[2018/Nr 4] Kazeina mleka wybranych zwierząt hodowlanych jako prekursor „funkcjonalnych” peptydów – analiza bioinformatyczna

Damir Mogut, Iwona Szerszunowicz

KAZEINA MLEKA WYBRANYCH ZWIERZĄT HODOWLANYCH JAKO PREKURSOR „FUNKCJONALNYCH” PEPTYDÓW –

ANALIZA BIOINFORMATYCZNA Katedra Biochemii Żywności, Wydziału Nauki o Żywności

Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie Kierownik: prof. dr hab. inż. M. Darewicz

Produkty mleczarskie są jednym z podstawowych pokarmów spożywanych przez ludzi. Rynek funkcjonalnych produktów wciąż się rozwija. Jednym z ele-mentów projektowania żywności funkcjonalnej jest analiza surowców pod kątem zawartości potencjalnie bioaktywnych peptydów za pomocą programów kom-puterowych. Narzędzie dostępne na stronie uwm.edu.pl/biochemia umożliwia wyszukiwanie peptydów o wybranej biologicznej aktywności w białkach żywno-ści. Udowodniono, że kazeina mleka owczego jest bogatym źródłem potencjalnie aktywnych peptydów, w szczególności inhibitorów DPP4 i ACE odpowiedzialnych za obniżanie poziomu glukozy we krwi oraz nadciśnienia. Kontrolowana pro-teoliza umożliwiałaby otrzymywanie produktów spożywczych wspomagających profi laktykę cukrzycy typu 2 oraz nadciśnienia tętniczego.

Hasła kluczowe: żywność funkcjonalna, kazeina, peptydy, BIOPEP-UWM. Key words: functional food, casein, peptide, BIOPEP-UWM.

Mleko jest pierwszym „funkcjonalnym” pokarmem jaki człowiek spożywa. Funkcjonalne produkty mleczarskie stanowią bardzo szeroki asortyment. Mogą one być różnie klasyfi kowane w zależności od kryteriów podziału. W literaturze można zauważyć podział żywności funkcjonalnej na dwa główne nurty:

• uwzględniające ich specyfi czny skład jak np.: probiotyczna, wzbogacana, nisko-energetyczna, wysokobłonnikowa czy o obniżonej zawartości cholesterolu; • uwzględniające pokrywania określonych potrzeb organizmu jak np.: dla osób

obciążonych stresem, sportowców, kobiet karmiących, niemowląt, osób starszych czy produkty zmniejszające ryzyko wybranych chorób.

Najczęstszym podziałem produktów mleczarskich pod względem ich właściwości prozdrowotnych jest:

• artykuły podstawowe tj. mleko spożywcze, fermentowane produkty mleczarskie, niefermentowane napoje mleczarskie, itp.);

• produkty mleczarskie o zmodyfi kowanym składzie tj.: nisko- i bezlaktozowe, hipoalergiczne, fortyfi kowane wapniem i/lub magnezem;

• funkcjonalne produkty mleczarskie z udowodnionym korzystnym wpływem na organizm np.: wzbogacone w składniki funkcjonalne tj. bakterie probiotyczne i/ lub prebiotyki) (1).

Inną metodą podejścia do zagadnienia żywności funkcjonalnej jest analiza składu makroskładników danego produktu. Mleko, w zależności od gatunku, zawiera od 3 do 6% białka (kozie 2,9, krowie 3,2, owcze 6,2%, w tym odpowiednio 2,47, 2,63 oraz 5,16% kazeiny) (2). Białka te są niezwykle cenne biologicznie. Już w 1951 r. analizowano skład aminokwasowy mleka i produktów mleczarskich. Ustalono wówczas, że białka mleka są źródłem wszystkich egzogennych aminokwasów (3). Są one zatem przedmiotem badań naukowych od ponad 60-ciu lat. Można je po-dzielić na trzy główne grupy: kazeinę, białka serwatkowe oraz białka otoczki ku-leczek tłuszczowych (4). Wśród białek mleka ilościowo dominuje kazeina. Należy ona do rodziny heterogenicznych fosfoprotein (5), różniących się zarówno składem aminokwasowym jak i stopniem ufosforylowania czy glikozylacji. Wyróżniamy

następujące główne formy kazeiny: αs1, αs2, β i ϰ. W mleku znaczna część kazeiny

(95%) występuje w formie micel koloidalnych (6).

Bioaktywne peptydy pochodzące z mleka i produktów mleczarskich mogą po-wstawać w wyniku hydrolizy białek enzymami trawiennymi, fermentacji mleka przy udziale kultur starterowych, proteolizy z udziałem enzymów pochodzenia mi-krobiologicznego, roślinnego lub endogennych enzymów mleka. Najskuteczniej-szą metodą otrzymywania biopeptydów jest kombinacja enzymatycznej hydrolizy z udziałem enzymów trawiennych z fermentacją mleka za pomocą kultur startewych lub hydrolizy z wykorzystaniem enzymów mikrobiologicznych czy też ro-ślinnych (7). Niektóre bioaktywne peptydy znalazły już zastosowanie w produkcji i projektowaniu żywności jak też leków. Przykładem są produkty zawierające ka-zeinofosfopeptydy, stosowane do produkcji artykułów przeznaczonych do higieny jamy ustnej. Peptydy te wykazują również działanie przeciwnowotworowe (8).

Coraz więcej badań wskazuje na to, że produkty mleczarskie mogą być pomocne w profi laktyce wielu chorób cywilizacyjnych tj. cukrzyca typu 2 czy nadciśnienie tętnicze (9). Peptydy bioaktywne pochodzące np. z kazeiny, oddziałując z odpo-wiednimi receptorami mogą regulować funkcjonowanie organizmu (10). Peptydo-we inhibitory DPP4 (dipeptydylopeptydazy 4) oraz ACE (enzymu konPeptydo-wertującego angiotensynę) przyczyniają się odpowiednio do obniżania poziomu glukozy we krwi i ciśnienia krwi (11). Analiza badań wykonanych na pacjentach chorych na cukrzycę typu 2 oraz na populacji kontrolnej potwierdzają, że regularne spożywanie produktów mleczarskich, w tym serów dojrzewających, pozytywnie wpływało na poziom glukozy we krwi na czczo i tym samym zmniejszało ryzyko zachorowania na cukrzycę typu 2 (12). Według badań produkty mleczarskie, oprócz obniżania ciśnienia tętniczego krwi, mogą również wpływać pozytywnie na metabolizm trój-glicerydów i cholesterolu, co może wspomóc profi laktykę chorób układu krążenia (13). Badania in vitro potwierdzają, że kazeina jest prekursorem zarówno peptydów biorących udział w obniżaniu glikemii (14) jak i ciśnienia krwi (15).

Przydatnym narzędziem w rozwoju strategii produkcji żywności o fi zjologicz-nych właściwościach mogą być badania z wykorzystaniem narzędzi komputero-wych dotyczące poszukiwania białek jako prekursorów bioaktywnych peptydów. Celem pracy była analiza porównawcza składu kazein pochodzących z mleka

owczego, koziego i krowiego. Analiza ta umożliwi ocenienie, który surowiec może być potencjalnie najlepszy do produkcji funkcjonalnych produktów mleczar-skich.

MATERIAŁY I METODY

W bazie BIOPEP-UWM dostępnej na stronie http://www.uwm.edu.pl/biochemia w panelu „Analysis” wygenerowano profi l potencjalnej biologicznej aktywności wybranych sekwencji białek (zakładka „Profi les of proteins biological activity”) oraz obliczono częstość występowania motywów o określonej aktywności w łań-cuchu polipeptydowym białka (zakładka „A, B, Y Calculation”). Profi l potencjal-nej aktywności biologiczpotencjal-nej białka określa rodzaj, ilość i położenie występujących w białku fragmentów aktywnych. Częstość występowania fragmentów o określonej aktywności biologicznej w łańcuchu białkowym wyrażana jest parametrem A, ob-liczanym równaniem (16):

A = a/N; gdzie:

a – liczba fragmentów o danej aktywności w łańcuchu białka, N – liczba reszt aminokwasowych w łańcuchu polipeptydowym.

Sporządzono i przeanalizowano profi l potencjalnej aktywności biologicznej 12

sekwencji białkowych tj.: frakcji αs1, αs2, β i ϰ kazeiny trzech gatunków ssaków:

owcy, kozy i krowy. Sekwencje pobrano z bazy danych Uni-Prot dostępnej na stronie: https://www.uniprot.org/. Numery identyfi kacyjne poszczególnych białek: P02662, P18626, P04653, P02663, P33049, P04654, P02666, P33048, P11839, P02668, P02670, P02669 (dostęp: kwiecień 2018). Uzupełnieniem wyznaczonych profi li potencjalnej aktywności biologicznej białek było obliczenie składu amino-kwasowego poszczególnych frakcji kazein za pomocą programu ProtParam, dostęp-nego na stronie web.expasy.org (dostęp: kwiecień 2018).

WYNIKI I ICH OMÓWIENIE

W tab. I. przedstawiono wyniki analizy profi li potencjalnej aktywności biolo-gicznej poszczególnych frakcji kazeiny owczej, koziej i krowiej. Na przykładzie inhibitorów DPP4 można zauważyć, że potencjalnie najlepszym prekursorem spo-śród przeanalizowanych sekwencji białek jest owcza i kozia kazeina-β (A = 0,820). Analiza profi lu również wykazała, że najwięcej zidentyfi kowano peptydów o ak-tywności inhibitorowej wobec DPP4, ACE oraz peptydów przeciwutleniających i to niezależnie od gatunku zwierzęcia i frakcji kazeiny.

Z analizy składu aminokwasowego poszczególnych frakcji kazeiny z mleka owczego, koziego i krowiego wynika, że pomimo małych różnic w składzie

jako-ściowym, to różnice w profi lu są znaczne (tab. II i III). Krowia kazeina-αs1 składa

się z 222 reszt aminokwasowych, a kozia i owcza ma po 223. Jednak w

T

abela I

.

Profile potencjalnej biologicznej aktywności analizowanych sekwencji kazeiny (parametr A) (BIOPEP

-UWM)

T

able I

.

Profiles of potential biological activity of chosen casein sequences (parameter A) (BIOPEP

-UWM) Aktywność / frakcja Kazeina-αs1 Kazeina-αs2 Kazeina-β Kazeina-ϰ owcza kozia krowia owcza kozia krowia owcza kozia krowia owcza kozia krowia Inhibitorowa DPP4 0,598 0,622 0,617 0,664 0,673 0,694 *0,820 * 0,820 0,817 0,776 0,771 0,774 Inhibitorowa ACE 0,477 0,477 0,542 0,426 0,426 0,455 0,518 0,518 0,638 0,448 0,422 0,495 Przeciwutleniająca 0,117 0,117 0,136 0,076 0,072 0,081 0,054 0,054 0,085 0,125 0,125 0,147 Stymulująca 0,089 0,079 0,084 0,085 0,085 0,086 0,086 0,086 – 0,031 0,042 0,032 Przeciwbakteryjna 0,009 – 0,028 0,018 0,018 0,054 – – – 0,010 0,010 0,058 Przeciwnowotworowa – – 0,019 – – – 0,005 0,005 0,018 – – – Immunomodulująca – 0,005 0,014 – – 0,005 0,018 0,010 0,010 0,011 Opioidowa 0,009 0,014 0,014 – – – 0,009 0,009 0,013 0,010 0,010 0,011

Aktywująca ubikwitynozależna proteolizę

0,009 0,009 0,009 0,009 0,009 0,009 0,009 0,009 0,013 0,005 0,010 0,005 Neuropeptyd 0,014 0,014 0,009 0,018 0,014 0,018 ––––––

Ligand permeazy bakteryjnej

0,005 0,005 0,005 0,014 0,014 0,014 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 Inhibitorowa (inne) 0,005 0,005 0,005 0,018 0,018 0,014 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,016 Antagonista opioidowy 0,005 0,005 0,005 –––––– 0,010 0,010 0,011 Przeciwamnezyjna – – 0,005 0,009 0,009 0,005 0,018 0,018 0,045 ––– Immunostymulująca 0,005 0,005 0,005 ––– 0,005 0,005 0,005 ––– Regulująca 0,005 0,005 0,005 0,009 0,009 0,005 0,014 0,014 0,027 ––– Agonista opioidowy 0,005 0,005 0,005 ––––– 0,013 ––– Przeciwzakrzepowa – – – 0,014 0,009 0,005 0,014 0,014 0,027 0,031 0,031 0,032 Skurczowa ––––––––– 0,010 0,010 0,011 Przeciwnadciśnieniowa – – – 0,018 0,018 0,014 0,005 0,005 0,005 – – 0,005 Anorektyczna –––––––– 0,005 ––– Chemotaktyczna –––––––– 0,005 ––– W iążąca ––––– 0,023 –––––– Hemolityczna ––––– 0,023 –––––– * p o g ru b io n ą c zc io n k ą z a zn a c zo n o n a jw y ż s ze w a rt o ś c i p a ra m e tr u A d la d a n e j a k ty w n o ś c i

T

abela

II.

Skład aminokwasowy analizowanych sekwencji białek (ProtP

aram)

T

able

II.

Amino acid composition of analyzed protein sequences (ProtP

aram) Aminokwas Kazeina-αs1 Kazeina-αs2 Kazeina-β Kazeina-ϰ krowia kozia owcza krowia kozia owcza krowia kozia owcza krowia kozia owcza A la (A ) 1 2 1 5 1 5 1 1 1 2 1 2988 1 6 1 8 2 1 A rg (R ) 676677433556 A sn (N ) 8 1 1 1 0 1 4 1 3 1 2544899 A sp (D ) 777456444477 C y s (C ) 111333111233 Gln (Q) 14 14 15 16 16 16 20 21 21 15 15 15 Glu (E) 25 20 20 24 25 25 19 19 19 12 11 11 G ly (G ) 999222555322 H is (H ) 544355555344 Ile (I) 12 10 12 12 13 12 11 11 10 13 11 11 Leu (L) 22 22 23 16 13 14 27 26 27 13 13 12 L y s (K) 15 14 15 25 25 25 12 13 13 10 9 9 M e t (M ) 666555777434 P h e (F ) 8779 1 09999777 Pro (P) 17 19 17 10 13 12 35 33 34 21 20 20 Ser (S) 16 18 19 17 14 15 16 15 14 14 14 13 Thr (T) 6 6 4 16 15 15 9 1 1 1 1 1 7 1 7 1 4 T rp (W ) 222233111111 Ty r (Y ) 1 0 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2433999 V a l (V) 13 11 11 15 12 13 21 23 23 13 14 14 Suma 214 214 214 222 223 223 224 222 222 190 192 192

reszt aminokwasowych: kwasu glutaminowego – 5, waliny – 2, izoleucyny – 2, lizyny – 1, histydyny – 1 oraz fenyloalaniny – 1 (po myślniku podano liczbę reszt aminokwasowych). Peptydy te biorą udział w tworzeniu peptydów biologicznie

aktywnych, co spowodowało, że w profi lu krowiej kazeiny-αs1 zidentyfi kowano

322 biopeptydy, natomiast w koziej o 30 sekwencji biopeptydów mniej (tab. IV). Najwięcej biopeptydów zidentyfi kowano w kazeinie-β i to niezależnie od gatun-ku zwierzęcia. Wśród analizowanych gatunków, kazeina krowia odznacza się naj-większą liczbą biopeptydów (409). Kazeina-β, niezależnie od gatunku zwierzęcia, okazała się również potencjalnie najlepszym prekursorem peptydów pomocnych w profi laktyce cukrzycy typu 2 i nadciśnienia tętniczego, co jest zgodne z dany-mi literaturowydany-mi (17). Liczba zidentyfi kowanych inhibitorów DPP4 w kazeinie-β (z mleka owczego, koziego i krowiego) wynosiła odpowiednio 184, 182 i 183, natomiast inhibitorów ACE 116, 115, 143 sekwencji.

WNIOSKI

Wszystkie biopeptydy z 4 głównych białek mleka (kazeiny αs1, αs2, β i ϰ)

otrzy-mano odpowiednio 1226, 1231 i 1375 peptydów biologicznie aktywnych dla od-powiednio kazeiny koziej, owczej i krowiej. Z tej liczby biopeptydów 77,8% sta-nowiły inhibitory DPP4 i ACE dla kazeiny krowiej oraz 49,5 i 50% odpowiednio dla owczej i koziej. Biorąc to pod uwagę oraz fakt, że w mleku owczym znajduje się prawie dwa razy więcej białka niż w krowim, można stwierdzić, iż potencjalnie najlepszym prekursorem biopeptydów funkcjonalnych może być kazeina z mleka owczego, w szczególności w otrzymywaniu produktów funkcjonalnych w profi lak-tyce cukrzycy typu 2 oraz nadciśnienia tętniczego.

Kolejnym etapem badań będzie ustalenia jaka kombinacja enzymów będzie naj-skuteczniejsza w uwalnianiu konkretnej puli biopeptydów. Badania bioinformatycz-ne, a w szczególności analiza profi li potencjalnej aktywności biologicznej białek mleka potwierdza, że są one wyjątkowo bogatym źródłem potencjalnie bioaktyw-nych peptydów. Uwolnione z nich peptydy mogą stanowić suplementy diety lub naturalne konserwanty oraz nutraceutyki. Badania w tym zakresie mogą przyczynić się do rozwoju rynku produktów funkcjonalnych o korzystnym działaniu zdrowot-nym.

Ta b e l a III. Liczba biopeptydów w profilu potencjalnej biologicznej aktywności poszczególnych frakcji kazeiny (BIOPEP-UWM)

Ta b l e III. Number of biopeptides identified in the profile of potential biological activity of given casein fraction (BIOPEP-UWM)

Gatunek Kazeina-αS1 Kazeina-αS2 Kazeina-β Kazeina-ϰ

Krowia *322* 338 409 306

Kozia 292 306 347 281

Owcza 289 307 351 284

T

abela I

V.

Liczba peptydów o danej aktywności zidentyfikowanych w profilu potencjalnej biologicznej aktywności [BIOPEP

-UWM]

T

able I

V .

Number of peptides of given activity identified in the profile of potential biological activity [BIOPEP

-UWM] Aktywność / frakcja Kazeina-αS1 Kazeina-αS2 Kazeina-β Kazeina-ϰ Owcza K ozia Krowia Owcza K ozia Krowia Owcza K ozia Krowia Owcza K ozia Krowia Inhibitorowa DPP4 128 133 132 148 150 154 *184 182 183 149 148 147 Inhibitorowa ACE 102 102 116 95 95 101 116 115 143 86 81 94 Przeciwutleniająca 25 25 29 17 16 18 12 12 19 24 24 28 Stymulująca 19 17 18 19 19 19 19 19 19 686 Przeciwbakteryjna 2 –644 17 – – –22 1 1 Przeciwnowotworowa – – 4 – – –11 4 ––– Immunomodulująca – 1 3 – – 1 4 222 Opioidowa 2 33 – – –22 3 222

Akt. Ub-zależna proteolizę

222222 3 2 3 121 Neuropeptyd 3 3 2 4 3 4 ––––––

Ligand permeazy bakterynej

1 1 1 333 111111 Inhibitorowa (inne) 1 1 1 44 3111113 Antagonista opioidowy 1 1 1–––––– 222 Przeciwamnezyjna – –122144 10 ––– Immunostymulująca 111 ––– 111 ––– Regulująca 11122133 6 ––– Agonista opioidowy 1 1 1––––– 3 ––– Przeciwzakrzepowa – – –32133 6666 Skurczowa – – – 222 Przeciwnadciśnieniowa – – – 44 3111 – – 1 Anorektyczna –––––––– 1 ––– Chemotaktyczna –––––––– 1 ––– W iążąca ––––– 5 –––––– Hemolityczna ––––– 5 –––––– Suma 289 292 322 307 306 338 351 347 409 284 281 306 * P o g ru b io n ą c zc io n k ą z a zn a c zo n o n a jw y ż s z ą l ic zb ę p e p ty d ó w d la d a n e j a k ty w n o ś c i

D. M o g u t, I. S z e r s z u n o w i c z

CASEIN FROM MILK OF CHOSEN LIVESTOCK AS A PRECURSOR OF “FUNCTIONAL” PEPTIDES – A BIOINFORMATIC ANALYSIS

S u m m a r y

Introduction. Dairy products are one of the basic foods consumed by people. Milk proteins are

a great potential source of biologically active peptides. These peptides can be used in functional foods. The functional products market is still growing. Bioinformatic analyses of raw materials are one of the elements of designing functional foods. The use of IT tools enables the search for potentially bioactive peptides in the structure of a protein.

Aim. The aim of the study was to analyze milk caseins of three mammalian species (bovine, ovine

and caprine) in order to obtain peptides with health-promoting effects. Selected bioinformatic tools made it possible to create profi les of potential biological activity of the four main casein fractions.

Material and methods. The bioinformatic analysis was performed with the use of the

BIOPEP-UWM tool, available on the website www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep. The sequences of the analyzed proteins were obtained from the Uni-Prot database, available at: https://www.uniprot. org/. Additionally, the amino acid compositions of the individual casein fractions were calculated using the ProtParam program, available at web.expasy.org.

Results. The profi les of potential biological activity of the individual casein fractions indicate

that ovine and caprine casein-β are potentially the best precursors of DPP4 inhibitors (parameter A = 0.820). Caseins of all three mammalian species are also good potential precursors of ACE inhibitors and antioxidant peptides. Total amounts of the biopeptides indentifi ed in the four major milk proteins (αs1, αs2, β and ϰ casein) are 1226, 1231 and 1375 of biologically active peptides for caprine,

ovine, and bovine casein respectively. From this number of biopeptides 77.8% were DPP4 and ACE inhibitors for bovine casein, and 49.5% and 50% for ovine and caprine respectively. Taking this into account together with the fact that ovine milk contains almost twice as much protein than bovine milk, it can be concluded that the best potential precursor of functional biopeptides can be caseins from ovine milk, in particular in the preparation of functional products for the prevention of type 2 diabetes and hypertension

Conclusions. The tool BIOPEP-UWM, available at uwm.edu.pl/biochemia, makes it possible to

search for biologically active peptides within food proteins. It has been proven that ovine milk caseins are rich in potentially biologically active peptides, in particularly DPP4 and ACE inhibitors responsible for lowering blood glucose level and hypertension. Controlled proteolysis would enable the preparation of functional food products supporting the prevention of type 2 diabetes and hypertension.

PIŚMIENNICTWO

1. Błaszczak A., Grześkiewicz W.: Żywność funkcjonalna – szansa czy zagrożenie dla zdrowia? Medycyna Ogólna i Nauki o Zdrowiu, 2014: 20(49), 2: 214-221. – 2. Jandal J.M.: Comparative as-pects of goat and sheep milk. Small Ruminant Research, 1996; 22(2): 177-185. – 3. Block R.J.: Some Amino Acids, Peptides and Amines in Milk, Concentrated Milks and Cheese. J. Dairy Sci., 1951; 34(1): 1-10. – 4. Farrell H.M., Jimenez-Florez R., Bleck G.T., Brown E.M., Butler J.E., Creamer L.K.,

Hicks C.L., Hollar C.M., Ng-Kwai-Hang K.F., Swaisgood H.E.: Nomenclature of the proteins of cows’

milk – Sixth revision. J. Dairy Sci., 2004; 87: 1641-1674. – 5. Chemiczne i funkcjonalne właściwości składników żywności. Red. Sikorski Z.E., Wyd. 2. Warszawa, WNT, 1996. – 6. Dziuba J., Żbikowska

A.: Enzymatic coagulation of casein micelles. Post Biochem, 1988; 34(4): 429-33. – 7. Korhonen H., Pihlanto A.: Food-derived bioactive peptides – opportunities for designing future foods. Curr. Pharm.

Des., 2001; 9: 1297-1308. – 8. Meisel H., FitzGerald R.J.: Biofunctional peptides from milk proteins: mineral binding and cytomodulatory effects. Curr. Pharm. Des., 2003; 9: 1289-1295. – 9. Lovegrove

J.A., Givens D.I.: Dairy food products: good or bad for cardiometabolic disease? Nutrition Res. Rev.,

2016; 29: 249-267. – 10. Kostyra H., Kostyra E.: Bioaktywne peptydy uwalniane z białek żywności. W: Żywność prozdrowotna, Wyd. Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, 2014; 235-249.

11. Minkiewicz P., Dziuba J., Darewicz M., Iwaniak A., Dziuba M., Nałęcz D.: Food peptidomics. Food Technol. Biotechnol., 2008; 46: 1-10. – 12. Comerford K.B., Pasin G.: Emerging evidence for

the importance of dietary protein source on glucoregulatory markers and type 2 diabetes: Different effects of dairy, meat, fi sh, egg, and plant protein foods. Nutrients, 2016; 8(8): 446. – 13. Bjornshave

A., Hermansen K.: Effects of Dairy Protein and Fat on the Metabolic Syndrome and Type 2 Diabetes.

Rev. Diabet Stud., 2014; 11(2): 153-166. – 14. Uenishi H., Kabuki T., Seto Y., Serizawa A., Nakajima

H.: Isolation and identifi cation of casein-derived dipeptidyl-peptidase 4 (DPP-4)-inhibitory peptide

LPQNIPPL from gouda-type cheese and its effect on plasma glucose in rats. Int. Dairy J., 2012; 22(1): 24-30. – 15. López-Expósito I., Amigo L., Recio I.: A mini-review on health and nutritional aspects of cheese with a focus on bioactive peptides. Dairy Sci. Technol., 2012; 92(5): 419-438. – 16. Minkiewicz P.,

Dziuba J., Iwaniak A., Dziuba M., Darewicz M.: ‘BIOPEP database and other programs for processing

bioactive peptide sequences’. J. AOAC Int, 2008; 91(4): 965-980. – 17. Iwaniak A.: Analiza zależności między strukturą peptydów pochodzących z białek żywności a ich aktywnością inhibitorową wobec enzymu konwertującego angiotensynę. Ocena przydatności metod in silico w badaniach nad białkowymi prekursorami bioaktywnych peptydów. Wyd. UWM, Olsztyn, 2011.