BIOMEDYCZNE ZASTOSOWANIE BAKTERYJNEJ CELULOZY
Fijałkowski K1, Drozd R1, Rakoczy R2, Junka AF31 Katedra Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie 2 Instytut Inżynierii Chemicznej i Procesów Ochrony Środowiska Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego
w Szczeci-nie
3 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu
Celuloza syntetyzowana przez bakterie (CB) znalazła szereg zastosowań m.in. w medycynie oraz przemyśle kosmetycz-nym. Pomimo wielu zalet oraz możliwości zastosowania, wysokie koszty, nieefektywny proces produkcji oraz stosunkowo trudny proces modyfikacji w celu uzyskania pożądanych właściwości są największymi przeszkodami w szerokim zastoso-waniu CB. Celem badań była analiza możliwości zastosowania wirującego pola magnetycznego (WPM) w celu zwiększenia efektywności procesu produkcji oraz modyfikacji wybranych właściwości fizykochemicznych CB syntetyzowanej przez bak-terie Gluconacetobacter xylinus pod kątem zastosowań biomedycznych. Analizie poddano m.in.: ilość produkowanej celulo-zy, stopień jej uwodnienia, zdolność do pochłaniania i utrzymywania wody, morfologię mikrofibryli, stopień polimeryzacji oraz krystaliczności. Ponadto przeanalizowano właściwości magnetycznie modyfikowanej CB jako nośnika do immobili-zacji i impregnacji substancji bioaktywnych oraz mikroorganizmów. Wykazano, że ekspozycja hodowli G. xylinus na WPM wpływała przede wszystkim na zmiany w mikrostrukturze syntetyzowanej celulozy. Obserwowane zmiany w morfologii ce-lulozy wpływały na jej właściwości wodne, przede wszystkim na zdolność do pochłaniania i utrzymania wody. Podsumo-wując, ekspozycja hodowli G. xylinus na WPM zwiększa wydajność procesu produkcji oraz pozwala na modyfikowanie wy-branych właściwości CB szczególnie istotnych dla zastosowań biomedycznych. Uzyskane wyniki mogą znaleźć zastosowa-nie w opracowaniu wysokochłonnych opatrunków, dedykowanych do leczenia ran charakteryzujących się szczególzastosowa-nie du-żym wysiękiem.
Słowa kluczowe: biomateriał, biopolimer, celuloza bakteryjna, Gluconacetobacter xylinus, pole magnetyczne
IX OGÓLNOPOLSKIE SYMPOZJUM
Z CYKLU „BIOFILM TWORZONY PRZEZ
DROBNOUSTROJE W PATOGENEZIE
ZAKAŻEŃ”
„POSZUKIWANIE NOWYCH ROZWIĄZAŃ
DIAGNOSTYCZNYCH I TERAPEUTYCZNYCH
W WYKRYWANIU I ERADYKACJI BIOFILMU”
KUDOWA ZDRÓJ, 17–19 LISTOPADA 2016
STRESZCZENIA ZGŁOSZONE DO 31 PAŹDZIERNIKA 2016 ROKU*
BIOMEDICAL APPLICATION OF BACTERIAL CELLULOSE
Fijałkowski K1, Drozd R1, Rakoczy R2, Junka AF31 Department of Immunology, Microbiology and Physiological Chemistry, West Pomeranian University of Technology in Szczecin 2 Institute of Chemical Engineering and Environmental Protection Processes, West Pomeranian University of Technology in Szczecin 3 Department of Pharmaceutical Microbiology and Parasitology, Medical University of Wroclaw
Cellulose synthesized by bacteria (bacterial cellulose – BC) has found a number of applications, e.g. in medicine and co-smetics industry. Despite many advantages and applicability, high costs, inefficient production process and the relatively dif-ficult process of modification to achieve the desired properties are the greatest barriers to extensive use of the BC. The aim of the study was to analyse the possibility of applying a rotating magnetic field (RMF) to increase the efficiency of the produc-tion process and modificaproduc-tion of some physicochemical properties of BC synthesized by bacteria Gluconacetobacter xylinus for biomedical applications. The amount of cellulose produced, its degree of hydration, the ability to absorb and hold water, microfibrillar morphology, degree of polymerization and crystallinity were analysed. Moreover, the properties of magneti-cally modified BC as a carrier for impregnation and immobilization of bioactive substances and microorganisms were also analysed. It has been shown that exposure of G. xylinus to RMF primarily affects the microstructure of the synthesized cel-lulose. The observed changes in the morphology of the cellulose affected its water properties, especially the ability to absorb and retain water. In conclusion, exposure of G. xylinus to RMF increases the efficiency of the production process and al-lows to modify the selected properties of BC, particularly important for biomedical applications. The obtained results can be used to develop high capacity dressings, dedicated for the treatment of wounds characterized by a particularly high effusion. Key words: bacterial cellulose, biomaterials, biopolymer, Gluconacetobacter xylinus, magnetic field
CRYPTOCOCCUS – NOWY WIEK, NOWE WYZWANIA
Florek M
Zakład Mikrobiologii Katedry Patologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu
Częstość infekcji wywoływanych przez grzyby na świecie rośnie, mimo to wiedza na temat epidemiologii zakażeń przez nie powodowanych wciąż jest niewystarczająca, czego skutkiem mogą być trudności związane z opracowywaniem skutecz-nych metod terapii. Do grzybów mających największe znaczenie dla zdrowia zwierząt i człowieka należą drożdże z kom-pleksu Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii (CNCG). Postrzeganie patogenów należących do tej grupy w znacznym stopniu uległo zmianie w ciągu ostatnich 16 lat, w związku z pojawieniem się licznych publikacji wyników badań będących odpowiedzią na wybuch kryptokokozy, jaki miał miejsce na przełomie XX i XXI wieku na wyspie Vancouver. Badania grzy-bów należących do kompleksu CNCG prowadzone w Kanadzie, a później w innych miejscach na świecie, wymagały uży-cia rozmaitych technik molekularnych, dzięki którym wykazano wśród omawianych grzybów obecność genetycznie zróż-nicowanych podgrup. W 2007 roku pod patronatem ISHAM (ang. International Society for Human and Animal Mycolo-gy) powołana została grupa robocza Genotyping of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, która rozpoczęła gro-madzenie i analizę molekularną szczepów klinicznych, weterynaryjnych i środowiskowych z całego świata. Ponadto grupa ta zajęła się standaryzacją metod badawczych (m.in. ujednolicony schemat MLST obejmujący loci: CAP59, GPD1, IGS1, LAC1, PLB1, SOD1 i URA5; uporządkowanie nomenklatury dotyczącej głównych typów molekularnych (genotypów) wy-różnianych w obrębie kompleksu CNCG). Badania prowadzone przez członków ISHAM oraz inne grupy pozwoliły powią-zać poszczególne genotypy tych grzybów z miejscem pochodzenia, niszą ekologiczną, a także zrozumieć strukturę popula-cji kompleksu CNCG. Wykazano, że patogeny należące do poszczególnych typów molekularnych mogą różnić się patogen-nością i wrażliwością na preparaty przeciwgrzybicze. Postulowana została także zmiana systematyki, zgodnie z którą w ob-rębie omawianej grupy miałoby się znaleźć 7 gatunków należących do 2 odrębnych kompleksów. Zwiększenie ilości danych dotyczących grzybów należących do kompleksu CNCG spowodowało pojawienie się nowych pytań oraz sugestii dotyczą-cych patogenezy i epidemiologii zakażeń przez nie powodowanych. Analiza dostępnych danych epidemiologicznych i ba-dania molekularne w połączeniu z oceną stopnia ekspozycji na propagule C. gattii w stosunku do odsetka przypadków za-każeń sugerują, że wymieniony gatunek może być oportunistą, a nie jak się uznaje – patogenem pierwotnym. Wśród auto-rów publikacji pojawiają się sugestie potrzeby poszukiwania, innych niż do tej pory uznawane, czynników lub uwarunko-wań genetycznych makroorganizmu przyczyniających się do jego zwiększonej wrażliwości na zakażenie grzybami z rodzaju
organów nadzoru i konieczności zgłaszania przypadków infekcji u ludzi i zwierząt, niewystarczającego stopnia identyfikacji izolatów klinicznych kompleksu CNCG w części laboratoriów oraz braku danych dotyczących występowania szczepów śro-dowiskowych w niektórych regionach Europy i świata.
Słowa kluczowe: Cryptococcus, epidemiologa, główne typy molekularne, immunosupresja, ISHAM, rozprzestrzenienie się patogenu, wyspa Vancouver
ZASTOSOWANIE NOWEGO GLIKOPEPTYDU, DALBAWANCYNY (XYDALBA®), W LECZENIU ZAKAŻENIA
U CHOREGO W OIT
Gierek D1, Wożniak M1, Cyzowski T1, Piłat D1, Kluczewski G1, Gierek M2, Skupińska J1
1 Oddział Anestezjologii i Intensywnej Terapii Samodzielnego Publicznego Szpitala Klinicznego Nr 7 Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, Górnośląskie Centrum Medyczne im. prof. L. Gieca – Szpital w Ochojcu
2 Oddział Urologiczny Śląskiego Centrum Urologii Urovita w Chorzowie
74-letni mężczyzna doznał urazu wielonarządowego z powodu wciągnięcia kończyny górnej prawej do pracującej tokar-ki. Z objawami wstrząsu został przywieziony do szpitala przez zespół pogotowia ratunkowego. Zastosowano postępowanie przeciwwstrząsowe z uwzględnieniem: postępowania przeciwbólowego, adekwatnej płynoterapii, profilaktyki przeciwtęż-cowej, leczenia przeciwzakrzepowego. Ze względu na niewydolność oddechową chorego zaintubowano i wentylowano me-chanicznie. Po przeprowadzonej diagnostyce stwierdzono: stłuczenie klatki piersiowej, uraz zmiażdżeniowy kończyny gór-nej prawej, zwichnięcie przednie w stawie ramiennym, wieloodłamowe otwarte złamanie trzonu kości ramiengór-nej prawej. Chorego zakwalifikowano do zabiegu w trybie natychmiastowym. Na bloku operacyjnym wykonano rewizję naczyń i ner-wów kończyny górnej prawej oraz założono stabilizator zewnętrzny kości ramiennej. Po zabiegu mężczyzna został przeka-zany do oddziału intensywnej terapii (OIT). Zastosowano leczenie farmakologiczne obejmujące antybiotykoterapię empi-ryczną – amoksycylina z kwasem klawulanowym (Amoksiklav®) i klindamycyna (Dalacin®) – oraz leczenie przeciwzakrze-powe. Kontynuowano terapię przeciwbólową z wykorzystaniem znieczulenia regionalnego – ciągła blokada splotu ramien-nego. Monitorowano parametry rabdomiolizy oraz funkcję nerek (kinaza kreatynowa, kreatynina). Ze względu na rozległe zmiażdżenie tkanek miękkich ramienia, dołu łokciowego i przedramienia, rozległy ubytek skóry oraz zmiażdżenie mięśni prowadzono intensywne interdyscyplinarne leczenie miejscowe, stosując: odkażanie Octeniseptem®, 3% wodę borową, opa-trunki nasączone parafiną, opaopa-trunki Granuflex®, siatki ActiCoat® Flex 3, opaopa-trunki bioceramiczne Cerdak, opaopa-trunki Aqu-acel® Ag. Chorego codziennie konsultowano ortopedycznie i chirurgicznie. Wobec braku możliwości chirurgicznego zaopa-trzenia ubytku i martwicy skóry, surowiczo-ropnej treści w ranie, pacjent był konsultowany w Regionalnym Centrum Opa-rzeń w celu zakwalifikowania do leczenia w komorze hiperbarycznej – zdyskwalifikowany ze względu na ciężki stan i ko-nieczność wentylacji mechanicznej. Kontynuowano leczenie miejscowe i farmakologiczne. Badania mikrobiologiczne po-siewów jednoczasowo pobranych w dniu przyjęcia z rany, dróg oddechowych (BAL) i krwi były ujemne. W kolejnych ba-daniach uzyskano dodatni posiew z BAL Pseudomonas aeruginosa i ujemny z rany urazowej oraz krwi. Ze względu na go-rączkę oraz parametry: leukocytoza – 14 tysięcy/ul, PCT – 5,0 ng/ml, CRP – 240 mg/l włączono szerokospektralną anty-biotykoterapię meropenem (Meronem™) i wankomycyną (Edicin®) pod kontrolą stężenia wankomycyny w surowicy. W ko-lejnym badaniu BAL utrzymywał się Pseudomonas aeruginosa wrażliwy również na ceftazydym, a z posiewu rany uzyskano wzrost kolonii Acinetobacter baumannii (wrażliwy na kolistynę); posiew krwi był nadal ujemny. Deskalowano antybiotyko-terapię, włączając ceftazydym (Fortum®) oraz kolistynę (Co listin®). Pomimo intensywnego miejscowego i ogólnego lecze-nia, rana nie wykazywała cech gojelecze-nia, a ropna wydzielina nie sprzyjała ziarninowaniu. W 34. dobie pobytu w OIT zastoso-wano dalbawancynę (Xydalba®) 1000 mg w pierwszej dobie i 500 mg w 8. dobie (zgodnie z ChPL), dołączając empirycznie lewofloksacynę (Levoxa®). Uzyskano znaczącą poprawę stanu miejscowego (ziarninowanie całego ubytku skórnego przed-ramienia i dołu łokciowego, pokrycie rany włóknikiem) oraz spadek parametrów zapalnych. Znacząca poprawa była naj-prawdopodobniej spowodowana dobrym przenikaniem antybiotyku do tkanek miękkich, co w tym przypadku miało bar-dzo duże znaczenie ze względu na obrzęk i zmiażdżenie. Uzyskano również poprawę stanu ogólnego. W 57. dobie pobytu chorego odłączono od respiratora, a następnego dnia dekaniulowano tchawicę. Choremu nie udało się jednak opuścić szpi-tala, gdyż na etapie rehabilitacji wystąpił u niego zawał mięśnia sercowego STEMI. Pomimo pilnej interwencji hemodyna-micznej u pacjenta rozwinął się wstrząs kardiogenny. Mężczyzna zmarł w wyniku niewydolności wielonarządowej. Słowa kluczowe: dalbawancyna, uraz wielonarządowy, zakażenia skóry i tkanki podskórnej
OCENA ZDOLNOŚCI ADHEZYJNYCH SZCZEPÓW
KLEBSIELLA OXYTOCA
Janczura A, Gościniak GKatedra i Zakład Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu
Wstęp Pałeczki Klebsiella oxytoca są drobnoustrojami oportunistycznymi, zasiedlającymi przewód pokarmowy człowieka. Wyposażone są w różnorodne czynniki chorobotwórczości, takie jak: otoczka, lipopolisacharyd, siderofory, cytotoksyny, he-molizyny, enterotoksyny oraz czynniki adhezyjne. Adherencja do powierzchni błon śluzowych i komórek nabłonkowych go-spodarza jest często pierwszym krokiem do rozwoju kolonizacji i infekcji. Cel pracy Ocena zdolności adhezyjnych szczepów
K. oxytoca. Materiały i metody Przebadano 25 szczepów Klebsiella oxytoca izolowanych z przewodu pokarmowego
od dzie-ci hospitalizowanych na różnych oddziałach. W doświadczeniu zbadano zdolność adhezji tych szczepów do linii komórkowej Intestine 407 (ludzkie komórki embrionalne nabłonka jelita) i HEp-2 (ludzkie komórki raka nabłonka krtani). Wyniki Wśród badanych pałeczek K. oxytoca określono 3 typy adhezji: typ agregacyjny (AA), rozsiany (DA) i zlokalizowany (LA). Do li-nii komórkowej Intestine 407 w sposób agregacyjny adherowało 18 (72%) szczepów, dyfuzyjny – 12 (48%), a zlokalizowany – 3 (12%) szczepy. Do linii komórkowej HEp-2 w sposób agregacyjny adherowało 17 (68%) szczepów, dyfuzyjny – 10 (40%) oraz zlokalizowany – 2 (8%) szczepy. Badane szczepy przylegały za pośrednictwem pojedynczych lub mieszanych typów adhe-zji. Do linii Intestine 407 przylegało ogółem 19 szczepów K. oxytoca, z czego 6 (32%) wykazywało pojedynczy profil AA, naj-więcej – bo aż 9 szczepów (48%) – wykazywało zarówno agregacyjny, jak i dyfuzyjny profil (AA, DA). 2 (10%) szczepy adhe-rowały na 3 sposoby – AA, DA, LA. Jeden szczep (5%) wykazywał profil mieszany adhezji – (AA, LA) oraz jeden szczep (5%) pojedynczy typ DA. Do linii komórkowej HEp-2 adherowało 18 z 25 szczepów. Połowa z nich (50%) wykazywała pojedyn-czy agregacyjny typ adhezji (AA), ⅓ (33%) – mieszany (AA, DA), 2 szczepy (11%) adherowały na trzy sposoby – AA, DA, LA. W jednym szczepie (5%) wykazano typ DA. Wnioski Badane pałeczki Klebsiella oxytoca wykazują trzy różne typy adhe-zji do linii Intestine 407 i Hep-2. Adhezja ta może być pojedyncza lub mieszana. Przebadane szczepy adherują do linii Intesti-ne 407,wykazując najczęściej mieszaIntesti-ne typy adhezji; natomiast do linii Hep-2 adherują najczęściej na jeden z możliwych spo-sobów. Typ agregacyjny jest najczęściej spotykanym typem adhezji wśród 25 przebadanych szczepów Klebsiella oxytoca. Słowa kluczowe: adhezja, Klebsiella oxytoca
ZALEŻNOŚĆ POMIĘDZY TYPEM PŁUKANIA, CYTOTOKSYCZNOŚCIĄ BIONANOCELULOZY A OBECNOŚCIĄ
METABOLITÓW W BŁONIE CELULOZOWEJ
Junka AF1, Fijałkowski K2, Zabek A3, Mikołajewicz K4, Chodaczek G4, Szymczyk P5, Smutnicka D1, Zywicka A2, Sedghizadeh PP6, Dziadas M7, Młynarz P3, Bartoszewicz M1
1 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu
2 Centrum Dydaktyczno-Badawcze Nanotechnologii Katedry Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej Zachodniopomor-skiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie
3 Wydział Chemii Katedry Chemii Bioorganicznej Politechniki Wrocławskiej 4 Laboratorium Mikroskopii Konfokalnej Wrocławskiego Centrum Badawczego EIT+
5 Centrum Zaawansowanych Technologii Wydziału Mechanicznego Politechniki Wrocławskiej
6 Center for Biofilms and Craniofacial Molecular Biology, Ostrow School of Dentistry of University of Southern California, Los Angeles, CA, United States
7 Wydział Bromatologii i Dietetyki Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu
Celem badania była ocena metod zasadowego płukania membran celulozowych wytwarzanych przez 3 szczepy
Koma-gataeibacter xylinus pod kątem skuteczności usuwania z celulozy bakterii oraz metabolitów bakteryjnych. Badaniu
podda-no także cytotoksyczpodda-ność wytworzonych membran względem linii komórkowych osteoblastów i fibroblastów oraz zdolpodda-ność ekstraktów uzyskanych z membran do indukcji stresu oksydacyjnego na linii komórkowej makrofagów. W membranach ce-lulozowych wykryto 11 metabolitów pochodzenia bakteryjnego oraz wykazano różnice w parametrach celulozy związanych z cytotoksycznością oraz zdolnością indukcji stresu oksydacyjnego, zależne od rodzaju zastosowanego płukania. Uzyskane wyniki mają znaczenie dla wytwórców opatrunków z biocelulozy i mogą posłużyć stworzeniu biomateriału celulozowego o niezwykle korzystnych warunkach aplikacyjnych.
Badanie zostało częściowo przeprowadzone ze środków NCBIR (grant nr LIDER/011/221/L-5/13/NCBR/2014).
CORRELATION BETWEEN TYPE OF ALKALI RINSING, CYTOTOXICITY OF BIO-NANOCELLULOSE
AND PRESENCE OF METABOLITES WITHIN CELLULOSE MEMBRANES
Junka AF1, Fijałkowski K2, Zabek A3, Mikołajewicz K4, Chodaczek G4, Szymczyk P5, Smutnicka D1, Zywicka A2, Sedghizadeh PP6, Dziadas M7, Młynarz P3, Bartoszewicz M1
1 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu
2 Centrum Dydaktyczno-Badawcze Nanotechnologii Katedry Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej Zachodniopomor-skiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie
3 Wydział Chemii Katedry Chemii Bioorganicznej Politechniki Wrocławskiej 4 Laboratorium Mikroskopii Konfokalnej Wrocławskiego Centrum Badawczego EIT+
5 Centrum Zaawansowanych Technologii Wydziału Mechanicznego Politechniki Wrocławskiej
6 Center for Biofilms and Craniofacial Molecular Biology, Ostrow School of Dentistry of University of Southern California, Los Angeles, CA, United States
7 Wydział Bromatologii i Dietetyki Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu
The study aimed at evaluation of various types of alkali rinsing with regard to their efficacy in terms of removal, not only of bacteria but also bacterial metabolites, from cellulose matrices formed by three Komagataeibacter xylinus strains. More-over, we tested the type of alkali rinsing on membrane cytotoxicity in vitro in fibroblast and osteoblast cells and we compa-red matrices’ ability to induce oxidative stress in macrophages. We identified 11 metabolites of bacterial origin that rema-ined in cellulose after rinsing. Moreover, our results indicated that the type of alkali rinsing should be adjusted to specific
K. xylinus strains that are used as cellulose producers to obtain safe biomaterials in the context of low cytotoxicity and
crophage induction. The findings have translational importance and may be of direct significance to cellulose dressing ma-nufacturers.
This research was partially supported by the National Centre for Research and Development in Poland (Grant no. LIDER/011/221/L-5/13/NCBR/2014).
Key words: alkali rinsing, bacterial nanocellulose, cytotoxicity, macrophage, metabolite
OPORNOŚĆ BAKTERII NA GENTAMYCYNĘ A ZASTOSOWANIE MIEJSCOWE ANTYBIOTYKU W ORTOPEDII,
CHIRURGII I KARDIOCHIRURGII – BADANIA
IN VITRO
Mączyńska B, Junka AF, Rurańska-Smutnicka D, Secewicz A, Bartoszewicz M
Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu
Wstęp Gentamycyna jest antybiotykiem z grupy aminoglikozydów, leków bakteriobójczych, których efekt działania zale-ży od stężenia w środowisku, jest szybki i niezależny od inokulum, a dodatkowo ich kumulacja w komórce prowadzi do tzw. efektu poantybiotykowego (ang. post-antibiotic effect – PAE). Aminoglikozydy to antybiotyki o szerokim zakresie działa-nia. Ich spektrum obejmuje: Gram-ujemne pałeczki (z wyjątkiem Haemophilus), Gram-dodatnie ziarniaki (Staphylococcus),
Mycobacterium tuberculosis i inne gatunki, patogeny wewnątrzkomórkowe Yersinia pestis oraz Brucella abortus. Wykazują
silne działanie na paciorkowce Streptococcus pyogenes i Streptococcus pneumoniae oraz beztlenowce. W przypadku
Entero-coccus są nieaktywne w monoterapii, mogą natomiast być stosowane w leczeniu skojarzonym z antybiotykami niszczącymi
ścianę komórkową (pod warunkiem, że szczep nie ma mechanizmu HLAR (ang. high-level aminoglycoside resistance)). Te cechy aminoglikozydów pozwalają na ich wygodne dawkowanie raz na dobę i warunkują przydatność w leczeniu ciężkich zakażeń szpitalnych spowodowanych przez bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie, a także w terapii empirycznej, zwykle w skojarzeniu z: beta-laktamami, glikopeptydami, chinolonami, metronidazolem lub ryfampicyną. Niestety, podobnie jak w przypadku innych antybiotyków, w ostatnich latach narasta także oporność bakterii na aminoglikozydy. Według raportu ECDC (Antimicrobial resistance surveillance in Europe, 2013), stosunkowo niski procent szczepów opornych notuje się dla
E. coli i Pseudomonas aeruginosa (10– 24%), natomiast szczepy Klebsiella pneumoniae i Acinetobacter baumannii
wykazu-ją znacznie wyższy odsetek oporności (50– 60%). Oporność na aminoglikozydy opiera się jednak na trzech różnych mecha-nizmach: enzymatycznym (modyfikacja grup aminowych i hydroksylowych przez acetylotransferazy, fosfotransferazy i nu-kleotydylotransferazy), receptorowym (zmiany na podjednostce 30S rybosomu, np. metylacja przez plazmidowo kodowa-ne metylazy) oraz transportowym (nieprzepuszczalność ściany komórkowej dla leku lub aktywkodowa-ne jego usuwanie z komór-ki). Wydaje się prawdopodobne, że mechanizm transportowy i enzymatyczny może być częściowo przełamywany poprzez użycie wysokiego miejscowego stężenia antybiotyku. Wprawdzie w terapii odchodzi się obecnie od miejscowego stosowania
antybiotyków, jednak w przypadku gentamycyny dopuszczalne jest jej użycie w postaci zarejestrowanych produktów, takich jak gąbka kolagenowa, uwalniająca miejscowo bardzo wysokie stężenie gentamycyny, które nie byłoby możliwe do zastoso-wania systemowo, ze względu na wysoką toksyczność produktu. Celem badań dotyczących miejscowego działania genta-mycyny uwalnianej z gąbki kolagenowej było porównanie różnymi metodami oporności na gentamycynę patogenów izolo-wanych z zakażeń kości i ran, w chirurgii, kardiochirurgii i ortopedii, oraz stworzenie modelu imitującego warunki panu-jące in vivo. Dlatego użyto materiału podobnego do budulca kości (hydroksyapatyt), utworzono formy biofilmowe szczepu na hydroksyapatycie i użyto bogatego odżywczo medium. Dodatkowo próbowano ocenić, czy w przypadku szczepów opor-nych już w hodowli planktonicznej możliwe jest przełamanie określonego stopnia oporności za pomocą wysokiego stężenia gentamycyny. Materiały i metody Badaniem objęto kliniczne, izolowane szczepy Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeru-ginosa oraz Klebsiella pneumoniae. Określano MIC (ang. minimal inhibitory concentration) szczepów w stosunku
do gen-tamycyny zarówno w formie planktonicznej (za pomocą metody E-testów oraz metody rozcieńczeniowej), jak i w formie biofilmowej – zmodyfikowaną metodą MIC na polistyrenie oraz na krążkach hydroksyapatytowych (HA). Do badań użyto produktu Garamycin® gąbka: 130 mg gentamycyny/200 mg siarczanu gentamycyny (1,3 mg/cm2) w połączeniu z nośnikiem
kolagenowym (EUSA Pharma). W doświadczeniu użyto fragmentów wielkości 1 cm2 – co przekłada się na zawartość
genta-mycyny w stężeniu 1300 μg/ml. Krążki hydroksyapatytowe o średnicy 9,6 mm stworzone zostały do badań przez Laborato-rium „Bad-Mat” Politechniki Wrocławskiej i wykonane z komercyjnie dostępnego proszku hydroksyapatytowego MT3300 (LOW-WET, Tomita Pharmaceutical Co.). Jakość wyprodukowanych krążków była sprawdzona przy użyciu mikrosko-pii konfokalnej i mikro-CT. Wyniki i Wnioski Uzyskane wyniki wykazały, że szczepy wrażliwe na gentamycynę w formie planktonicznej (MIC >2 μg/ml) charakteryzują się w formie biofilmowej opornością na gentamycynę (MIC=64– 1024 μg/ ml), która przełamana może być jedynie poprzez uzyskanie wysokich miejscowych stężeń antybiotyku – tak jak dzieje się to w przypadku zastosowania gąbki kolagenowej z gentamycyną. Okazało się bowiem, że wszystkie badane szczepy two-rzyły na hydroksyapatycie wysokooporny biofilm, a pomimo to ulegały skutecznej eradykacji przy użyciu tego produk-tu. Potwierdzono to posiewem ilościowym, wobec kontroli nietraktowanej gentamycyną. Badania kliniczne wskazują rów-nież, że do 48 godzin od implantacji utrzymuje się w tkance stężenie miejscowe gentamycyny powyżej 1300 μg/ml. Ponadto szczepy, które już w hodowli planktonowej wykazywały podwyższone MIC (od 4 nawet do 96), kwalifikowane jako oporne na gentamycynę, także były skutecznie eradykowane przy użyciu gentamycyny uwalnianej z gąbki. Skutecznie eradykowane były także oporne na gentamycynę szczepy K. pneumoniae KPC+ (MIC=3, 4 i 12 μg/ml). Natomiast szczepy K. pneumoniae NDM-1+ (MIC=256) nie ulegały eradykacji po zastosowaniu gąbki. Uzyskano także skuteczny efekt dla opornych szcze-pów Pseudomonas aeruginosa o MIC=96 i MIC=128. Szczepy o wysokim stopniu oporności (MIC<256 μg/ml w plankto-nie i MIC<2000 μg/ml w biofilmie) wykazywały całkowity brak eradykacji w porównaniu z kontrolą bez antybiotyku. Nale-ży jednak pamiętać, że aplikacja gentamycyny w postaci gąbki kolagenowej w kardiochirurgii, chirurgii i ortopedii stanowi pewien wyjątek, bowiem w leczeniu większości zakażeń ran, jak już wspomniano, odchodzi się od miejscowego stosowania antybiotyków (np. w postaci maści). Wydaje się że produkt ten może być skutecznie używany do eradykacji bakterii w za-każonych kościach i ranach dla szczepów wrażliwych i niskoopornych (zależność od MIC wymaga dalszych badań), jednak powinien być stosowany ściśle według wskazań i z określonymi ograniczeniami.
Słowa kluczowe: gentamycyna, MIC, oporność
BACTERIAL GENTAMYCIN-RESISTANCE AND LOCAL APPLICATION OF GENTAMYCIN IN ORTHOPEDICS,
SURGERY AND CARDIAC SURGERY
Mączyńska B, Junka AF, Rurańska-Smutnicka D, Secewicz A, Bartoszewicz M
Department of Pharmaceutical Microbiology and Parasitology, Medical University of Wroclaw
Introduction Gentamycin belongs to aminoglycosides’ class of antibiotics. It displays environment-dependent bacte-riocidal activity and rapid and inoculum-independent action. Aminoglycoside accumulation leads to the phenomenon referred to as the post-antibiotic effect (PAE). Broad antimicrobial spectrum of aminoglycosides includes Gram(-) rods (besides Haemophilus), Gram(+) cocci (Staphylococcus); Mycobacterium tuberculosis and other species including intracel-lular pathogenic bacteria such as Yersinia pestis and Brucella abortus. Aminoglycosides display weak activity against
S. pyo-genes, S. pneumoniae and anaerobic species. Aminoglycosides are ineffective against Enterococcus when used as a single
drug, however they may be used when antibiotics destroying bacterial cell wall are applied concurrently; with exception of HLAR mechanism-possessing strains. Above-mentioned aminoglycoside features are of beneficial impact in term of
treatment of severe nosocomial infections caused by Gram(+) and Gram(-) bacteria and also for empiric therapy together with beta-lactams, glycopeptides, quinolones, metronidazole and rifampicin. However, in the recent years increase of bacte-rial resistance against aminoglycosides is observed. According to ECDC (Antimicrobial resistance surveillance in Europe 2013), relatively low percentage of resistant strains is observed for E. coli and Pseudomonas aeruginosa (10– 24%), while analogical value for Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter baumanii reaches 50– 60%. There are three distinct resistance mechanisms to aminoglicosides: in enzymatic mechanism amine and hydroxylic groups are modified by acetylotransfer-ases, posphotransferases and nucleotidylic transferases; the other mechanism works through receptor alterations (changes of 30S ribosomal subunit, such as methylation performed by plasmid-encoded methylases) and, last but not least, by the transport mechanisms (impermeability of cell wall for drug or active efflux). It seems likely that the last two of above- -mentioned mechanisms might be at least partially overcame by local use of high antibiotic concentration. The local use of antibiotics is presently less frequently applied than previously, however it is acceptable to locally use registered, gentamycin- -containing products, such as collagen sponge that releases high concentration of this antibiotic. Aim Compare using in vitro methods, resistance and sensitivity of bone and wound pathogens against gentamycin released locally from collagen sponge and to establish experimental setting imitating in vivo conditions. To obtain these goals we used hydroxyapatite (HA) discs with preformed biofilm on it and we cultured it in rich medium. Additionally we tried to evaluate if resistance of planktonic cells could be overcame by application of high gentamycin concentration. Material and methods The MIC of gentamycin for clinical Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella pneumoniae planktonic and biofilmic forms was evaluated using microdilution method, E-test method and quantitative techniques using HA discs and polystyrene surface. As the gentamycin carrier, Garamycin® sponge (130 mg of gentamycin/200 mg of gentamycin sulphate – 1,3 mg/cm2 +
collagen carrier (EUSA Pharma)). The 1 cm2 sponge fragments containing 1300 μg/ml gentamycin concentration were
ap-plied. The HA discs of 9.6 mm diameter were performed by Wroclaw Technical University “Bad-Mat” laboratory from hy-droxyapatite powder MT3300 (LOW-WET, Tomita Pharmaceutical Co.). The quality of product was confirmed by confocal microscopy and micro-CT tomography. Results and Conclusions Planktonic, gentamycin-sensitive strains (MIC>2 μg/ml) when transformed into biofilm displayed resistance profile (MIC=64– 1024 μg/ml) that was overcame only by application of local, high drug concentration – as it happens when Garamycin® sponge is applied. All investigated strains, although they were in highly resistant biofilmic form were completely eradicated as compared to control samples that were not gentamy-cin-treated. The clinical trials indicate that local concentration of gentamycin remains high >1300 μg/ml up to 48 hours after implantation. Moreover, planktonic strains that displayed elevated MIC (4– 96 times higher above sensitivity baseline) and were gentamycin-resistant were also eradicated by gentamycin released from sponge. Also gentamycin-resistant KPC
K. pneumoniae strains (KPC+; MIC=3, 4, 12 μg/ml) were eradicated. Contrary, K. pneumoniae NDM-1+ strains (MIC=256)
were not eradicated. Efficient effect was observed also for resistant strains of Pseudomonas aeruginosa of MIC=96– 128. These strains that displayed high resistance pattern (MIC<256 μg/ml for planktonic forms and MIC<2000 μg/ml for bio-filmic forms), were not eradicated. The stress should be put on the fact that gentamycin-containing sponge in orthopedics, surgery and cardiac surgery is a somewhat exceptional because presently local application of antibiotics is being withdrawn. However, garamycin sponge seems to be feasible for eradication of bacteria from infected bones and wounds – if these bac-teria display sensitivity or low profile of resistance (dependence of efficacy to MIC value needs further experiments) and if a sponge is applied according to manufacturer’s guidelines.
