1) Absorpcja, emisja wymuszona i emisja spontaniczna 2) Przesunięcie Stokesa

Fluorescencja

Plan wykładu

1) Absorpcja, emisja wymuszona i emisja spontaniczna 2) Przesunięcie Stokesa

3) Prawo lustrzanego odbicia

4) Znaczniki fluorescencyjne

5) Fotowybielanie

Emisja spontaniczna i wymuszona

hν hν

hν hν

w

n

∆E = hν absorpcja emisja

spontaniczna

emisja wymuszona

Przesunięcie Stokesa

Widmo fluorescencji cząsteczek w roztworze zazwyczaj wykazuje

maksimum dla fal dłuŜszych niŜ widmo absorpcji ze względu na jądrową relaksację wzbudzonych cząsteczek, których część energii zostaje

przeniesiona do otoczenia przez cząsteczki rozpuszczalnika zanim dojdzie do fluorescencji wzbudzonej cząsteczki

=> przesunięcie Stokesa

Przesunięcie Stokesa -

relaksacja chromoforu

Przesunięcie Stokesa – relaksacja otoczenia

Dodatkowo, przesunięcie Stokesa moŜe być spowodowane relaksacją (=reorganizacją) otaczających cząsteczek rozpuszczalnika (do której dochodzi równieŜ pomiędzy aktem absorpcji i emisji).

Przesunięcie Stokesa - relaksacja chromoforu c.d.

Relaksują (słabną) drgania wewnątrzcząsteczkowe

∆ – zmiana długości wiązania podczas oscylacji = b_e - b_g

Λ – wibracyjna energia

reorganizacji (energia potrzebna do rozciągnięcia lub ściśnięcia wiązania o (b_e - b_g)

b_g, b_e – średnia długość wiązania w stanie

podstawowym i wzbudzonym

Energia

Współrzędne koordynacyjne chromoforu (np. zmiana długości wiązania)

∆ Przesunięcie Stokesa: hν_abs - hν_fl =2Λ

Przesunięcie Stokesa – relaksacja otoczenia c.d.

Energia

Współrzędne koordynacyjne rozpuszczalnika

∆

Analogiczny rysunek do

poprzedniego, ale energia w funkcji współrzędnych cząsteczek

rozpuszczalnika!

tu: Λ - energia reorganizacji rozpuszczalnika

Całkowita energia reorganizacji jest sumą energii reorganizacji

wibracyjnej (chromoforu) i rozpuszczalnika

i podobnie:

Całkowite przesunięcie Stokesa jest sumą przesunięć wibracyjnego i

pochodzącego od rozpuszczalnika

Przesunięcie Stokesa, a polarność rozpuszczalnika

Ze wzrostem polarności rozpuszczalnika, przesunięcie Stokesa z reguły rośnie (relaksacja cząsteczek rozpuszczalnika mocno obniŜa energię stanu wzbudzonego), np. tryptofan moŜe być w białku w róŜnym środowisku

bardziej lub mniej polarnym - maksima fluorescencji dla róŜnych długości fali.

Prawo lustrzanego odbicia

Prawo lustrzanego odbicia

Widmo fluorescencji cząsteczki jest zazwyczaj w przybliŜeniu lustrznym odbiciem widma absorpcji.

Względna amplituda

Liczba falowa (1/λ) [cm^-1]

ε ≈ ν D_ba F ≈ ν³D_ba

absorpcja fluorescencja

(Uwzględnienie róŜnych zaleŜności absorpcji i fluorescencji od

częstotliwości światła)

Kiedy prawo lustrzanego odbicia jest zachowane?

1) Gdy mody wibracyjne są harmoniczne (krzywe energii potencjalnych modów drgań cząsteczki są opisywane przez parabole; kx²) a ich częstotliwości

wibracji ν są jednakowe w stanie podstawowym i wzbudzonym

=> Wówczas energie moŜliwych przejść wibronowych w widmach absorpcji i emisji są symetrycznie rozłoŜone po przeciwnych stronach energii przejścia 0- 0, hν₀₀

np. hν_abs = hν₀₀ + 3hν hν_fl = hν₀₀ - 3hν lub ogólniej:

ν_abs = ν₀₀ + δ ν_fl = ν₀₀ - δ

Energia

Współrzędne koordynacyjne chromoforu∆ hν_abs

hν_fl hν₀₀

Znaczniki fluorescencyjne (barwniki)

Znaczniki fluorescencyjne (barwniki)

- mają powszechne zastosowanie

do badania zmian strukturalnych w białkach i innych cząsteczkach

znakowania Ŝywych komórek

Znaczniki

fluorescencyjne (barwniki) -

przykłady

Znaczniki fluorescencyjne – kropki kwantowe

-nanokryształy (klastry) materiałów półprzewodnikowych (np. CdS, CdSe) o średnicy ~20 -100 Å otoczone przezroczystą warstwą izolacyjną;

-dodatkowo mogą być pokryte polimerem z przyłączonymi ligandami konkretnych białek lub innych cząsteczek

Kropki kwantowe

- właściwości fluorescencyjne są związane z ograniczonymi rozmiarami kropek

- kształt gaussowski pasm fluorescencji - wąskie pasma fluorescencji - szerokość spektralna (FWHM) 30-50 nm

- szerokie widma absorpcji (łatwo

wzbudzić światłem o dowolnej długości fali poniŜej długości fali światła emitowanego) - bardzo odporne na fotozniszczenie

Białko GFP

Green Fluoresent Protein (GFP)

"for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP"

The Nobel Prize in Chemistry 2008

Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien

- GFP silnie „świeci” w zakresie widzialnym i moŜe być genetycznie przyłączane do innych białek – nie trzeba dodatkowo znakować badanych białek

GFP

Aequorea victoria Gly-Tyr-Ser
emisja fluorescencji

Pochodne GFP

Pochodne GFP

Fotowybielanie

Fotowybielanie

- fotochemiczny proces nieodwracalnego przejścia cząsteczki w stan niefluoryzujący (i nieabsorbujący),

- często związany z obecnością O₂ w elektronowym stanie singletowym (wzbudzony stan O₂ powstający np. na skutek przeniesienia energii ze wzbudzonych stanów tripletowych cząsteczek aromatycznych na O₂ w stanie podstawowym)

O₂ w stanie singletowym reaguje z podwójnymi wiazaniami C=C

=> fotoprodukty

- wydajność fotowybielania: rzędu 10^-7 – 10^-6 lub większa przy duŜym natęŜeniu światła

FRAP i FLIP

- wykorzystanie zjawiska fotowybielenia do badania ruchliwości biomolekuł (np. lipidów lub białek w błonie biologicznej)

- FRAP = fluorescence recovery after photobleaching - FLIP = fluorescence loss in photobleaching

Fluorescencja w róŜnych miejscach próbki obserwowana przez mikroskop FRAP

FLIP