNA siRNA

DCL4

DCL1

(11)

11 U roślin w biogenezie

U roślin w biogenezie miRNA miRNA i i siRNA siRNA uczestniczą różne białka

uczestniczą różne białka DCL DCL

AtDCL1

AtDCL1 miRNA miRNA

AtDCL2 - 4

AtDCL2 - 4 siRNA siRNA

DCL4 DCL1

Arabidopsis thaliana:

•

DCL1 → 21nt miRNA → AGO1/7/10 DCL1 → 21nt miRNA → AGO1/7/10

•

DCL2 → 22nt siRNA DCL2 → 22nt siRNA

•

DCL3 → 24nt siRNA → AGO4/6 DCL3 → 24nt siRNA → AGO4/6

•

DCL4 → 21nt siRNA DCL4 → 21nt siRNA (tasiRNA) (tasiRNA) → AGO1 → AGO1

Bologna N.G., Voinnet O.

Bologna N.G., Voinnet O. (20 (201414) ) Annu. Rev. Plant BiolAnnu. Rev. Plant Biol. .

(12)

12

AAAn

RNAP II

microRNA działaja poprzez cięcie mRNA lub inhibicję translacji

DCL

gen gen MIR MIR

RNAP II

mRNA

AAAn

AGO

AAAn

AGO

AAAn

Inhibicja Inhibicja translacji translacji

cięcie cięcie mRNA mRNA

microRNA u roślin

• miRNA są kodowane przez specyficzne geny ^miRNA są kodowane przez specyficzne geny MIR MIR, ale wpływają na ekspresję innych genów , ale wpływają na ekspresję innych genów – – są cząsteczkami regulatorowymi działającymi

są cząsteczkami regulatorowymi działającymi in trans in trans

• ^miRNA ^miRNA u roślin (również u zwierząt) regulują procesy rozwojowe i fizjologiczne u roślin (również u zwierząt) regulują procesy rozwojowe i fizjologiczne

• uważa się, że uważa się, że miRNA wyewoluowały z miRNA wyewoluowały z siRNA – powstają i dojrzewają w podobny (do pewnego siRNA – powstają i dojrzewają w podobny (do pewnego stopnia) sposób

stopnia) sposób

(13)

13 aktywna aktywna translacja translacja

inhibicja inhibicja inicjacji inicjacji translacji translacji

inhibicja inhibicja translacji translacji

degradacja degradacja

mRNA mRNA

Stefani G., Slack F. J.,

Stefani G., Slack F. J., (200 (20088) ) Mol Cell BiolMol Cell Biol

microRNA u zwierząt

(14)

14 aktywna aktywna translacja translacja

degradacja degradacja

mRNA mRNA

Stefani G., Slack F. J.,

Stefani G., Slack F. J., (200 (20088) ) Mol Cell BiolMol Cell Biol

microRNA - miRNA

(15)

15 Step 1.

Step 1. Initial effect of miRNAs: inhibition of translation at the initiation step without mRNA Initial effect of miRNAs: inhibition of translation at the initiation step without mRNA decay.

decay.

Step 2.

Step 2. mRNA deadenylation by PAN2–PAN3 and CCR4–NOT complexes recruited by mRNA deadenylation by PAN2–PAN3 and CCR4–NOT complexes recruited by

miRISC as a consequence of translation inhibition that makes poly(A) tail more accessible.

Step3.

Step3. Stimulated deadenylation potentiates the effect on translational inhibition and lead Stimulated deadenylation potentiates the effect on translational inhibition and leads s to decay of target mRNAs through the recruitment of the decapping machinery

to decay of target mRNAs through the recruitment of the decapping machinery . .

Destabilization of target Destabilization of target mRNA is the predominant mRNA is the predominant reason for reduced protein reason for reduced protein output.

output.

(16)

16 Geny Geny MIR MIR : transkrypcja długich cząsteczek : transkrypcja długich cząsteczek pri-mi

pri-mi RNA RNA z których powstają z których powstają miRNA miRNA

• miRNA są kodowane przez geny MIR

• pierwotne transkrypty miRNA (pri-miRNA) tworzą drugorzędowe, dwuniciowe struktury, które są rozpoznawane i cięte przez białka Dicer (u roślin DCL1)

**• nić miRNA* jest degradowana**

• miRNA są kodowane przez geny MIR

• pierwotne transkrypty miRNA (pri-miRNA) tworzą drugorzędowe, dwuniciowe struktury, które są rozpoznawane i cięte przez białka Dicer (u roślin DCL1)

**• nić miRNA* jest degradowana**

3'

5' miRNA

miRNA*

3'

5' pri-miRNA

miRNA

MIR gene

mRNA target

DCL1

(17)

17 Biogeneza

Biogeneza miRN miRN A A

u roślin u roślin

DNA DNA

pri-miRNA pri-miRNA transkrypcja

transkrypcja

cięcie cięcie

eksport eksport

tworzenie tworzenie kompleksu kompleksu

RISC RISC metylacja metylacja

jądro jądro komórkowe komórkowe cytoplazma cytoplazma

miRNA miRNA miRNA*

miRNA*

mRNA mRNA

cięcie mRNA cięcie mRNA

Mallory A., Vaucheret H.

Mallory A., Vaucheret H. (200 (20066) ) Nature Genet.

Nature Genet.

HYL1:

oddziaływanie z DCL1 oddziaływanie z DCL1

HEN1:

metylotransferaza, metylotransferaza,

metylacja miRNA/miRNA*

HST (

HST ( HASTY HASTY ): ):

eksport miRNA/miRNA*

do cytoplazmy, do cytoplazmy,

homolog eksportyny 5

(18)

18 Biogeneza

Biogeneza miRN miRN A A

u zwierząt u zwierząt

DNA DNA

pri-miRNA pri-miRNA

pre-miRNA pre-miRNA

miRNA/miRNA*

jądro komórkowe jądro komórkowe

cytoplazma cytoplazma

transkrypcja transkrypcja

cięcie cięcie

eksport eksport

cięcie cięcie

tworzenie tworzenie kompleksu kompleksu

RISC RISC

Wg: Ding X.C., Weiler J., Grosshans H.

Wg: Ding X.C., Weiler J., Grosshans H. (200 (20099) ) Trends in Biotechnology

Trends in Biotechnology

Drosha+DGCR8

Drosha+DGCR8 (Pasha) (Pasha) : :

cięcie pri-miRNA cięcie pri-miRNA

→ → ^pre-miRNA ^pre-miRNA

EXP5

EXP5 (eksportyna 5) (eksportyna 5) : :

eksport pre-miRNA eksport pre-miRNA do cytoplazmy

do cytoplazmy

Dicer:

cięcie pre-miRNA cięcie pre-miRNA

→ → miRNA/miRNA* miRNA/miRNA*

(19)

19 Biogeneza miRNA u roślin i zwierząt Biogeneza miRNA u roślin i zwierząt

eksport z jądra komórkowego do cytoplazmy eksport z jądra komórkowego do cytoplazmy

MIRTRONY MIRTRONY pri-miRNA pri-miRNA pri-miRNA pri-miRNA

Carthew R. W., Sontheimer E. J.,

Carthew R. W., Sontheimer E. J., (200 (20099) ) CellCell

(20)

20 Mirtrony Mirtrony

występują u

występują u D. melanogaster D. melanogaster, , C. elegans

C. elegans, ssaków , ssaków

powstaja z intronów wyciętych powstaja z intronów wyciętych z pre-mRNA podczas

z pre-mRNA podczas składania mRNA składania mRNA

(splicing) (splicing)

niezależne od Drosha niezależne od Drosha

rozcięcie struktury lariatu rozcięcie struktury lariatu

(debranching) (debranching)

prowadzi do powstania prowadzi do powstania pre-miRNA

pre-miRNA pre-miRNA

pre-miRNA → → biogeneza miRNA biogeneza miRNA

lariat lariat

Kim V. N., Han J., Siomi M.C.

Kim V. N., Han J., Siomi M.C. (2009) (2009) Mol Cell BiolMol Cell Biol

(21)

21 Przykłady genów Przykłady genów regulowanych przez

regulowanych przez miRNA miRNA u roślin u roślin

Wg Wg Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Curr. Opin. Plant Biol. Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Curr. Opin. Plant Biol.

Factors

Factors

Fahlgren, N., Howell, M.D., Kasschau, K.D., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., Law, T.F., Grant, S.R., Dangl, J.L., and Carrington, J.C. (2007) PLoS ONE.

rodzina

rodzina miRNA miRNA rodzina genów regulowanych przez miRNA rodzina genów regulowanych przez miRNA funkcja funkcja

156 czynniki transkrypcyjne SPL Synchronizacja procesów rozwojowych 160 czynniki transkrypcyjne ARF Odpowiedź na auksyny, procesy rozwojowe

165 czynniki transkrypcyjne HD-ZIPIII Rozwój, polaryzacja

172 czynniki transkrypcyjne AP2 Synchronizacja procesów rozwojowych, floral organ identity 390 TAS3 (tasiRNA – regulują ekspresję

czynników transkrypcyjnych ARF) Odpowiedź na auksyny, procesy rozwojowe

395 Transport siarczanów Asymilacja siarki

399 Ubikwitynacja białek Asymilacja fosforu

Blisko połowa spośród genów regulowanych przez miRNA to czynniki transkrypcyjne

Blisko połowa spośród genów

regulowanych przez miRNA to

czynniki transkrypcyjne

(22)

22 miRNA - podsumowanie

Uważa się, że miRNA regulują większość procesów biologicznych zarówno u roślin jak i zwierząt, kontrolując ekspresję specyficznych genów działając in trans

miRNA regulują procesy rozwojowe:

np. u A. thaliana miR156 i miR172 regulują procesy kwitnienia;

u C. elegans wyciszenie lin-14 przez lin-4 jest potrzebne do prawidłowego przez rozwoju

miRNA działają głównie poprzez obniżenie poziomu mRNA (cięcie, degradacja), ale również poprzez inhibicję translacji

DCL

MIR

RNAP

AGO

_AAAn AAAn

RNAP

AAAn

mRNA

AGO AGO

AAAn

(23)

23 ochrona genomu przed „obcym” materiałem ochrona genomu przed „obcym” materiałem genetycznym (exo-siRNA):

genetycznym (exo-siRNA):

transgenicznym transgenicznym wirusowym

wirusowym (VIGS – viral induced gene silencing ( VIGS – viral induced gene silencing ) )

endo-siRNA:

wyciszanie transpozonów i sekwencji wyciszanie transpozonów i sekwencji powtórzonych

powtórzonych

utrzymywanie niektórych genów utrzymywanie niektórych genów

w stanie epigenetycznie nieaktywnym w stanie epigenetycznie nieaktywnym

Lam, E., Kato

Lam, E., Kato^,^, N., and Lawton, M. (2001 N., and Lawton, M. (2001)). . NatureNature

siRNA siRNA

ochrona i utrzymywanie stabilności genomu

(24)

24 Exo-siRNA: wyciszanie transgenów

Transgeny wprowadzane sztucznie są często wyciszane przez siRNA Transgeny wprowadzane sztucznie są często wyciszane przez siRNA Wyciszenie może być wywołane:

Wyciszenie może być wywołane:

• bardzo wysokim poziomem ekspresji transgenu bardzo wysokim poziomem ekspresji transgenu

• dwuniciowym RNA dwuniciowym RNA pochodzącym z ekspresji transgenu pochodzącym z ekspresji transgenu

• nieprawidłowymi RNA pochodzącymi z ekspresji transgenu nieprawidłowymi RNA pochodzącymi z ekspresji transgenu

Transgeny są wyciszane

Transgeny są wyciszane post-trans post-transkrypcyjnie krypcyjnie i i trans transkrypcyjnie krypcyjnie

DCL

AGO _AAAn

AGO

RNA Pol

AGO

(25)

25 Post-transkrypcyjne wyciszanie genów u roślin Post-transkrypcyjne wyciszanie genów u roślin

transgene-induced post-transcriptional silencing t ransgene-induced post-transcriptional silencing

Eksperymenty modyfikacji koloru kwiatów petunii (Petunia hybrida)

- odkrycie mechanizmu wyciszania genów

Martha Hawes, University of Arizona Martha Hawes, University of Arizona

komórka roślinna komórka roślinna

jądro komórkowe

DNA

Agrobacterium

tumefaciens

na powierzchni

komórki roślinnej

(26)

26 Manipulacja ekspresją genu syntazy chalkonowej:

Manipulacja ekspresją genu syntazy chalkonowej:

zmiana pigmentacji kwiatów petunii zmiana pigmentacji kwiatów petunii

Dzikie kwiaty petunii Dzikie kwiaty petunii zawierają

zawierają antocyjaniny antocyjaniny

nadające purpurową nadające purpurową barwę

barwę

syntaza chalkonowa (CHS)

enzym szlaku biosyntezy antocyjanin

syntaza chalkonowa (CHS)

enzym szlaku biosyntezy antocyjanin

Aksamit-Stachurska et al. BMC Biotechnology 2008 Aksamit-Stachurska et al. BMC Biotechnology 2008 Foto: Richard Jorgensen Foto: Richard Jorgensen

antocyjaniny antocyjaniny

CHS CHS

(27)

27 Oczekiwanie

Oczekiwanie – – synteza RNA o prawidłowej synteza RNA o prawidłowej orientacji pogłębi barwę kwiatów

orientacji pogłębi barwę kwiatów ... ...

PRO ORF

gen mRNA

transgen

mRNA translacja

mRNA mRNA

dodatkowa translacja mRNA

konstrukt o orientacji „sens”

(28)

28 … … a synteza RNA o odwróconej orientacji a synteza RNA o odwróconej orientacji zablokuje syntezę barwnika

zablokuje syntezę barwnika

RNA RNA antysensowny antysensowny

transgen tworzenie dupleksów RNA tworzenie dupleksów RNA

„sens-antysens”

„sens-antysens” → → inhibicja inhibicja translacji

translacji

konstrukt o orientacji „sens”

PRO ORF

gen mRNA

transgen

mRNA translacja translacja

mRNA mRNA

dodatkowa translacja dodatkowa translacja mRNA

konstrukt o orientacji „antysens”

(29)

29 Nieoczekiwanie, wprowadzenie zarówno Nieoczekiwanie, wprowadzenie zarówno

konstruktów

konstruktów sens sens jak i jak i antysens antysens prowadzi prowadzi do inhibicji syntezy barwnika

do inhibicji syntezy barwnika

Foto: Richard Jorgensen Foto: Richard Jorgensen

rośliny zawierające transgen

rośliny zawierające transgen CH CH S S

CaMV 35S pro : CHS CaMV 35S pro : CHS sens sens antysens antysens

lub lub

(30)

30 W modyfikowanych roślinach nie dochodzi W modyfikowanych roślinach nie dochodzi do syntezy ani endogennej ani transgenicznej

do syntezy ani endogennej ani transgenicznej CHS CHS

Napoli, C., Lemieux, C., and Jorgensen, R

Napoli, C., Lemieux, C., and Jorgensen, R.. (1990) Plant Cell (1990) Plant Cell

transgeniczny RNA

endogenny RNA

purpurowe kwiaty

białe

kwiaty Zjawisko wyciszania zarówno sztucznie wprowadzonego genu, jak i jego endogennego

odpowiednika nazywamy

kosupresją

Zjawisko wyciszania zarówno sztucznie wprowadzonego genu, jak i jego endogennego

odpowiednika nazywamy

kosupresją

RNase protection

(31)

31 Późniejsze badania wykazały, że Późniejsze badania wykazały, że

kosupresja

kosupresja jest wynikiem produkcji siRNA jest wynikiem produkcji siRNA

De Paoli, E., Dorantes-Acosta, A., Zhai, J.,

De Paoli, E., Dorantes-Acosta, A., Zhai, J., Accerbi, M., Jeong, D.-H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and Green, P.J. (2009). RNAAccerbi, M., Jeong, D.-H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and Green, P.J. (2009). RNA

PRO ORF

typ dziki typ dziki

mRNA

translacja translacja

gen gen

mRNA

konstrukt „sens”

roślina transgeniczna

roślina transgeniczna kosupresja kosupresja

PRO ORF

gen gen mRNA

^AGO ^AAA

A AGO ^AAA^A AGO

produkcja produkcja

siRNA

(32)

32 modyfikacje genetyczne nicienia

modyfikacje genetyczne nicienia Caenorhabditis elegans Caenorhabditis elegans : :

Fire, A. et al., (1998) Nature Fire, A. et al., (1998) Nature

RNA sens RNA sens

RNA RNA antysens

antysens dsRNA ds RNA

bez zmian bez zmian fenotypowych fenotypowych

fenotyp fenotyp twitching twitching

Wprowadzanie do organizmów nicieni C. elegans RNA o prawidłowej lub odwróconej orientacji, oraz dwuniciowych RNA (dsRNA), odpowiadających sekwencji genu unc-22, kodującego miofilamentowe

białko komórek mięśniowych. Wyciszenie unc-22 powoduje fenotyp kurczenia ciała (twitching) Wprowadzanie do organizmów nicieni C. elegans RNA o prawidłowej lub odwróconej orientacji, oraz dwuniciowych RNA (dsRNA), odpowiadających sekwencji genu unc-22, kodującego miofilamentowe

białko komórek mięśniowych. Wyciszenie unc-22 powoduje fenotyp kurczenia ciała (twitching) bez zmian

bez zmian fenotypowych fenotypowych

Exo-siRNA u zwierząt:

dsRNA – najsilniejszy inicjator wyciszania

(33)

33 Exo-siRNA u zwierząt:

Exo-siRNA u zwierząt:

U ssaków i

U ssaków i C. elegans C. elegans – tylko jedno białko – tylko jedno białko Dicer Dicer , odpowiada za biogenezę zarówno siRNA, jak i miRNA , odpowiada za biogenezę zarówno siRNA, jak i miRNA

Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster: : Dcr1 – miRNA Dcr1 – miRNA

Dcr2 – siRNA, Dcr2 – siRNA,

wiązane przez

wiązane przez AGO2 AGO2 obrona przeciwwirusowa obrona przeciwwirusowa

egzogenny dsRNA egzogenny dsRNA wirusowy dsRNA wirusowy dsRNA

cięcie RNA cięcie RNA

obrona przeciwwirusowa obrona przeciwwirusowa

Okamura K. & Lai E.C.

Okamura K. & Lai E.C. (200 (20088) ) Mol Cell BiolMol Cell Biol

(34)

34 AGO1

Większość roślinnych wirusów to wirusy

RNA, których replikacja odbywa się

poprzez dsRNA

wirusowy ssRNA

wirusowy dsRNA wirusowa

polimeraza RNA zależna od RNA

AGO1

dsRNA jest cięty przez DCL DCL4 4 → powstają siRNA które

wiążą się z AGO AGO1 1 → wyciszenie replikacji

wirusa

VIGS - - viral induced gene silencing viral induced gene silencing

mechanizm obrony roślin przed wirusami mechanizm obrony roślin przed wirusami

Wyciszanie ekspresji genów za pośrednictwem siRNA jest ważnym mechanizmem Wyciszanie ekspresji genów za pośrednictwem siRNA jest ważnym mechanizmem

obrony roślin przed patogenami – wirusami i bakteriami obrony roślin przed patogenami – wirusami i bakteriami siRNA

siRNA hamują replikację wirusową hamują replikację wirusową u roślin u roślin (również u zwierząt - Drosophila melanogaster) (również u zwierząt - Drosophila melanogaster) Większość wirusów wytwarza białka supresorowe, hamujące szlak wyciszania

Większość wirusów wytwarza białka supresorowe, hamujące szlak wyciszania

(35)

35

Waterhouse, P.M. and Fusaro, A.F. (2006) Science.

Mutanty biogenezy

Mutanty biogenezy siRNA siRNA są mniej odporne na choroby wirusowesą mniej odporne na choroby wirusowe

WT

WT Arabidopsis Arabidopsis inokulowany inokulowany TRV TRV

Podwójny

Podwójny mutant mutant dcl2-dcl4 dcl2-dcl4 inokulowany

inokulowany TRV TRV Wyciszanie wirusa TRV

Tobacco Rattle Virus (wirus nekrotycznej kędzierzawki tytoniu) w roślinach A. thaliana dzikiego typu zapobiega objawom choroby.

Mutanty dcl są niezdolne do zahamowania infekcji.

Deleris, A., Gallego-Bartolome, J., Bao, J., Kasschau, K., Carrington, J.C., and Voinnet, O. (2006) Science Deleris, A., Gallego-Bartolome, J., Bao, J., Kasschau, K., Carrington, J.C., and Voinnet, O. (2006) Science

Obrona przeciwwirusowa u roślin: głównie na

poziomie wyciszania RNA

TRV: 21-nt (DCL4), 24-nt siRNA (DCL3) TCV (Turnip Crinkle Virus): 22-nt siRNA (DCL2) degradacja wirusowego RNA: 21-nt i 24-nt siRNA

VIGS - - viral induced gene silencing viral induced gene silencing

mechanizm obrony roślin przed wirusami

(36)

36 Małe RNA komplementarne do wirusowego RNA są obecne Małe RNA komplementarne do wirusowego RNA są obecne zarówno w liściach inokulowanych, jak i w młodszych dystalnych zarówno w liściach inokulowanych, jak i w młodszych dystalnych liściach

liściach (ale nie w liściach kontrolnych) (ale nie w liściach kontrolnych)

liść inokulowany liść inokulowany

Infekcja wirusowa powoduje akumulację siRNA Infekcja wirusowa powoduje akumulację siRNA

dni po inokulacji

Northern blot Northern blot

Hamilton, A.J., and Baulcombe, D.C. (1999) Hamilton, A.J., and Baulcombe, D.C. (1999) ScienceScience

liść liść

inokulowany inokulowany liść liść

dystalny dystalny

AGO DCL

liść inokulowany liść inokulowany

siRNA

(37)

37 Efekt wyciszenia jest wzmacniany Efekt wyciszenia jest wzmacniany

przez amplifikację siRNA przez amplifikację siRNA

DC L

2-rzędowy siRNA RdRP

DC L

1-rzędowy siRNA

Wyciszenie może się rozprzestrzeniać poza miejsce infekcji wirusowej dzięki aktywności RdRP (RNA-dependent RNA polymerase) i biogenezie 2-rzędowych siRNA.

RdRP – polimeraza RNA zależna od RNA

RdRP – polimeraza RNA zależna od RNA (RNA-dependent RNA Polymerase) (RNA-dependent RNA Polymerase)

(38)

38 Efekt wyciszenia jest wzmacniany Efekt wyciszenia jest wzmacniany

przez amplifikację siRNA przez amplifikację siRNA

1° 1 ° siRNA siRNA 1° 1 °siRNA siRNA

2° 2 ° siRNA siRNA

Ghildiyal & Zamore

Ghildiyal & Zamore (200 (20099) ) Nat Rev GenetNat Rev Genet

‘

‘primary Argonaute’primary Argonaute’

(39)

39

Sarkies P., Miska E.A. (2014) Nat. Rev. MCB Sarkies P., Miska E.A. (2014) Nat. Rev. MCB

Małe RNA działają ogólnoustrojowo Małe RNA działają ogólnoustrojowo

- u roślin mogą rozprzestrzeniać się poprzez wiązki przewodzące - u roślin mogą rozprzestrzeniać się poprzez wiązki przewodzące

• egzogenne siRNA egzogenne siRNA 21 i 24nt

21 i 24nt (PTGS) – (PTGS) – wyciszanie transgenu GFP wyciszanie transgenu GFP

• endogenne 24nt siRNA endogenne 24nt siRNA

(TGS poprzez przebudowę (TGS poprzez przebudowę chromatyny, pochodzą z chromatyny, pochodzą z transpozonów i innych transpozonów i innych zmetylowanych rejonów zmetylowanych rejonów genomu)

genomu)

• miRNA miRNA (PTGS) (PTGS) inokulowany liść wyciszenie

Voinnet, O., and Baulcombe, D. (1997) Nature Voinnet, O., and Baulcombe, D. (1997) Nature

(40)

40 Endo-siRNA: pochodzenie endogenne

(41)

41 Endo-siRNA u roślin:

Endo-siRNA u roślin:

cis-acting

cis-acting siRNA siRNA

(casiRNA, hc-siRNA) (casiRNA, hc-siRNA)

trans-acting

trans-acting siRNA siRNA

(tasiRNA) (tasiRNA)

natural antisense

natural antisense siRNA siRNA

(natsiRNA)

(42)

42 RNA P IV

RNA P V

modyfikacja modyfikacja

histonów histonów

metylacja metylacja

DNA DNA

Z biogenezą i funkcją hc-siRNA związane są dwie specyficzne dla roślin polimerazy RNA

Ten rodzaj wyciszenia jest często związany ze stale nieaktywnym transkrypcyjnie DNA, włączając rejony centromerowe i transpozony, ale również zachodzi w genach.

Polimeraza RNA IV uczestniczy w biogenezie siRNA

Niekodujące transkrypty

polimerazy RNA V nakierowują maszynerię wyciszającą do odpowiednich sekwencji DNA

=> mechanizm metylacji DNA zależnej od RNA (RNA-directed DNA Methylation, RdDM)

hc-siRNA: roślinne endogenne siRNA

(43)

43 Większość endogennych siRNA powstaje z transpozonów i powtórzeń sekwencji DNA

Kasschau, K.D., Fahlgren, N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., and Carrington, J.C. (2007) PLoS Biol Kasschau, K.D., Fahlgren, N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., and Carrington, J.C. (2007) PLoS Biol

U Arabidopsis thaliana duże zagęszczenie tego typu sekwencji występuje w rejonach

centromerowych chromosomów.

małe RNA małe RNA

t transpo ranspoz zon ony y retrotranspo retrotranspozony zony

Chromosom Chromosom

Centromer Centromer

Wysoko-przepustowe sekwencjonowanie małych RNA (Arabidopsis thaliana)

(44)

44 tasiRNA: roślinne endogenne siRNA

gen TAS

RNA Pol II

AGO

RDR6

transkrypcja locus TAS przez polimerazę RNA II

wiązanie przez miRNA/RISC i cięcie

synteza drugiej nici RNA

przez RDR6 (RNA-dependent RNA polymerase)

tasiRNA –

tasiRNA – trans-acting siRNA trans-acting siRNA

• specyficzne dla roślin specyficzne dla roślin

• kodowane przez geny kodowane przez geny TAS TAS

• obróbka pierwotnego transkryptu obróbka pierwotnego transkryptu jest inicjowana przez

jest inicjowana przez miRNA miRNA

rekrutacja RDR6

dsRNA jest cięty przez DCL4 na serię

krótszych dsRNA, uwalniając wiele

cząsteczek tasiRNA z jednego genu TAS.

(45)

45 Z jednego genu

Z jednego genu TAS TAS powstaje wiele cząsteczek

powstaje wiele cząsteczek tasiRNA tasiRNA

Allen, E., Xie, Z., Gustafson, A M., and Carrington, J.C. (2005) Cell Allen, E., Xie, Z., Gustafson, A M., and Carrington, J.C. (2005) Cell

↑ ↑

miejsce cięcia pierwotnego transkryptu przy

udziale miRNA

kluczowe dla zapewnienia

specyficzności tasiRNA;

DCL4 zaczyna ciąć prekursor dokładnie w tym miejscu i tnie

w odstępach 21nt

tasiRNA mogą powstawać z obu nici RNA

DCL4

DCL4 przesuwa przesuwa się wzdłuż się wzdłuż dsRNA, dsRNA, odmierzając odmierzając

i tnąc

(46)

46 Mutacje rdr6 i zip,

Mutacje rdr6 i zip,

podobnie jak

podobnie jak dcl4 dcl4 i i tas3, tas3,

przyspieszają zmiany przyspieszają zmiany rozwojowe rozwojowe

przyspieszone przejście z fazy juwenilnej przyspieszone przejście z fazy juwenilnej do dorosłej: wydłużone liście, wywinięte do dorosłej: wydłużone liście, wywinięte pod spód brzegi blaszek liściowych pod spód brzegi blaszek liściowych

Zaburzenia biogenezy

Zaburzenia biogenezy tasiRNA tasiRNA

→ → zaburzenia rozwoju zaburzenia rozwoju

Fahlgren, N., Montgomery, T.A., Howell, M.D., Allen, E., Dvorak, S.K., Alexander, A.L., and Carrington, J.C. (2006) Curr. Biol.

mutacja rdr6-15:

brak tasiRNA

zip-1 (AGO7):

brak TAS3 tasiRNA

Northern Northern

Arabidopsis

Arabidopsis – 4 rodziny genów – 4 rodziny genów TAS TAS

• TAS1 TAS1 i i TAS2 TAS2 tasiRNA tasiRNA – PPR – PPR

• TAS3 TAS3 tasiRNA tasiRNA – czynniki transkrypcyjne – czynniki transkrypcyjne ARF ARF

• TAS4 TAS4 tasiRNAs tasiRNAs – – czynniki transkrypcyjne czynniki transkrypcyjne MYB MYB

(47)

47

Wg

Wg Katiyar-Agarwal, S., Morgan, R., Dahlbeck, D., Borsani, O., Villegas Jr. A., Zhu, J.-K., Staskawicz, B.J., and Jin, H. (2006) Katiyar-Agarwal, S., Morgan, R., Dahlbeck, D., Borsani, O., Villegas Jr. A., Zhu, J.-K., Staskawicz, B.J., and Jin, H. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USAProc. Natl. Acad. Sci. USA

natsiRNA n atsiRNA – n – natural atural antisense-transcript derived siRNA antisense-transcript derived siRNA cis-acting

cis-acting

AGO AGO

zachodzące na siebie sekwencje zachodzące na siebie sekwencje

sąsiadujących genów sąsiadujących genów

(związanych z odpowiedzią na stres) (związanych z odpowiedzią na stres)

komplementarne względem komplementarne względem

siebie transkrypty NAT siebie transkrypty NAT

(natural antisense) (natural antisense)

tworzą

tworzą dsRNA dsRNA

wyciszenie wyciszenie

natsiRNA: roślinne endogenne siRNA

biogeneza:

DCL2 i/lub DCL1 DCL2 i/lub DCL1 RDR6

RDR6 ( (polimeraza RNA zależna od RNA polimeraza RNA zależna od RNA) )

SGS3 SGS3 (białko wiążące ( białko wiążące RNA RNA) )

i polimeraza RNA IV i polimeraza RNA IV syntetyzowane w odpowiedzi na stres np. wysokie zasolenie gleby

syntetyzowane w odpowiedzi na stres np. wysokie zasolenie gleby

A. thaliana

A. thaliana: : lsiRNA lsiRNA (long siRNA; 30-40nt ( long siRNA; 30-40nt) )

również powstają z transkryptów NAT,

inne białka uczestniczą w biogenezie

(48)

48 ~25-30 nt, 2’-

~25-30 nt, 2’-O O-metylowane końce 3’ -metylowane końce 3’

występują u zwierząt, zidentyfikowane w liniach występują u zwierząt, zidentyfikowane w liniach komórek rozrodczych

komórek rozrodczych D. melanogaster D. melanogaster wiążą się z białkami PIWI:

wiążą się z białkami PIWI:

Piwi, Aubergine, Ago3 –

Piwi, Aubergine, Ago3 – D. melanogaster D. melanogaster MILI, MIWI, MIWI2 – mysie

MILI, MIWI, MIWI2 – mysie HILI, HIWI1, HIWI2 – ludzkie HILI, HIWI1, HIWI2 – ludzkie

C. elegans – „21U”RNA – 21 nt – wiąże PRG-1

C. elegans – „21U”RNA – 21 nt – wiąże PRG-1 (Piwi-related gene 1) (Piwi-related gene 1)

wyciszanie transpozonów i powtórzeń DNA;

uważa się, że mogą działać na różnych poziomach:

posttranskrypcyjnie – degradacja transkryptu posttranskrypcyjnie – degradacja transkryptu u ssaków

u ssaków metylacja DNA sekwencji transpozonowych metylacja DNA sekwencji transpozonowych

Małe RNA niezależne od Dicer: piRNA

metylacja metylacja końca 3’

końca 3’

(49)

49 pr pr iRNA iRNA – primal small RNAs – primal small RNAs

•

zidentyfikowane u S.pombe zidentyfikowane u S.pombe

•

tworzenie/utrzymywanie heterochromatyny w rejonach tworzenie/utrzymywanie heterochromatyny w rejonach centromerowych

centromerowych

•

Triman: 3’-5’ egzorybonukleaza – obróbka prekursorów priRNA i Triman: 3’-5’ egzorybonukleaza – obróbka prekursorów priRNA i siRNA

siRNA

Małe RNA niezależne od Dicer: priRNA

(50)

50 siRNA - podsumowanie

Szlak siRNA wycisza egzogenny, „obcy” DNA, transpozony oraz sekwencje powtórzone Szlak siRNA wycisza egzogenny, „obcy” DNA, transpozony oraz sekwencje powtórzone siRNA powstają dzięki aktywności białek typu Dicer, które tną dsRNA

siRNA powstają dzięki aktywności białek typu Dicer, które tną dsRNA siRNA

siRNA są wiązane przez białka z rodziny AGO i tworzą kompleksy wyciszające (RISC) są wiązane przez białka z rodziny AGO i tworzą kompleksy wyciszające (RISC) Kompleksy wyciszające mogą działać posttranskrypcyjnie, poprzez cięcie mRNA lub Kompleksy wyciszające mogą działać posttranskrypcyjnie, poprzez cięcie mRNA lub

inhibicję translacji inhibicję translacji

Kompleksy wyciszające mogą zmieniać strukturę chromatyny poprzez metylację DNA Kompleksy wyciszające mogą zmieniać strukturę chromatyny poprzez metylację DNA

lub modyfikację białek histonowych – transkrypcyjne wyciszanie ekspresji lub modyfikację białek histonowych – transkrypcyjne wyciszanie ekspresji

DCL

AGO _AAAn

AGO

RNA Pol

AGO

(51)

51 O N

NH

2

N

~

O N

N NH

2

~

CH3

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS)

małe

małe RNA RNA mogą hamować transkrypcję określonych genów (wyciszać DNA) za pośrednictwem mogą hamować transkrypcję określonych genów (wyciszać DNA) za pośrednictwem enzymów metylujących cytozyny w DNA lub modyfikujących białka histonowe

enzymów metylujących cytozyny w DNA lub modyfikujących białka histonowe

transkrypcja transkrypcja

DNA DNA

białka białka histonowe histonowe

wyciszenie wyciszenie

EPIGENETYCZNA REGULACJA EKSPRESJI GENÓW EPIGENETYCZNA REGULACJA EKSPRESJI GENÓW

metylacja metylacja

DNA DNA

AGO metylotransferaza

DNA

modyfikacja modyfikacja

histonów histonów

przebudowa

chromatyny

(52)

52 Co oznacza

Co oznacza “epigenet “epigenet yczna yczna ”? ”?

Dosłownie, słowo „epigenetyka”

oznacza „powyżej genetyki”

Jest to informacja pozagenowa, nie Jest to informacja pozagenowa, nie dotycząca samej sekwencji, ale dotycząca samej sekwencji, ale kowalencyjnych modyfikacji DNA i kowalencyjnych modyfikacji DNA i zmian struktury chromatyny

zmian struktury chromatyny

W praktyce, epigenetyka opisuje

zjawiska, dzięki którym w identycznych genetycznie komórkach lub

organizmach dochodzi do różnego sposobu ekspresji genów czego efektem są różnice fenotypowe.

komórki komórki (organizmy) (organizmy) identyczne identyczne genetycznie genetycznie

Różne epigenetyczne modyfikacje prowadzą do różnych wzorów

ekspresji genów

różne różne fenotypy fenotypy

Epigen

Epigenetyczna regulacja ekspresji genów etyczna regulacja ekspresji genów = zmiana ekspresji genu, = zmiana ekspresji genu, która zachodzi bez zmiany sekwencji DNA

która zachodzi bez zmiany sekwencji DNA

(53)

53 DNA DNA

struktury 2 struktury 2° °

nukleosomy nukleosomy struktury 2 struktury 2° °

maksymalnie maksymalnie upakowane upakowane

(np. włókno 30nm) (np. włókno 30nm)

struktury 3 struktury 3° °

(oddziaływania między (oddziaływania między włóknami chromatyny) włóknami chromatyny)

Caterino & Hayes

Caterino & Hayes (2007) (2007) NatureNature

H2A

H2B

H3 H4

Struktura chromatyny ~147 bp DNA jest

„owinięty” wokół oktameru białek histonowych: : 2x 2 x H2A H2A

H2B H2B H3 H3 H4 H4

+ 50bp DNA łącznikowego + 50bp DNA łącznikowego + histon H1

+ histon H1

(54)

54 h h eterochromatyna eterochromat yna

• konstytutywna konstytutywna

stale obecna w komórce, stale obecna w komórce, nie zawiera genów

nie zawiera genów

(obszary centromerów i telomerów) (obszary centromerów i telomerów)

• fakultatywna fakultatywna

pojawia się w jądrze

pojawia się w jądrze okresowo okresowo i tylko w niektórych komórkach, i tylko w niektórych komórkach, prawdopodobnie zawiera geny prawdopodobnie zawiera geny nieaktywne w czasie

nieaktywne w czasie niektórych faz niektórych faz cyklu komórkowego

cyklu komórkowego

euchromat e uchromatyna yna

luźno upakowana forma luźno upakowana forma

chromatyny, zawierająca geny chromatyny, zawierająca geny aktywne transkrypcyjnie

aktywne transkrypcyjnie

CENTROMER CENTROMER

W mitozie cały DNA występuje W mitozie cały DNA występuje

jako heterochromatyna jako heterochromatyna

Struktura chromatyny

(55)

55 DNA DNA

chromatyna chromatyna

histony histony

metylacja DNA

metylacja DNA potranslacyjne potranslacyjne modyfikacje histonów modyfikacje histonów

przebudowa przebudowa chromatyny chromatyny zależna od ATP

zależna od ATP warianty warianty histonów

histonów ncRNA ncRNA

Dulac C.

Dulac C. (20 (201010) ) NatureNature

Epigenetyczne mechanizmy

regulacji ekspresji genów