Medycyna Wet. 2007, 63 (11) Suplement 1482
Praca oryginalna Original paper
Obecnie przy oficjalnym, rutynowym badaniu mikro-biologicznym ¿ywnoci najczêciej wykorzystuje siê kla-syczne metody hodowlane, które s¹ kosztowne, a tak¿e pracoch³onne i czasoch³onne. Opracowanie i zastosowa-nie w praktyce ³añcuchowej reakcji polimerazy (PCR) umo¿liwi³o wykorzystanie do identyfikacji drobnoustro-jów sond genetycznych (7), co spowodowa³o prze³om w diagnostyce mikrobiologicznej. Obecnie dostêpnych jest na rynku wiele testów do wykrywania Salmonella, opar-tych na PCR. W badaniach wykorzystuje siê dostêpne komercyjnie lub opracowane indywidualnie do celów dowiadczalnych protoko³y izolacji bakteryjnego DNA. Ró¿nice w wiêkszoci przypadków dotycz¹ zastosowa-nych starterów i ich specyficznoci oraz odczynników optymalizuj¹cych przebieg reakcji. Jedn¹ z najwiêkszych zalet PCR jest mo¿liwoæ uzyskania wyniku ju¿ po ok. 4-8 godzinach. Podstawow¹ wad¹ tej metody, z punktu widzenia higieny ¿ywnoci, jest fakt, ¿e DNA wykryte w próbce produktu spo¿ywczego mo¿e pochodziæ zarów-no z ¿ywych, jak i martwych pa³eczek Salmonella. Kolej-n¹ wad¹ testów opartych na PCR jest stosunkowo ma³a iloæ materia³u pobierana do oznaczeñ. Trudnoci te
pró-buje siê przezwyciê¿yæ poprzez po³¹czenie wstêpnej in-kubacji próbek ¿ywnoci w p³ynnym pod³o¿u z technik¹ PCR.
Celem badañ by³o okrelenie i porównanie czêstotli-woci wykrywania pa³eczek Salmonella przy wykorzys-taniu metody hodowlanej i PCR w:
a) surowym miêsie drobiu, sztucznie zanieczyszczonym tymi drobnoustrojami,
b) miêsie drobiu poddanym obróbce termicznej o ró¿-nej intensywnoci (pasteryzacji, gotowaniu i sterylizacji).
Materia³ i metody
Do badañ u¿yto szczepu Salmonella enterica subspecies enterica serotyp Enteritidis szczep nr 271/97 z kolekcji Pra-cowni Pa³eczek Jelitowych Zak³adu Bakteriologii PZH w War-szawie.
Miêso drobiowe, pochodz¹ce z miêni piersiowych kurcz¹t, rozdrabniano za pomoc¹ maszynki do mielenia miêsa z u¿y-ciem siatki o rednicy oczek 4 mm, a nastêpnie dzielono na próbki po 25 g ka¿da, które umieszczano w sterylnych toreb-kach z polietylenu. Nastêpnie próbki ska¿ano 24-godzinn¹ ho-dowl¹ bulionow¹ pa³eczek Salmonella, d¹¿¹c do uzyskania
ino-Ocena efektywnoci tradycyjnych i molekularnych
metod wykrywania pa³eczek Salmonella
w surowym i ogrzewanym miêsie drobiu
MAREK NOWICKI, JACEK SZCZAWIÑSKI
Katedra Higieny ¯ywnoci i Ochrony Zdrowia Publicznego Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Nowoursynowska 159, 02-776 Warszawa
Nowicki M., Szczawiñski J.
Evaluation of the efficacy of traditional and molecular methods for Salmonella detection
in raw and heated poultry meat
Summary
Samples of poultry meat were artificially contaminated with Salmonella and subjected to heat treatment: pasteurization, cooking and sterilization. Subsequently both raw and heated samples were tested for the presence of Salmonella with the standard culture method, according to EN-ISO 6579:2002, and with direct application of PCR as well as PCR with preenrichment incubation. The presence of Salmonella was detected in all samples of raw meat by the use of the culture method and PCR with the preenrichment incubation. Salmonellae were not found in the portion of samples containing a low number of bacteria when direct PCR method was applied. Salmonellae were not detected by the standard culture method and PCR with preenrichment incubation in all heated samples. When direct PCR method was used, the presence of Salmonella was found in all samples subjected to pasteurization, cooking and sterilization at 121°C for 15 and 30 minutes. However, DNA of Salmonella was not detected in the portion of the samples heated at 121°C for 45 minutes and in all samples heated at 130°C for 45 minutes, which was probably caused by thermal degradation of DNA to such an extent that its detection by PCR was impossible. One of the most important advantages of PCR is the short time of Salmonella detection. The most important disadvantage, besides difficulties in differentiating between live and dead bacteria, seems to be the relatively high cost of tests.
Medycyna Wet. 2007, 63 (11) Suplement 1483
culum 3,5 × 10, 3,5 × 102 oraz 3,5 × 103 komórek bakteryjnych w 1 próbce. Torebki zamykano pró¿niowo (Vacuum Ver-packungs Maschinen 1000), a nastêpnie poddawano obróbce termicznej pasteryzacji, gotowaniu i sterylizacji.
Pasteryzacjê przeprowadzono w ultratermostacie z ci¹g³ym przep³ywem wody destylowanej i regulacj¹ temperatury z do-k³adnoci¹ ± 0,5°C. Próbki ogrzewano w temperaturze 72°C w ci¹gu 10 minut. Wartoæ pasteryzacyjna procesu termiczne-go wynosi³a 11,70. Okrelano j¹ za pomoc¹ urz¹dzenia Pasteu-rization Value Meter APEK AL154PM01/93 W.1.
Gotowanie przeprowadzono w urz¹dzeniu opisanym powy-¿ej, stosuj¹c 3 warianty ogrzewania o nastêpuj¹cych paramet-rach: 100°C/10 minut, 100°C/15 minut oraz 100°C/20 minut. Sterylizacjê przeprowadzono w autoklawach cinieniowych, stosuj¹c 4 nastêpuj¹ce kombinacje czasu i temperatury: 121°C/ 15 minut, 121°C/30 minut, 121°C/45 minut, 130°C/30 minut. Badanie metod¹ hodowlan¹ przeprowadzano zgodnie z nor-m¹ EN-ISO 6579: 2002 (2). Po przednamna¿aniu w niese-lektywnej po¿ywce p³ynnej materia³ przenoszono do namna-¿aj¹cej po¿ywki selektywnej RVS, któr¹ inkubowano w tem-peraturze 41,5°C przez 24 godziny. Z otrzymanej hodowli wy-konywano przesiewy na selektywn¹ po¿ywkê sta³¹ agar z ksyloz¹ i lizyn¹ (XLD), któr¹ inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 godziny.
Metodê PCR stosowano w dwojaki sposób: bezporednio, tj. bez przednamna¿ania drobnoustrojów zawartych w bada-nym materiale i po ich przednamna¿aniu w zbuforowanej wo-dzie peptonowej.
Izolacjê genomowego DNA przeprowadzono przy u¿yciu zestawu Genomic DNA Prep Plus (A&A Biotechnology). Do reakcji PCR zosta³y u¿yte komercyjne zestawy firmy DNA--Gdañsk II s.c. Zestaw diagnostyczny PCR Salmonella.
Amplifikacja prowadzona by³a przy u¿yciu termocyklera Mastercykler personal firmy Eppendorf. Dla ka¿dej serii ba-dañ wykonano kontrolê pozytywn¹, przygotowan¹ z materia³u dostarczonego wraz z zestawem oraz kontrolê negatywn¹. Jako kontroli negatywnej u¿yto roztworu TE. Rozdzia³ produktów reakcji PCR zosta³ wykonany metod¹ elektroforezy w 2% ¿elu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny przy napiêciu 10 V/cm ¿elu. Elektroforezê przeprowadzono przy u¿yciu zestawu Wide Mini-Sub cell GT firmy Bio-Rad. Jako ród³o napiêcia wykorzystano zasilacz Power Pac 200 firmy Bio-Rad. Na ¿el agarozowy nanoszono próbki przygotowane przez zmie-szanie 3 µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR bada-nej próbki. Marker wielkoci fragmentów DNA przygotowy-wano przez zmieszanie 2 µl barwnika i 5 µl markera DNA M100-500. Produkty reakcji PCR by³y uwidaczniane przez wzbudzenie fluorescencji przy u¿yciu transiluminatora UV. Za wynik pozytywny testu uznawano obecnoæ w ¿elu produktu reakcji PCR o wielkoci 429 par zasad. Archiwizacja wyni-ków prowadzona by³a przy pomocy cyfrowego aparatu foto-graficznego Minolta Dimage Z1.
Przy okrelaniu obecnoci pa³eczek Salmonella w miêsie drobiowym metod¹ PCR po etapie przednamna¿ania próbki o masie 25 g dodawano do 225 ml zbuforowanej wody pepto-nowej, któr¹ inkubowano w temperaturze 37°C w ci¹gu 18 go-dzin. Nastepnie pobierano 1 ml hodowli, któr¹ odwirowywa-no. Osad zawieszano w 100 µl roztworu TE, do którego do-dawano 200 µl roztworu LT i 20 µl roztworu proteinazy K. Uzyskan¹ mieszaninê inkubowano w 37°C przez 30 minut. Dalej postêpowano zgodnie z podanym wczeniej opisem me-tody PCR bez przednamna¿ania.
Wyniki i omówienie
Na podstawie wyników dotycz¹cych surowego miêsa drobiu (tab. 1) mo¿na stwierdziæ, ¿e metod¹ hodowlan¹
oraz metod¹ PCR z przednamna¿aniem wykryto salmo-nelle we wszystkich celowo zanieczyszczanych próbkach niezale¿nie od poziomu inokulum. Znacznie gorsze wy-niki uzyskano przy metodzie PCR stosowanej bezpored-nio. W przypadku tej metody wystêpuje wyrany zwi¹-zek pomiêdzy liczb¹ komórek salmonelli wprowadzonych do próbek i liczb¹ wyników pozytywnych. Im ni¿szy by³ poziom inokulum, tym wiêksza liczba próbek, w których nie stwierdzono salmonelli. Przyczyn¹ tego faktu wydaje siê ma³a masa materia³u pobieranego do oznaczeñ meto-d¹ PCR. Przy pobieraniu z próbki zanieczyszczonego miêsa 20-miligramowej nawa¿ki mo¿e siê zdarzyæ, ¿e przy niewielkiej liczbie pa³eczek Salmonella ich obecnoæ pozostanie nie wykryta. Dopiero przy najwy¿szym po-ziomie inokulum (3,5 × 103 na 25 g) we wszystkich
prób-kach stwierdzono obecnoæ salmonelli (tab. 1).
Wysok¹ zgodnoæ metody hodowlanej z metod¹ PCR po³¹czon¹ z przednamna¿aniem (76%) obserwowa³ rów-nie¿ Feder i wsp. (5) podczas badañ terenowych w kie-runku obecnoci pa³eczek Salmonella w kale wiñ. Zda-niem niektórych autorów (1, 9, 11), po³¹czenie metody PCR i przednamna¿ania daje nawet lepsze rezultaty ni¿ metoda hodowlana. Czu³oæ metody zale¿y równie¿ od wizualizacji produktów amplifikacji. Stosuj¹c elektro-forezê agarozow¹ upraszcza siê procedurê, jednak, jak podaj¹ niektórzy autorzy, mo¿na zwiêkszyæ jej czu³oæ przez zastosowanie PCR-OLA procedury ³¹czenia oli-gonukleotydów i uwidocznienia produktów w immuno-enzymatycznej reakcji ELISA (11). Specyficznoæ i czu-³oæ metody PCR z przednamna¿aniem w badaniach miêdzylaboratoryjnych okrelono na 97,5% i zapropono-wano j¹ jako standard miêdzynarodowy (6).
Na podstawie wyników dotycz¹cych ogrzewanego miê-sa drobiu (tab. 2) mo¿na stwierdziæ, ¿e we wszystkich próbkach poddanych obróbce termicznej nie stwierdzo-no obecstwierdzo-noci salmonelli zarówstwierdzo-no metod¹ hodowlan¹, jak i metod¹ PCR po³¹czon¹ z przednamna¿aniem. Stosuj¹c bezporedni¹ metodê PCR uzyskano wyniki pozytywne we wszystkich próbkach poddanych pasteryzacji, goto-waniu oraz sterylizacji w temp. 121°C przez 15 i 30 mi-nut. W próbkach sterylizowanych w temp. 121°C przez 45 minut pojawi³y siê wyniki ujemne przy niskim pozio-mie inokulum, natomiast przy ogrzewaniu w temp. 130°C przez 30 minut wszystkie wyniki by³y ujemne (tab. 2), co by³o zapewne spowodowane termiczn¹ degradacj¹ DNA.
Tab. 1. Wp³yw inokulum i metody oznaczania na wyniki ba-dania surowego miêsa drobiu w kierunku obecnoci pa³eczek Salmonella m u l u k o n I k e z c e ³ a p a b z c il a ll e n o m l a S a s ê i m g 5 2 w h c y n a d a b k e b ó r p a b z c il / h c y n w y t y z o p k e b ó r p a b z c i L k e z c e ³ a p i c o n c e b o a i n a z c a n z o a d o t e M Salmonella a d o t e m a n a l w o d o h O S I-N E g u ³ d e w 2 0 0 2 : 9 7 5 6 a d o t e m R C P a i n d e r o p z e b a d o t e m R C P -d e z r p z m e i n a ¿ a n m a n ) a l o rt n o k ( 0 0/9 0/9 0/9 5 , 3 × 01 2 9/9 3/9 9/9 5 , 3 × 01 2 9/9 8/9 9/9 5 , 3 × 01 3 9/9 9/9 9/9
Medycyna Wet. 2007, 63 (11) Suplement 1484
Uzyskane wyniki wykazuj¹, ¿e wszystkie rodzaje sto-sowanej obróbki termicznej doprowadza³y do pe³nej inaktywacji salmonelli oraz ¿e pozytywne wyniki uzys-kane metod¹ bezporedni¹ PCR odnosz¹ siê do DNA po-chodz¹cego z martwych komórek bakteryjnych, które nie stanowi¹ ju¿ zagro¿enia dla zdrowia konsumentów. Po-dobne prawid³owoci obserwowali inni autorzy (4).
Nale¿y podkreliæ, ¿e zastosowanie w praktyce rów-noleg³ego badania próbek ¿ywnoci tradycyjn¹ metod¹ hodowlan¹ oraz metod¹ PCR umo¿liwi³oby nie tylko uzys-kanie informacji, czy pa³eczki Salmonella prze¿y³y ob-róbkê termiczn¹, ale te¿ czy by³y one obecne w surow-cach i pó³produktach przed ogrzewaniem. Wyniki przed-stawione w tab. 2 wskazuj¹, ¿e uzyskanie takiej informa-cji by³oby mo¿liwe w przypadku próbek poddanych pas-teryzacji, gotowaniu i sterylizacji w temperaturze 121°C w ci¹gu 15 i 30 minut. Bardziej intensywna obróbka ter-miczna mo¿e doprowadzaæ do uszkodzenia DNA salmo-nelli w stopniu uniemo¿liwiaj¹cym jego wykrycie meto-d¹ PCR.
Interesuj¹cy wydaje siê fakt, ¿e stosuj¹c metodê trady-cyjn¹ oraz metodê PCR z przednamna¿aniem stwierdzo-no pe³n¹ zgodstwierdzo-noæ uzyskanych wyników, tj. obecstwierdzo-noæ salmonelli jedynie w próbkach kontrolnych i ich brak we wszystkich próbkach ogrzewanych. Wydaje siê to wiad-czyæ o tym, ¿e podczas procesu przednamna¿ania docho-dzi do takiej dezintegracji DNA inaktywowanych
salmo-nelli, ¿e nie mo¿na go wykryæ metod¹ PCR. W przeciwnym wypadku powinny wyst¹piæ wyniki pozytywne i niezgodnoæ z wynika-mi uzyskanywynika-mi metod¹ hodowlan¹. Zdaniem niektórych autorów, przy stosowaniu przed-namna¿ania i PCR mo¿e mieæ miejsce poja-wianie siê wyników fa³szywie pozytywnych (3, 10). Wydaje siê, ¿e do wyjanienia tego zjawiska potrzebne s¹ dalsze badania.
Obserwowane ostatnio postêpy w norma-lizacji metod wykrywania patogenów w ¿yw-noci opartych na PCR (np. ISO 20837:2006, ISO 20838:2006) i dynamiczny rozwój prac badawczych w tej dziedzinie z pewnoci¹ do-prowadz¹ do masowego stosowania metod molekularnych w rutynowej kontroli ¿yw-noci i pasz. Jedn¹ z najwa¿niejszych zalet tych metod jest krótki czas wykonywania oznaczeñ, a najistotniejszym ograniczeniem, oprócz trudnoci ze zró¿nicowaniem ¿ywych i martwych bakterii, wydaj¹ siê obecnie sto-sukowo wysokie koszty. Wed³ug w³asnych wyliczeñ, oznaczenie obecnoci pa³eczek Salmonella w 25 próbkach miêsa metod¹ ho-dowlan¹ wymaga 74 h, metod¹ PCR 9 h, a metod¹ PCR po³¹czon¹ z przednamna¿a-niem 27 h. Koszt jednego oznaczenia z wy-korzystaniem metody PCR jest od 4,8 (me-toda bezporednia) do 4,9 (PCR z przednam-na¿aniem) raza wy¿szy od kosztów oznacze-nia wykonanego tradycyjn¹ metod¹ hodow-lan¹ (8).
Pimiennictwo
1.Aabo S., Andersen J. K., Olsen J. E.: Research note: detection of Salmonella in minced meat by the polymerase chain reaction method. Lett. appl. Microbiol. 1995, 2, 180-182.
2.Anon.: Polska Norma PN-EN ISO 6579:2002: Mikrobiologia ¿ywnoci i pasz, Horyzontalna metoda wykrywania Salmonella spp. (ISO 6579:2002). Polski Ko-mitet Normalizacyjny, Warszawa 2002.
3.Czajkowska D., Sikorska I., Witkowska-Gwiazdowska A.: Problemy w wykrywa-niu bakterii Salmonella w ¿ywnoci. Przem. Spo¿. 2002, 56, 2-6.
4.D¹browski W., Grochulska I., Mêdrala D., Czeszejko K.: The Effect of Food--Processing Conditions on Detection of The iap Gene of Listeria Monocytogenes Performed Using Polymerase Chain Reaction Technique (PCR), Elect. J. Pol. Agr. Univ., Fd Sci. Technol. 2002, 5, issue 2.
5.Feder I., Nietfeld I., Jerome C., Galland J., Yeary T., Sargeant J. M., Oberst R., Tamplin M. L., Luchansky J. B.: Comparison of cultivation and pcr-hybridization for detection of Salmonella in porcine fecal and water samples. J. Clin. Microbiol. 2001, 39, 2477-2484.
6.Malorny B., Hoorfar J., Hugas M., Heuvelink A., Fach P., Ellerbroek L., Bun-ge C., Dorn C., Helmuth R.: Interlaboratory diagnostic accuracy of a Salmonella specific PCR-based method. Int. J. Fd Microbiol. 2003, 89, 241-249.
7.Mullis K. B., Faloona F.: Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase--catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987, 155, 335-350.
8.Nowicki M.: Ocena efektywnoci tradycyjnych i molekularnych metod wykrywa-nia pa³eczek Salmonella w ¿ywnoci pochodzewykrywa-nia zwierzêcego. Praca dokt. Wydz. Medycyny Weterynaryjnej, SGGW, Warszawa 2005.
9.Piknova L., Stefanovicova A., Drahovska H., Sasik M., Kuchta L.: Detection of Salmonella in food, equivalent to ISO 6579, by a three-days polymerase chain reaction based method. Fd Control 2002, 13, 191-194.
10.Rys P. N., Persing D. H.: Preventing False Positives: Quantitive Evaluation of Three Protocols for Inactivation of Polymerase Chain Reaction Amplification Products. J. Clin. Microbiol. 1993, 31, 2356-2360.
11.Stone G. G., Oberst R. D., Hays M. P., Mcvey S., Galland J. C., Curtiss R., Kelly S. M., Chengappa M. M.: Detection of Salmonella Typhimurium from Rectal Swabs of Experimentally Infected Beagles by Short Cultivation and PCR--Hybridization. J. Clin. Microbiol. 1995, 33, 1292-1295.
Adres autora: dr Marek Nowicki, ul. Nowoursynowska 159, 02-776 Warszawa; e-mail: marek_nowicki@sggw.pl
b ó s o p S a i n a w e z r g o m u l u k o n I k e z c e ³ a p a b z c il a ll e n o m l a S a s ê i m g 5 2 w h c y n a d a b k e b ó r p a b z c il / h c y n w y t y z o p k e b ó r p a b z c i L k e z c e ³ a p i c o n c e b o a i n a z c a n z o a d o t e M Salmonella a d o t e m a n a l w o d o h O S I-N E g u ³ d e w 2 0 0 2 : 9 7 5 6 a d o t e m R C P a i n d e r o p z e b a d o t e m R C P -d e z r p z m e i n a ¿ a n m a n a l o rt n o K ) a i n a w e z r g o z e b ( 5 , 3 × 01 2 3/3 3/3 3/3 5 , 3 × 01 3 3/3 3/3 3/3 a j c a z y r e t s a P 2 7 ( °C/10min.PV ) 0 7 , 1 1 5 , 3 × 01 2 0/3 3/3 0/3 5 , 3 × 01 3 0/3 3/3 0/3 1 e i n a w o t o G 0 0 1 ( °C/10min). 5 , 3 × 01 2 0/3 3/3 0/3 5 , 3 × 01 3 0/3 3/3 0/3 2 e i n a w o t o G 0 0 1 ( °C/15min). 5 , 3 × 01 2 0/3 3/3 0/3 5 , 3 × 01 3 0/3 3/3 0/3 3 e i n a w o t o G 0 0 1 ( °C/20min). 5 , 3 × 01 2 0/3 3/3 0/3 5 , 3 × 01 3 0/3 3/3 0/3 1 a j c a zi l y r e t S 1 2 1 ( °C/15min). 5 , 3 × 01 2 0/3 3/3 0/3 5 , 3 × 01 3 0/3 3/3 0/3 2 a j c a zi l y r e t S 1 2 1 ( °C/30min). 5 , 3 × 01 2 0/3 3/3 0/3 5 , 3 × 01 3 0/3 3/3 0/3 3 a j c a zi l y r e t S 1 2 1 ( °C/45min). 5 , 3 × 01 2 0/3 1/3 0/3 5 , 3 × 01 3 0/3 3/3 0/3 4 a j c a zi l y r e t S 0 3 1 ( °C/30min). 5 , 3 × 01 2 0/3 0/3 0/3 5 , 3 × 01 3 0/3 0/3 0/3 Tab. 2. Wp³yw rodzaju obróbki termicznej, inokulum i metody oznaczania na wyniki badania ogrzewanego miêsa drobiu w kierunku obecnoci pa³e-czek Salmonella
