Artyku³ przegl¹dowy Review
Kompetencja rozwojowa (developmental competen-ce) oocytów jest definiowana jako zdolnoæ tych ko-mórek do przejcia stadium dojrzewania, skuteczne-go zap³odnienia, formowania zyskuteczne-goty oraz rozwoju zarodka do stadium przedimplantacyjnego. W³aciwy przebieg wszystkich tych etapów warunkuje równie¿
skuteczn¹ implantacjê oraz narodziny zdrowego po-tomstwa. Opisano szereg mechanizmów reguluj¹cych te procesy (13). Nale¿¹ do nich, miêdzy innymi, zmia-ny molekularne, przejawiaj¹ce siê modulacj¹ ekspre-sji wybranych genów, reguluj¹cych wa¿ne etapy zwi¹-zane z rozwojem oocytów oraz ró¿nicowaniem siê zarodków. Regulacje molekularne tych procesów polegaj¹ równie¿ na syntezie znacznych iloci mRNA
Ocena kompetencji rozwojowej oocytów
oraz zarodków wiñ na podstawie badañ
molekularnych i mikrofluidycznych*
)
BARTOSZ KEMPISTY, RAFA£ WALCZAK*, PATRYCJA NIADEK*, JAN DZIUBAN*, HANNA PIOTROWSKA**, PIOTR ZAWIERUCHA, KATARZYNA ZAORSKA, PAWE£ ANTOSIK***, DOROTA BUKOWSKA***, JÊDRZEJ M. JAKOWSKI***,
MICHA£ NOWICKI, MACIEJ ZABEL
Katedra i Zak³ad Histologii i Embriologii Wydzia³u Lekarskiego II UM, ul. wiêcickiego 6, 60-781 Poznañ *Zak³ad Mikroin¿ynierii i Fotowoltaiki Wydzia³u Elektroniki Mikrosystemów i Fotoniki PWr.,
ul. Zygmunta Janiszewskiego 11/17, 50-372 Wroc³aw
**Katedra i Zak³ad Toksykologii Wydzia³u Farmaceutycznego UM, ul. Dojazd 30, 60-631 Poznañ ***Katedra Weterynarii Wydzia³u Hodowli i Biologii Zwierz¹t UP, ul. Wojska Polskiego 52, 60-628 Poznañ
Kempisty B., Walczak R., niadek P., Dziuban J., Piotrowska H., Zawierucha P., Zaorska K., Antosik P., Bukowska D., Jakowski J. M., Nowicki M., Zabel M.
Assessment of porcine oocytes and embryo developmental competence based on molecular and microfluidic research
Summary
Evaluation of oocyte developmental competence has an important influence on the ability of these cells to attain maturation, successful fertilization, development of embryo to the blastocyst stage and proper implantation. Factors determining the reproductive potential of gametes included: (1) expression of important transcription factors, (2) epigenetic changes, which influence the silencing of selected genes transcription, (3) transcription regulation, and (4) post-transcriptional regulation. The epigenetic changes mainly include: DNA methylation, histones modifications and changes in chromatin structure in the oocytes. In several studies, the association between oocyte morphology (mostly determined by cumulus cell layers and granularity of cytoplasm) and the ability of these cells to attain maturation and fertilization has been described.
The use of biochemical, metabolomical and molecular markers is the most frequently applied tool in the assessment of oocyte developmental competence. However, most of these methods are invasive and lead to the decreased viability of the analyzed cells. Searching for new, objective and noninvasive techniques leads to the development of a microfluidic chip system, which shows the physical (spectral) properties of oocytes and embryos in comparison to the biological parameters.
In this article, selected issues associated with the genetic regulation of such processes as: maturation of oocytes, fertilization and early stages of embryonic development, have been presented. Moreover, the regulation of transcription and post-transcriptional modification during oogenesis and embryogenesis in mammals, with special relation to pigs and the possibilities of applying of microfluidics in assessment of oocyte and embryo developmental competence was shown.
Keywords: developmental competence, oocytes maturation, microfluidics
*) Praca wspó³finansowana z projektu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa
oraz bia³ek, które gromadzone s¹ w cytoplazmie ko-mórek podczas d³ugich etapów ró¿nicowania siê i doj-rzewania ¿eñskich gamet podczas follikulogenezy oraz oogenezy. Zgromadzony w ten sposób mRNA stano-wi matrycê do syntezy bia³ek reguluj¹cych wa¿ne eta-py rozwoju zarodków w stadium przedimplantacyjnym a¿ do momentu, w którym nastêpuje aktywacja geno-mu zarodkowego (EGA embryonic genome activa-tion). EGA jest procesem wykazuj¹cym wysok¹ spe-cyficznoæ gatunkow¹, poniewa¿ wystêpuje u ró¿nych gatunków ssaków na ró¿nych etapach ró¿nicowania siê blastomerów zarodkowych.
Proces dojrzewania oocytów dzieli siê na dwa g³ów-ne etapy: dojrzewanie j¹drowe (zwag³ów-ne równie¿ mole-kularnym) oraz dojrzewanie cytoplazmatyczne (7). W³aciwy przebieg obu tych procesów regulowany jest komunikacj¹ pomiêdzy komórk¹ jajow¹ a somatycz-nymi komórkami otaczaj¹cymi. Szlaki komunikacji wi¹¿¹ siê z kontrolowanym przep³ywem bia³ek regu-luj¹cych procesy dojrzewania oocytu. Uk³ady trans-portuj¹ce bia³ka tworzone s¹ g³ównie przez struktury zwane po³¹czeniami typu gap junction. Po³¹czenia te przypominaj¹ bia³kowe korytarze i s¹ zbudowane przez bia³ka wchodz¹ce w sk³ad du¿ej rodziny konek-syn (g³ównie s¹ to konekkonek-syny: 37, 43 i 45, Cx 37, 43, 45). Bia³ka te wspó³tworz¹ struktury po³¹czeñ typu gap junction i s¹ uwa¿ane za jedne z g³ównych markerów okrelaj¹cych zdolnoæ oocytów do dojrzewania. Ba-dania wykaza³y, ¿e ekspresja Cx43 i Cx45 oraz lokali-zacja komórkowa kodowanych przez nie bia³ek zwi¹-zane s¹ z morfologi¹ oocytów oraz wielkoci¹ pêche-rzyków jajnikowych, z jakich komórki te by³y pozy-skiwane. Ró¿na lokalizacja komórkowa tych bia³ek (mog¹ byæ one zlokalizowane w os³once przejrzystej lub w cytoplazmie lub w obu tych strukturach) wska-zuje, ¿e bia³ka te mog¹ pe³niæ odmienn¹ funkcjê w ró¿-nych strukturach komórkowych (5).
Proces zap³odnienia sk³ada siê z etapów interakcji oraz fuzji gamet (15, 17, 30). Oba te procesy podlega-j¹ cis³ej regulacji na poziomie molekularnym. Eks-presja wybranych bia³ek, takich jak bia³ka os³onki przejrzystej (ZP1, ZP2, ZP3 oraz ZP3á) czy integry-ny (integryna â-2, ITGB2), odgrywa kluczow¹ rolê w tym procesie. W przeprowadzonych badaniach z ostat-nich lat wykazano, ¿e ekspresja tych markerów za-p³odnienia (ZP2, ZP3, ITGB2) zwi¹zana jest z taki-mi czynnikataki-mi, jak: wiek dawczyñ, morfologia oocy-tów oraz komórek wzgórka jajononego czy wielkoæ pêcherzyków jajnikowych, z jakich pozyskiwane by³y oocyty (2, 3, 6). Wykazano ponadto, ¿e lokalizacja komórkowa integryn (ITGB2) oraz bia³ka os³onki przejrzystej 3 (ZP3) w przypadku oocytów wiñ zmie-niaj¹ siê w zale¿noci od tego, czy ekspresjê tych bia-³ek oraz ich lokalizacjê badano przed, czy po hodowli in vitro (IVM in vitro maturation). Znacz¹cy wzrost ekspresji tych bia³ek odnotowano w oocytach podda-nych procesowi dojrzewania in vitro (IVM). Ponadto, w przypadku wiêkszoci komórek po IVM badane
bia³-ka zlobia³-kalizowane by³y w cytoplazmie, podczas gdy w przypadku analizowanych komórek przed IVM lo-kalizacja ta zmienia³a siê na b³onow¹. Na podstawie przytoczonych badañ mo¿na zauwa¿yæ, ¿e ekspresja genów warunkuj¹cych w³aciwy przebieg procesów dojrzewania i zap³odnienia oocytów podlega regula-cji ze strony podobnych czynników (4, 5).
Morfologia oocytów jest kolejnym wa¿nym para-metrem zwi¹zanym z kompetencj¹ rozwojow¹ tych komórek. Klasyfikacja morfologiczna komórek jajo-wych stanowi nadal jeden z g³ównych kryteriów se-lekcyjnych powszechnie stosowanych w procedurach poprzedzaj¹cych manipulacjê na oocytach, takich jak: dojrzewanie in vitro (IVM), zap³odnienie in vitro (IVF in vitro fertilization) oraz produkcja zarodków w wa-runkach pozaustrojowych (IVP in vitro production). W okrelaniu jakoci morfologicznej oocytów, pos³u-guj¹c siê standardow¹ ocen¹ w mikroskopie wietl-nym, uwzglêdnia siê takie parametry, jak: liczba warstw komórek wzgórka jajononego (cumulus complex), gruboæ os³onki przejrzystej (zona pellucida), zabar-wienia i ziarnistoci cytoplazmy oraz strukturê cia³ka kierunkowego (12, 16). Wszystkie wymienione para-metry wykazuj¹ zwi¹zek z kompetencj¹ rozwojow¹ oocytów. Oocyty charakteryzuj¹ce siê obni¿on¹ war-toci¹ wskaników morfologicznych nie mog¹ osi¹g-n¹æ pe³nej kompetencji rozwojowej.
Zgromadzony podczas follikulogenezy i oogenezy mRNA staje siê matryc¹ do syntezy bia³ek reguluj¹-cych wa¿ne etapy zwi¹zane z formowaniem zygoty oraz pocz¹tkowymi etapami rozwoju zarodkowego w stadium przedimplantacyjnym. Rozwój zarodków w tych stadiach do momentu, w którym nastêpuje aktywacja genomu zarodkowego (EGA), odbywa siê na matczynym mRNA. Dlatego te¿ sugeruje siê, ¿e zaburzenie etapów follikulogenezy lub oogenezy w znacz¹cy sposób wp³ywa na niew³aciw¹ iloæ zgro-madzonego mRNA w oocytach, co nastêpnie mo¿e skutkowaæ zaburzeniem rozwoju zarodków w stadium przedimplantacyjnym.
Ponadto wykazano udzia³ plemnika we wczesnych stadiach rozwoju zarodkowego. Pos³uguj¹c siê mode-lem mysim Ostermeier i wsp. (23) wykazali, ¿e nie-które z transkryptów specyficznych dla plemników, jak protamina 2 (PRM2) oraz klusteryna (Clu), mog¹ byæ przekazywane do komórki jajowej podczas zap³odnie-nia. Sugeruje siê jednak, ¿e transkrypty te mog¹ wp³y-waæ w sposób toksyczny na komórkê jajow¹. Badania te zosta³y potwierdzone przez innych autorów, wyko-rzystuj¹cych pochodz¹ce od wiñ oocyty, plemniki, zygoty oraz zarodki w stadium dwukomórkowym (15). Jak dot¹d, badania nad istnieniem oraz prawdo-podobn¹ funkcj¹ cz¹steczek mRNA w plemnikach zwierz¹t by³y prowadzone w niewielkim stopniu. Na-tomiast w badaniach przeprowadzonych na plemni-kach ludzkich wykazano wyrane korelacje pomiêdzy ich iloci¹ a: (1) zdolnoci¹ plemników do zap³od-nienia, (2) ruchliwoci¹ plemników oraz (3)
rozwo-jem zarodków w stadium przedimplantacyjnym (9, 14, 18).
Molekularne aspekty embriogenezy
Pe³na kompetencja rozwojowa oocytów jest osi¹-gana po w³aciwym przebiegu procesu dojrzewania j¹drowego oraz cytoplazmatycznego. Podczas tych stadiów informacja genetyczna ulega transkrypcji na RNA, który nastêpnie jest przechowywany i staje siê matryc¹ do przepisywania informacji na bia³ko. Po osi¹gniêciu stadium zaniku pêcherzyka zarodkowego (germinal vesicle break down, GVBD) proces trans-krypcji zostaje zatrzymany a¿ do przejcia do stadium metafazy drugiego podzia³u mejotycznego (MII). Pod-czas fuzji b³on komórkowych oocytu oraz plemnika dochodzi do przesuniêcia chromatyny plemnika z ooplazmy oraz wznowienia i dokoñczenia mejozy. Chromatyna pochodz¹ca zarówno z plemnika, jak i oocytu tworzy oddzielne przedj¹drza (pronucleus), które nastêpnie migruj¹ do rodkowej czêci cytoplaz-my komórki jajowej. Podczas pierwszego podzia³u mitotycznego nastêpuje rozpad przedj¹drzy. Chroma-tyna pochodz¹ca z plemników oraz oocytów wspó³-tworzy chromosomy formuj¹ce p³ytkê metafazow¹, z której podczas cytokinezy wêdruj¹ one nastêpnie do przeciwleg³ych biegunów komórki. Specyfika pierw-szych etapów rozwoju zarodkowego u wiñ polega na tym, ¿e po pierwszym podziale mitotycznym nastêpu-je natychmiast synteza DNA z pominiêciem fazy G1. Po zakoñczeniu syntezy DNA (nastêpuje to po oko³o 12 godzinach (26)) zarodek wchodzi bezporednio w kolejny podzia³ mitotyczny z pominiêciem pored-niej fazy G2. Dopiero w stadium 4-komórkowym za-rodek wchodzi w fazê G1, co jest zwi¹zane z aktywa-cj¹ transkrypcji (29). Czterokomórkowe stadium za-rodka jest ponad dwukrotnie d³u¿sze od stadium dwu-komórkowego, co wynika z krótkiej fazy G1, a d³u-giej fazy G2 (1). W momencie, gdy chromatyna nie jest jeszcze zwi¹zana z polimerazami DNA, np. w fa-zie G1 i G2, ca³a transkrypcyjna bia³kowa maszy-neria zyskuje dostêp do chromatyny, aktywuj¹c tym samym syntezê RNA (25). W zwi¹zku z zahamowa-niem lub aktywowan¹ w niewielkim stopniu transkryp-cj¹ pomiêdzy stadium GVBD a stadium 4-komórko-wym zarodka wskazuje siê, ¿e stadium pêcherzyka za-rodkowego (germinal vesicle, GV) kontroluje rozwój zarodka w pierwszych podzia³ach komórkowych. Su-geruje siê tak¿e, ¿e zgromadzona podczas oogenezy i follikulogenezy informacja genetyczna w formie transkryptomu i proteomu musi byæ wystarczaj¹ca w celu kierowania w³aciwym przebiegiem pierwszych podzia³ów blastomerów zarodka oraz, co siê z tym wi¹¿e, osi¹gniêcia w³aciwej konfiguracji chromaty-ny. Wszystkimi wymienionymi powy¿ej procesami kie-ruje ekspresja cile okrelonych genów. W przypad-ku niew³aciwej konfiguracji chromatyny mo¿e do-chodziæ do zahamowania rozwoju zarodka, co z kolei mo¿e byæ wynikiem zaburzonej transkrypcji genów,
wa¿nych z punktu widzenia rozwoju zarodka (34). Widoczne jest to na przyk³adzie zarodków powsta³ych na drodze klonowania (8). Po aktywacji genomu za-rodkowego (EGA) u wiñ blastomery zarodkowe podlegaj¹ kolejnym podzia³om do stadium 8-, 16-, a nastêpnie 32-komórkowego. Podczas tego etapu dochodzi do obwodowego i niesymetrycznego roz-mieszczenia blastomerów zarodkowych, co skutkuje formowaniem blastocysty z dwóch odmiennych typów komórek, z których ka¿da posiada swój w³asny wzór transkrypcyjny. Najwiêksze zmiany w syntezie mRNA nastêpuj¹ w stadium 4-komórkowym oraz blastocy-cie. Podlegaj¹ one regulacji zarówno transkrypcyjnej, jak i posttranskrypcyjnej (37).
Regulacja transkrypcji w oocytach oraz zarodkach W³aciwy przebieg oogenezy u ssaków, dojrzewa-nie oocytów, zap³oddojrzewa-niedojrzewa-nie oraz pocz¹tkowe etapy roz-woju zarodkowego w stadium przedimplantacyjnym s¹ regulowane oraz koordynowane przez ekspresjê maszynerii genowej, która jest cile okrelona, co do czasu aktywacji oraz przestrzeni (37). Odnosz¹c siê do wielu bia³kowych czynników transkrypcyjnych, które wi¹¿¹c siê do sekwencji promotorowych wybra-nych genów, aktywuj¹ transkrypcjê, nale¿y tak¿e zwró-ciæ uwagê, ¿e regulacja genetyczna pocz¹tkowych sta-diów rozwoju zarodkowego odbywa siê na drodze mechanizmów epigenetycznych. Epigenetyka oznacza dziedziczne zmiany genetyczne, które s¹ zwi¹zane z funkcj¹ genów, ale nie wi¹¿¹ siê ze zmian¹ sekwen-cji DNA. Mechanizmy epigenetyczne w oocytach oraz zarodkach polegaj¹ na: (1) metylacji DNA, (2) mo-dyfikacji histonów, (3) zmian struktury chromatyny (remodeling) oraz zmianach w strukturze niekoduj¹-cego RNA (non-coding RNA, ncRNA).
Metylacja cytozyny, wystêpuj¹cej w formie wysp dinukleotydowych CpG, odgrywa kluczow¹ rolê w re-gulacji transkrypcji u ssaków (10). W wiêkszoci przy-padków zametylowanie s¹siaduj¹cych wysp CpG w strukturze danego genu prowadzi do zahamowania jego transkrypcji (11). Metylacja DNA jest procesem katalizowanym przez trzy g³ówne enzymy, nale¿¹ce do grupy metylotransferaz, tj: DNMT1, DNMT3a i DNMT3b. Badania wykonane przez Whitworth i wsp. (37) wykaza³y 20-krotny wzrost ekspresji mRNA dla genu DNMT1 w oocytach w stadium GV oraz 4-ko-mórkowym w porównaniu do blastocysty, podczas gdy poziom ekspresji genu DNMT3b nie ulega³ zmianie. W procesie wyciszania ekspresji wybranych genów uwzglêdnia siê cztery nastêpuj¹ce mechanizmy: (1) bezporednie zahamowanie ekspresji czynnika trans-krypcyjnego wi¹¿¹cego siê do zmetylowanych regio-nów promotorowych danego genu, (2) aktywacjê do-datkowych korepresorów do zmetylowanych regionów sekwencji promotora poprzez w³¹czenie w ten proces szeregu bia³ek wi¹¿¹cych siê do DNA, (3) remodeling chromatyny, w którym porednicz¹ bia³ka zwi¹zane z metylotransferazami oraz (4) wyciszenie
wydajno-ci etapu elongacji transkrypcji, bogatych w wyspy CpG sekwencjach promotorowych wybranych genów (21).
Regulacja post-transkrypcyjna
Wiele sporód cz¹steczek RNA oraz bia³ek pocho-dzenia matczynego ulega degradacji przez aktywa-cjê microRNA lub wi¹zania siê bia³ek regulatorowych do nie podlegaj¹cych translacji sekwencji 3 (28, 31). Degradacja bia³ek pochodz¹cych z oocytów nastêpuje natychmiast po zap³odnieniu. Sugeruje siê istnienie dwóch etapów degradacji: pierwszy z nich nastêpuje po zap³odnieniu, drugi natomiast po aktywacji geno-mu zarodkowego (EGA).
Makroautofagia polega na zwi¹zaniu degradowa-nych bia³ek i skierowaniu ich do autofagosomów, ule-gaj¹cych fuzji z lizosomami, w których dochodzi do degradacji (22). Proces ten jest regulowany miêdzy innymi poprzez bia³ko autofagowe 5 (ATG5), którego wzrost ekspresji u myszy nastêpuje po zap³odnieniu lub partenogenetycznej aktywacji oocytów. Aktywnoæ tego systemu spada natomiast w momencie obumar-cia zarodków w stadium 4-8-komórkowym (35). Whit-worth i wsp. (37) wykazali obni¿enie ekspresji bia³ka ATG5 u wiñ pocz¹wszy od stadium GV oocytów, poprzez stadium 4-komórkowe a¿ do ca³kowitego spadku w stadium blastocysty. Ekspresja genu ATG5 w oocytach i zarodkach wiñ mo¿e byæ zatem potwier-dzeniem istnienia systemu makroautofagii tak¿e u tego gatunku zwierz¹t.
Rola badañ mikrofluidycznych w ocenie kompetencji rozwojowej oocytów oraz zarodków Ocena kompetencji rozwojowej oocytów oraz za-rodków polega na okrelaniu profili biochemicznych, molekularnych oraz metabolicznych analizowanych komórek (13, 19). W wiêkszoci przypadków badania te zwi¹zane s¹ z du¿¹ inwazyjnoci¹ i/lub prowadz¹ do utraty ¿ywotnoci analizowanych komórek. Dlate-go te¿ poszukuje siê nowych, nieinwazyjnych metod oceny kompetencji rozwojowych oocytów oraz zarod-ków, które by³yby w pe³ni obiektywne, zautomatyzo-wane, szybkie w wykonaniu oraz tanie.
Termin mikrofluidyka oznacza badanie w³aci-woci fizykochemicznych cieczy przep³ywaj¹cych przez uk³ady kapilarne mikrochipów. Badania te zna-laz³y równie¿ powszechne zastosowanie w biotechno-logii oraz medycynie (20). Wyniki badañ ostatnich lat wskazuj¹ tak¿e na mo¿liwoæ wykorzystania mikro-fluidyki w ocenie w³aciwoci oocytów oraz zarod-ków ssazarod-ków. Mikrochip stosowany w tego typu bada-niach zbudowany jest z mikrokomory, do której za pomoc¹ kana³ów doprowadzaj¹cych wprowadzany jest oocyt lub zarodek, oraz dwóch lub czterech wiat³o-wodów. Funkcja wiat³owodów polega na zbieraniu fali wiat³a emitowanego ze ród³a. Po wprowadzeniu komórki (oocyt lub zarodek) do mikrokomory docho-dzi do pomiaru jej w³aciwoci spektralnych, odno-sz¹cych siê g³ównie do gruboci os³onki przejrzystej
i b³ony komórkowej oraz ziarnistoci i zabarwienia cytoplazmy.
W literaturze dostêpnych jest jednak niewiele da-nych, odnosz¹cych siê do mo¿liwoci wykorzystania systemów opartych na mikrochipach fluidycznych w biologii rozrodu (24, 27, 36, 37). Jedne z pierwszych badañ dotycz¹cych analiz w³aciwoci spektralnych komórek jajowych i zarodków zosta³y wykonane przez Szczepañsk¹ i wsp. (32). Analizy te dotyczy³y oocy-tów wiñ oraz byd³a, podzielonych na, odpowiednio, trzy i cztery klasy morfologiczne (oparte na klasyfi-kacji morfologicznej opracowanej przez Jackowsk¹ i wsp. 12). Wykazano ró¿nice w maksymalnych war-tociach spektralnych w przypadku oocytów wiñ (620 nm) oraz byd³a (580 nm). Ponadto przedstawio-no charakterystyki spektralne dla oocytów wiñ izolo-wanych z pêcherzyków jajnikowych o ró¿nej wielko-ci (ma³ych < 3 mm, rednich 3-5 mm oraz du¿ych > 5 mm). Kolejne badania tego zespo³u potwier-dzi³y wczeniejsze wyniki odnosz¹ce siê do specyficz-noci maksimum spektralnego, ró¿nego dla oocytów wiñ i byd³a (33). Sugeruje to, ¿e opracowany uk³ad mikrochipu fluidycznego analizuj¹cy w³aciwoci spektralne badanych komórek jest systemem okrela-j¹cym jakoæ oocytów, odnosz¹c siê do ich morfologii oraz kompetencji rozwojowej.
Podsumowanie
Przedstawiono wybrane zagadnienia zwi¹zane z ocen¹ kompetencji rozwojowej oocytów oraz zarod-ków ssazarod-ków ze szczególnym uwzglêdnieniem specy-fiki szeregu procesów biochemicznych oraz rozwojo-wych u wiñ. Warto podkreliæ, ¿e wiele sporód tych procesów podlega cis³ej regulacji genetycznej, pole-gaj¹cej na aktywacji ekspresji wybranych genów lub czynników transkrypcyjnych. Ponadto zastosowanie nowych, nieinwazyjnych technik oceny kompetencji rozwojowej oocytów w postaci mikrochipów
fluidycz-Ryc. 1. Schemat budowy mikrochipu fluidycznego (Lab-on--Chip) stosowanego w ocenie w³aciwoci spektralnych oocy-tów oraz zarodków ssaków. Widok z góry
Mikrochip zbudowany jest z dwóch wiat³owodów, odbieraj¹-cych falê wiat³a emitowanego ze ród³a (A), krzy¿uj¹odbieraj¹-cych siê w komorze pomiarowej. Do komory pomiarowej mikrokana³em doprowadzaj¹cym wprowadzana jest komórka jajowa lub zaro-dek. rednica kana³u mikrofluidycznego wprowadzaj¹cego i wy-prowadzaj¹cego komórki do komory pomiarowej wynosi 250 µm
nych otwiera przed nami nowe mo¿liwoci zastoso-wania w³aciwoci fizycznych (spektralnych) badanych komórek w opisywaniu cech biologicznych. Mimo i¿ wstêpne wyniki badañ s¹ obiecuj¹ce, nale¿y przepro-wadziæ szereg kolejnych analiz korelacji parametrów spektralnych ze zdolnoci¹ komórek jajowych i zarod-ków do wzrostu i rozwoju.
Pimiennictwo
1.Anderson A. R., Wilkinson S. S., Price S., Crain J. L.: Reduction of high order multiples in frozen embryo transfers. Reprod. BioMedicine Online 2005, 10, 402-405.
2.Antosik P., Kempisty B., Bukowska D., Jackowska M., W³odarczyk R., Budna J., Brüssow K. P., Lianeri M., Jagodziñski P. P., Jakowski J. M.: Follicular size is associated with the levels of transcripts and proteins of selected molecules responsible for the fertilization ability of oocytes of pube-ral gilts. J. Reprod. Dev. 2009, 55, 588-593.
3.Antosik P., Kempisty B., Bukowska D., Lianeri M., Bie¿yñski J., Jakowski J. M., Olechnowicz J.: Effect of different estrus synchronization systems on embryo quality in multiparous sows and prepuberal gilts. Medycyna Wet. 2010, 66, 251-256.
4.Antosik P., Kempisty B., Jackowska M., Bukowska D., Lianeri M., Brüssow K. P., Wona M., Jakowski J.: The morphology of porcine oocytes is asso-ciated with zona pellucida glycoprotein 3 and integrin beta 2 protein levels. Vet. Med. Praha 2010, 55, 154-162.
5.Antosik P., Kempisty B., Jackowska M., Piotrowska H., Bukowska D., Wona M., Lianeri M., Brüssow K. P., Jakowski J.: Assessment of trans-cript and protein levels contributing to cell cycle control and gap junction connections in morphologically variable groups of porcine cumulus-oocyte complexes. Vet. Med. Praha 2010, 55, 512-521.
6.Bukowska D., Kempisty B., Antosik P., Jackowska M., Wona M., Lianeri M., Jakowski J. M.: Association between the number and quality of bitch COC.s and selected donor factors. Medycyna Wet. 2010, 66, 480-483.
7.Bukowska D., Kempisty B., Antosik P., Jakowski J. M., Olechnowicz J.: Selected aspects of canine oocytes maturation, fertilization and embryo de-velopment in dogs. Medycyna Wet. 2008, 64, 617-736.
8.Carter D. B., Lai L., Park K. W., Samuel M., Lattimer J. C., Jordan K. R., Estes D. M., Besch-Williford C., Prather R. S.: Phenotyping of transgenic cloned piglets. Cloning Stem. Cells 2002, 4, 131-145.
9.Depa-Martynów M., Kempisty B., Lianeri M., Jagodziñski P. P., Jedrzej-czak P.: Association between fertilin beta, protamines 1 and 2 and sperma-tid-specific linker histone H1-like protein mRNA levels, fertilization ability of human spermatozoa, and quality of preimplantation embryos. Folia Histo-chem. Cytobiol. 2007, 45, 79-85.
10.Górska I., Kempisty B., Jagodziñski P. P.: Epigenetyczne modyfikacje w komórkach rozrodczych. Gin. Prakt. 2006, 3, 2-5.
11.Iager A. E., Ragina N. P., Ross P. J., Beyhan Z., Cunniff K., Rodriguez R. M., Cibelli J. B.: Trichostatin A improves histone acetylation in bovine somatic cell nuclear transfer early embryos. Cloning Stem. Cells 2008, 10, 371-379. 12.Jackowska M., Kempisty B., Antosik P., Bukowska D., Budna J., Lianeri M., Rosiñska E., Wona M., Jagodziñski P. P., Jakowski J. M.: The morphology of porcine oocytes is associated with zona pellucida glycoprotein transcript contents. Reprod. Biol. 2009, 9, 79-85.
13.Jakowski J. M., Kempisty B., Wona M., Walczak R., Szczepañska P., Dziuban J., Antosik P.: Wybrane metody oceny kompetencji rozwojowej oraz selekcji oocytów i zarodków bydlêcych. Medycyna Wet. 2010, 66, 740-744. 14.Jêdrzejczak P., Kempisty B., Bryja A., Mostkowska M., Depa-Martynów M., Pawlaczyk L., Jagodziñski P. P.: Qantitative assessment of transition proteins 1, 2 spermatid-specific linker histone H1-like protein transcripts in spermatozoa from normozoospermic and asthenozoospermic men. Arch. Androl. 2007, 53, 199-205.
15.Kempisty B., Antosik P., Bukowska D., Jackowska M., Lianeri M., Jakowski J. M., Jagodziñski P. P.: Analysis of selected transcript levels in porcine spermatozoa, oocytes, zygotes and two-cell stage embryos. Reprod. Fertil. Dev. 2008, 20, 513-518.
16.Kempisty B., Antosik P., Bukowska D., Jackowska M., Lianeri M., Jakowski J. M., Jagodziñski P. P.: Assessment of zona pellucida glycoprotein and integrin transcript contents in porcine oocytes. Reprod. Biol. 2009, 9, 71-78. 17.Kempisty B., Bukowska D., Wona M., Sikora J., Jakowski J. M.: Moleku-larne aspekty interakcji plemnika z oocytem u ssaków. Medycyna Wet. 2010, 66, 544-546.
18.Kempisty B., Depa-Martynow M., Lianeri M., Jedrzejczak P., Darul-Waso-wicz A., Jagodzinski P. P.: Evaluation of protamines 1 and 2 transcript
contents in spermatozoa from asthenozoospermic men. Folia Histochem Cytobiol. 2007, 45, 109-113.
19.Kempisty B., Walczak R., Antosik P., Szczepañska P., Wona M., Bukowska D., Zaorska K., Dziuban J., Jakowski J. M.: Systemy oceny kompetencji roz-wojowej oocytów oraz zarodków oparte na technologii mikrofluidycznej typu Lab-on-Chip. Medycyna Wet. 2011, 67, 25-28.
20.Kim S., Kim H. J., Jeon N. L.: Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr. Biol. (Camb). 2010, 2, 584-603.
21.Klose R. J., Bird A. P.: Genomic DNA methylation: the mark and its media-tors. Trends Biochem Sci. 2006, 31, 89-97.
22.Mizushima N., Levine B., Cuervo A. M., Klionsky D. J.: Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature 2008, 451, 1069-1075. 23.Ostermeier G. C., Miller D., Huntriss J. D., Diamond M. P., Krawetz S. A.:
Reproductive biology: delivering spermatozoan RNA to the oocyte. Nature 2004, 429, 154.
24.Park J., Li J., Han A.: Micro-macro hybrid soft-lithography master (MMHSM) fabrication for lab-on-a-chip applications. Biomed. Microdev. 2010, 12, 345--351.
25.Prather R. S.: Nuclear control of early embryonic development in domestic pigs. J. Reprod. Fertil. Suppl. 1993, 48, 17-29.
26.Prather R. S., Hoffman K. E., Schoenbeck R. A., Stumpf T. T., Li J.: Charac-terization of DNA synthesis during the 2-cell stage and the production of tetraploid chimeric pig embryos. Mol. Reprod. Dev. 1996, 45, 38-42. 27.Sano H., Matsuura K., Naruse K., Funahashi H.: Application of a
micro-fluidic sperm sorter to the in-vitro fertilization of porcine oocytes reduced the incidence of polyspermic penetration. Theriogenology 2010, 74, 863--870.
28.Schier A. F.: The maternal-zygotic transition: death and birth of RNAs. Science 2007, 316, 406-407.
29.Schoenbeck R. A., Peters M. S., Rickords L. F., Stumpf T. T., Prather R. S.: Characterization of deoxyribonucleic acid synthesis and the transition from maternal to embryonic control in the 4-cell porcine embryo. Biol. Reprod. 1992, 47, 1118-1125.
30.Sikora J., Kempisty B., Jêdrzejczak P., Jagodziñski P. P.: Rola uszkodzeñ DNA w plemnikach w ocenie ich zdolnoci do zap³odnienia. Przegl. Lek. 2006, 63, 800-802.
31.Stitzel M. L., Seydoux G.: Regulation of the oocyte-to-zygote transition. Science 2007, 316, 407-408.
32.Szczepañska P., Walczak R., Dziuban J., Jackowska M., Kempisty B., Jakowski J. M., Bargiel S.: Lab-on-chip quality classification of porcine/ bovine oocytes. Procedia Chemistry 2009, 1, 341-344.
33.Szczepañska P., Walczak R., Dziuban J., Kempisty B., Jackowska M., Antosik P., Jakowski J., Bargiel S.: Ocena jakociowa komórek rozrodczych zwierz¹t hodowlanych z wykorzystaniem mikrocytometru typu lab-chip. Elek-tronika 2010, 6, 93-96.
34.Tian L., Wu X., Lin Y., Liu Z., Xiong F., Han Z., Zhou Y., Zeng Q., Wang Y., Deng J., Chen H.: Characterization and Potential Function of a Novel Pre-Implantation Embryo-Specific RING Finger Protein: TRIML. Mol. Reprod. and Develop. 2009, 76, 656-664.
35.Tsukamoto S., Kuma A., Murakami M., Kishi C., Yamamoto A., Mizu-shima N.: Autophagy is essential for preimplantation development of mouse embryos. Science 2008, 321, 117-120.
36.Walczak R., Szczepañska P., Dziuban J., Kempisty B., Jackowska M., Antosik P., Jakowski J., Che³moñska-Soyta A.: Lab-on-a-chip for develop-mental competence assessment of bovine oocytes. Elektronika 2010, 11, 30-33.
37.Whitworth K. M., Agca C., Kim J. G., Patel R. V., Springer G. K., Bivens N. J., Forrester L. J., Mathialagan N., Green J. A., Prather R. S.: Transcrip-tional profiling of pig embryogenesis by using a 15-K member unigene set specific for pig reproductive tissues and embryos. Biol. Reprod. 2005, 72, 1437-1451.
Adres autora: dr Bartosz Kempisty, ul. wiêcickiego 6, 60-781 Poznañ; e-mail: etok@op.pl
