• Nie Znaleziono Wyników

Odpowiedź fibroblastów na obecność biofilmów tworzonych przez patogeny izolowane z przewlekłych owrzodzeń żylnych

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2023

Share "Odpowiedź fibroblastów na obecność biofilmów tworzonych przez patogeny izolowane z przewlekłych owrzodzeń żylnych"

Copied!
21
0
0

Pełen tekst

(1)

Rozprawa doktorska

“Odpowiedź fibroblastów na obecność biofilmów tworzonych przez patogeny izolowane z przewlekłych owrzodzeń żylnych

mgr inż. Joanna Czajkowska

Promotor pracy doktorskiej: dr hab. Agata Markowska-Szczupak, prof. ZUT Promotor pomocniczy pracy doktorskiej: dr hab. Adam Feliks Junka, prof. UMW

Streszczenie

Ostatnie kilkadziesiąt lat to okres bardzo intensywnych przemian cywilizacyjnych, prowadzących m.in. do licznych zmian społecznych i zmian stylu życia. Starzenie się społeczeństwa i rosnąca liczba osób cierpiących na takie choroby, jak cukrzyca i choroby układu krążenia, korelują z rosnącą liczbą przypadków ran przewlekłych, takich jak zespół stopy cukrzycowej, owrzodzenia żylne i odleżyny. Z tego względu rany przewlekłe stanowią istotny problem dla światowych systemów opieki zdrowotnej. Rana przewlekła jest definiowana jako rana, w której występuje stan zapalny i która nie ulega prawidłowemu procesowi gojenia w określonym czasie. Kluczową przyczyną przejścia ran w stan przewlekły jest ich kontaminacja, a następnie kolonizacja przez mikroorganizmy żyjące w formie biofilmu. Ze względu na szereg swoich wyjątkowych cech, biofilm cechuje się wysoką odpornością, zarówno na odpowiedź układu immunologicznego, jak i środki przeciwdrobnoustrojowe. Ponadto rozpoznanie infekcji bakteryjnych, a w szczególności takich w których obecny jest biofilm, jest zadaniem bardzo trudnym. Wynika to między innymi z ograniczeń jakie niosą obecnie dostępne narzędzia diagnostyczne. Dało to asumpt do podjęcia badań mogących stanowić punkt wyjścia do opracowania i wdrożenia skutecznej, i nieinwazyjnej metody diagnostyki infekcji rany przewlekłej.

Głównym celem rozprawy doktorskiej była analiza metabolomiczna i genetyczna infekcji wywoływanej przez biofilmy drobnoustrojów, izolowanych z przewlekłych owrzodzeń żylnych goleni oraz poszukiwanie biomarkerów infekcji w oparciu o model in vitro. Badania przeprowadzono dla trzech szczepów wzorcowych mikroorganizmów:

gronkowca złocistego Staphylococcus aureus, pałeczki okrężnicy Escherichia coli oraz drożdżaka Candida albicans. Jako model infekcji rany przewlekłej wykorzystano linię komórkową prawidłowej tkanki łącznej L929.

W pierwszym etapie badań przeanalizowano proces tworzenia biofilmu in vitro przez badane szczepy mikroorganizmów z zastosowaniem metod mikrobiologii klasycznej, mikroskopii konfokalnej i skaningowej mikroskopii elektronowej. Opracowano również

(2)

autorską metodę kohodowli komórek prawidłowych z biofilmami drobnoustrojowymi.

Określono wpływ drobnoustrojów na żywotność fibroblastów i zidentyfikowano krytyczne punkty infekcji tzw. punkty krytycznej kolonizacji. Na podstawie uzyskanych wyników wskazano moment w którym powinno się wykonywać analizy zmian metabolicznych, indukowanych poprzez interakcję gospodarz–patogen. Dowiedziono, że proces tworzenia biofilmów w warunkach, odzwierciedlających środowisko rany przewlekłej, powoduje wysoką zmienność metaboliczną. Badania przeprowadzone z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), pozwoliły na wyróżnienie metabolitów występujących w podwyższonym stężeniu w czasie krytycznej kolonizacji monowarstwy fibroblastów przez badane patogeny. Przeprowadzona analiza genów związanych z rozwojem biofilmu pozwoliła dowieść, że interakcja komórek drobnoustrojów z fibroblastami prowadzi do aktywacji szlaków sygnałowych, odpowiedzialnych za tworzenie biofilmów w ranach.

Zaproponowany, uproszczony model rany, umożliwił identyfikację metabolitów wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych charakterystycznych dla zakażenia fibroblastów różnymi rodzajami patogenów. Otrzymane rezultaty badań wnoszą wkład, nie tylko w znajomość patomechanizmu tworzenia biofilmów w ranach przewlekłych, ale mogą przyczynić się do wdrożenia nowatorskiej metody prognostyki przewlekłych owrzodzeń żylnych goleni.

Słowa kluczowe: rany przewlekłe, biofilmy bakteryjne, fibroblasty, metabolomika,

(3)
(4)

Doctoral dissertation

“The fibroblast response to the presence of biofilms formed by pathogens isolated from the chronic venous ulcers”

MSc. Eng

. Joanna Czajkowska

PhD thesis supervisor: Associate Professor Agata Markowska-Szczupak, PhD Eng. (West Pomeranian University of Technology in Szczecin)

Associate PhD thesis supervisor: Associate Professor Adam Feliks Junka, PhD (Wroclaw Medical University)

Abstract

The last few decades have been a period of very intense civilization transformation leading, among others, to numerous social and lifestyle changes. The aging of society and increasing number of people suffering from such diseases as diabetes and cardiovascular diseases correlate with increasing number of chronic wound cases, such as diabetic foot syndrome, venous and venous ulcers. Therefore, chronic wounds are a distinctively arising problem for global healthcare systems. A chronic wound is defined as a wound that is inflamed and that fails to proceed through the normal phases of wound healing in an orderly and timely manner. A key reason for the transition of wounds into a chronic state is their contamination, followed by colonization by microorganisms living in a biofilm form.

Biofilms due to a number of its unique features, is highly resistant to both the immune system and the use of antimicrobial agents and difficult to diagnose. Moreover, the diagnosis of bacterial infections, especially those caused by biofilm, is difficult. It is due in part by the limitations of currently available diagnostic tools. It has given rise to research that may provide a starting point for the development and implementation of an effective, non-invasive method of diagnosing chronic wound infection.

The main aim of the doctoral dissertation was metabolomic and genetic analysis of the infection caused by microbial biofilms, isolated from chronic venous leg ulcers and search for infection biomarkers based on an in vitro model. The research was carried out on three reference strains: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and Candida albicans. The L929 normal connective tissue cell line was used as a model of chronic wound infection. In the first stage of the study, the process of biofilm formation in vitro by the above-mentioned strains was analyzed using the methods of classical microbiology, confocal microscopy, and scanning electron microscopy. A original method of co-culturing normal cells with microbial biofilms has been developed. The influence of microorganisms on the viability of fibroblasts

(5)

and the critical points of infection - the so-called critical colonization points were determined.

Based on the obtained results, the point at which the analysis of metabolic changes induced by the host-pathogen interaction should be performed was indicated. The analysis of the biofilm formation process under conditions reflecting some of the parameters present in the chronic wound showed its high metabolic variability. The research carried out by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allowed us to distinguish the metabolites present in increased concentration during the critical colonization of the fibroblast monolayer by the studied pathogens. The analysis of genes related to biofilm formation showed that the interaction of microbial cells with fibroblasts leads to the activation of signaling pathways responsible for the development of biofilm in wounds. The proposed, simplified wound model led to distinguishing several intracellular and extracellular metabolites characteristic of fibroblast infection with a given type of pathogen. The obtained research results contribute not only to the knowledge of the pathomechanism of biofilm formation in chronic wounds but may contribute to the implementation of an innovative method of prognosis of chronic venous leg ulcers.

Keywords: chronic wounds, bacterial biofilms, fibroblasts, metabolomics

(6)

1 dr hab. n. med. Bartosz Kubisa

Oddział Kliniczny Torakochirurgii Kliniki Kardiochirurgii

Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego

recenzent rozprawy doktorskiej Joanny Czajkowskiej

zgodnie z pismem od Dziekana Wydziału Technologii i Inżynierii Chemicznej Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie

WTiICh/A/111/2022 z dnia 08.07.2022r

Warszawa, 03.08.2022r.

Recenzja rozprawy doktorskiej Pani Joanny Czajkowskiej pt.: „Odpowiedź fibroblastów na obecność biofilmów tworzonych przez patogeny izolowane z przewlekłych owrzodzeń żylnych”

Współcześnie coraz więcej ludzi dożywa sędziwszego wieku, co powoduje wzrost częstotliwości chorób cywilizacyjnych, takich jak choroby układu krążenia, cukrzyca i otyłość.

Sprzyja to komplikacjom i wydłużeniu się czasu gojenia ran przewlekłych (odleżyny, owrzodzenia żylne i stopa cukrzycowa) występujących w tej grupie pacjentów. Istnieje zatem potrzeba znalezienia nowych metod diagnostyki i leczenia tych schorzeń. W tej pracy analizowano metabolomikę i genetykę drobnoustrojów tworzących biofilmy w przewlekłych owrzodzeniach żylnych goleni oraz poszukiwano biomarkerów infekcji w oparciu o model in vitro.

Jest mi miło oceniać pracę z perspektywy lekarza klinicysty – chirurga na co dzień zajmującego się między innymi leczeniem ran pooperacyjnych – jednak innych niż modelowe, opisywane w niniejszej rozprawie doktorskiej owrzodzenie żylne podudzia. W swojej recenzji

(7)

2

skupię się bardziej na aspektach medycznych zagadnienia, a siłą rzeczy mniej na technikaliach badania, patrząc na ten problem z innej perspektywy.

Dostępna literatura naukowa podkreśla brak pełnej wiedzy na temat procesów biologicznych zachodzących w ranie przewlekłej, których poznanie jest konieczne do opracowania diagnostyki oraz terapii leczniczych. Jednym z kluczowych czynników negatywnie wpływającym na stan rany i podnoszącym ryzyko jej przejścia w stan przewlekły jest obecność drobnoustrojów. W ranie rozwijają się one w formie biofilmów, czyli złożonych i dobrze zorganizowanych społeczności, które są oporne na eradykację standardowo dostępnymi metodami oraz trudne (we wczesnym etapie rozwoju) do wykrycia technikami diagnostycznymi.

Chociaż w czasie ostatniej dekady dość dobrze opisano właściwości biofilmów rozwijających się w warunkach laboratoryjnych, to niewiele wiadomo o ich metabolizmie i zmienności adaptacyjnej zachodzących w środowisku rany przewlekłej. Dało to asumpt do podjęcia badań mogących stanowić punkt wyjścia do opracowania i wdrożenia skutecznej, nieinwazyjnej metody diagnostyki infekcji rany przewlekłej.

Ostatnie postępy w technologiach metabolomicznych prowadzą do rosnącej liczby zastosowań biomedycznych. W szczególności metabolomika jest coraz częściej wykorzystywana do diagnozowania chorób i poznawania ich mechanizmów, identyfikowania nowych celów leków, dostosowywania terapii i monitorowania wyników terapeutycznych, co może się przyczynić do wieloaspektowej poprawy jakości życia pacjentów. Głównym ograniczeniem analityki metabolomicznej jest brak możliwości scharakteryzowania całego fenotypu drobnoustrojów. Dlatego wydaje się, że przyszłe cele metabolomiczne będą obejmować rozwój bardziej kompleksowych platform analitycznych oraz integrację danych metabolomicznych otrzymanych z wykorzystaniem różnych narzędzi badawczych. Nowatorskie lub/oraz zintegrowane techniki analityczne, takie jak obrazowanie metabolitów, algorytmy statystyczne i obliczeniowe, są pilnie potrzebne by uczynić z metabolomiki stałe narzędzie użyteczności klinicznej. Nasza wiedza, na temat profilu metabolicznego ran przewlekłych i jego roli w procesach gojenia, jest ograniczona, ponieważ metabolom procesu gojenia się ran nie został jak do tej pory zbadany. Wiadomo jednak, że zrozumienie związku między różnymi zbiorowiskami drobnoustrojów w ranie a ostatecznym wynikiem gojenia się rany umożliwi manipulowanie mikrobiomem w stanach chorobowych za pomocą terapii celowanej. Aby ułatwić wdrożenie

(8)

3

nowych biomarkerów, w tym markerów metabolicznych, w postępowaniu klinicznym niezbędne staje się przeprowadzenie badań na dużą skalę z zastosowaniem solidnych kryteriów walidacji oraz zrozumienie interakcji między wszystkimi czynnikami biologicznymi (genami, transkryptami, białkami i metabolitami). Podążając tą ścieżką badawczą zaproponowano przeprowadzenie badań metabolomicznych i genetycznych w środowisku odzwierciedlającym warunki w zainfekowanej ranie przewlekłej. Otrzymane rezultaty badań wniosą wkład w znajomość patomechanizmu tworzenia biofilmu w ranach przewlekłych, co może się przyczynić do wdrożenia nowatorskiej, przystępnej kosztowo, metody diagnostyki ran przewlekłych.

W związku z powyższym, po zapoznaniu się z rozprawą doktorską Pani Joanny Czajkowskiej przedstawiam pozytywną recenzję, która obejmuje obszary i uwzględnia kryteria oceny wskazane w ustawie o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz rozporządzeniu w sprawie szczegółowego trybu i warunkach przeprowadzania czynności w przewodach doktorskich, w postępowaniu habilitacyjnym oraz postepowaniu o nadanie tytułu profesora.

Rozprawa doktorska spełnia warunki określone w art. 13 ust. 1 ustawy z dnia 14 marca 2003r o stopniach naukowych i tytule naukowym o raz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. Nr 65, poz 595, z późn. zm).

Rozprawa doktorska – doktorat wdrożeniowy - została przygotowana na Wydziale Technologii i Inżynierii Chemicznej Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie. Promotorem pracy jest Pani dr hab. inż. Agata Markowska-Szczupak, a promotorem pomocniczym Pan dr hab. Adam Feliks Junka.

Ocena rozprawy doktorskiej w zakresie wstępu, celów, materiału i metody 1. Bardzo dobry wstęp, właściwe przedstawienie tła pracy badawczej.

2. Bogaty materiał badawczy stanowiły trzy szczepy wzorcowe mikroorganizmów: bakterii gronkowca złocistego Staphylococcus aureus (SA), pałeczki okrężnicy Escherichia coli oraz drożdżaka bielnika białego Candida albicans w oparciu o model infekcji rany przewlekłej linii komórkowej tkanki łącznej mysich fibroblastów L929. Praca polegała na

(9)

4

inokulacji kultur fibroblastów tymi trzema patogenami na odpowiednich – precyzyjnie dobranych podłożach i obserwacji ich rozwoju w okresie 24 godzin dla bakterii oraz 96 godzin dla drożdżaka. Obserwowano dwie fazy hodowli: fazę wzrostu i fazę stacjonarną.

Fazy zamierania nie obserwowano ze względu na czas hodowli – prawdopodobnie faza zamierania występuje po czasie odpowiednio 24 i 96 godzin.

Doktorantka postawiła sobie 7 celów pracy doktorskiej:

1. Przeanalizowanie procesu tworzenia biofilmu in vitro metodami mikrobiologii klasycznej, mikroskopii konfokalnej i skaningowej mikroskopii elektronowej trzech wspomnianych wyżej patogenów: dwóch bakteryjnych i jednego drożdżaka.

2. Opracowanie kohodowli fibroblastów z 3 patogenami – co jest modelem infekcji rany przewlekłej.

3. Ocena wpływu patogenów na żywotność fibroblastów – jaki jest punkt krytyczny kolonizacji.

4. Ocena zmian metabolicznych w czasie interakcji gospodarz-patogen, jakie towarzyszą temu metabolity wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe.

5. Ocena ekspresji genów w czasie tworzenia biofilmu przez patogeny.

6. Ocena ekspresji genów apoptozy w fibroblastach w odpowiedzi na infekcję.

7. Identyfikacja biomarkerów przewlekłych owrzodzeń żylnych goleni.

Ocena rozprawy doktorskiej w zakresie wyników, wniosków i dyskusji

1. Przejściu z fazy wzrostu drobnoustrojów w biofilmie w fazę stacjonarną towarzyszy spadek aktywności metabolicznej- co doktorantka udowodniła w swoim badaniu.

2. Określono in vitro punkty krytyczne kolonizacji, czyli moment rozpoczęcia szkodliwego działania patogenu na leczenie rany. Wynosił on odpowiednio 12 godzin dla SA, 16 godzin dla E. coli oraz 24 godz. dla C. albicans. Po tym czasie można wnioskować, że in vivo biofilm tych patogenów zaczyna być odporny na próby leczenia. Doktorantka sugeruje, że ze względu na inne siły obronne organizmu in vivo te czasy mogą być dłuższe.

(10)

5

3. Wykazano metabolity charakterystyczne dla rozwoju biofilmu SA – dimetyloamina, w odróżnieniu od metabolitu fibroblastów – kwas izowalerianowy.

4. Metabolit charakterystyczny dla E. coli: octan oraz kwas aminomasłowy.

5. Metabolity dla C. albicans to kwas 4-hydroksybenzoesowy oraz kwas nikotynowy.

6. Należy uznać, że osiągnięcie stanu stacjonarnego w ranie, czyli braku przyrostu drobnoustrojów oraz spadku stężenia ich metabolitów – czyli osiągnięcie dojrzałości przez biofilm - jest z punktu widzenia klinicznego okresem, kiedy leczenie antyseptykami oraz lekami przeciwzakaźnymi (bakterio- i grzybobójczymi) przestaje przynosić efekty, a wtedy ratunkiem in vivo mogło by być chirurgiczne opracowanie rany.

Doktorantka sformułowała 9 wniosków, z czego wnioski 3-6 stanowią wnioski stricte naukowe, natomiast wnioski 1-2 oraz 7-9 stanowią raczej komentarz do tej pracy badawczej.

Najciekawsze wydaje się być określenie punktów krytycznych poszczególnych hodowli, określenie metabolitów – markerów zakażenia rany, określenie genów odpowiedzialnych za apoptozę ulegających zwiększonej ekspresji oraz określenie genów kodujących białka odpowiedzialne za tworzenie biofilmów ustrojowych.

Ocena rozprawy doktorskiej – inne aspekty.

1. W pracy umieszczono 11 tabel oraz aż 77 rysunków. Tabele i ryciny (rysunki) dobrze ilustrują treść pracy i są przydatne przy czytaniu i zrozumieniu tekstu pracy. Pouczająca jest zwłaszcza Tabela 2, gdzie porównano zastosowanie, wady, zalety oraz czułość i specyficzność technik badania infekcji ran przewlekłych. Z przedstawionych 6 technik dwie wydają się najbardziej czułe i specyficzne: tomografia komputerowa oraz rezonans magnetyczny – co w opinii recenzenta zbiega się to z praktyką kliniczną.

2. Dyskusja (Omówienie wyników) została starannie przeprowadzona.

3. Rozległe piśmiennictwo jest cytowane prawidłowo, dobór literatury, umiejętności w korzystaniu z niej oraz wykorzystanie źródeł poprawne.

7. Podjęta problematyka badawcza jest oryginalna i niesie ze sobą wartości praktyczne, ponieważ wnoszą wkład nie tylko w znajomość mechanizmu tworzenia biofilmów w

(11)

6

ranach przewlekłych, ale mogą przyczynić się do wdrożenia nowatorskiej metody prognostyki przewlekłych owrzodzeń żylnych goleni.

4. Nie znajduję w tej pracy poważniejszych błędów formalno-językowych, stylistycznych, czy interpunkcyjnych. Moje pytania do doktorantki, to co miała na myśli pisząc o zakażeniu protez płuc na stronie 27 – czy chodziło o respiratory? Czy na stronie 27 nie powinien być użyty skrót TIMERS zamiast TIMES?

5. Metody badawcze są trafne oraz umiejętnie zastosowane.

6. Układ pracy jest poprawny, a struktura podziału treści nadzwyczaj rozwinięta.

(12)

Dr hab. inż. Marek Ochowiak, prof. uczelni WYDZIAŁ TECHNOLOGII CHEMICZNEJ Instytut Technologii i Inżynierii Chemicznej

ul. Berdychowo 4, 61-131 Poznań, tel. +48 61 665 2789 e-mail: marek.ochowiak@put.poznan.pl, www.put.poznan.pl

Poznao, 28 lipca 2022 roku

RECENZJA

rozprawy doktorskiej Pani mgr inż. Joanny Czajkowskiej

pt. „Odpowiedź fibroblastów na obecnośd biofilmów tworzonych przez patogeny izolowane z przewlekłych owrzodzeo żylnych”.

Podstawą prawną sporządzenia niniejszej recenzji jest pismo Pana Prof. dr hab. inż.

Rafała Rakoczego – dziekana Wydziału Technologii i Inżynierii Chemicznej Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie, z dnia 8 lipca 2022 roku informujące o powołaniu przez Senat Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie mojej osoby na recenzenta rozprawy doktorskiej Pani mgr inż. Joanny Czajkowskiej.

Doktorat wdrożeniowy to program Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego, obecnie Ministerstwa Edukacji i Nauki, uruchomiony w 2017 roku prowadzący do uzyskania stopnia doktora poprzez przygotowanie rozprawy doktorskiej, łączącej zarówno teoretyczny jak i praktyczny wymiar badao. Program Doktoratu Wdrożeniowego realizowany jest poprzez prowadzenie w ramach szkół doktorskich kształcenia doktorantów we współpracy z zatrudniającymi ich przedsiębiorcami albo innymi podmiotami. Daje on zatem możliwośd uzyskania stopnia naukowego osobom, które jednocześnie chcą w pełni kontynuowad pracę zawodową poza uczelnią. Stanowi zatem swoistego rodzaju pomost pomiędzy karierą w nauce i biznesie. Jest to zarazem szansa na wdrożenie i komercjalizację otrzymanych wyników badao, dedykowanych dla konkretnego podmiotu czy branży. Przygotowywane w jego ramach dysertacje stanowią nie tylko oryginalne rozwiązanie problemu naukowego, ale także podstawę zastosowania będącego jego wynikiem wdrożenia w praktyce gospodarczej. Przedłożona do recenzji rozprawa doktorska została wykonana w ramach I edycji projektu Doktorat Wdrożeniowy finansowanego ze środków Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego (nr 29/DW/2017). Praca doktorska wykonana została pod kierunkiem promotora dr hab. inż. Agaty Markowskiej-Szczupak, prof. ZUT oraz promotora pomocniczego dra hab. Adama Feliksa Junki, prof. UMW.

(13)

str. 2

1. Treśd i zakres rozprawy

Rany przewlekłe definiuje się jako rany, które nie przechodzą przez fazy gojenia w sposób uporządkowany i terminowy. Rany przewlekłe stanowią duże obciążenie, zarówno dla pacjenta, jak i dla systemu opieki zdrowotnej. Są one nie tylko przyczyną obniżenia jakości życia osoby chorej, ale w skrajnych przypadkach mogą prowadzid do amputacji kooczyn, a nawet zgonu. Z danych literaturowych wynika, że rany przewlekłe występują u 2,21 na 1000 osób, a częstośd występowania ran przewlekłych nóg występują u 1,51 na 1000 osób. Najbardziej narażone na ich występowanie są osoby w wieku podeszłym, ponieważ wskutek procesu starzenia się organizmu dochodzi do upośledzenia procesu gojenia się ran. Jednym z głównych czynników prowadzących do opóźnienia procesu gojenia rany jest rozwój biofilmu drobnoustrojów, które kolonizują ranę, ale mogą również wywoład infekcję ogólnoustrojową.

Leczenie ran przewlekłych jest trudne i należy zastosowad metodę holistyczną zakładającą, że leczyd należy zarówno ciało, jak i duszę pacjenta, zaś poprawa w jednym obszarze życia przynosi również poprawę w innych obszarach. Personel medyczny zajmujący się pacjentem z raną przewlekłą musi posiadad umiejętności praktyczne, kompetencje oraz przede wszystkim wiedzę w tej dziedzinie.

W nawiązaniu do powyższego uznano, że bardzo ważne jest przeprowadzenie badao infekcji wywoływanej przez biofilmy drobnoustrojów oraz poszukiwanie biomarkerów infekcji w oparciu o model in vitro. Niniejsze badania są w szczególności próbą lepszego poznania opisanych w pracy infekcji oraz opracowanie wdrożenia pozwalającego na szybką diagnostykę owrzodzeo, które przyczynid się może do poprawy jakości życia pacjentów. Praca doktorska Pani mgr inż. Joanny Czajkowskiej już na pierwszy rzut oka robi dobre wrażenie, jest ciekawa, dobrze napisana i zredagowana, ma klasyczny i przejrzysty układ, zawiera bogatą literaturę przedmiotu, głównie pochodzącą z ostatnich lat.

Celem rozprawy doktorskiej była analiza metabolomiczna i genetyczna infekcji wywoływanej przez biofilmy drobnoustrojów izolowanych z przewlekłych owrzodzeo żylnych goleni oraz poszukiwanie biomarkerów infekcji w oparciu o model in vitro. Szczegółowe cele badawcze obejmowały:

 Analizę procesu tworzenia biofilmu w warunkach in vitro przez trzy szczepy patogenne drobnoustrojów Staphylococcus aureus, Escherichia coli oraz Candida albicans w oparciu o metody mikrobiologii klasycznej, mikroskopii konfokalnej oraz mikroskopii SEM;

 Opracowanie metody kohodowli komórek prawidłowych fibroblastów tkanki łącznej L929 z badanymi patogenami, stanowiącej model infekcji rany przewlekłej in vitro;

 Analizę wpływu patogenów na żywotnośd fibroblastów oraz określenie kluczowego punktu infekcji tzw. punktu krytycznej kolonizacji;

 Analizę zmian metabolicznych indukowanych poprzez interakcję gospodarz-patogen, obejmującą badanie metabolitów zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych, wydzielanych w czasie infekcji in vitro;

 Analizę zmian w ekspresji genów zaangażowanych w proces tworzenia biofilmu przez poszczególne patogeny oraz ekspresji genów odpowiedzialnych za przebieg procesu

(14)

str. 3

apoptozy w komórkach fibroblastów w odpowiedzi na obecnośd patogenów izolowanych z przewlekłych owrzodzeo żylnych goleni;

 Przygotowanie wdrożenia biomarkera/biomarkerów pozwalających na szybką diagnostykę przewlekłych owrzodzeo żylnych goleni.

Wyróżniającymi się ośrodkami badawczymi zajmującymi się tym zagadnieniem są z całą pewnością Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny oraz Uniwersytet Medyczny im.

Piastów Śląskich we Wrocławiu. Autorka opiniowanej rozprawy postawiła sobie ambitne zadanie przeprowadzid kompleksową analizę metabolomiczną i genetyczną infekcji wywoływanej przez wspomniane wcześniej biofilmy oraz poszukiwanie biomarkerów infekcji.

Wymagało to zaplanowania i zrealizowania obszernego programu badawczego obejmującego zastosowanie wielu nowoczesnych metod badawczych. W mojej ocenie najtrudniejszym etapem było wyeksponowanie praktycznego aspektu badao tj. przygotowanie wdrożenia.

Przedstawiona rozprawa doktorska dotyczy ważnej, ze względów poznawczych i praktycznych, problematyki ran przewlekłych, infekcji, owrzodzeo. Obecnie, bardzo szerokim spektrum nauki w ramach nowoczesnych rozwiązao materiałowych jest poszukiwanie nowych biomarkerów (markery fizjologiczne – ocena przepływu i wartości pH krwi, stężenie tlenu tkankowego, wyniki durometryczne, ekstensometryczne i ultrasonograficzne, markery tkankowe – stopieo infekcji rany oraz poziom epitelializacji) oraz biodegradowalnych i aktywnych opatrunków. Aktualnie personel medyczny ma bardzo ograniczony dostęp do metod umożliwiających szybką, niezawodną i tanią identyfikację, zarówno mikroorganizmów, jak i formy w jakiej one występują w ranie. Prawidłowe rozpoznanie czynników infekcji mogłoby by się przyczynid do zatrzymania rozwoju zakażenia, bez poważnych konsekwencji dla zdrowia i życia pacjenta.

Rozprawa doktorska powinna stanowid oryginalne rozwiązanie zagadnienia naukowego oraz powinna wykazywad ogólną wiedzę teoretyczną Autora w danej dziedzinie jak i umiejętności samodzielnego prowadzenia pracy naukowej. Dodatkowo należy wziąd pod uwagę charakter projektu Doktorat Wdrożeniowy, w ramach którego niniejsza rozprawa została przygotowana. Uważam, że najważniejsze wymogi spełnia zarówno recenzowana praca, jak i Kandydatka na doktora. Rozprawa ma charakter pracy metodologicznej ukierunkowanej na opracowanie nowego systemu opartego na technice spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) do identyfikacji metabolitów, które mogłyby zostad implementowane jako markery, związanej z obecnością biofilmu infekcji ran.

Rozprawa została przedstawiona w postaci 204 stronnicowej monografii. Przedstawioną do recenzji pracę, składającą się z 5 rozdziałów, podzielid można na dwie zasadnicze części:

częśd teoretyczną (rozdział 1) oraz częśd doświadczalną (rozdziały 2 – 5). Całośd poprzedza wykaz ważniejszych stosowanych symboli i akronimów oraz krótkie wprowadzenie. Kooczą natomiast streszczenie pracy w językach polskim i angielskim oraz wykaz cytowanego piśmiennictwa. Autorka zamieściła ponadto w rozprawie swój dorobek naukowy. Praca zawiera również wykaz tabel i rysunków. Tytuł rozprawy oddaje w pełni jej zawartośd. Niespełna dwustronicowy wstęp oraz sformułowane hipotezy badawcze wprowadzają czytelnika w

(15)

str. 4

analizowane zagadnienia i w sposób bardzo jasny przedstawiają koniecznośd podjęcia proponowanych przez Autorkę badao. Częśd teoretyczna przedstawia studia literaturowe dotyczące analizowanego zagadnienia. Opisano w niej rany przewlekłe, tworzenie biofilmów oraz diagnostykę i zwalczanie infekcji ran przewlekłych. Częśd doświadczalna omawia szeroko i szczegółowo metody badawcze, oraz wyniki badao doświadczalnych. Rozdział ten jest najobszerniejszy. Nie będę streszczad przeprowadzonych badao, sam ich zakres jest dośd szeroki, a liczba duża. Wszystkie prezentowane przez Doktorantkę wyniki badao są dobrze udokumentowane z wykorzystaniem tabel oraz rysunków. Wszystkie rysunki w pracy zostały przygotowane dośd starannie, a ich jakośd nie budzi zastrzeżeo. Rozdział 5 podsumowuje uzyskane wyniki badao oraz przedstawia prawidłowo sformułowane wnioski. Na koocu pracy Doktorantka zawarła spis literatury. Przedstawiony przegląd literatury obejmuje aż 286 pozycji literaturowych, w ogromnej większości z ostatniej dekady. Zrobiony jest on bardzo szczegółowo i w pełni odzwierciedla złożonośd problemu, jakim zajęła się Doktorantka. Pokazuje również rozwój koncepcji naukowych związanych z badanym zagadnieniem. Tak liczny zbiór cytowanych prac dowodzi ogromnego nakładu pracy Doktorantki, która umiejętnie wybrała oraz przejrzyście przedstawiła najważniejsze zagadnienia w części teoretycznej rozprawy. Podsumowując tę częśd pracy stwierdzid należy, że Autorka zarówno dobrze przygotowała się teoretycznie do zaplanowanych badao, jak też dobrze uzasadnia koniecznośd podjęcia tego rodzaju badao.

Doktorantka wnosi znaczący element nowości naukowej w obecny stan wiedzy, a przeprowadzone badania odznaczają się oryginalnością i mają duży potencjał w aspekcie ich zastosowania w praktyce.

Cenną umiejętnością Autorki jest zwięzłe formułowanie myśli, brak przerostu formy nad treścią oraz jasne formułowanie wniosków i prezentowanie wyników prowadzonych badao.

Przedstawiona do recenzji praca napisana jest poprawnym językiem polskim. Praca zredagowana jest starannie, ale nie jest wolna od drobnych błędów edytorskich. Poniżej przedstawiam kilka wybranych z dostrzeżonych przeze mnie tego rodzaju niezręczności:

 „Rysunek” - pisany dużą literą, czasami małą, niekiedy skrótowo „Rys.”, podobna uwaga dotyczy zwrotu „Tabela”);

 Nieprawidłowe użycie łącznika np. str. 18, 138, myślnik (inaczej pauza) jest znakiem interpunkcyjnym, zaś łącznik to znak graficzny, a odróżniają je zarówno długośd, jak i zasady użycia. Myślnik jest przede wszystkim dłuższy: „—”, a ponieważ jest znakiem międzywyrazowym, powinien byd wydzielony odstępami od wyrazów, pomiędzy którymi występuje. Łącznik to najkrótsza z „kresek”, tzw. znak wewnątrzwyrazowy: „-”.

 str. 26, 41, 76, 80, 86, w różnych miejscach wstawiono „kropki”, których nie powinno tam byd;

 str. 137, 139, brak „kropki”, „przecinka”, „średnika”;

 str. 36, niewłaściwe użycie „przecinka” przed cytowaną literaturą;

 str. 40, 71, 111, 127, brak spacji;

 rys. 7, przydałaby się skala z jednostką metryczną;

(16)

str. 5

 str. 65-66, …710,0 do 1,180 μm… czy na pewno? Dokładnośd zapisu i brak przecinka (zapewne zapożyczony z wersji anglojęzycznej) dałby wartości, w mojej opinii, prawidłowe tj. od 710 do 1180 μm;

 np. str. 87, 88, 89, 102, 119, 120, 123, puste miejsca, których można było uniknąd;

 str. 97, Na rysunku 34 A, B przedstawiono wyniki analizy żywotności kokultury fibroblastów… są tylko rysunki A i B, zatem wystarczyłoby podad, że na rysunku 34 przedstawiono…

 np. str. 105, 106, użycie jednostki „godziny” i zamiennie „h”, lepiej używad tego samego słowa/skrótu w całej pracy;

 ko-kultury, czy kokultury – różny zapis w pracy;

 różny sposób zapisu cytowanej literatury w treści pracy (w stylu: *236+, *237+, *238+, *239+, [240], [241], lub [237]-[252]).

2. Ocena merytoryczna rozprawy – uwagi ogólne

Zasadnicza częśd pracy poświęcona realizacji postawionego celu jest jej bardzo mocną stroną. Zadeklarowany cel pracy jest w znacznym stopniu wynikiem zainteresowao badawczych i dokonao Autorki rozprawy, jak też twórczą kontynuacją badao prowadzonych przez zespoły kierowane przez Panią dr hab. inż. Agaty Markowskiej-Szczupak, prof. ZUT oraz Pana dra hab. Adama Feliksa Junki, prof. UMW. Przeprowadzone badania dowodzą, że zastosowanie spektroskopii NMR pozwala na rozróżnienie form drobnoustrojów. Zaproponowany model eksperymentalny, łączący dwa rodzaje komórek (drobnoustroje i fibroblasty), mógłby zostad wykorzystany do oceny wpływu zastosowanych terapeutyków zarówno na gospodarza, jak i na patogeny. Znając biomarker świadczący o zakażeniu określonym szczepem bakterii, z zastosowaniem metaboliki celowanej możliwe byłoby opracowanie testu diagnostycznego pozwalającego określid rodzaj infekcji. Technika tak mogłaby stanowid alternatywę dla standardowych czaso- i kosztochłonnych metod diagnostyki i umożliwid stałe monitorowanie stanu rany. Otrzymane w niniejszej rozprawie wyniki mogą zostad wykorzystane do przygotowania schematu postępowania, który może byd wdrożony do ogólnego stosowania w laboratoriach diagnostycznych. Oczywista wydaje się byd kwestia czasu i kolejnych kilkunastu lat dalszych badao i prób klinicznych niezbędnych do pełnego zaimplementowania opracowanego modelu. Należy podkreślid, że przedstawiona tematyka rozprawy doktorskiej wnosi istotny wkład w rozwój wiedzy dotyczącej analizowanego zagadnienia przez co wypełnia istniejącą lukę informacyjną, dlatego podjęte działanie badawcze uważam za w pełni uzasadnione, nie tylko z punktu widzenia nauki, ale również z punktu widzenia osoby chorej.

Stwierdzam, że Pani mgr inż. Joanna Czajkowska zrealizowała zadeklarowane cele pracy, a uzyskane z wykorzystaniem nowoczesnych metod badawczych wyniki – uznaję za wkład w rozwój prac badawczych związanych z szeroko rozumianymi ranami przewlekłymi. Na uwagę zasługuje fakt, że uzyskane wyniki mają duże znaczenie praktyczne, a przedstawiona do recenzji praca ma charakter interdyscyplinarny. Do głównych osiągnięd Doktorantki należy zaliczyd:

(17)

str. 6

 określenie metabolitów wydzielanych zewnątrzkomórkowo i wewnątrzkomórkowo przez drobnoustroje i komórki fibroblastów, które można uznad za markery zakażenia rany, co stanowi główne elementy wdrożenia, którego realizacja zależy jednak od uwarunkowao związanych z istniejącymi przepisami prawa i obowiązującymi programami leczenia ran przewlekłych w Polsce,

 zastosowanie opracowanego modelu infekcji rany przewlekłej in vitro do badao nad aktywnością antyseptyków jest przygotowane do implementacji jako element oferty komercyjnego Laboratorium Mikrobiologii w Centrum Diagnostyki Populacyjnej Łukasiewicz – PORT.

3. Ocena strony formalnej rozprawy – uwagi szczegółowe

Recenzowaną rozprawę czyta się z zainteresowaniem, jest poprawna językowo i praktycznie wolna od błędów natury edytorskiej. Praca jest dobrze napisana i zredagowana oraz ma przejrzysty, logiczny i wyczerpujący układ. Drugą grupę stanowią uwagi o charakterze merytorycznym, na które oczekuję wyjaśnieo Doktorantki podczas publicznej obrony pracy doktorskiej. W tym miejscu chciałbym zwrócid uwagę na kilka kwestii i zdad parę pytao:

 W tym miejscu chciałbym zwrócid jednak uwagę na jedną kwestię. Dążenie do jak najwyższych wartości dokładności, skuteczności i wiarygodności jest istotne, jednakże należy pamiętad, aby zachowad umiar. Dotyczy ono m.in. następujących sformułowao:

„Najwyższy poziom ekspresji wykazano dla genu fimB (ekspresja względem genu referencyjnego równa 532,51) w 16 h od wprowadzenia inokulum bakterii E. coli.

Poziom ten gwałtownie się obniżył (wartośd 0,89 względem genu referencyjnego) po 24 godzinach kohodowli…” oraz „Zaobserwowano silną ekspresję genu csrA w 16 h kohodowli E. coli z komórkami fibroblastów (52,95 razy wyższa względem genu referencyjnego) oraz znaczące obniżenie jego ekspresji (0,69 razy wyższa względem genu referencyjnego) w 24 h prowadzenia kohodowli” (str. 140, 141, 142, 143). Co według Doktorantki miało na celu tak dokładne podawanie danych? We wcześniejszych opisach Doktorantka stosuje zwroty „ponad” i „około”. Czy jest to statystycznie uzasadnione?

 Czy Doktorantka mogłaby przedstawid szacunkowe koszty inwestycyjne opracowanej techniki? Jak mają się one do aktualnie stosowanych technik diagnostycznych?

 czy opracowany model infekcji rany przewlekłej in vitro do badao nad aktywnością antyseptyków, który został przygotowany do implementacji jako element oferty komercyjnego Laboratorium Mikrobiologii w Centrum Diagnostyki Populacyjnej Łukasiewicz – PORT ma szansę na „pełne wdrożenie” w przedsiębiorstwie? Czy jest on ogólnodostępny, czy tylko wyłącznie dla pracodawcy (z udziałem którego niniejszy doktorat wdrożeniowy został przygotowany)?

 Personel medyczny zajmujący się pacjentem z raną przewlekłą musi posiadad umiejętności praktyczne, kompetencje oraz przede wszystkim wiedzę w tej dziedzinie – czy w przypadku zaproponowanej techniki personel musiałby zostad dodatkowo przeszkolony? Czy może Pani przedstawid swoją opinię na ten temat?

(18)

str. 7

Powyższe uwagi, poczynione z obowiązku recenzenta, w najmniejszym stopniu nie podważają wartości poznawczej i aplikacyjnej rozprawy, a stanowią jedynie podstawę do merytorycznej dyskusji podczas publicznej obrony pracy doktorskiej. W mojej opinii przedstawiony w rozprawie materiał spełnia wymogi stawiane rozprawom doktorskim.

4. Podsumowanie i wniosek koocowy

Uwzględniając aktualnośd podjętej tematyki rozprawy, trafnośd zdefiniowanego celu oraz poprawnośd wnioskowania, pozytywnie oceniam rozprawę doktorską pt. „Odpowiedź fibroblastów na obecnośd biofilmów tworzonych przez patogeny izolowane z przewlekłych owrzodzeo żylnych”. Złożonośd problemów z jakimi spotkała się Doktorantka realizując recenzowaną rozprawę, a także ich interdyscyplinarnośd, niewątpliwie wymagała wiedzy teoretycznej i praktycznej niezbędnej do prowadzenia badao eksperymentalnych oraz ogromnego nakładu pracy. Sposób zaplanowania i prowadzenia badao, jak również forma przedstawienia uzyskanych wyników oraz ich analiza świadczą o dużej wiedzy oraz kompetencjach. Uważam, że Doktorantka zrealizowała założone cele swojej pracy.

Reasumując stwierdzam, że recenzowana rozprawa doktorska jest opracowaniem oryginalnym o wysokiej wartości poznawczej. Uważam, że recenzowana przeze mnie praca doktorska Pani mgr inż. Joanny Czajkowskiej spełnia wymagania stawiane rozprawom doktorskim przez obowiązującą aktualnie w Polsce Ustawę o Stopniach i Tytule Naukowym i wnoszę o dopuszczenie Pani mgr inż. Joanny Czajkowskiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego.

POLITECHNIKA POZNAOSKA WYDZIAŁ TECHNOLOGII CHEMICZNEJ INSTYTUT TECHNOLOGII I INŻYNIERII CHEMICZNEJ

DR HAB. INŻ.MAREK OCHOWIAK,PROF. UCZELNI KIEROWNIK ZAKŁADU INŻYNIERII I APARATURY CHEMICZNEJ

(19)

str. 8

Uzasadnienie wniosku o wyróżnienie

rozprawy doktorskiej Pani mgr inż. Joanny Czajkowskiej

pt. „Odpowiedź fibroblastów na obecnośd biofilmów tworzonych przez patogeny izolowane z przewlekłych owrzodzeo żylnych”.

Uważam, że ze względu na istotne elementy nowości naukowej, pomyślnie zrealizowany bardzo obszerny program badawczy, przejrzysty sposób opracowania dużej liczby uzyskanych wyników oraz duże ich znaczenie praktyczne praca zasługuje na wyróżnienie. Na podkreślenie zasługuje również bogaty dorobek publikacyjny Autorki obejmujący 11 publikacji. Wartośd indeksu Hirscha wynosi 7, a całkowita liczba cytowao 89. Jest to więc duży pod względem liczbowym i wartościowy pod względem merytorycznym dorobek.

POLITECHNIKA POZNAOSKA WYDZIAŁ TECHNOLOGII CHEMICZNEJ INSTYTUT TECHNOLOGII I INŻYNIERII CHEMICZNEJ

DR HAB. INŻ.MAREK OCHOWIAK,PROF. UCZELNI KIEROWNIK ZAKŁADU INŻYNIERII I APARATURY CHEMICZNEJ

(20)

Uchwała nr 249

Senatu Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie z dnia 10 października 2022 r.

w sprawie nadania mgr inż. Joannie Czajkowskiej stopnia doktora

Na podstawie art. 179 ust. 2 i 3 pkt 2b ustawy z dnia 3 lipca 2018 r. Przepisy wprowadzające ustawę – Prawo o szkolnictwie wyższym i nauce (Dz. U. poz. 1669, z późn. zm.) w związku z art. 14 ust. 2 pkt 5 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym

oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (tekst jedn. Dz. U. z 2017 r. poz. 1789, z późn. zm.) uchwala się, co następuje:

§ 1.

Senat Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie nadaje

mgr inż. Joannie Czajkowskiej stopień doktora w dziedzinie nauk inżynieryjno-technicznych, w dyscyplinie inżynieria chemiczna.

§ 2.

Uchwała wchodzi w życie z dniem podjęcia.

Przewodniczący Senatu Rektor

dr hab. inż. Jacek Wróbel, prof. ZUT

(21)

Uchwała nr 250

Senatu Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie z dnia 10 października 2022 r.

w sprawie wyróżnienia rozprawy doktorskiej dr inż. Joanny Czajkowskiej Na podstawie art. 179 ust. 2 i 3 pkt 2b ustawy z dnia 3 lipca 2018 r. Przepisy wprowadzające ustawę – Prawo o szkolnictwie wyższym i nauce (Dz. U. poz. 1669, z późn. zm.) w związku z § 3 pkt 4 i § 21 rozporządzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 21 maja 2019 r. w sprawie kryteriów

i trybu przyznawania nagród Prezesa Rady Ministrów oraz wzoru wniosku o ich przyznanie (Dz. U. poz. 976, z późn. zm.) oraz z § 11a uchwały nr 113 Senatu ZUT z dnia 23 września 2019 r.

w sprawie określenia sposobu postępowania w sprawie nadania stopnia doktora

w Zachodniopomorskim Uniwersytecie Technologicznym w Szczecinie (z późn. zm.) uchwala się, co następuje:

§ 1.

Senat Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie wyróżnia rozprawę doktorską dr inż. Joanny Czajkowskiej, pt. „Odpowiedź fibroblastów na obecność biofilmów tworzonych przez patogeny izolowane z przewlekłych owrzodzeń żylnych”.

§ 2.

Uchwała wchodzi w życie z dniem podjęcia.

Przewodniczący Senatu Rektor

dr hab. inż. Jacek Wróbel, prof. ZUT

Cytaty

Powiązane dokumenty

Wobec powyższego można przyjąć tezę, że w warunkach polskiego rynku finansowania nieruchomości zakres regulacji, co do zasady, zapewniał już wystarczającą

Obecność kompozytora w utworze zaznacza się tym intensywniej, im większy i oryginalniejszy jest jego talent oraz — ujmując to zagadnienie bardziej ogólnie. —

Do tego leczenia przyjmowałem przypadki owrzodzeń podudzi wielokrotnie bezskutecznie leczonych, owrzodzenia najtrudniejsze w leczeniu jak:. owrzodzenia po zakrzepowym zapaleniu

development of a certain place (Brańka, 2014, pp. According to a place marketing literature review made by S. 57) only promotion is widely perceived as an important instrument

Dużym zainteresowaniem cieszyły się sesje prezen- tujące metody postępowania miejscowego chorych z roz- ległymi oparzeniami, w tym również leczenie Integrą opa- rzeń u dzieci,

Zgadzam się z Recenzentem w Definicji 4, BG jest oznaczany jako zbiór grafów bazowych, natomiast Definicja 1 wprowadza oznaczenie BG jako grafu bazowego.. Aktualnie jest ona

Ta ostatnia uwaga jest ważna w sytuacji gdy problem optymalnego projektowania całego systemu jest dzielny na (pod)segmenty, gdyż wtedy właśnie dla każdego

W tym kontekście, z uwagi na możliwe działanie drażniące lub cytotoksyczne fazy płynnej olejków, skuteczność ich frakcji lot- nych może okazać się opcją terapeutyczną