Vol. 14/2005 Nr 28
NEUROLOGIA
DZIECIĘCA
NEUROLOGIA
DZIECIĘCA
C H IL D N EU RO LOPRACA ORYGINALNA/ORIGINAL ARTICLE
Cel pracy: Analiza związku polimorfizmów epsilon genu APOE i I/D genu ACE z dokonanym uda-rem niedokrwiennym mózgu u dzieci z uwzględnieniem ciężkości stanu pacjenta. Materiał i meto-dy: Badaniami objęto 218 osób rasy kaukaskiej, w tym: dzieci po udarze niedokrwiennym mózgu (n = 17), ich rodziców (n = 33) oraz grupę kontrolną (n = 168). Grupa dzieci po udarze mózgu została podzielona na 2 podgrupy w zależności od ciężkości stanu klinicznego pacjenta w okresie ostrym oraz dalszego przebiegu choroby i odległych następstw oraz pod względem płci. Grupę kontrolną również podzielono na 2 podgrupy: dzieci zdrowe (n = 53) oraz dobrowolnych dawców krwi (n = 115). Polimorfizm epsilon genu APOE analizowano techniką RFLP-PCR, polimorfizm insercyjno/delecyjny genu ACE metodą PCR. Wyniki: Wykazano, że w grupie dzieci po udarze niedokrwiennym mózgu częstość allelu ε4 genu apolipoproteiny E jest znamiennie wyższa w po-równaniu zarówno z całą grupą kontrolną (0,23 vs 0,08, p = 0,01, OR = 3,36), jak i podgrupą osób zdrowych do 20 roku życia (0,05, p = 0,01, OR = 6,26). Szczególnie duże różnice w częstościach allelu ε4 oraz nosicieli tego allelu stwierdzono między podgrupami płci męskiej (p = 0,003 dla allelu i p = 0,02 dla nosicielstwa). Różnice wykazano także pomiędzy podgrupami chorych wyodrębnio-nymi na podstawie ciężkości stanu pacjenta. Stwierdzono znacznie niższą częstość allelu ε4 w grupie w stanie klinicznym ciężkim niż w grupie w stanie dość dobrym (p = 0,03). Wykazano, że częstość allelu I polimorfizmu ACE jest wyższa w podgrupie pacjentów w stanie klinicznym cięż-kim (0,78) w porównaniu do pacjentów w stanie klinicznym dość dobrym (0,42). Po zróżnicowaniu badanych grup ze względu na płeć stwierdzono, że częstość allelu I jest znamiennie wyższa w podgrupie dziewcząt po udarze (0,72) w porównaniu do podgrupy dziewcząt zdrowych (0,39) (p = 0,01, OR = 4,00). Wyniki te wymagają potwierdzenia na liczniejszej grupie pacjentów.
Aim: Analysis of association between epsilon polymorphism of APOE gene and I/D polymor-phism of ACE gene and brain ischemic stroke in children with considering of state after stroke and gender. Material and methods: The study included 218 Caucasian subjects: children with brain ischemic stroke (n = 17), their parents (n = 33) and control group (n = 168). Study group of children after brain stroke was divided into two subgroups dependently on the state of patients in acute phase and in further development of the disease and noticeable distant consequences and considering gender. Control group were also divided into two subgroups: healthy subjects aged < 20 years (n = 53) and aged 21–40 years (n = 115). The epsilon polymorphism of APOE gene was analyzed using PCR-RFLP method and insertion/deletion polymorphism in ACE gene was ana-lyzed using PCR. Results: There was shown significantly higher frequency of ε4 allele of APOE
Streszczenie
Słowa kluczowe: udar niedokrwienny mózgu, apolipoproteina E, kon-wertaza angiotensyno-wa, polimorfizm
Abstract
Key words: brain
isch-emic stroke, APOE, ACE, polymorphism
Polimorfizm epsilon genu apolipoproteiny E
i polimorfizm insercyjno-delecyjny genu ACE
a udar niedokrwienny mózgu u dzieci:
pilotowe badanie związków
Epsilon polymorphism of apolipoprotein E gene
and insertion-deletion polymorphism of ACE gene
and brain ischemic stroke in children: association
pilot-study
1Iwona Żak, 1Anna Balcerzyk, 1Beata Sarecka, 1Paweł Niemiec, 2Ilona
Kopyta, 2Ewa Emich-Widera, 2Elżbieta Marszał
1Katedra i Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach
Kierownik: dr hab. n. med. I. Żak
2Katedra i Klinika Pediatrii i Neurologii Wieku Rozwojowego Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach
gene in group of children after brain ischemic stroke in comparison to entire control group (0.23 vs 0.08, p = 0.01, OR = 3.36), as well as to healthy subjects up to 20 years old (0.05, p = 0.01, OR = 6.26). Especially significant differences in the frequency of ε4 allele and ε4 allele carriers were observed between male subgroups (p = 0.003 for allele and p = 0.02 for carriers). The differences were also obtained between subgroups of patients divided dependently on the state of patients. There was signifficantly lower frequency of ε4 allele in the subgroup of patients in serious state comparing to patients in good state (p = 0.03). We also demonstrate that frequency of I allele of
ACE I/D polymorphism is significantly higher in subgroup of patients in serious state (0.78)
com-pared to patients in good state (0.42). After considering the gender we found that frequency of I allele is significantly higher in subgroup of girls after stroke (0.72) compared to subgroup of healthy girls (0.39) (p = 0.01, OR = 4.00).These results need confirmation on larger group of patients.
Wstęp
Udar niedokrwienny mózgu jest trzecią co do często-ści przyczyną zgonów osób dorosłych. Chociaż choro-ba ta u dzieci występuje znacznie rzadziej (z częstością około 1/100 000/rok) pozostaje ważnym problemem społecznym ze względu na deficyty neurologiczne, któ-re pozostają u ok. połowy pacjentów. Etiologia udarów u dzieci jest słabo poznana i składają się na nią prawdo-podobnie liczne czynniki środowiskowe i genetyczne. Za udziałem tych ostatnich przemawia fakt, że udary niedokrwienne mózgu pięciokrotnie częściej występu-ją u par bliźniąt jednojajowych w porównaniu z dwuja-jowymi [1]. Czynnik genetyczny może być szczególnie istotny u osób młodych, u których udział czynników środowiskowych nie jest jeszcze tak znaczący. W nie-licznych przypadkach do powstania udarów u dzieci mogą prowadzić rzadkie choroby uwarunkowane jed-nogenowo, np. rodzinna hipercholesterolemia [2] czy anemia sierpowata [3]. Wśród zaburzeń genetycznych mogących odgrywać rolę w etiopatogenezie udaru niedokrwiennego mózgu u dzieci szczególna rola jest przypisywana polimorfizmom w genach fibrynogenu [4], reduktazy metylenetetrahydrofolianowej, czynni-ków krzepnięcia V i VII [5] oraz konwertazy angio-tensynowej [6]. Jednak najczęściej genetyczne podłoże udarów niedokrwiennych mózgu jest uwarunkowane wielogenowo. W światowej literaturze niewiele jest doniesień na ten temat.
Podłoże genetyczne chorób naczyń mózgowych mogą stanowić geny polimorficzne, których produkty białkowe uczestniczą w patogenezie choroby [7, 8]. Genów kandydatów chorób naczyń mózgowych po-szukuje się między innymi wśród genów kodujących białka biorące udział w zaburzeniach gospodarki lipi-dowej oraz wśród genów kodujących składniki układu renina-angiotensyna (RAS).
Poza rzadko występującym schorzeniem mono-genowym – hipercholesterolemią rodzinną, uwarun-kowaną mutacjami w genie receptora LDL, stężenie cholesterolu i innych lipidów w osoczu może być wy-nikiem funkcjonalnego współdziałania ze sobą wielu genów. Do ważniejszych czynników genetycznych, wpływających na poziom cholesterolu w osoczu,
na-leży polimorfizm genu apolipoproteiny E (apo E). Apo E jest syntetyzowana głównie w wątrobie, występuje w remnantach chylomikronów i VLDL, umożliwiając ich usuwanie z krążenia, dzięki pełnionej funkcji liganda dla dwóch ważnych receptorów dla lipoprotein, mia-nowicie receptora LDL i receptora LRP. Polimorfizm genu APOE odpowiedzialny jest za istnienie trzech izoform tej apolipoproteiny: E2, E3, E4, które kodowa-ne są przez trzy allele ε2, ε3, ε4. Ze względu na różkodowa-ne powinowactwo poszczególnych izoform do receptora lipoprotein, polimorfizm ten wpływa na profil lipido-wy osocza. W mózgu i płynie mózgowo-rdzeniolipido-wym, gdzie brakuje głównych osoczowych transporterów lipidów endogennych, lipoprotein o niskiej gęstości (LDL), apoE, która jest podstawową apoproteiną pły-nu mózgowo-rdzeniowego, pełni funkcję białkowego transportera lipidów. Funkcje apo E wykraczają jednak znacznie poza jej udział w regulacji metabolizmu lipi-dów. Liczne prace dowodzą, że apo E jest zaangażo-wana w modulowanie odpowiedzi zapalnej, regulację funkcji płytek krwi, zjawiska apoptozy i stresu oksy-dacjnego [9].
Konwertaza angiotensynowa (ACE) bierze udział w proteolitycznym przekształceniu angiotensyny I w aktywną angiotensynę II, jak również w inaktywacji bradykininy [10]. Angiotensyna II pobudza wzrost i proliferację miocytów naczyniowych, a także skurcz mięśni gładkich ściany tętnic. Posiada również właści-wości aktywowania śródbłonka naczyniowego, mani-festowane syntezą i ekspresją na powierzchni błony re-ceptorów adhezyjnych (VCAM, ICAM, CD-62E) oraz sekrecją chemokin (MCP-1). Zjawiska stymulowane przez angiotensynę II należą do kluczowych w patoge-nezie miażdżycy.
Wykazano, że polimorfizm insercyjno-delecyjny (I/D) w genie ACE ma związek ze stężeniem ACE w osoczu [11]. Homozygoty DD charakteryzują się ak-tywnością ACE większą co najmniej dwukrotnie, w porównaniu do homozygot II. Heterozygoty ID charak-teryzują się aktywnością pośrednią. Bazując na powyż-szych informacjach wykazano, że genotyp DD może być czynnikiem ryzyka choroby niedokrwiennej serca i zawału mięśnia sercowego w niektórych populacjach [12, 13]. Związek ten został potwierdzony i
udokumen-towany badaniami własnymi w populacji pacjentów kardiologicznych z Górnego Śląska [14]. Wpływ po-limorfizmu genu ACE na ryzyko wystąpienia choroby niedokrwiennej serca może sugerować jego udział w tworzeniu genetycznego podłoża udarów niedokrwien-nych mózgu, zarówno u dorosłych, jak i u dzieci.
Autorzy prowadzą badania nad genetycznym pod-łożem chorób naczyń mózgowych, w tym udaru nie-dokrwiennego mózgu u dzieci. Celem niniejszej pracy jest analiza związku polimorfizmów epsilon genu apo-lipoproteiny E oraz insercyjno/delecyjnego genu kon-wertazy angiotensynowej (ACE) z dokonanym udarem niedokrwiennym mózgu u dzieci z uwzględnieniem ciężkości stanu pacjenta i następstw.
Materiał i metody
Badaniami objęto 218 białych osób rasy kaukaskiej, w tym dzieci po dokonanym udarze niedokrwiennym mózgu, ich rodziców, osoby zdrowe do 20 roku życia bez klinicznych objawów neurologicznych i bez obcią-żeń rodzinnych chorobami sercowo-naczyniowymi w wywiadzie oraz dobrowolnych dawców krwi w wieku 21–40 lat bez obciążeń rodzinnymi chorobami serco-wo-naczyniowymi w ankiecie.
Grupę pacjentów stanowiło siedemnaścioro dzieci i młodych dorosłych w wieku od 2 do 27 lat (9 dziew-cząt, 8 chłopców), którzy byli hospitalizowani w ostrej fazie niedokrwienia mózgu w Klinice Neurologii Wie-ku Rozwojowego ŚAM w Katowicach i nadal są objęci opieką ambulatoryjną. Dokonany udar niedokrwienny mózgu rozpoznano zgodnie z obowiązującymi kryte-riami klinicznymi i potwierdzono badaniami neuro-obrazującymi (TK i MR). Ocenę neurologiczną stanu pacjentów (grupa 1) przeprowadzano w skali Orgogo-zo, nazywanej przez autora „skalą tętnicy środkowej mózgu”. Skala ta pozwala na dokonanie obiektywnej oceny stanu świadomości, kontaktu słownego, ruchów oraz napięcia mięśniowego w obrębie kończyny górnej i dolnej, a także ruchów głowy i gałek ocznych. Uzy-skanie 100 punktów oznacza, iż pacjent jest w pełnym, logicznym kontakcie słownym, nie stwierdza się tak-że deficytów neurologicznych (poratak-żenia/niedowłady kończyn oraz mięśni twarzy), a ruchy głowy i gałek ocznych są prawidłowe. Mniejsza od 100 liczba punk-tów oznacza z kolei obecność deficypunk-tów ruchowych, zaburzeń świadomości i/lub zaburzeń mowy. Grupę pacjentów podzielono na dwie podgrupy w zależności od ciężkości stanu pacjenta w okresie ostrym, od po-czątku wystąpienia objawów klinicznych oraz dalszego przebiegu choroby i widocznych odległych następstw: pacjentów w stanie ciężkim (śpiączka, porażenie lub niedowład znacznego stopnia, poniżej 55 punktów w skali Orgogozo; n = 9; wiek w czasie ostatnich badań kontrolnych od 8 do 27 lat) – podgrupa 1a; pacjentów w
stanie dość dobrym (niedowład średnio lub słabo wyra-żony, bez zaburzeń świadomości, powyżej 55 punktów w skali Orgogozo; n = 6; wiek w czasie ostatnich badań kontrolnych od 2 do 17 lat) – podgrupa 1b.
Dwie pacjentki spośród całej grupy chorych nie mogą być zakwalifikowane do żadnej z podgrup ze względu na brak widocznych następstw poudarowych.
Grupę rodziców pacjentów stanowiło trzydziestu trzech zdrowych rodziców w wieku od 28 do 53 lat. Matka jednego pacjenta zmarła z powodu tętniaków tętnic nerkowych (grupa 2).
Grupę kontrolną stanowiło sto sześćdziesiąt osiem
osób bez klinicznych objawów neurologicznych i bez obciążeń rodzinnymi chorobami sercowo-naczyniowy-mi w wywiadzie w wieku od 7 do 40 lat (♀ n = 59, ♂ n = 109). Osoby te były rekrutowane spośród pacjentów Kliniki Neurologii Wieku Rozwojowego ŚAM w Ka-towicach oraz dobrowolnych dawców krwi (grupa 3). Grupę tę podzielono na dwie podgrupy w zależności od wieku: osoby do 20 roku życia, n = 53, ♀ n = 33,♂ n = 20 (grupa 3a), osoby między 21 a 40 rokiem życia, n = 115, ♀ n = 26, ♂ n = 89 (grupa 3b).
Wszystkie osoby włączone do badań wyraziły chęć uczestniczenia w nich zgodnie z zasadami etycznymi i organizacją badań naukowych, na które uzyskano zgo-dę Komisji Bioetycznej przy Śląskiej Akademii Me-dycznej.
Analizy biochemiczne
Krew do badań pobierano z żyły odłokciowej po 12– –24-godzinnej przerwie w przyjmowaniu pokarmów. Stężenia wskaźników gospodarki lipidowej: choleste-rolu całkowitego, cholestecholeste-rolu HDL i trójglicerydów oznaczano w świeżej surowicy za pomocą gotowych zestawów firmy Analco i spektrofotometru UV-VIS MINI 1240 firmy Schimadzu. Stężenie cholesterolu LDL obliczono wg wzoru Friedewalda [15].
Analizy genetyczne
Izolację DNA z limfocytów krwi obwodowej wy-konywano z użyciem gotowego zestawu MasterPureTM
Genomic DNA Purification Kit (Epicentre Techno-logies). Stężenie i czystość izolatów DNA mierzono spektrofotometrycznie przy λ = 260/280 nm.
Polimorfizm epsilon genu APOE genotypowa-no techniką PCR-RLFP (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragments Lenght Polymorphism), która obejmuje następujące etapy:
Reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), która umoż-liwia namnożenie badanego fragmentu genu APOE. Wykorzystano następującą parę oligonukleotydowych starterów [16]:
5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3’ Reakcję prowadzono w termocyklerze gradiento-wym Tgradient 96 firmy Biometra w następujących warunkach: 1) wstępna denaturacja DNA: 950C – 5
min, 2) denaturacja: 950C – 1 min, 3) przyłączanie
star-terów: 640C – 1 min, 4) wydłużanie nici DNA: 720C – 1
min, etapy 2, 3, 4 powtarzano dwukrotnie, obniżając temp. przyłączania starterów o 1 stopień co 2 cykle aż do temp. 610C, 5) denaturacja: 950C – 1 min, 6)
przy-łączanie starterów: 600C – 1 min, 7) wydłużanie nici
DNA: 720C – 2 min, etapy 5, 6, 7 powtarzano
cyklicz-nie 20 razy, 8) końcowe wydłużacyklicz-nie 720C – 30 min.
Trawienie enzymem restrykcyjnym HhaI produktu re-akcji PCR. Restrykcję przeprowadzano w temp. 370C,
przez 16 godzin, używając 2,5 U enzymu na 8,65 μl amplifikatu. Na skutek trawienia uzyskiwano następu-jące fragmenty: dla allelu ε2 – 38, 83, 91 par zasad (pz), dla ε3 – 35, 38, 48, 91 pz, dla ε4 – 35, 38, 48, 72 pz.
Elektroforezę i wizualizację DNA, umożliwiające detekcję określonej formy polimorficznej.
Produkty trawienia rozdzielano elektroforetycznie na 8% żelu poliakrylamidowym z 5% glicerolem w bu-forze 1xTBE o pH 8,3. DNA po elektroforezie barwio-no azotanem srebra zgodnie ze standardową procedurą dla DNA. Następnie żele suszono i dokumentowano za pomocą systemu UV i VIS Docprint firmy Vilber Lo-urmat.
Polimorfizm insercyjno/delecyjny genu ACE geno-typowano techniką PCR (ang. polymerase chain
reac-tion), obejmującą następujące etapy:
1. Reakcję PCR, która umożliwia namnożenie ba-danego fragmentu genu konwertazy angiotensyny I z parą oligonukleotydowych starterów opisanych wcze-śniej [12]. Reakcję przeprowadzano w termocyklerze gradientowym Tgradient 96 firmy Biometra w warun-kach wg własnego opracowania: wstępna denaturacja w 94oC przez 5 min; 30 cykli obejmujących:
denatu-rację w 92oC przez 1 min, przyłączanie starterów w
52oC przez 1 min, wydłużanie w 72oC przez 2 min. 30
s; końcowe wydłużanie w 72oC przez 6 min;
schłodze-nie w 4oC. Wielkość produktu allelu I wynosi 490 par
zasad (pz), natomiast allelu D wynosi 190 pz.
2. Elektroforezę i wizualizację DNA. Produkty re-akcji PCR rozdzielano elektroforetycznie na 2% żelu agarozowym w roztworze buforowym TBE 1x o pH 8,3. Rozdzielone fragmenty DNA uwidaczniano na elektroforogramach bromkiem etydyny. Żele suszono i dokumentowano przy użyciu systemu dokumentacji żeli Docprint core UV-Vis firmy Vilber Lourmat.
Analiza statystyczna
Uzyskane wyniki analizowano za pomocą programu EpiInfo-6 (WHO). Częstości alleli ustalono na podsta-wie częstości genotypów. Zgodność rozkładu z
równo-wagą Hardy-Weinberga określono za pomocą testu χ2.
Porównanie częstości genotypów i alleli między grupa-mi badanygrupa-mi wykonano testem χ2. W przypadku gdy
liczba danych była mniejsza niż 5, stosowano dodatko-wo test dokładny Fishera. Za istotne statystycznie róż-nice przyjmowano te wartości, dla których p < 0,05.
Siłę asocjacji poszczególnych alleli i genotypów z dokonanym udarem niedokrwiennym mózgu określo-no na podstawie wartości współczynnika ilorazu szans (ang. odds ratio – OR) z przedziałem ufności 95% CI.
Wyniki i dyskusja
Wiek poszczególnych pacjentów w chwili wystą-pienia ostrego niedokrwienia mózgu wahał się w gra-nicach od 14 miesiąca życia do 15 roku życia. Badania kontrolne przeprowadzano w warunkach ambulatoryj-nych, ostatnie po upływie 10 miesięcy do 12 lat od wy-stąpienia udaru, odpowiednio w wieku pacjentów 2 do 27 lat. Udar mózgu u wszystkich pacjentów dotyczył przedniego krągu unaczynienia mózgu PACI (ang. Par-tial Anterior Circulation Infarct). Pełną charakterysty-kę pacjentów pod względem klinicznym i biochemicz-nym przedstawiono we wcześniejszej publikacji, gdzie szczegółowo opisano objawy udaru w fazie ostrej i najczęstsze odległe następstwa udaru oraz szczegóły klinicznych badań kontrolnych [17].
We wcześniejszym doniesieniu wykazano [18], że u badanych dzieci z dokonanym udarem niedokrwien-nym mózgu współwystępowało wiele różnych czynni-ków ryzyka chorób naczyniowych mózgu, najczęściej dyslipidemie, w tym hipercholesterolemia u 6 pacjen-tów, hipertrójglicerydemia u 2, hiperlipoproteinemia u 4, dyslipidemia mieszana u jednego pacjenta, dodat-kowo zespół antyfosfolipidowy u 2 pacjentów, deficyt białka S u 4 pacjentów, oporność na aktywną postać białka C APCR (ang. Activated Protein C Resistance) u dwóch pacjentów i deficyt białka C u jednego pacjenta. Stwierdzono współwystępowanie przynajmniej dwóch czynników ryzyka u 9 dzieci.
Wyniki wskaźników gospodarki lipidowej surowi-cy przedstawiono w tabeli I.
Stwierdzono istotną statystycznie różnicę pomiędzy grupą chorych (gr. 1) a zdrowymi dziećmi (gr. 3a) w stężeniu cholesterolu całkowitego oraz cholesterolu LDL (p = 0,014 i p = 0,004).
Zdrowi rodzice dzieci po udarze niedokrwiennym mózgu nie odbiegają znacząco od normy pod wzglę-dem parametrów gospodarki lipidowej surowicy, nie wykazano znamiennych statystycznie różnic w porów-naniu z krwiodawcami (tab. I).
Polimorfizm APOE. Rozkłady częstości genotypów
i alleli genu apolipoproteiny E w badanych grupach oraz rozkłady w podgrupach z uwzględnieniem płci przedstawiono w tabeli II. Rozkłady we wszystkich
Tab. I. Wskaźniki gospodarki lipidowej w surowicy wśród badanych grup. Parameters of serum lipids levels among study groups mediana lub średnia Cholesterol całkowity (mmol/l) Cholesterol HDL (mmol/l) Cholesterol LDL (mmol/l) Trójglicerydy (mmol/l) pacjenci (grupa 1) Mediana (min.-max.) 4,53 (3,81–5,96)* 1,11 (0,67–2,05) 3,13 (1,71–4,32)* 1,10 (0,54–2,54)
pacjenci w stanie ciężkim (podgrupa 1a)
Mediana
(min.-max.) 4,53 (3,91–5,96) 1,11 (0,67–2,05) 3,00 (1,71–4,32) 1,01 (0,54–2,54)
pacjenci w stanie dość dobrym (podgrupa 1b)
Mediana
(min.-max.) 4,87 (4,14–5,83) 1,37 (0,85–1,55) 3,26 (2,28–4,12) 1,14 (0,62–2,06)
rodzice pacjentów (grupa 2)
Średnia ± SD 4,49 ± 1,04 1,07 ± 0,42 2,84 ± 1,12 1,24 ± 0,68
dzieci zdrowe (podgrupa 3a)
Mediana
(min.-max.) 4,09 (2,61–6,73) 1,07 (0,47–2,59) 2,56 (1,29–4,35) 0,90 (0,36–3,48)
dobrowolni dawcy krwi (podgrupa 3b)
Średnia ± SD 4,98 ± 1,31 1,04 ± 0,39 3,28 ± 1,15 1,36 ± 0,62
* Dane są znamienne statystycznie. * Statistically significant data
Tab. II. Dystrybucja częstości genotypów i alleli polimorfizmu epsilon genu APOE wśród badanych grup.
Distribu-tion of genotypes and alleles frequencies of epsilon polymorphism in APOE gene among study groups
GRUPA n GENOTYPY* ALLELE
ε3ε3 ε3ε4 ε3ε2 ε4ε4 ε4ε2 ε3 ε4 ε2 Pacjenci (1) ♀ ♂ 17 częstn 0,5910 0,122 0,122 0,173 00 0,7124 0,238 0,062 9 częstn 0,676 00 0,222 0,111 00 0,7814 0,112 0,112 8 częstn 0,504 0,252 00 0,252 00 0,6310 0,376 00 (1a) w stanie ciężkim1 9 n częst 8 0,89 0 0 0 0 1 0,11 0 0 16 0,90 2 0,10 0 0 (1b) w stanie dość dobrym2 6 n częst 2 0,33 2 0,33 0 0 2 0,33 0 0 6 0,50 6 0,50 0 0
Rodzice pacjentów (2) Gr. kontrolna (3) ♀ ♂ (3a) do 20 lat ♀ ♂ (3b) 21-40 lat ♀ ♂ 27 częstn 0,6317 0,267 0,113 00 00 0,8244 0,137 0,053 137 częstn 0,74101 0,1622 0,0913 00 0,011 0,87237 0,0823 0,0514 45 częstn 0,7333 0,167 0,115 00 00 0,8778 0,087 0,055 92 częstn 0,7468 0,1615 0,098 00 0,011 0,86159 0,0916 0,059 32 częstn 0,7223 0,093 0,196 00 00 0,8655 0,053 0,096 21 częstn 0,6714 0,143 0,194 00 00 0,8335 0,073 0,014 11 częstn 0,829 00 0,182 00 00 0,9120 00 0,092 105 częstn 0,7478 0,1819 0,077 00 0,011 0,87182 0,0920 0,048 24 częstn 0,7919 0,174 0,041 00 00 0,9043 0,084 0,021 81 częstn 0,7359 0,1915 0,076 00 0,011 0,86139 0,1016 0,047
1 Porażenie lub niedowład znacznego stopnia, śpiączka, poniżej 55 punktów75 w skali Orgogozo.
2 Niedowład średnio lub słabo wyrażony, bez zaburzeń świadomości, powyżej 55 punktów w skali Orgogozo.
* Nie uwzględniono genotypu ε2ε2 ponieważ nie obserwowano takiego genotypu w żadnej grupie.
Tab. III. Dystrybucja częstości genotypów i alleli polimorfizmu insercyjno/delecyjnego genu ACE wśród badanych grup. Distribution of genotypes and alleles frequencies of insertion/deletion polymorphism in ACE gene among
study groups
GRUPA n GENOTYPY ALLELE
II ID DD I D Pacjenci (1) ♀ ♂ 17 częstośćn 0,478 0,417 0,122 0,6823 0,3211 9 częstośćn 0,565 0,333 0,111 0,7213 0,285 8 częstośćn 0,383 0,504 0,121 0,6310 0,376 (1a) w stanie ciężkim1 9 n częstość 5 0,56 4 0,44 0 0 14 0,78 4 0,22 (1b) w stanie dość dobrym2 6 n częstość 1 0,17 3 0,50 2 0,33 5 0,42 7 0,58
Rodzice pacjentów (2) Gr. kontrolna (3) ♀ ♂ (3a) do 20 lat ♀ ♂ (3b) 21-40 lat ♀ ♂ 33 częstośćn 0,4214 0,4615 0,124 0,6543 0,3523 168 częstośćn 0,2644 0,5288 0,2236 0,52176 0,48160 59 częstośćn 0,1911 0,5432 0,2716 0,4654 0,5464 109 częstośćn 0,3033 0,5256 0,1820 0,56122 0,4496 53 częstośćn 0,2312 0,5429 0,2312 0,5053 0,5053 33 częstośćn 0,124 0,5518 0,3311 0,3926 0,6140 20 częstośćn 0,408 0,5511 0,051 0,6827 0,3213 115 częstośćn 0,2832 0,5159 0,2124 0,54123 0,46107 26 częstośćn 0,277 0,5414 0,195 0,5428 0,4624 89 częstośćn 0,2825 0,5145 0,2119 0,5395 0,4783
1 Porażenie lub niedowład znacznego stopnia, śpiączka, poniżej 55 punktów w skali Orgogozo.
2 Niedowład średnio lub słabo wyrażony, bez zaburzeń świadomości, powyżej 55 punktów w skali Orgogozo.
Tab. IV. Porównanie częstości allelu ε4 i nosicieli allelu ε4 genu APOE oraz częstości allelu I genu ACE między pacjentami a grupą kontrolną z uwzględnieniem płci oraz między pacjentami w stanie ciężkim a pacjentami w
stanie dość dobrym za pomocą testu χ2 i testu dokładnego Fishera. Comparison of ε4 allele and ε4 allele
carri-ers of APOE gene and allele I of ACE gene between patients and control group considering gender and between
patients in serious state and patients in rather good state using χ2 test and Fisher’s exact test
POLIMORFIZM EPSILON GENU APOE
test ALLEL ε4 nosiciele allelu ε4 (ε3ε4 + ε4ε4)
Pacjenci po udarze (1) n = 17 / zdrowe dzieci (3a) n = 32 χ2 (p) Fisher jednostronny Fisher dwustronny OR (95% CI) 7,91 (p = 0,005)* p = 0,01* p = 0,01* 6,26 (1,35–32,71) 3,26 (p = 0,07) p = 0,08 p = 0,11 Pacjenci po udarze (1) n = 17 / cała grupa kontrolna (3) n = 137 χ2 (p) Fisher jednostronny Fisher dwustronny OR (95% CI) 7,65 (p = 0,01)* p = 0,01* p = 0,01* 3,36 (1,24–8,92) 1,82 (p = 0,18) p = 0,15 p = 0,18 ♂ po udarze (1) n = 8 / ♂ zdrowe dzieci (3a) n = 11 χ2 (p) Fisher jednostronny Fisher dwustronny 9,80 (p = 0,002)* p = 0,003* p = 0,003* 6,97 (p = 0,01)* p = 0,02* p = 0,02*
badanych grupach, z wyjątkiem chorych, były zgodne z równowagą Hardy-Weinberga. Istotne statystycznie różnice w częstościach alleli i genotypów między ba-danymi grupami przedstawiono w tabeli IV.
Porównanie grupy chorych dzieci (1) z grupą zdro-wych osób do 20 roku życia (3a) wykazało istotne staty-stycznie różnice w częstościach allelu ε4 (0,23 vs 0,05, p = 0,01). Nieco mniejsze różnice, ale również istotne, stwierdzono porównując chorych z całą grupą kontrolną (0,23 vs 0,08, p = 0,01). Częstość nosicieli allelu ε4 (ge-notypy ε3ε4, ε4ε4) była również wyższa wśród chorych (0,29) zarówno w porównaniu z młodymi, zdrowymi osobami (0,09), jak i z całą grupą kontrolną (0,16), róż-nice te jednak nie były istotne statystycznie.
Szczególnie duże różnice w częstościach allelu ε4 oraz nosicieli tego allelu stwierdzono między pod-grupami płci męskiej. Częstość allelu ε4 u chorych chłopców wynosiła 0,37, a częstość nosicieli tego al-lelu – 0,50, podczas gdy wśród zdrowych chłopców nie stwierdzono nosicieli allelu ε4 (p = 0,003 oraz p = 0,02 odpowiednio). Różnice w rozkładzie częstości genotypów i alleli pomiędzy grupą rodziców a grupą kontrolną nie były istotne statystycznie.
Znaczące różnice stwierdzono natomiast pomiędzy podgrupami chorych wyodrębnionymi na podstawie ciężkości stanu pacjenta w okresie ostrym, od początku wystąpienia objawów klinicznych oraz dalszego prze-biegu choroby i widocznych następstw odległych. W podgrupie w stanie dość dobrym częstość allelu ε4 była znacznie wyższa w porównaniu z podgrupą w stanie ciężkim (0,50 vs 0,10, p = 0,03). Podobne różnice doty-czyły częstości nosicieli allelu ε4 (0,66 vs 0,11).
Polimorfizm ACE. Dystrybucję wariantów
polimor-fizmu insercyjno/delecyjnego genu ACE w badanych
grupach przedstawia tabela III. Istotne statystycznie różnice w częstościach alleli i genotypów między ba-danymi grupami przedstawiono w tabeli IV.
W grupie pacjentów stwierdzono wyższą częstość allelu insercyjnego oraz nosicieli tego allelu niż w gru-pie kontrolnej. Analiza podgrup pacjentów w zależno-ści od stanu wykazała, że homozygotyczny genotyp II występuje znacznie częściej u pacjentów w stanie cięż-kim (0,56) w porównaniu do grupy pacjentów w stanie dość dobrym (0,17). W podgrupie pacjentów w stanie ciężkim nie stwierdzono występowania genotypu DD. W podgrupach kontrolnych (3a i 3b) częstość genoty-pu II jest na porównywalnym poziomie (odpowiednio 0,23 i 0,28) i w porównaniu do grupy rodziców jest prawie 2-krotnie niższa (0,42). Wykazane różnice nie są znamienne statystycznie.
Podobne tendencje zaobserwowano w dystrybucji alleli analizowanego polimorfizmu genu ACE. Czę-stość allelu I jest wyższa w grupie pacjentów (0,68) niż w grupie kontrolnej (0,52). Częstość allelu I w podgru-pie pacjentów w stanie ciężkim jest prawie dwukrot-nie wyższa w porównaniu do pacjentów w stadwukrot-nie dość dobrym (0,78 vs 0,42). Nie stwierdzono znamiennych różnic w częstościach allelu I między rodzicami cho-rych dzieci (0,65) a podgrupą dobrowolnych dawców krwi (0,54).
Cała grupa pacjentów (n = 17) charakteryzuje się najniższą częstością występowania heterozygot ID. Częstości heterozygot ID w podgrupie pacjentów w stanie dość dobrym (0,50) są nieznacznie wyższe w porównaniu z podgrupą pacjentów w stanie ciężkim (0,44). U rodziców pacjentów i w grupie kontrolnej wartości te są na porównywalnym poziomie (0,46 vs 0,52).
Pacjenci w stanie ciężkim (1a) n = 9 / Pacjenci w stanie dość dobrym (1b) n = 6 χ2 (p) Fisher jednostronny Fisher dwustronny OR (95% CI) 5,57 (p = 0,02)* p = 0,03* p = 0,03* 0,13 (0,01–1,02) 5,0 (p = 0,03)* p = 0,05 p = 0,09 0,06 (0,0–1,34) POLIMORFIZM INSERCYJNO/DELECYJNY GENU ACE
test ALLEL I
♂ po udarze (1) n = 9 / ♂ zdrowe (3a) n = 33 χ2 (p)
OR (95% CI)
6,13 (p = 0,01)* 4,00 (1,14–14,77)
Pacjenci w stanie ciężkim (1a) n = 9 / Pacjenci w stanie dość dobrym (1b) n = 6 χ2 (p) Fisher jednostronny Fisher dwustronny OR (95% CI) 4,04 (p = 0,04)* p = 0,05 p = 0,06 4,90 (0,78–34,28)
Liczba nosicieli allelu I (osoby z genotypami II + ID) w grupie pacjentów jest taka sama jak w grupie rodziców (0,88 vs 0,88). Najwyższą częstość występo-wania nosicieli allelu I zaobserwowano w podgrupie pacjentów w stanie ciężkim (1,00), najniższą charak-teryzuje się podgrupa pacjentów w stanie dość dobrym (0,67). Różnica ta nie jest istotna statystycznie. Pomię-dzy pozostałymi badanymi grupami nie stwierdzono znamiennych różnic w występowaniu nosicieli poli-morficznego wariantu I polimorfizmu insercyjno/dele-cyjnego genu ACE.
Po zróżnicowaniu badanych grup pod względem płci wykazano, że najwyższą częstością występowania allelu I charakteryzuje się podgrupa dziewcząt po uda-rze i jest to wartość prawie dwukrotnie wyższa w po-równaniu do częstości allelu I w grupie dziewcząt zdro-wych (0,72 vs 0,39, p = 0,01). Liczba nosicieli allelu I jest nieznacznie wyższa u pacjentek po udarze (0.89) w porównaniu do dziewcząt zdrowych (0,77). Nie stwier-dzono istotnych różnic w częstości występowania alle-lu I i nosicieli allealle-lu I między chorymi dziewczętami a dobrowolnymi dawcami krwi płci żeńskiej, jak również pomiędzy chłopcami po udarze a chłopcami zdrowymi. W podgrupach płci męskiej częstości występowania al-lelu I i nosicieli alal-lelu I są na podobnym poziomie.
Otrzymane wyniki sugerują związek pomiędzy no-sicielstwem allelu ε4 a udarem niedokrwiennym mó-zgu, szczególnie u dzieci płci męskiej. Związek taki stwierdzono w niektórych pracach u ludzi dorosłych [19]. W populacjach chorych dzieci nie badano do tej pory wpływu polimorfizmu genu APOE na ryzyko
wystąpienia udaru. Nasze wstępne badania wykazują, że genotyp APOE ma także wpływ na ciężkość stanu pacjenta. Nieco zaskakujący może być fakt, że osoby w stanie dobrym charakteryzują się znacznie wyższą częstością nosicieli allelu ε4 niż pacjenci w stanie cięż-kim. Być może wskazówką do wyjaśnienia tego faktu są wyniki badań osób dorosłych po przebytym udarze niedokrwiennym mózgu, które dowodzą, że z allelem ε4 związane jest zwiększone przeżycie [20]. Jeśli po-dobny związek istniałby wśród chorych dzieci, możli-we byłoby, że wśród badanych przez nas osób zwięk-szona częstość allelu ε4 jest wynikiem zwiększonego przeżycia pacjentów będących nosicielami ε4. Mogło-by to również wyjaśniać niską częstość tego allelu w podgrupie w stanie ciężkim. Dodatkowo niezgodność rozkładu genotypów i alleli z równowagą Hardy-Wein-berga może wskazywać, że pewne genotypy mogą być eliminowane z populacji chorych dzieci w związku ze śmiertelnością.
Obiecujące wyniki badań pilotowych, przedsta-wione w niniejszej pracy, wymagają potwierdzenia na znacznie liczniejszej populacji pacjentów. Analiza większej liczby chorych dzieci wraz z rodzicami po-zwoliłaby dodatkowo na potwierdzenie ewentualnego związku danego polimorfizmu z chorobą przy uży-ciu wewnątrzrodzinnego testu powiązań – TDT (ang.
transmission/disequilibrium test). Ponieważ w
popula-cji wieku rozwojowego schorzenia naczyniowe mózgu występują rzadziej niż u ludzi dorosłych, zamierzamy objąć badaniami genetycznymi przypadki udaru niedo-krwiennego mózgu u dzieci z innych regionów Polski.
Piśmiennictwo
[1] Brass L.M., Isaacsohn J.L., Merikangas K.R. et al.: A study of twins and stroke. Stroke, 1992:23, 221. [2] Kaste M., Koivisto P.: Risk of brain infarction in familial hypercholesterolemia. Stroke, 1988:19, 1097.
[3] Hoppe C., Klitz W., Cheng S. et al.: Gene interactions and stroke risk in children with sickle cell anemia. Blood, 2004:103, 2391.
[4] Liu Y., Pan J., Wang S. et al.: Beta-fibrinogen gene -455A/G polymorphism and plasma fibrinogen level in Chinese stroke patients. Chin. Med. J. (Engl.), 2002:115, 214.
[5] Nowak-Gottl U., Strater R., Heinecke A. et al.: Lipoprotein (a) and genetic polymorphisms of clotting factor V, proth-rombin, and methylenetetrahydrofolate reductase are risk factors of spontaneous ischemic stroke in childhood. Blood, 1999:94, 3678.
[6] Sharma P.: Meta-analysis of the ACE gene in ischaemic stroke. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry., 1998:64, 227. [7] Bednarska-Makaruk M., Wehr H.: Genetyka udarów. Czyn. Ryzyka., 2002:35, 29.
[8] Członkowska A., Sarzyńska-Długosz I.: Genetyczne podłoże udaru mózgu. [w:] Genetyka chorób układu krążenia. Red. Ciechanowicz A., Medycyna Praktyczna, Kraków 2002, 95.
[9] Balcerzyk A., Żak I.: Apolipoproteina E – rola polimorfizmu w patogenezie licznych chorób. Postępy Biochemii, 2004:4, 344.
[10] Ruiz-Ortega M., Lorenzo O., Ruperez M. et al.: Role of renin-angiotensin system in vascular diseases. Hypertension, 2001:38, 1382.
[11] Rigat B., Hubert C., Alhenc-Gelas F. et al.: An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin I-converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels. J. Clin. Invest., 1990:86, 1343.
[12] Cambien F., Poirier O., Lecerf L. et al.: Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction. Nature, 1992:359, 641.
[13] Arbustini E., Grasso M., Fasani R. et al.: Angiotensin converting enzyme gene deletion allele is independently and strongly associated with coronary atherosclerosis and myocardial infarction. Br. Heart J., 1995:74, 584.
[14] Żak I., Niemiec P., Sarecka B. et al.: Carrier-state of D allele in ACE gene insertion/deletion polymorphism is associ-ated with coronary artery disease, in contrast to the C677→T transition in the MTHFR gene. Acta Biochimica Polonica, 2003:50, 527.
[15] Friedewald W.T., Levy R.I., Fredrickson D.S.: Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma without the use of preparative centrifuge. Clin. Chem., 1972:18, 499.
[16] Hixson J.E., Vernier D.T.: Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with
HhaI. J. Lipid. Res., 1990:31, 545.
[17] Żak I., Sarecka B., Balcerzyk A. et al.: Polimorfizm PstI 561A→C genu selektyny-E i udar niedokrwienny mózgu u dzieci: pilotowe badania związków, część I. Neurol. Dziec., 2004:26, 23.
[18] Kopyta I., Emich-Widera E., Marszał E.: Udar niedokrwienny mózgu u dzieci – analiza przypadków ze szczególnym uwzględnieniem czynników ryzyka. Neurol. Dziec., 2002:11, 21.
[19] McCarron M.O., Delong D., Alberts M.J.: APOE genotype as a risk factor for ischemic cerebrovascular disease: a meta-analysis. Neurology, 1999:53, 1308.
[20] McCarron M.O., Muir K.W., Weir C.J. et al.: The apolipoprotein E epsilon4 allele and outcome in cerebrovascular dis-ease. Stroke, 1998:29, 1882.
Adres autora:
Katedra i Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej 40-752 Katowice, ul. Medyków 18
