Oporność na bezpośrednio działające leki anty-HCV – podsumowanie bieżącego stanu wiedzy

Wstęp

Zakażenie wirusem zapalenia wątro-by typu C (ang. hepatitis c virus – HCV) po-zostaje istotną przyczyną chorób wątroby, mogąc prowadzić do marskości tego na-rządu i rozwoju raka wątrobowo-komórko-wego. Według aktualnych szacunków oko-ło 170 milionów ludzi na świecie jest zakażo-nych tym wirusem, a liczba zakażeń z aktyw-ną replikacją (wiremią) wynosi około 80 milio-nów (95% przedział ufności (CI): 64–108 mln) [1, 2]. W ostatnich latach (1990–2013) uległa zwiększeniu liczba zgonów związanych z wi-rusowym zapaleniem wątroby – z 0,89 mi-liona (95% CI: 0,86–94) do 1,4 mimi-liona (95% CI: 1,38–1,54 mln) [3]. Częstość występowa-nia zakażewystępowa-nia jest istotnie różna w zależno-ści od regionu świata, wahając się od ≤1% w Europie Środkowej i Zachodniej, Amery-ce Północnej, Australii, AmeryAmery-ce Łacińskiej, Wyspach Karaibskich, Afryce Południowej i Wschodniej i wysoko rozwiniętych krajach azjatyckich, takich jak Japonia czy Singapur, poprzez 1–2% w Azji Wschodniej i Azji Po-łudniowo-Wschodniej, Europie Wschodniej i zachodniej części Afryki Subsaharyjskiej. Do krajów o endemicznie wysokiej (do 7% populacji) częstości występowania zakażeń HCV należą kraje z regionu Azji Środkowej, takie jak: Egipt, Syria, Gabon, Pakistan, Uzbe-kistan, Gruzja czy Mongolia [4]. Historycznie dominującą drogą zakażenia były zakażenia związane z procedurami medycznymi, prze-toczeniami krwi i preparatów krwiopochod-nych oraz dożylnym przyjmowaniem środ-ków psychoaktywnych. W ostatnich latach obserwuje się wzrost częstości nowych za-każeń drogą seksualną, szczególnie w gru-pie mężczyzn mających kontakty seksualne z mężczyznami (ang. men who have sex with men – MSM) [5].

Ewolucja genotypowa HCV

Według aktualnej wiedzy, HCV wyewolu-ował w siedem genotypów, których zmien-ność genetyczna waha się od 30–35% ge-nomu oraz >60 subtypów [10]. Genotypy i subtypy są identyfikowane na podstawie filogenetycznych analiz sekwencji genomu wirusowego, dla określenia genotypu uży-wa się kodu cyfrowego (cyfry 1–7), a dla subtypu – literowego (litery a–z) [11, 12]. Najczęściej występującym na świecie wa-riantem jest genotyp 1, z szacowaną liczbą zakażeń na poziomie ~80 milionów.

Kolejnym jest genotyp 3 (54,3 miliona), częsty w Azji Południowej, Rosji, Austra-lii oraz wielu krajach europejskich, podczas gdy genotypy 2, 4, 6 są rzadsze i odpowia-dają za ~25% pozostałych zakażeń, genotyp 5 występuje głównie w Afryce Południowej, stanowiąc <1% wszystkich infekcji, a ge-notyp 7 zidentyfikowano wyłącznie w po-jedynczych przypadkach i nie jest istotny z klinicznego punktu widzenia. Dla geno-typu 1 najczęściej występującymi subtypa-mi są 1a i 1b, z których 1a występuje często w Ameryce Północnej oraz w krajach Oce-anii, a 1b w całej Europie, z dominacją w kra-jach Europy Wschodniej. W zależności od ro-dzaju uważa się, że genotypy HCV oddzieli-ły się od wspólnego przodka około 300–400 lat temu, a z pewnością genotypy 1 i 4 mają wspólne pochodzenie; ponadto ewolu-cja w subtypy rozpoczęła się około 200 lat temu [13]. Jest również prawdopodobne, że

Miłosz Parczewski

Klinika Chorób Zakaźnych, Tropikalnych i Nabytych Niedoborów Immunologicznych Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie

Oporność na bezpośrednio działające

leki anty-HCV – podsumowanie bieżącego

stanu wiedzy

HCV jest wirusem RNA, należącym do ro-dziny Flaviviridae, rodzaju Hepaciviridae, z li-niowym genomem o pojedynczej ramce odczytu kodującym białka nukleokapsydu (C), otoczki (E1, E2) oraz białka niestruktu-ralne – NS2 (NEP – ang. nuclear export pro-tein – istotne podczas składania wirionów i hamujące apoptozę komórek wątrobo-wych, ale niekonieczne do aktywnej repli-kacji wirusowej), NS3 (p70 – proteaza sery-nowa), NS4A (kofaktor proteazy NS3), NS4B (kofaktor), NS5A (wiążąca cynk fosfoprote-ina kotwicząca polimerazę NS5B na siatecz-ce cytoplazmatycznej, z funkcją aktywa-cji transkrypaktywa-cji, modulująca odpowiedź ze strony interferonu i innych cytokin, stymu-lująca ekspresję MCP-1 i RANTES). Ostatnim kluczowym białkiem jest RNA – zależna po-limeraza RNA – białko NS5B, które na matry-cy dodatniej nici RNA jest odpowiedzialne za replikację materiału genetycznego wi-rusa. Z powodu braku mechanizmu kon-troli błędów podczas replikacji wirus ulega szybkiej ewolucji z ~0,001 substytucji/ko-don/rok. Z kolei interakcje z układem im-munologicznym gospodarza prowadzą do tego, że zmienność genetyczna regionów kodujących otoczkę wirusową jest wyższa (0,007 substytucji/kodon/rok) od regionów zaangażowanych bezpośrednio w repli-kację, gdzie kluczowe jest utrzymanie sta-bilnej funkcji enzymatycznej – białka nie-strukturalne ewoluują wolniej, na poziomie <0,0005 substytucji/kodon/rok [6]. Nale-ży pamiętać, że w przypadku wirusa o wiel-kości genomu około 9600 par zasad, w po-pulacji krążących („quasispecies”) wirusów obecne będą wszystkie możliwe kombina-cje i mutakombina-cje, stąd w przypadkach selek-cji lekooporności dochodzi do niej szybko [7–9].

najstarszym genotypem jest 6, który poja-wił się około 1100–1300 lat temu i może być przodkiem wszystkich pozostałych warian-tów genetycznych. W analizach genotypu 1 sugeruje się, że subtyp 1b pojawił się w Eu-ropie, Stanach Zjednoczonych i Japonii oko-ło 1915–1930 roku, a genotyp 3 okooko-ło roku 1940, z gwałtownym wzrostem liczby zaka-żeń od roku 1940 [14]. Ciekawych danych dostarczają również analizy filogeograficz-ne dla poszczególnych genotypów, suge-rujące, że genotyp 1 rozprzestrzeniał się po-czątkowo w krajach rozwiniętych i dopie-ro później został zawleczony do krajów dopie- roz-wijających się. Genotyp 2 pochodzi z Afryki Centralnej i Zachodniej i został przeniesiony na Karaiby w wyniku handlu niewolnikami, a genotyp 3 pochodzi z Azji Południowo--Wschodniej [15]. Filogenetyka wskazuje również, że introdukcja HCV w Japonii od-była się po 1860 roku, kiedy zniesiono Sako-ku – politykę izolacjonizmu zakazującą wjaz-du obcokrajowców i wyjazwjaz-du Japończyków. Po tym okresie nastąpił szybki wzrost liczby zakażeń HCV związanych z wprowadzaniem programów profilaktyki zdrowotnej, stoso-waniem preparatów krwiopochodnych oraz używaniem narkotyków dożylnych [16].

Podstawowe zjawiska prowadzące do

selekcji oporności

Rewolucja związana ze stosowaniem bezpośrednio działających przeciwwiruso-wo preparatów w leczeniu HCV pozwala na eliminację aktywnego replikacyjnie zakaże-nia w 90–95% przypadków. Dostępne leki są inhibitorami kilku różnych białek wiruso-wych, a preparaty złożone zawierające 2–3 klasy leków przeciwwirusowych praktycznie całkowicie zastąpiły leczenie z zastosowa-niem pegylowanego interferonu (PEG-IFN) z rybawiryną (RBV). Skuteczność terapii jest nieco niższa u osób zakażonych genoty-pem 2 i 3 HCV (85–95%) oraz u osób z mar-skością wątroby, a także u chorych uprzed-nio eksponowanych na leki przeciwwiruso-we [17–19]. Należy również zauważyć, że badania skuteczności leczenia dla genoty-pów 4, 5 i 6 były często przeprowadzane na niewielkich grupach pacjentów, a skutecz-ność leczenia tych genotypów w przypad-kach występowania lekooporności nie jest

Rozwój lekooporności na prepara-ty przeciwwirusowe jest zależny od wie-lu czynników – z jednej strony od skutecz-ności leku determinującej jego barierę ge-netyczną, ale również od przylegania pa-cjenta do terapii – adherencji, aktywno-ści replikacyjnej wirusa („fitness”), czy cza-sami zmienności genetycznej gospodarza. W przypadkach suboptymalnej ekspozycji na leki, wirus utrzymuje aktywną replikację, co skutkuje selekcją wirusów lekoopornych (Ryc. 1) [20–22] . W tym miejscu należy od-wołać się w skrócie do opisanych uprzednio zjawisk, kluczowych dla selekcji lekoopor-ności wirusowej – aktywlekoopor-ności replikacyjnej i bariery genetycznej. Oba te zjawiska zosta-ły szczegółowo opisane przez Autora w pu-blikacji na temat lekooporności HCV [23]. Aktywność replikacyjna określa „siłę” wiru-sa – zdolność produkcji cząstek zakaźnych w danym środowisku, włączając jego mody-fikacje na przykład w wyniku zastosowania danego leku [24]. Należy pamiętać, że jest ona często przełożeniem danych uzyskiwa-nych in vitro na model organizmu ludzkie-go – in vivo [20]. Selekcja mutacji lekoopor-ności może skutkować obniżeniem aktyw-ności replikacyjnej w stosunku do warian-tów dzikich (niezmutowanych), gdyż więk-szość ze zmutowanych populacji to

wiru-kacji w środowisku leku skutkuje szybką se-lekcją populacji lekoopornych, często z jawieniem się mutacji dodatkowych – po-prawiających fitness po pojawieniu się klu-czowej mutacji lekooporności [25, 26]. Ty-powo, początkowo mutacje pozwalają tylko na niewielką replikację (niska aktywność re-plikacyjna), wiremia zaś rośnie po pojawie-niu się mutacji wtórnych, poprawiających efektywność namnażania cząsteczek wiru-sowych [27, 28]. Co również istotne, zmiany w aktywności replikacyjnej są bezpośrednio związane z czasem utrzymywania się danej mutacji w populacjach wirusowych. Muta-cje niewpływające na aktywność replikacyj-ną utrzymują się długo lub są archiwizowa-ne na wiele lat, podczas gdy obniżające tę aktywność są eliminowane [29–33]. Wyjąt-kowo rzadko obserwuje się powstawanie wariantów poprawiających aktywność re-plikacyjną – te nie będą eliminowane z po-pulacji wirusów krążących.

Bariera genetyczna określa zmianę stę-żenia hamującego po selekcji mutacji leko-oporności; wiąże się ona ze stężeniem osią-ganym w surowicy krwi [34]. Bariera gene-tyczna może być „niska” – pojedyncze mu-tacje w genomie wirusowym zmieniają tak istotnie stężenie hamujące leku, że przesta-je on działać in vivo. Wysoka bariera

gene-Selekcja oporności

Wiremia

Częściowa

supresja

Rebound

R2

R2

R2

R2

R2

R2

R2

R2

R2

R1

na simeprewir. U osób zakażonych geno-typem 1A HCV z mutacją Q80K leczonych schematem z zastosowaniem pegylowa-nego interferonu+rybawiryna+simepre-wir skuteczność leczenia była istotnie niż-sza w porównaniu do grupy zakażonych tym samym genotypem, ale bez polimorfi-zmu Q80K (58% vs. 84%) [37]. Częstość wy-stępowania tego wariantu u osób z genoty-pem 1A waha się od kilku procent do ~50%, w zależności od regionu świata [38, 39]. Cie-kawym zjawiskiem jest fakt, że występowa-nie Q80K jest ograniczone tylko do jednej grupy filogenetycznej (kladu) genotypu 1a – kladu I, zidentyfikowanego przez de Luca i wsp. Klad ten występuje częściej poza Eu-ropą [40]. Wariant Q80K może również, choć w ograniczony sposób, zmniejszać wraż-liwość na asunaprewir, parytaprewir, nie wpływając na stężenie hamujące grazo-prewiru [9, 41, 42]. Monitorowanie obecno-ści wariantu Q80K jest istotne przed wdro-żeniem leczenia z zastosowaniem sime-prewiru+sofosbuwiru u osób zakażonych genotypem 1a (wytyczne AASLD (www. hcvguidelines.org)). Kolejnym istotnym po-limorfizmem dla regionu NS3 jest D168Q/E, który zmniejsza wrażliwość na grazoprewir (3,2-krotne zwiększenie stężenia hamujące-go), parytaprewir (15-krotne) oraz warunku-je pełną oporność (40-krotne zwiększenie stężenia hamującego) na simeprewir [43], choć należy zauważyć, że zmienność w tej pozycji występuje naturalnie w <1% popu-lacji pacjentów uprzednio nieleczonych za-każonych genotypem 1. Występuje on jako stały naturalny polimorfizm dla genotypu 3 (całkowita utrata skuteczności leczenia in-hibitorami proteazy NS3 w tym genotypie) [44]. Obecność polimorfizmu D168E była również obserwowana w grupie pacjentów nieskutecznie leczonych kombinacją falda-prewiru z PEG-IFN i rybawiryną (RBV) czy nia, wskazującym, że dla utraty aktywności

leku konieczna jest akumulacja wielu muta-cji. Lekooporność na preparaty o niższej ba-rierze genetycznej często rozwija się szyb-ciej i wymaga mniejszej liczby mutacji [34]; inhibitory NS3 HCV mają niższą barierę ge-netyczną niż inhibitory polimerazy [9, 35].

Techniki badań molekularnych

Dane na temat lekowrażliwości są okre-ślane na podstawie zmian sekwencji gene-tycznej izolatów krążących w krwi obwo-dowej populacji wirusa. Do tego celu naj-częściej stosowana jest tak zwana techni-ka sekwencjonowania populacyjnego me-todą Sangera z ~15–20% limitem detekcji dla wykrywanych mutacji genetycznych. W ostatnich latach coraz większą

popular-:\VRNDEDULHUDJHQHW\F]QD GODGDQHJROHNXMHVW ]MDZLVNLHPNRU]\VWQLHMV]\P ]NOLQLF]QHJRSXQNWXZLG]HQLD ZVND]XMþF\PúHGODXWUDW\ DNW\ZQRĄFLOHNXNRQLHF]QD MHVWDNXPXODFMDZLHOXPXWDFML /HNRRSRUQRĄĀQDSUHSDUDW\ RQLúV]HMEDULHU]HJHQHW\F]QHM F]ĆVWRUR]ZLMDVLĆV]\EFLHM LZ\PDJDPQLHMV]HMOLF]E\ PXWDFMLLQKLELWRU\16 +&9PDMþQLúV]þEDULHUĆ JHQHW\F]QþQLúLQKLELWRU\ SROLPHUD]\ :DULDQW4.PRúHUyZQLHú FKRĀZRJUDQLF]RQ\VSRVyE ]PQLHMV]DĀZUDúOLZRĄĀQD DVXQDSUHZLUSDU\WDSUHZLU QLHZSÜ\ZDMþFQDVWĆúHQLH KDPXMþFHJUD]RSUHZLUX 0RQLWRURZDQLHREHFQRĄFL ZDULDQWX4.MHVW LVWRWQHSU]HGZGURúHQLHP OHF]HQLD]]DVWRVRZDQLHP VLPHSUHZLUXVRIRVEXZLUX XRVyE]DNDúRQ\FK JHQRW\SHPDZ\W\F]QH $$6/'

ność w badaniach lekooporności zdobywa tzw. sekwencjonowanie nowej generacji (ang. next generation sequencing – NGS), które jest wydajniejsze, szybsze i pozwala na uzyskanie znacznie większej ilości infor-macji niż sekwencjonowanie klasyczne [36]. NGS pozwala również na wykrycie do 1% populacji z daną mutacją, jednakże w do-tychczasowych badaniach klinicznych naj-częściej używano progu detekcji na pozio-mie 15%; w przyszłości jednakże być może będą wprowadzane niższe progi detekcji wariantów lekoopornych. Ponadto różnica pomiędzy techniką sekwencjonowania tzw. metodą Sangera (klasyczną) i technikami sekwencjonowania nowej generacji polega na tym, że tylko techniki NGS pozwalają na określenie ilościowe proporcji wariantów z mutacją lub substytucją (np. jaki ilościo-wo odsetek populacji wirusowych w danej próbce posiada mutacje lekooporności).

Naturalnie występujące warianty

związane z lekoopornością

a skuteczność leczenia anty-HCV

Skuteczność terapii anty-HCV nie zależy jedynie od stosowanych leków czy genoty-pu/subtypu wirusa, ale również od obecno-ści wariantów zmniejszających wrażliwość na leki (ang. resistance-associated substi-tutions – RAS). Sztandarowym przykładem naturalnej zmienności wirusowej wpływa-jącej na skuteczność terapii jest substytu-cja w pozycji Q80K związana z opornością

ność mutacji lekooporności przed wdroże-niem leczenia skutkowała zmniejszewdroże-niem skuteczności terapii z 98% do 58% [49]. Nie-korzystny wpływ obecności RAS przed le-czeniem był jeszcze wyraźniejszy w podgru-pie osób, które nie odpowiedziały na terapię PEG-IFN/RBV – skuteczność w tej grupie spa-dła do 29%; wydłużenie leczenia do 16 tygo-daklataswiru z asunaprewirem (78% oraz

84,2% nieskuteczności wirusowych w przy-padkach występowania ww. substytucji przed leczeniem) [45, 46]. Inne polimorfi-zmy NS3 obejmują na przykład pozycje 41, 54, 55, 132V, 175L, rzadko współistniejąc u pacjentów dotychczas nieleczonych z klu-czowymi mutacjami lekooporności na przy-kład w pozycji 155, będąc obserwowanymi u <15% pacjentów po nieskutecznym lecze-niu [47, 48].

Aktualnie najistotniejsze klinicznie są wa-rianty NS5A, związane z obniżeniem sku-teczności terapii z zastosowaniem leków z tej grupy. Na przykład obniżenie skutecz-ności terapii związane z obecskutecz-nością natu-ralnych substytucji w regionie NS5A zwią-zanych z opornością było również obser-wowane dla terapii grazoprewir/elbaswir. U osób dotychczas nieleczonych lub z nie-skutecznością uprzedniego leczenia PEG-

Region NS5B

Region NS5A

Region NS3

Kodony, w których występują substytucje związane z obniżeniem

wrażliwości genotypowej

Ryc. 2. Kluczowe kodony związane z lekooprnością w regionach kodujących NS3, NS5A i NS5B. * – warianty zwiazane z opornością na sofosbuwir;

# – warianty związane z opornością na dasabuwir.

$NWXDOQLHQDMLVWRWQLHMV]H NOLQLF]QLHVþZDULDQW\16$ ]ZLþ]DQH]REQLúHQLHP VNXWHF]QRĄFLWHUDSLL ]]DVWRVRZDQLHPOHNyZ]WHM JUXS\1DSU]\NÜDGREQLúHQLH VNXWHF]QRĄFLWHUDSLL]ZLþ]DQH ]REHFQRĄFLþQDWXUDOQ\FK VXEVW\WXFMLZUHJLRQLH16$ ]ZLþ]DQ\FK]RSRUQRĄFLþ E\ÜRUyZQLHúREVHUZRZDQH ZSU]\SDGNXWHUDSLL JUD]RSUHZLUHOEDVZLU .ROHMQ\PLVWRWQ\P SROLPRUî]PHPGODUHJLRQX 16MHVW'4(NWyU\ ]PQLHMV]DZUDúOLZRĄĀQD JUD]RSUHZLUNURWQH ]ZLĆNV]HQLHVWĆúHQLD KDPXMþFHJRSDU\WDSUHZLU NURWQHRUD]ZDUXQNXMH SHÜQþRSRUQRĄĀNURWQH ]ZLĆNV]HQLHVWĆúHQLD KDPXMþFHJRQDVLPHSUHZLU FKRĀQDOHú\]DXZDú\ĀúH ]PLHQQRĄĀZWHMSR]\FML Z\VWĆSXMHQDWXUDOQLHZ SRSXODFMLSDFMHQWyZXSU]HGQLR QLHOHF]RQ\FK]DNDúRQ\FK JHQRW\SHPW\VWĆSXMH RQMDNRVWDÜ\QDWXUDOQ\ SROLPRUî]PGODJHQRW\SX FDÜNRZLWDXWUDWDVNXWHF]QRĄFL OHF]HQLDLQKLELWRUDPLSURWHD]\ 16ZW\PJHQRW\SLH 2EHFQRĄĀSROLPRUî]PX '(E\ÜDUyZQLHú REVHUZRZDQDZJUXSLH SDFMHQWyZQLHVNXWHF]QLH OHF]RQ\FKNRPELQDFMþ IDOGDSUHZLUX]3(*,)1 L5%9F]\GDNODWDVZLUX ]DVXQDSUHZLUHP RUD]QLHVNXWHF]QRĄFL ZLUXVRZ\FKZSU]\SDGNDFK Z\VWĆSRZDQLDZZ VXEVW\WXFMLSU]HGOHF]HQLHP

wariantów lekooporności [50]. Substytucje zmniejszające wrażliwość na EBR/GZR wystę-pują w pozycjach: 24, 28, 30, 31, 32, 38, 58, 92 i 93 NS5A (Ryc. 2). Mutacje te są również istot-ne w przypadku stosowania leczenia w sko-jarzeniu sofosbuwir i ledipaswir. Dla przykła-du, w dużym badaniu obejmującym grupę liczącą 1566 pacjentów, warianty związane z lekoopornością były wykryte u 13% i 18% osób zakażonych odpowiednio subtypem 1a i 1b, a warianty specyficznie związane z obni-żeniem wrażliwości na ledipaswir u 8% (1a) i 16% (1b) (technika standardowego sekwen-cjonowania (metodą Sangera), próg wykry-cia RAS – 15%). W przypadku subtypu 1a ob-serwowano zmniejszenie skuteczności lecze-nia do 91% (42/46) u osób, u których wystę-powały RAS związane z obniżeniem wrażli-wości na ledipaswir w porównaniu do 99% u osób z wirusem o pełnej wrażliwości ge-notypowej. Dla genotypu 1b skuteczność

ści RAS lub ich braku, ale u osób, które były uprzednio leczone skuteczność leczenia spadła do 89% (41/46 osób) w przypadku wykrycia RAS obniżających wrażliwość na ledipaswir w porównaniu z 98% (267/272) u osób, u których takie warianty nie wystę-powały. Obecność wariantów lekooporno-ści wiąże się więc z 8–11% redukcją skutecz-ności leczenia [51, 52]. Nawet w przypad-ku leczenia skojarzonego nowszej generacji – welpataswiru w skojarzeniu z sofosbuwi-rem, pomimo poprawy skuteczności lecze-nia genotypu 1, dla genotypu 3 obecność mutacji lekooporności przed leczeniem ne-gatywnie wpływała na jego skuteczność – 84–88% u osób z RAS w porównaniu z 97% u tych, którzy nie mieli takich muta-cji (19); należy zauważyć, że u osób ze zde-kompensowaną marskością wątroby czę-stość występowania mutacji Y93H może się-gać nawet 50% [53]. Podsumowując, można oszacować, że częstość występowania na-turalnej lekooporności na inhibitory NS5A z zastosowaniem 15% progu detekcji waha się w granicach 8–16% w zależności od ge-notypu [52]. Zakładając 90% skuteczność terapii u osób, u których obecne są natu-ralnie występujące warianty lekooporności, w skali świata kilka milionów osób może do-świadczyć nieskuteczności terapii związanej z mutacjami w genomie HCV. Z tego po-wodu na przykład w rekomendacjach EASL 2016, pomimo nieobowiązkowości, reko-menduje się wykonanie testowania leko-oporności dla optymalizacji decyzji terapeu-tycznych w przypadkach, gdy ośrodek ma łatwy dostęp do takiego testowania. Reko-mendacje nie preferują ani techniki sekwen-cjonowania klasycznego (Sanger), ani testo-wania metodą sekwencjonotesto-wania nowej generacji (NGS), przy założeniu osiągnięcia 15% progu detekcji wariantów związanych z lekoopornością [54, 55]. Badania lekoopor-ności przed wdrożeniem leczenia mogą po-móc w optymalizacji leczenia, co

wykaza-no dla kombinacji grazoprewiru/elbaswi-ru. Zgodnie z wytycznymi EASL u pacjen-tów zakażonych genotypem 1a, u których wykryto RAS związane z opornością na ledi-paswir (M28A/G/T, Q30E/G/H/K/R, L31M/V, P32L/S, H58D i /lub Y93C/H/N/S), do prepa-ratu złożonego z sofosbuwiru i ledipaswiru należy dodać rybawirynę. Te same warian-ty warunkują konieczność wydłużenia le-czenia kombinacją grazoprewiru/elbaswiru do 16 tygodni, jeśli wiremia HCV przekracza 800 000 IU/ml. W przypadku wykrycia wa-riantów związanych z lekoopornością w re-gionie NS5A również dla skojarzenia sofos-buwir/daklataswir w leczeniu genotypu 1a należy dodać rybawirynę. Podobnie w le-czeniu genotypu 3 u osób z mutacją Y93H – do leczenia z zastosowaniem sofosbuwi-ru i welpataswisofosbuwi-ru lub sofosbuwisofosbuwi-ru i daklata-swiru należy dołączyć rybawirynę [54, 55].

W grupie inhibitorów NS5B naturalnie występujące RAS, mogące zmniejszać sku-teczność kliniczną sofosbuwiru, to: L159F, C316N, L320F oraz V321I. Są to najczęściej warianty o niewielkim przełożeniu na kli-niczną skuteczność leczenia [8, 56–58]. Mogą one być również wykrywane po nie-skutecznym leczeniu sofosbuwirem, ale nie wpływały istotnie na skuteczność reterapii, szczególnie po dodaniu rybawiryny [59]. Kluczową mutacją lekooporności na so-fosbuwir pozostaje S282T (Ryc. 2), jednak-że ze względu na dużą zmianę aktywności replikacyjnej jest ona szybko eliminowana, więc nie ma istotnego znaczenia praktycz-nego, może jednak być istotna w

przypad-kach funkcjonalnej monoterapii sofosbu-wirem, na przykład w przypadku współist-nienia kluczowych wariantów lekooporno-ści obniżających wrażliwość na ledipaswir [60–63]. Kluczową mutacją dla dasabuwiru jest S556G [64] (Ryc. 2), pozostałe mutacje mają mniejsze znaczenie kliniczne.

Optymalizacja leczenia po

niepowodzeniu DAA związanym

z selekcją mutacji oporności

Opisana powyżej naturalna zmienność HCV i skłonność wirusowej polimerazy do błędów w skojarzeniu z replikacją rzędu 1010_–1013 _{wirionów/dobę [65, 66]}

skutku-je szybką selekcją wariantów lekoopornych pod wpływem terapii [67]. Najczęściej w cią-gu dwóch tygodni od rozpoczęcia leczenia, w przypadku jego nieskuteczności, więk-szość krążących w surowicy cząstek wiru-sowych będzie posiadała mutacje związane z obniżeniem lekowrażliwości [8, 24, 25, 68, 69]. Jak nakreślono powyżej, istnieje jasny związek pomiędzy naturalnie występujący-mi wariantawystępujący-mi lekooporności HCV w regio-nie NS5A a zmregio-niejszeregio-niem skuteczności le-czenia DAA. W przypadku inhibitorów pro-teazy warianty lekooporności najczęściej są eliminowane w ciągu 48 tygodni od ustą-pienia presji selekcyjnej związanej z lecze-niem – według literatury z zastosowalecze-niem sekwencjonowania populacyjnego mutacje w regionie NS3 były eliminowane po 6–14

8RVyEGRW\FKF]DV QLHOHF]RQ\FKOXE ]QLHVNXWHF]QRĄFLþXSU]HGQLHJR OHF]HQLD3(*,)15%9NWyUH RWU]\P\ZDÜ\JUD]RSUHZLU HOEDVZLU(%5*=5SU]H] W\JRGQLREHFQRĄĀ PXWDFMLOHNRRSRUQRĄFL SU]HGZGURúHQLHPOHF]HQLD VNXWNRZDÜD]PQLHMV]HQLHP VNXWHF]QRĄFLWHUDSLL]GR 

tacje mogą zmniejszać wrażliwość wszyst-kich stosowanych aktualnie klas leków prze-ciwwirusowych – zarówno inhibitorów pro-teazy (NS3), jak inhibitorów NS5A i polime-razy NS5B. Z klinicznego punktu widze-nia najbardziej istotne aktualnie wydają się RAS w regionie NS5A, które nie obniżają ak-tywności replikacyjnej wirusa, a przez to mogą utrzymywać się w populacjach krą-żących HCV przez długi czas; warianty zwią-zane z lekoopornością w regionach NS3 i NS5B ulegają szybkiej rewersji z powro-tem pełnej wrażliwości na dany lek w cią-gu kilku miesięcy. Dobranie terapii prze-ciwwirusowej zgodnej z profilem gene-tycznym wirusa pozwoli na optymalizację jej skuteczności oraz zapobiegnie transmi-sjom populacji lekoopornych, a więc po-zwoli na zachowanie skuteczności szero-kiej gamy preparatów przeciwwirusowych.

Opracowano na podstawie artykułu źródłowego: Miłosz Parczewki. Oporność na bezpośrednio działa-jące leki anty-HCV – podsumowanie bieżącego sta-nu wiedzy. Forum Zakażeń 2017; tom 8, nr 4. © Eve-reth Publishing, 2017.

Piśmiennictwo

1. European Union HCV Collaborators. Hepatitis C virus prevalence and level of intervention re-quired to achieve the WHO targets for elimi-nation in the European Union by 2030: a mo-delling study. Lancet Gastroenterol Hepatol 2017;2(5):325–336.

2. Gower E, Estes C, Blach S, Razavi-Shearer K, Raza-vi H. Global epidemiology and genotype distri-bution of the hepatitis C virus infection. J Hepatol 2014;61(Suppl. 1):S45–S57.

3. Stanaway JD, Flaxman AD, Naghavi M et al. The glo-bal burden of viral hepatitis from 1990 to 2013: fin-dings from the Global Burden of Disease Study

miesiącach [70, 71], jednakże RAS w regio-nie NS5A mogą utrzymywać się długotrwa-le, z pewnością powyżej 96 tygodni po za-kończeniu leczenia z powodu wysokiej ak-tywności replikacyjnej takich wariantów [33, 72, 73]. W badaniu Dvory-Sobol i wsp. obec-ność RAS była wykrywana u 82% osób po 92 tygodniach od nieskuteczności wiruso-wej [74]; jest to szczególnie istotne w kon-tekście krzyżowej oporności obserwowa-nej dla praktycznie wszystkich inhibitorów NS5A, co może wpływać na ograniczenie możliwości wyboru terapii ratującej u czę-ści pacjentów z niepowodzeniem leczenia DAA. W przypadkach prób wdrożenia te-rapii ratującej u osób z opornością wybie-ra się prepawybie-raty z najmniejszym pwybie-rawdopo- prawdopo-dobieństwem krzyżowej lekooporności lub preparaty nowych generacji, których pro-fil lekooporności jest korzystniejszy, nie-mniej nie istnieją jeszcze szczegółowe algo-rytmy postępowania. Należy zauważyć, że w przypadkach pacjentów uprzednio leczo-nych skojarzeniem grazoprewiru z elbaswi-rem, pomimo dobrej całkowitej skuteczno-ści (96,2%), wiązało się to z niższą skutecz-nością u osób, u których występowały RAS w regionie NS3 (31/34; 91,2%) [75]. Najczę-ściej wybieraną opcją leczenia u osób, u któ-rych wystąpiła nieskuteczność terapii jest jej wydłużenie (np. do 16 tygodni) lub doda-nie rybawiryny, co pozwala osiągnąć sku-teczną terapię w >95% przypadków [76]. Korzystne wyniki u osób z lekoopornością po uprzednim leczeniu uzyskiwano rów-nież w przypadkach osób leczonych skoja-rzeniami trzech DAA lub dwulekowymi te-rapiami nowej generacji. W badaniu fazy 3, w grupie 263 pacjentów z niepowodze-niem terapii z zastosowaniepowodze-niem inhibitorów NS5A (u których w 97% przypadków wy-stępowała oporność na NS3 lub NS5A lub NS3+NS5A), skojarzenie welpataswiru/so-fosbuwiru i woksylaprewiru pozwoliło na osiągnięcie >90% skuteczności leczenia właściwie niezależnie od genotypu HCV czy obecności marskości wątroby [77]. Również skojarzenie glecaprewiru (ABT-493)/pibren-taswiru (ABT-530) stosowane u osób z mu-tacjami lekooporności NS3 lub NS5A po-zwalało na eliminację zakażenia HCV [78].

'REUDQLHWHUDSLL SU]HFLZZLUXVRZHM]JRGQHM ]SURîOHPJHQHW\F]Q\PZLUXVD SR]ZROLQDRSW\PDOL]DFMĆMHM VNXWHF]QRĄFLRUD]]DSRELHJQLH WUDQVPLVMRPSRSXODFML OHNRRSRUQ\FKDZLĆFSR]ZROL QD]DFKRZDQLHVNXWHF]QRĄFL V]HURNLHMJDP\SUHSDUDWyZ SU]HFLZZLUXVRZ\FK

Braki danych i spojrzenie

w przyszłość

Do tej pory większość danych związa-nych z lekoopornością była opracowywana dla genotypu 1 HCV, subtypu 1a i 1b. Zmiany stężeń hamujących związanych z występo-waniem danej mutacji, określane jako zmia-na krotności (ang. fold-change) stężenia ha-mującego EC50 w porównaniu ze szczepa-mi niezmutowanyszczepa-mi są często słabo okre-ślone klinicznie, w szczególności dla geno-typów nie-1 HCV. Przełożenie danych muta-cji i ich kombinamuta-cji na zmiany stężeń hamu-jących dla poszczególnych genotypów HCV będzie istotne w przyszłości, gdyż pozwo-li na precyzyjne określenie skuteczności kpozwo-li- kli-nicznej danego preparatu. Ponadto, do tej pory badania nad lekoopornością HCV były ograniczone do niewielkich grup pacjen-tów z niepowodzeniem wirusowym lecze-nia, brakuje standaryzacji metod i walida-cji jakości wykrywania wariantów lekoopor-nych pomiędzy laboratoriami. Brak jest rów-nież standaryzacji raportowania poszcze-gólnych mutacji czy też standaryzowanego algorytmu interpretacji. Również dane mo-lekularnej lekowrażliwości dla genotypów 2, 4, 5, 6 są niezwykle ograniczone, co jest szczególnie istotne dla krajów o niskich za-sobach finansowych, a w których częstość występowania tych wariantów jest wysoka. Dla porównania w zakażeniu HIV istnieje kil-ka baz danych ułatwiających interpretację lekooporności: REGA, SIR, Stanford HIV Data-base – podobnej bazy danych dla HCV jesz-cze nie opracowano. Innym istotnym zjawi-skiem może być selekcja i transmisja wiru-sów pierwotnie lekoopornych – zagrożenie dla zdrowia publicznego [79].

W przyszłości można spodziewać się po-prawy algorytmów interpretacyjnych, stan-daryzacji metodologii oraz zwiększenia do-stępności i szybkości sekwencjonowań, aby były one w zasięgu klinicysty dla wszystkich przypadków, zarówno przed leczeniem, jak i w przypadkach niepowodzenia terapii.

Podsumowanie

Badania lekooporności stają się stan-dardem w terapii HCV, szczególnie

istot-4. Polaris Observatory HCV Collaborators. Global pre-valence and genotype distribution of hepatitis C vi-rus infection in 2015: a modelling study. Lancet Ga-stroenterol Hepatol 2017;2(3):161–176.

5. Boesecke C, Grint D, Soriano V et al. Hepatitis C se-roconversions in HIV infection across Europe: which regions and patient groups are affected? Liver Int 2015;35(11):2384–2391.

6. Gray RR, Parker J, Lemey P, Salemi M, Katzourakis A, Pybus OG. The mode and tempo of hepatitis C vi-rus evolution within and among hosts. BMC Evol Biol 2011;11:131.

7. Dahari H, Layden-Almer JE, Perelson AS, Layden TJ. Hepatitis C viral kinetics in special populations. Curr Hepat Rep 2008;7(3):97–105.

8. Dietz J, Susser S, Berkowski C, Perner D, Zeuzem S, Sarrazin C. Consideration of viral resistance for optimization of direct antiviral therapy of hepati-tis C virus genotype 1-infected patients. PLoS One 2015;10(8):e0134395.

9. Poveda E, Wyles DL, Mena A, Pedreira JD, Castro- -Iglesias A, Cachay E. Update on hepatitis C virus re-sistance to direct-acting antiviral agents. Antiviral Res 2014;108:181–191.

10. Smith DB, Bukh J, Kuiken C et al. Expanded clas-sification of hepatitis C virus into 7 genoty-pes and 67 subtygenoty-pes: updated criteria and ge-notype assignment web resource. Hepatology 2014;59(1):318–327.

11. Applegate TL, Gaudieri S, Plauzolles A et al. Natural-ly occurring dominant drug resistance mutations occur infrequently in the setting of recently acqu-ired hepatitis C. Antivir Ther 2015;20(2):199–208. 12. Simmonds P, Holmes EC, Cha TA et al. Classification

of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region. J Gen Virol 1993;74(11):2391–2399. 13. Sarwar MT, Kausar H, Ijaz B et al. NS4A protein as

a marker of HCV history suggests that different HCV genotypes originally evolved from genotype 1b. Vi-rol J 2011;8:317.

14. Simmonds P, Smith DB. Investigation of the pattern of diversity of hepatitis C virus in re-lation to times of transmission. J Viral Hepat 1997;4(Suppl. 1):S69–S74.

15. Markov PV, van de Laar TJ, Thomas XV et al. Colonial history and contemporary transmission shape the genetic diversity of hepatitis C virus genotype 2 in Amsterdam. J Virol 2012;86(14):7677–7687. 16. Magiorkinis G, Magiorkinis E, Paraskevis D et al. The

global spread of hepatitis C virus 1a and 1b: a phy-lodynamic and phylogeographic analysis. PLoS Med 2009;6(12):e1000198.

17. Foster GR, Afdhal N, Roberts SK et al. Sofosbuvir and velpatasvir for HCV genotype 2 and 3 infection. N Engl J Med 2015;373 (27):2608–2617.

18. Leroy V, Angus P, Bronowicki JP et al. Daclata-svir, sofosbuvir, and ribavirin for hepatitis C vi-rus genotype 3 and advanced liver disease: a ran-domized phase III study (ALLY-3+). Hepatology 2016;63(5):1430–1441.

19. Poordad F, Lawitz E, Gutierrez J et al. O006: C-swift: grazoprevir/elbasvir + sofosbuvir in cirrhotic and noncirrhotic, treatment-naive patients with he-patitis C virus genotype 1 infection, for dura-tions of 4, 6 or 8 weeks and genotype 3 infec-tion for durainfec-tions of 8 or 12 weeks. J Hepatol 2015:62(Suppl. 2)S192–S193.

20. Wargo AR, Kurath G. Viral fitness: definitions, me-asurement, and current insights. Curr Opin Virol 2012;2(5):538–545.

21. Silva T, Cortes Martins H, Coutinho R, Leitao E, Si-lva R, Padua E. Molecular characterization of hepa-titis C virus for determination of subtypes and de-tection of resistance mutations to protease inhibi-tors in a group of intravenous drug users co-infec-ted with HIV. J Med Virol 2015;87(9):1549–1557. 22. Wang H, Guo C, Chen BZ, Ji M. Computational

stu-dy on the drug resistance mechanism of HCV NS3 protease to BMS-605339. Biotechnol Appl Biochem 2017;64(2):153–164.

23. Parczewski M. Oporność na leki anty-HCV. Zakaże-nia 2016;16:19–30.

24. Halfon P, Locarnini S. Hepatitis C virus resistance to protease inhibitors. J Hepatol 2011;55(1):192–206. 25. Ehrenberg AE, Schmuck B, Anwar MI, Gustafsson

SS, Stenberg G, Danielson UH. Accounting for stra-in variations and resistance mutations stra-in the cha-racterization of hepatitis C NS3 protease inhibitors. J Enzyme Inhib Med Chem 2014;29(6):868–876. 26. Ferraro D, Urone N, Di Marco V, Craxi A. HCV-

-1b intra-subtype variability: impact on gene-tic barrier to protease inhibitors. Infect Genet Evol 2014;23:80–85.

27. Armstrong KL, Lee TH, Essex M. Replicative fit-ness costs of nonnucleoside reverse transcrip-tase inhibitor drug resistance mutations on HIV subtype C. Antimicrob Agents Chemother 2011;55(5):2146–2153.

28. De Luca A. The impact of resistance on viral fitness and its clinical implications. In: Geretti AM (ed.). An-tiretroviral Resistance in Clinical Practice. Medi-script, London, 2006.

29. Hedskog C, Dvory-Sobol H, Gontcharova

V et al. Evolution of the HCV viral population from a patient with S282T detected at relap-se after sofosbuvir monotherapy. J Viral Hepat 2015;22(11):871–881.

30. Irving WL, Rupp D, McClure CP et al. Develop-ment of a high-throughput pyrosequencing as-say for monitoring temporal evolution and resi-stance associated variant emergence in the hepa-titis C virus protease coding-region. Antiviral Res

31. Najera I. Resistance to HCV nucleoside analogue in-hibitors of hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase. Curr Opin Virol 2013;3(5):508–513. 32. Paolucci S, Fiorina L, Mariani B et al. Development

and persistence of DAA resistance associated mu-tations in patients failing HCV treatment. J Clin Virol 2015;72:114–118.

33. Yoshimi S, Imamura M, Murakami E et al. Long term persistence of NS5A inhibitor-resistant hepatitis C virus in patients who failed daclatasvir and asuna-previr therapy. J Med Virol 2015;87(11):1913–1920. 34. Luber AD. Genetic barriers to resistance and impact

on clinical response. Med Gen Med 2005;7:69. 35. Patino-Galindo JA, Salvatierra K,

Gonzalez-Can-delas F, Lopez-Labrador FX. Comprehensive scre-ening for naturally-occurring hepatitis C virus resi-stance to direct-acting antivirals in the NS3, NS5A and NS5B genes in worldwide isolates from viral genotypes 1–6. Antimicrob Agents Chemother 2016;60(4):2402–2016.

36. Goodwin S, McPherson JD, McCombie WR.

Coming of age: ten years of next-genera-tion sequencing technologies. Nat Rev Genet 2016;17(6):333–351.

37. Forns X, Lawitz E, Zeuzem S et al. Simeprevir with peginterferon and ribavirin leads to high rates of SVR in patients with HCV genotype 1 who relapsed after previous therapy: a phase 3 trial. Gastroente-rology 2014;146(7):1669–1679.

38. McCloskey RM, Liang RH, Joy JB et al. Global ori-gin and transmission of hepatitis C virus nonstruc-tural protein 3 Q80K polymorphism. J Infect Dis 2015;211(8):1288–1295.

39. Cuypers L, Vrancken B, Fabeni L et al. Implications of hepatitis C virus subtype 1a migration patterns for virus genetic sequencing policies in Italy. BMC Evol Biol 2017;17(1):70.

40. De Luca A, Di Giambenedetto S, Lo Presti A et al. Two distinct hepatitis C virus genotype 1a clades have different geographical distribution and asso-ciation with natural resistance to NS3 protease inhi-bitors. Open Forum Infect Dis 2015;2(2):ofv043. 41. McPhee F, Friborg J, Levine S et al. Resistance

ana-lysis of the hepatitis C virus NS3 protease inhibi-tor asunaprevir. Antimicrob Agents Chemother 2012;56(7):3670–3681.

42. Guo Z, Black S, Hu Y et al. Unraveling the struc-tural basis of grazoprevir potency against clini-cally relevant substitutions in hepatitis C virus NS3/4A protease from genotype 1a. J Biol Chem 2017;292(15):6202–6212.

43. Jensen SB, Serre SB, Humes DG et al. Substitutions at NS3 residue 155, 156, or 168 of hepatitis C virus genotypes 2 to 6 induce complex patterns of pro-tease inhibitor resistance. Antimicrob Agents Che-mother 2015;59(12):7426–7436.

44. Guo Z, Prongay A, Tong X et al. Computational stu-dy of the effects of mutations A156T, D168V, and D168Q on the binding of HCV protease inhibitors. J Chem Theory Comput 2006;2(6):1657–1663. 45. Berger KL, Scherer J, Ranga M et al. Baseline

poly-morphisms and emergence of drug resistance in the NS3/4A protease of hepatitis C virus genoty-pe 1 following treatment with faldaprevir and genoty- pe-gylated interferon alpha 2a/ribavirin in phase 2 and phase 3 studies. Antimicrob Agents Chemother 2015;59(10):6017–6025.

46. Iio E, Shimada N, Abe H et al. Efficacy of daclatasvir/ asunaprevir according to resistance-associated va-riants in chronic hepatitis C with genotype 1. J Ga-stroenterol 2017;52(1):94–103.

47. Nguyen LT, Gray E, Dean J et al. Baseline preva-lence and emergence of protease inhibitor resi-stance mutations following treatment in chronic HCV genotype-1-infected individuals. Antivir Ther 2015;20(8):865–869.

48. Shepherd SJ, Abdelrahman T, MacLean AR, Thom-son EC, Aitken C, GunThom-son RN. Prevalence of HCV NS3 pre-treatment resistance associated amino acid variants within a Scottish cohort. J Clin Virol 2015;65:50–53.

49. Jacobson IM, Asante-Appiah E, Wong P et al. Preva-lence and impact of baseline NS5A resistance as-sociated variants (RA_{Vs) on the efficacy of elbasvir/} grazoprevir (EBR/GZR) against GT1a infection. He-patology 2015;62(Suppl.):1393A–1394A. 50. Kwo P, Gane EJ, Peng CY et al. Effectiveness of

el-basvir and grazoprevir combination, with or wi-thout ribavirin, for treatment-experienced patients with chronic hepatitis C infection. Gastroenterolo-gy 2017;152(1):164–175.

51. Zeuzem S, Mizokami M, Pianko S et al. Prevalen-ce of pre-treatment NS5A resistanPrevalen-ce associa-ted variants in genotype 1 patients across diffe-rent regions using deep sequencing and effect on treatment outcome with LDV/SOF. Hepatology 2015;62(Suppl.):254A.

52. Zeuzem S, Mizokami M, Pianko S et al. NS5A resi-stance-associated substitutions in patients with ge-notype 1 hepatitis C virus: prevalence and effect on treatment outcome. J Hepatol 2017;66(5):910–918. 53. Curry MP, O’Leary JG, Bzowej N et al. Sofos-buvir and velpatasvir for HCV in patients with decompensated cirrhosis. N Engl J Med 2015;373(27):2618–2628.

54. American Association for the Study of Liver Diseases and Infectious Diseases Society of America (AASLD- -IDSA). HCV Guidance: Recommendations for te-sting, managing, and treating hepatitis C. http:// www.hcvguidelines.org (accessed: May 26, 2014). 55. European Association for the Study of the Liver. EASL

56. Ito J, Suda G, Yamamoto Y et al. Prevalence and characteristics of naturally occurring sofosbuvir re-sistance-associated variants in patients with he-patitis C virus genotype 1b infection. Hepatol Res 2016;46(13):1294–1303.

57. Nguyen LT, Hall N, Sheerin D, Carr M, De Gascun CF; Irish Hepatitis C Outcomes Research Network. Na-turally occurring HCV NS5A/B inhibitor resistance-associated mutations to direct-acting antivirals. An-tivir Ther 2016;21(5):447–453.

58. Costantino A, Spada E, Equestre M et al. Naturally occurring mutations associated with resistance to HCV NS5B polymerase and NS3 protease inhibitors in treatment-naive patients with chronic hepatitis C. Virol J 2015;12:186.

59. Svarovskaia ES, Gane E, Dvory-Sobol H et al. L159F and V321A sofosbuvir-associated he-patitis C virus NS5B substitutions. J Infect Dis 2015;213(8):1240–1247.

60. Schneider MD and Sarrazin C. Antiviral therapy of hepatitis C in 2014: do we need resistance testing? Antiviral Res 2014;105:64–71.

61. Naggie S, Cooper C, Saag M et al. Ledipasvir and so-fosbuvir for HCV in patients coinfected with HIV-1. N Engl J Med 2015;373(8):705–713.

62. Molina JM, Orkin C, Iser DM et al. Sofosbuvir plus ri-bavirin for treatment of hepatitis C virus in patients co-infected with HIV (PHOTON-2): a multicentre, open-label, non-randomised, phase 3 study. Lan-cet 2015;385(9973):1098–1106.

63. Lawitz E, Poordad F, Brainard DM et al. Sofosbuvir with peginterferon-ribavirin for 12 weeks in previo-usly treated patients with hepatitis C genotype 2 or 3 and cirrhosis. Hepatology 2015;61(3):769–775. 64. Krishnan P, Tripathi R, Schnell G et al. Resistance

analysis of baseline and treatment-emergent va-riants in hepatitis C virus genotype 1 in the AVIA-TOR study with paritaprevir-ritonavir, ombitasvir, and dasabuvir. Antimicrob Agents Chemother 2015;59(9):5445–5454.

65. Ribeiro RM, Li H, Wang S et al. Quantifying the diver-sification of hepatitis C virus (HCV) during prima-ry infection: estimates of the _{in vivo mutation rate.} PLoS Pathog 2012;8(8):e1002881.

66. Neumann AU, Lam NP, Dahari H et al.

Hepa-titis C viral dynamics _{in vivo and the}

antivi-ral efficacy of interferon-alpha therapy. Science 1998;282(5386):103–107.

67. Bartolini B, Selleri M, Garbuglia AR et al. HCV NS3 quasispecies in liver and plasma and dynamics of telaprevir-resistant variants in breakthrough pa-tients assessed by UDPS: a case study. J Clin Virol 2015;72:60–65.

68. Guan Y, Sun H, Li Y, Pan P, Li D, Hou T. The compe-titive binding between inhibitors and substrates

69. Guan Y, Sun H, Pan P, Li Y, Li D, Hou T. Exploring resi-stance mechanisms of HCV NS3/4A protease mu-tations to MK5172: insight from molecular dyna-mics simulations and free energy calculations. Mol Biosyst 2015;11(9):2568–2578.

70. Howe AYM, Long J, Nickle D et al. Long-term follow- -up of patients receiving boceprevir for treatment of chronic hepatitis C. Antiviral Res 2015;113:71–78. 71. Sullivan JC, De Meyer S, Bartels DJ et al. Evolu-tion of treatment-emergent resistant variants in telaprevir phase 3 clinical trials. Clin Infect Dis 2013;57(2):221–229.

72. Krishnan P, Tripathi R, Schnell G et al. O057: Long--term follow-up of treatment-emergent resistan-ce-associated variants in NS3, NS5A and NS5B with paritaprevir/r-, ombitasvir- and dasabuvir-based re-gimens. J Hepatol 2015;62(Suppl. 2):S220. 73. Wyles DL, Gutierrez JA. Importance of HCV

genoty-pe 1 subtygenoty-pes for drug resistance and response to therapy. J Viral Hepat 2014;21(4):229–240. 74. Dvory-Sobol H, Wyles D, Ouyang W et al. Long-

-term persistence of HCV NS5A variants after tre-atment with NS5A inhibitor ledipasvir. J Hepatol 2015;62(Suppl. 2):S221.

75. Forns X, Gordon SC, Zuckerman E et al. Grazoprevir and elbasvir plus ribavirin for chronic HCV genoty-pe-1 infection after failure of combination therapy containing a direct-acting antiviral agent. J Hepatol 2015;63(3):564–572.

76. Gane EJ, Shiffman ML, Etzkorn K et al. Sofosbu-vir/velpatasvir in combination with ribavirin for 24 weeks is effective retreatment for patients who failed prior NS5A containing DAA regimens: re-sults of the GS-US-342-1553 Study. J Hepatol 2016;64(Suppl.):S147–S148.

77. Zeuzem S, Flamm SL, Tong MJ et al. A Randomized, controlled, phase 3 trial of sofosbuvir/velpatasvir/ voxilaprevir or sofosbuvir/velpatasvir for 12 weeks in direct acting antiviral-experienced patients with genotype 1–6 HCV infection: The POLARIS-4 Stu-dy. 67th _{Annual Meeting of the American}

Associa-tion for the Study of Liver Diseases (AASLD); 11–15 November, 2016, Boston, Massachusetts, USA (abs-tract no. 109).

78. Poordad F, Gordon SC, Asatryan A et al. High Effica-cy of ABT-493 and ABT-530 in HCV genotype 1 in-fected patients who have failed direct-acting anti-viral-containing regimens: the MAGELLAN-I Study. J Hepatol 2016;64(Suppl.):S160–S161.

79. Abravanel F, Métivier S, Chauveau M, Péron JM, Izo-pet J. Transmission of HCV NS5A inhibitor-resistant variants among HIV-infected men who have sex with men. Clin Infect Dis 2016;63(9):1271–1272.