Artyku³ przegl¹dowy Review
Mleko jest biologiczn¹ substancj¹ uznawan¹ za ide-alne po¿ywienie. Dzieci karmione mlekiem matki, w porównaniu do karmienia mlekiem modyfikowanym, wykazuj¹ mniejsz¹ podatnoæ na biegunki, infekcje uk³adu oddechowego i moczowego, astmê, zapalenie ucha rodkowego, martwicze zapalenie jelit, atopiê, celiakiê czy cukrzycê typu I (8). St¹d biologiczna rola sk³adników mleka nie ogranicza siê tylko do ich war-toci od¿ywczej, ale pe³ni¹ one równie¿ szereg dodat-kowych funkcji. Wymieniæ tu mo¿na substancje chro-ni¹ce organizm przed infekcjami bakteryjnymi i wiru-sowymi, informacyjne cz¹steczki bior¹ce udzia³ w prze-mianach komórkowych oraz stymuluj¹ce w³aciwe wykszta³cenie uk³adów: immunologicznego, nerwo-wego i pokarmonerwo-wego, w tym m.in. wp³ywaj¹ce na doj-rzewanie i w³aciwe ukszta³towanie struktury kosm-ków jelitowych, a tak¿e selektywnie oddzia³ywuj¹ce na naturaln¹ symbiotyczn¹ mikroflorê w przewodzie pokarmowym (8, 19). Poznanie funkcji, struktury oraz mechanizmu oddzia³ywania poszczególnych sk³adni-ków mleka pozwala zatem poprzez lepsze od¿ywia-nie zapewniæ prawid³owy rozwój dziecka i mo¿e przy-czyniæ siê do zrozumienia etiologii wielu schorzeñ i opracowania sposobów ich leczenia, byæ mo¿e rów-nie¿ u doros³ych.
W ostatnich dwóch dekadach wzros³o zaintereso-wanie otoczk¹ kuleczek t³uszczowych w mleku.
Do-tyczy to zarówno wystêpowania, struktury oraz biolo-gicznych i ¿ywieniowych w³aciwoci poszczególnych jej sk³adników, a tak¿e fizjologicznej roli ca³ej struk-tury kuleczki i jej otoczki (10, 34).
Mleko cz³owieka zawiera 3,8-3,9% t³uszczu, mle-ko krowie 3-5% t³uszczu wystêpuj¹cego w formie zdyspergowanej, w tzw. kuleczkach t³uszczowych, sta-bilizowanych poprzez otoczkê kuleczek t³uszczowych. Wielkoæ kuleczek t³uszczowych zawarta jest w prze-dziale od 0,2 do 15 µm, rednia wielkoæ wynosi 4 µm, a niewielka ich liczba przekracza 10 µm (40). Powstaj¹ one w nie do koñca poznanym procesie, w komórkach nab³onkowych gruczo³u mlekowego, wycielaj¹cych pojedyncz¹ warstw¹ wnêtrze pêcherzy-ka mlekotwórczego (21). W otoczce kuleczek t³usz-czowych wyró¿niæ mo¿na, zaczynaj¹c od rodka, mo-nowarstwê polarnych lipidów i bia³ek otaczaj¹cych wnêtrze, czyli rdzeñ lipidowy, nastêpnie warstwê bia³-kow¹, czyli tzw. p³aszcz bia³kowy, wystêpuj¹cy w prze-strzeni miêdzyb³onowej oraz otaczaj¹c¹ ca³¹ kulecz-kê t³uszczow¹ rzeczywist¹, zewnêtrzn¹ dwuwarstwê lipidow¹ sk³adaj¹c¹ siê z bia³ek, glikoprotein, enzy-mów, niepolarnych i polarnych lipidów oraz fosfolipi-dów (17).
Wa¿n¹ grupê sk³adników otoczki kuleczek t³uszczo-wych stanowi¹ bia³ka. Podstawow¹ ich funkcj¹ jest udzia³ w stabilizacji struktury kuleczek, jednak
rosn¹-Biologiczne w³aciwoci bia³ek otoczki
kuleczek t³uszczowych mleka
MICHA£ SMOCZYÑSKI, BOGUS£AW STANIEWSKI, KATARZYNA KIE£CZEWSKA
Katedra Mleczarstwa i Zarz¹dzania Jakoci¹ Wydzia³u Nauki o ¯ywnoci UWM, ul. Oczapowskiego 7, 10-719 Olsztyn
Smoczyñski M., Staniewski B., Kie³czewska K.
Biological activities of milk fat globule membrane proteins
Summary
Milk is a biological fluid considered as an ideal food. However milk not only provides a good balance of all nutrients, but also contains many bioactive compounds fulfilling various functions. One of such components gaining increasing attention in recent years is the milk fat globule membrane. Alongside its primary role in stabilizing lipid globules, it comprises many biologically active molecules. One of such groups are proteins. The primary milk fat globule membrane proteins are: butyrophilin, mucin 1, mucin 15, xanthine dehydro-genase/oxidase (XDH/XO), CD 36, adipophilin, lactadherin and fatty-acid binding protein (FABP). Moreover, many minor proteins with different functions are found in the milk fat globule membrane.
In this review biological activities of milk fat globule membrane proteins are described. Unraveling the full composition of the membrane and its impact on the nutritional value of milk should enable the conscious application and use of these bioactive compounds in functional foods.
ca liczba informacji na temat bioak-tywnoci tych bia³ek wskazuje na ich potencjalnie szerszy zakres oddzia-³ywania i znacznie istotniejsz¹ rolê w mleku. Biologiczne w³aciwoci tych bia³ek s¹ tematem niniejszego opracowania.
Bia³ka otoczki kuleczki t³uszczo-wej stanowi¹ 1% masy ca³ej kuleczki t³uszczowej, 25-60% masy otoczki i ok. 1-2% ca³kowitej masy bia³ek w mleku. Rozdzia³ i charakterystyka bia³ek otoczki kuleczki t³uszczowej oparta jest g³ównie o metody elektro-foretyczne (3, 6, 20, 31, 39) i w chwi-li obecnej zidentyfikowano ponad 40 ró¿nych bia³ek (34) o masie cz¹s-teczkowej w zakresie od 13 000 do 280 000 Da, przy czym wiele frakcji bia³kowych wystêpuje dodatkowo w ró¿nych izoformach. W przypadku metod o wysokiej rozdzielczoci, jak np. elektroforeza 2D, uzyskiwane
wy-niki w du¿ym stopniu zale¿¹ od zastosowanych me-tod izolowania, prefrakcjonowania, oczyszczania oraz wybarwiania i uzyskanie referencyjnych 2DE map czê-sto nie jest prostym zadaniem. Dodatkowo znaczna hydrofobowoæ tych bia³ek utrudnia ich wyizolowa-nie i oddzielewyizolowa-nie przy pomocy odpowiednio dobranych rozpuszczalników od fosfolipidów i niepolarnych li-pidów. G³ówne sk³adniki bia³kowe (wg u³o¿enia na jednokierunkowym ¿elu SDS) otoczki kuleczek t³usz-czowych przedstawiono w tab. 1.
Mucyny
W otoczce stwierdzono wystêpowanie dwóch bia-³ek z rodziny mucyn, tj. mucyny 1 i mucyny 15. Mu-cyna 1 ma najwy¿sz¹ masê cz¹steczkow¹ sporód bia-³ek otoczki kuleczek t³uszczowych, jednak ze wzglê-du na znaczny polimorfizm i ró¿nice w glikozylacji (zawartoæ cukrów mo¿e stanowiæ od 50% do 80% masy cz¹steczki) trudno jest precyzyjnie okreliæ masê tego bia³ka. Jest transmembranowym bia³kiem posia-daj¹cym wiele izoform, w zale¿noci od organizmu czy tkanki, o krótkiej domenie cytoplazmatycznej, po-³¹czonej z elementami cytoszkieletu, oraz silnie gli-kozylowanej czêci zewn¹trzkomórkowej. Mo¿e rów-nie¿ wystêpowaæ w formie rozpuszczalnej. Z powodu glikozylacji bia³ko to s³abo barwi siê barwnikiem Coomassie Blue, natomiast dobrze barwi siê odczyn-nikiem PAS. Wystêpuje w komórkach nab³onkowych wielu tkanek oraz w otoczce kuleczek t³uszczowych. Charakterystyczn¹ cech¹ wykorzystywan¹ do wykry-wania tego bia³ka jest wi¹zanie lektyny z orzeszków ziemnych. Mucyna 1 jest wyj¹tkowo oporna na tra-wienie. Mo¿e pe³niæ szereg funkcji. Wystêpuj¹c na po-wierzchni wielu tkanek, poprzez silny ³adunek ujem-ny (kwas sjalowy), tworzy barierê dla
mikroorganiz-mów oraz chroni przed uszkodzeniami chemicznymi czy fizycznymi. W otoczce jako bia³ko adhezyjne (czy te¿ antyadhezyjne) mo¿e zabezpieczaæ przed atakiem szkodliwych drobnoustrojów i enzymów w przewo-dzie pokarmowym. Stanowi¹c alternatywne miejsce wi¹¿¹ce, uniemo¿liwia wi¹zanie i przedostawanie siê mikroorganizmów do tkanek. Mo¿e tak¿e braæ udzia³ w sygnalizacji miêdzykomórkowej. Oprócz mleka podwy¿szony poziom tego bia³ka pojawia siê w ko-mórkach rakowych piersi, st¹d stanowi ono potencjal-ny marker w diagnostyce raka piersi (20, 29, 35).
Mucyna 15 jest silnie glikozylowanym, transmem-branowym, wysokocz¹steczkowym bia³kiem, nale¿¹-cym do rodziny mucyn. Oprócz otoczki kuleczki t³usz-czowej mleka wystêpuje równie¿ w wielu innych ko-mórkach (w tym immunologicznych) i tkankach. Jest jednym z najmniej poznanych bia³ek otoczki. Funkcje tego bia³ka pozostaj¹ nieznane. Bior¹c pod uwagê siln¹ glikozylacjê typow¹ dla mucyn, jest prawdopo-dobne, ¿e pe³ni funkcje typowe dla tej grupy bia³ek, tj. tworzenie bariery dla mikroorganizmów, zwil¿anie powierzchni czy te¿ modyfikowanie struktury po-wierzchni glikozylowanych regionów (28).
Dehydrogenaza/oksydaza ksantynowa
Oksydaza, wykazuj¹ca równie¿ NAD+ zale¿n¹ ak-tywnoæ dehydrogenazy (XDH/XO), wystêpuje jako homodimer wi¹¿¹cy jony ¿elaza, siarki, molibdenu i FAD. Jest kluczowym enzymem w szlaku utleniania puryn, katalizuj¹cym utlenienie hipoksantyny do kwasu moczowego. Przyjmuje siê, ¿e monomery s¹ katali-tycznie niezale¿ne od siebie (20), przy czym dominu-j¹c¹ form¹ jest dehydrogenaza, ulegaj¹ca przekszta³-ceniu do formy oksydazy poprzez utlenienie specyficz-nych reszt cysteinowych (reakcja odwracalna) lub te¿ Tab. 1. G³ówne sk³adniki bia³kowe otoczki kuleczki t³uszczowej (wg kolejnoci u³o¿enia na jednokierunkowym ¿elu SDS) (20, 32)
a k ³ a i b ) y -( a w z a n a k s l o P ) y w z a n e n n i( a k s l e i g n a a w z a n t o r P -s s i w S e iz a b w r e m u N Masa , a w o k z c e t s ¹ z c a D k e i w o ³ z C Krowa ) 1 S A P , 1 C U M ( 1 n i c u M 1 a n y c u M , 1 4 9 5 1 P , 0 0 9 4 0 Q , 2 0 1 9 9 Q , 5 0 5 2 0 Q , 7 1 8 2 0 Q 8 8 0 8 9 P , 1 9 0 8 9 P 50000-500000 a w o n y t n a s k a z a d y s k o / a z a n e g o r d y h e D e s a d i x o / e s a n e g o r d y h e d e n i h t n a X ) O X / H D X ( P47989 P80457 0 0 0 0 0 3 2 ( ×150000) 5 1 n i c u M II I S A P , 5 1 a n y c u M )I II S A P ,I II ff i h c S d i c a c i d o ir e P , 5 1 C U M ( Q8N387 Q8MI01 94000-100000 ) V I S A P ( 6 3 D C 6 3 D C P16671 P26201 53000 ) N T B ( n il i h p o r y t u B a n il if o r y t u B Q13410 P18892 56000 ) P R D A , H P D A ( n il i h p o p i d A a n il if o p i d A Q99541 Q9TUM6 52000 d i c A c i d o ir e P a n y r e h d a t k a L , 7 / 6 S A P ) 8 E -G F M , n ir e h d a t c a L , 7 / 6 S A P ( 7 / 6 ff i h c S Q08431 Q95114 43000-59000 P B A F , e w o z c z s u ³t y s a w k e c ¹ ¿ ¹ i w o k ³ a i B ) P B A F ( n i e t o r p g n i d n i b d i c a -y tt a F P15090 P48035 13000
poprzez ograniczon¹ proteolizê. Stanowi ok. 20% wszystkich bia³ek otoczki i jest g³ównym bia³kiem otoczki o w³aciwociach enzymatycznych. Fizjolo-giczna rola tego bia³ka nie jest do koñca wyjaniona, przy czym du¿a jego zawartoæ w tkankach oraz wystêpowanie w du¿ych ilociach w otoczce, z czego w du¿ym stopniu w formie nieaktywnej w stosunku do puryn, sugeruj¹ dodatkowe funkcje poza ich utle-nianiem. Ekspresja i poziom tego bia³ka w gruczole mlekowym w okresie laktacji s¹ wyj¹tkowo wysokie, nie spotykane w innych tkankach. Jedn¹ z funkcji mo¿e byæ udzia³ w wydzielaniu kuleczek t³uszczowych. Wystêpuj¹c na powierzchni cytoplazmatycznych kro-pelek t³uszczowych, po dotarciu do apikalnej czêci komórek wydzielniczych poprzez interakcje z butyro-filin¹ wystêpuj¹c¹ w b³onie komórki mo¿e tworzyæ kompleksy, zapocz¹tkowuj¹ce proces wydzielania kuleczki t³uszczowej na zewn¹trz komórki (27). Oprócz tego, poprzez tworzenie aktywnych form tle-nu i azotu, zabójczych dla mikroorganizmów, mo¿e pe³niæ funkcje ochronne (14, 35). Poniewa¿ powierzch-nia otoczki pochodzi z komórek nab³onkowych, szko-dliwe drobnoustroje bêd¹ siê wi¹zaæ w tym samym stopniu z otoczk¹, jak i tkank¹ nab³onkow¹, przez co umo¿liwiony bêdzie kontakt XDH/XO z bakteriami i ich zniszczenie. Efekt ten mo¿e byæ zwiêkszony po-przez obecnoæ laktoperoksydazy w mleku. Coraz wiê-cej danych wskazuje na mo¿liwe dzia³anie tego enzy-mu poprzez tworzenie aktywnych form tlenu, jako modulatora aktywnoci innych cz¹steczek, w tym czyn-ników transkrypcyjnych. Wydaje siê równie¿, ¿e en-zym ten bierze udzia³ w procesach zapalnych, ponie-wa¿ jego ekspresja ulega intensyfikacji pod wp³ywem cytokin i steroidów (20).
CD 36 (PAS IV)
Bia³ko to posiada dwie domeny transmembranowe, dwie krótkie domeny wewn¹trzkomórkowe i zewn¹trz-komórkow¹ pêtle. Jest silnie glikozylowanym bia³kiem. Wystêpuje na powierzchni wielu komórek, takich jak: p³ytki krwi, monocyty, komórki ródb³onka czy ko-mórki nowotworowe. Pe³ni wiele funkcji, m.in. bierze udzia³ w przekazywaniu sygna³ów miêdzykomórko-wych i procesach adhezji. Jako receptor dla kolagenu i trombospondyny mo¿e braæ udzia³ w procesie akty-wacji i agregacji p³ytek krwi. Oprócz tego bierze udzia³ w procesach rozpoznawania komórek apoptotycznych i ich eliminacji poprzez fagocytozê, a tak¿e wi¹¿e lipo-proteiny o niskiej gêstoci i d³ugo³añcuchowe kwasy t³uszczowe. Dok³adna rola tego bia³ka w kuleczkach t³uszczowych jest niejasna. Jedn¹ z funkcji mo¿e byæ udzia³ w transporcie d³ogo³añcuchowych kwasów t³uszczowych (2, 20).
Butyrofilina
Butyrofilina (BTN butyrophilin) jest g³ównym, glikozylowanym bia³kiem otoczki. Mo¿e stanowiæ nawet ponad 40% masy bia³ek otoczki. Jest bia³kiem
transmembranowym, silnie zwi¹zanym z otoczk¹ ku-leczki t³uszczowej (rolê mog¹ tu odgrywaæ wi¹zania disiarczkowe), pe³ni¹cym razem z oksydaz¹ ksanty-now¹ (XDH/XO) kluczow¹ rolê podczas wydzielania kuleczek t³uszczowych (16, 27). Ekspresjê tego bia³-ka stwierdzono tylko w gruczole mlekowym i ulega ona znacznej intensyfikacji w okresie laktacji. Zwiêk-sza siê równie¿ jego koncentracja w apikalnych rejo-nach b³ony komórek wydzielniczych, w których na-stêpuje kontakt i wydzielanie kuleczek t³uszczowych z komórki (15). Strukturalnie zawiera dwie zewn¹trz-komórkowe domeny nale¿¹ce do rodziny immunoglo-bulin, wykazuj¹c mo¿liw¹ strukturê receptorow¹, a tym samym mo¿e braæ udzia³ w procesach wi¹zania i ko-munikacji miêdzy komórkami (38). Prawdopodobnie g³ówn¹ funkcj¹ tego bia³ka jest udzia³ w wydzielaniu kuleczek t³uszczowych z komórek nab³onkowych gru-czo³u mlecznego. Istniej¹ tak¿e sugestie dotycz¹ce mo¿liwoci zwi¹zku pomiêdzy spo¿yciem tego bia³ka a stwardnieniem rozsianym, autyzmem czy chorob¹ niedokrwienn¹ serca, poprzez autoimmunogenne od-dzia³ywanie tego bia³ka (32).
Adipofilina
Adipofilina (ADPH-adipophilin, ADRP-adipose differentiation-related protein) jest bia³kiem bêd¹cym jednym z wczesnych markerów ró¿nicowania komó-rek t³uszczowych (adipocytów). Nale¿y do rodziny bia³ek PAT (razem z perilipin¹, TIP47, S3-12 i OXPAT wykazuj¹cymi du¿e homologie strukturalne), zwi¹za-nych z wewn¹trzcytoplazmatycznym transportem kwa-sów t³uszczowych, powierzchni¹ kropelek t³uszczo-wych w cytoplazmie komórek i reguluj¹cymi procesy odk³adania lub hydrolizy t³uszczu, np. poprzez regu-lowanie dostêpu lipaz do wnêtrza kropelki t³uszczu (4). Wystêpuje równie¿ w otoczce kuleczki t³uszczo-wej. Mo¿e braæ tak¿e udzia³ w oddzia³ywaniach buty-rofiliny i XDH/XO w procesie wydzielania kuleczek t³uszczowych z komórek nab³onkowych i tworzeniu p³aszcza bia³kowego na ich powierzchni (15, 22). Oprócz tego mo¿e byæ zwi¹zana z rozwojem i funk-cjonowaniem tkanki t³uszczowej, jakkolwiek dok³ad-na rola tego bia³ka nie jest zdok³ad-nadok³ad-na.
PAS VI/VII
Inne nazwy tego bia³ka to laktadheryna (ludzki ho-molog) oraz MFG-EGF 8 (milk fat globule-epidermal growth factor 8, mysi homolog). Jest ono raczej luno zwi¹zanym z otoczk¹ glikozylowanym bia³kiem, bar-wi¹cym siê zarówno Coomassie Blue, jak i odczynni-kiem PAS, wystêpuj¹cym w wielu tkankach. Mo¿e pe³niæ wyj¹tkowo wiele funkcji. G³ówne jego funkcje zwi¹zane s¹ z procesami adhezyjnymi. Wi¹¿e siê z fos-folipidami, a poprzez wi¹zanie fosfatydyloseryny na komórkach apoptycznych umo¿liwia ich fagocytozê (23, 24). Wykazano, ¿e ludzka laktadheryna mo¿e chro-niæ przed infekcjami rotawirusowymi (18, 25) oraz zabezpieczaæ przed infekcjami bakteryjnymi, w tym
E. coli (33). Oprócz tego bierze udzia³ w procesach zapalnych, a tak¿e odgrywa istotn¹ rolê w utrzymy-waniu homeostazy i regeneracji uszkodzeñ komórek nab³onka jelit (5). Wykazano równie¿ udzia³ tego bia³-ka w morfogenezie i inwolucji gruczo³u mlekowego (1, 9).
Bia³ko wi¹¿¹ce kwasy t³uszczowe
FABP (fatty acid binding protein) jest bia³kiem o sto-sunkowo niewielkiej masie cz¹steczkowej (ok. 13 000 Da), barwi¹cym siê Coomassie Blue, ale nie odczyn-nikiem PAS. Nale¿y do rodziny bia³ek bior¹cych udzia³ w rozpuszczaniu, utrzymywaniu w³aciwego stê¿enia kwasów t³uszczowych w komórce, przechowywaniu oraz transferze kwasów t³uszczowych przez b³onê i po-miêdzy b³on¹ a organellami w komórkach, i jako takie zwi¹zane jest z procesami lipolizy i lipogenezy (13). Bia³ka nale¿¹ce do tej rodziny zidentyfikowano w wie-lu ró¿nych tkankach, niekoniecznie kojarzonych z in-tensywnymi przemianami t³uszczu (np. mózg) (37). Oprócz g³ównej funkcji zwi¹zanej z kwasami t³usz-czowymi wykazano, ¿e bia³ko to wp³ywa hamuj¹co na wzrost niektórych linii komórek raka piersi (35) oraz wykazuje stymuluj¹ce oddzia³ywanie na ró¿nicowa-nie siê komórek gruczo³u mlekowego (43). Oprócz tego mo¿e modulowaæ aktywnoæ enzymów zwi¹zanych z metabolizmem t³uszczów i wp³ywaæ na ekspresjê ge-nów zwi¹zanych z przemianami kwasów t³uszczowych (37).
Inne bia³ka
Oprócz tych g³ównych frakcji bia³kowych, otoczka kuleczek t³uszczowych zawiera wiele innych bia³ek, takich jak enzymy czy immunoglobuliny. Fong i wsp. (10) w otoczce kuleczki z mleka krowiego wykryli w znacznych ilociach proteozo-pepton 3. Bia³ko to mo¿e byæ inhibitorem lipazy lipoproteinowej, tym sa-mym zabezpieczaæ przed spontaniczn¹ lipoliz¹ w mle-ku (11) oraz chroniæ zêby przed atakiem kwasów (12). Bia³ka tego nie stwierdzono jednak w mleku kobie-cym (30). Oprócz tego Fong i wsp. zidentyfikowali nowe bia³ka dotychczas nie kojarzone z otoczk¹ kule-czek t³uszczowych, to jest: receptor polimerycznych immunoglobulin (polymeric Ig receptor protein), apo-lipoproteinê E, apoapo-lipoproteinê A1, 71 kDa pokrewne bia³ko szoku termicznego (heat-shock cognate pro-tein), klasterynê, izomerazê peptydylo-prolylow¹ A, oraz laktoperoksydazê i immunoglobulinowy ³añcuch ciê¿ki (10).
Wu i wsp. (42) wykazali obecnoæ w otoczce kule-czek t³uszczowych bia³ek funkcjonalnie zwi¹zanych z b³on¹ retikulum endoplazmatycznego (ERP99, ERP29, esteraza karboksylowa ER), co wskazuje na udzia³ tej b³ony nie tylko w syntezie t³uszczu, ale rów-nie¿ w dostarczaniu materia³u tworz¹cego otoczkê. Badacze ci stwierdzili równie¿ obecnoæ w otoczce kuleczek t³uszczowych bia³ek zwi¹zanych z transpor-tem wewn¹trzkomórkowym i szkieletranspor-tem
cytoplazma-tycznym (poredni ³añcuch dyneiny, bia³ko motorycz-ne, gelsolina, gefiryna). Bia³ka te prawdopodobnie bio-r¹ udzia³ w transporcie kuleczek i wydzielaniu ich z komórki. Co wiêcej, bia³ka te stwierdzono w otocz-ce cytoplazmatycznych kuleczek t³uszczowych pocho-dz¹cych z gruczo³u mlecznego, ale nie stwierdzono w kuleczkach t³uszczowych wyizolowanych z w¹tro-by (komórki w¹trow¹tro-by nie wydzielaj¹ t³uszczu na ze-wn¹trz).
Reinhardt i wsp. (31), stosuj¹c po³¹czenie jednokie-runkowej elektroforezy z wysokosprawn¹ chromato-grafi¹ cieczow¹ i tandemowym spektrometrem maso-wym, zidentyfikowali w otoczce kuleczki t³uszczowej mleka krowiego 120 ró¿nych bia³ek, z czego 23% tych bia³ek zwi¹zanych by³o z wewn¹trzkomórkowym transportem pêcherzykowym, 23% z sygnalizacj¹ ko-mórkow¹, a 21% stanowi³y bia³ka o nieznanej funk-cji. Oprócz tego, stwierdzono obecnoæ bia³ek zwi¹-zanych z transportem i metabolizmem t³uszczu, bia³-ka transportuj¹ce zwi¹zane z syntez¹ i fa³dowaniem bia³ek oraz bia³ka o funkcjach immunologicznych.
Oprócz bia³ek typowo zwi¹zanych z otoczk¹, czêsto pojawiaj¹ siê w preparatach otoczki zarówno bia³ka mleka, jak i bia³ka serwatkowe. Ogólnie, wiele z tych bia³ek mo¿e byæ luno zwi¹zanych z otoczk¹ i czêsto trudno jest jednoznacznie okreliæ, czy dane bia³ko jest integraln¹ czêci¹ otoczki bia³kowej, czy te¿ wystê-puje w preparatach bia³ek otoczki jako wynik agrega-cji z otoczk¹, np. w wyniku jej uszkodzenia. Niektóre ze sk³adników bia³kowych mog¹ równie¿ ulegaæ de-naturacji podczas przygotowywania preparatów bia-³ek otoczki.
Oligosacharydy
Osobn¹ wa¿n¹ grup¹ zwi¹zków, trzeci¹ pod wzglê-dem zawartoci w mleku, maj¹c¹ istotne znaczenie nie tylko w odniesieniu do mleka, ale i bia³ek otoczki s¹ oligosacharydy. Mog¹ wystêpowaæ w formie rozpusz-czalnej lub byæ zwi¹zane z bia³kami. Poniewa¿ wiêk-szoæ bia³ek otoczki jest silnie glikozylowana, wystê-puj¹c na powierzchni otoczki kuleczek t³uszczowych, tworz¹ powierzchniow¹ warstwê, tzw. glikokaliks, któ-ra jest odpowiedzialna za bezporedni kontakt z oto-czeniem. Struktury te zyskuj¹ coraz wiêksze zaintere-sowanie, poniewa¿ mog¹ pe³niæ wiele funkcji, w tym mog¹ przede wszystkim selektywnie wi¹zaæ mikroor-ganizmy, zabezpieczaj¹c organizm przed patogenami i jednoczenie stymulowaæ rozwój korzystnej mikro-flory (Bifidobacterium) w jelicie. Oprócz tego mog¹ byæ g³ównym elementem bior¹cym udzia³ w komuni-kacji miêdzykomórkowej, w tym z komórkami immu-nologicznymi oraz braæ udzia³ w procesach adhezji (7, 26, 41).
Z³o¿onoæ otoczki kuleczek t³uszczowych sugeruje, ¿e prawdopodobnie wiele z jej bia³kowych sk³adników, szczególnie tych wystêpuj¹cych w mniejszych ilo-ciach, mo¿e byæ jeszcze niezidentyfikowanych. Pozna-nie pe³nego sk³adu otoczki pozwoli wyjaniæ
mecha-nizmy reguluj¹ce tworzenie i wydzielanie kuleczek t³uszczowych oraz ich wp³yw na w³aciwoci ¿ywie-niowe mleka. To z kolei mo¿e pozwoliæ na wiadome wykorzystanie potencjalnych w³aciwoci tych bia³ek w projektowaniu ¿ywnoci funkcjonalnej. Zarówno biologiczne w³aciwoci, jak i naturalne w³aciwoci emulguj¹ce bia³ek otoczki kuleczek t³uszczowych, wskazuj¹ na wysoki potencja³ prozdrowotny i mo¿li-we ich zastosowanie w przemyle spo¿ywczym jako nutraceutyków lub/i emulgatorów.
Pimiennictwo
1.Aoki N.: Regulation and functional relevance of milk fat globules and their components in the mammary gland. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006, 70, 2019-2027.
2.Berglund L., Petersen T. E., Rasmussen J. T.: Structural characterization of bovine CD36 from the milk fat globule membrane. Biochim. Biophys. Acta 1996, 1309, 63-68.
3.Bianchi L., Puglia M., Landi C., Matteoni S., Perini D., Armini A., Verani M., Trombetta C., Soldani P., Roncada P., Greppi G., Pallini V., Bini L.: Solu-bilization methods and reference 2-DE map of cow milk fat globules. J. Pro-teomics 2009, 72, 853-864.
4.Bickel P. E., Tansey J. T., Welte M. A.: PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochim. Biophys. Acta 2009, 1791, 419-440.
5.Bu H. F., Zuo X. L., Wang X., Ensslin M. A., Koti V., Hsueh W., Raymond A. S., Shur B. D., Tan X. D.: Milk fat globule-EGF factor 8/lactadherin plays a crucial role in maintenance and repair of murine intestinal epithelium. J. Clin. Invest. 2007, 117, 3673-3683.
6.Cavaletto M., Giuffrida M. G., Conti A.: The proteomic approach to analysis of human milk fat globule membrane. Clin. Chim. Acta 2004, 347, 41-48. 7.Charlwood J., Hanrahan S., Tyldesley R., Langridge J., Dwek M.,
Camil-leri P.: Use of proteomic methodology for the characterization of human milk fat globular membrane proteins. Anal. Biochem. 2002, 301, 314-324. 8.Donovan S. M.: Role of human milk components in gastrointestinal
develop-ment: current knowledge and future needs. J. Pediatr. 2006, 149, 49-61. 9.Ensslin M. A., Shur B. D.: The EGF repeat and discoidin domain protein,
SED1/MFG-E8, is required for mammary gland branching morphogenesis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2007, 104, 2715-2720.
10.Fong B. Y., Norris C. S., MacGibbon A. K. H.: Protein and lipid composition of bovine milk-fat-globule membrane. Int. Dairy J. 2007, 17, 275-288. 11.Girardet J. M., Linden G., Loye S., Courthaudon J. L., Lorient D.: Study of
mechanism of lypolysis inhibition by bovine milk proteose-peptone compo-nent 3. J. Dairy Sci. 1993, 76, 2156-2163.
12.Grenby T. H., Andrews A. T., Mistry M., Williams R. J.: Dental caries-protec-tive agents in milk and milk products: investigations in vitro. J. Dent. 2001, 29, 83-92.
13.Hamilton J. A.: How fatty acids bind to proteins: the inside story from protein structures. Prostag. Leukotr. Ess. 2002, 67, 65-72.
14.Harrison R.: Milk xanthine oxidas: Properties and physiological roles. Int. Dairy J. 2006, 16, 546-554.
15.Heid H. W., Keenan T. W.: Intracellular origin and secretion of milk fat glo-bules. Eur. J. Cell Biol. 2005, 84, 245-258.
16.Ischii T., Aoki N., Noda A., Adachi T., Nakamura R., Matsuda T.: Carboxy-terminal cytoplasmic domain of mouse butyrophilin specifically associates with a 150-kDa protein of mammary epithelial cells and milk fat globule membrane. Biochim. Biophys. Acta 1995, 1245, 285-292.
17.Keenan T. W.: Milk lipid globules and their surrounding membrane: A brief history and perspectives for future research. J. Mammary Gland Biol. 2001, 6, 365-371.
18.Kvistgaard A. S., Pallesen L. T., Arias C. F., Lopez S., Petersen T. E., Heegaard C. W., Rasmussen J. T.: Inhibitory effects of human and bovine milk constituents on rotavirus infections. J. Dairy Sci. 2004, 87, 4088-4096. 19.LoCascio R. G., Ninonuevo M. R., Freeman S. L., Sela D. A., Grimm R., Lebrilla C. B., Mills D. A., Bruce German J.: Glicoprofiling of bifidobacte-rial consumption of human milk oligosaccharides demonstrates strain speci-fic, preferential consumption of small chain glycans secreted in early human lactation. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 8914-8919.
20.Mather I. H.: A review and proposed nomenclature for major proteins of the milk-fat globule membrane. J. Dairy Sci. 2000, 83, 203-247.
21.Mather I. H., Keenan T. W.: Origin and secretion of milk lipids. J. Mammary Gland Biol. 1998, 3, 259-273.
22.McManaman J. L., Russell T. D., Schaack J., Orlicky D. J., Robenek H.: Molecular determinants of milk lipid secretion. J. Mammary Gland Biol. 2007, 12, 259-268.
23.Naka M., Kusakabe K., Takeshita A., Nakagawa H., Ito Y., Shibata M. A. Otsuki Y.: Phagocytosis mechanism of apoptotic granulosa cells regulated by milk-fat globule-EGF factor 8. Med. Mol. Morphol. 2009, 42, 143-149. 24.Nanga R. P. R., Vivekanandan S., Yoon H. S.: Expression, purification and
characterization of C2 domain of milk fat globule-EGF-factor 8-L. Protein Expres. Purif. 2007, 52, 329-333.
25.Newburg D. S., Peterson J. A., Ruiz-Palacios G. M., Matson D. O., Morrow A. L., Shults J., de Lourdes Guerrero M., Chaturvedi P., Newburg S. O., Scallan C. D., Taylor M. R., Ceriani R. L., Pickering L. K.: Role of human--milk lactadherin in protection against symptomatic rotavirus infection. Lancet 1998, 351, 1160-1164.
26.Ninonuevo M. R., Park Y., Yin H., Zhang J., Ward R. E., Clowers B. H., Bruce German J., Wilson N. L., Robinson L. J., Donnet A., Bovetto L., Packer N. H., Karlsson N. G.: Glycoproteomics of milk: Differences in sugar epitopes on human and bovine milk fat globule membranes. J. Proteome Res. 2008, 7, 3687-3696.
27.Ogg S. L., Weldon A. K., Dobbie L., Smith A. J. H., Mather I. H.: Expression of butyrophilin in lactating mammary gland is essential for the regulated secretion of milk-lipid droplets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 10084--10089.
28.Pallesen L. T., Pedersen L. R. L., Petersen T. E., Rasmussen J. T.: Characte-rization of carbohydrate structures of bovine MUC15 and distribution of the mucin in bovine milk. J. Dairy Sci. 2007, 90, 3143-3152.
29.Patton S., Gendler S. J., Spicer A. P.: The epithelial mucin, MUC1, of milk, mammary gland and other tissues. Biochim. Biophys. Acta 1995, 1241, 407--422.
30.Rasmussen J. T.: Bioactivity of milk fat globule membrane proteins. Aust. J. Dairy Technol. 2009, 64, 63-67.
31.Reinhardt T. A., Lippolis J. D.: Bovine milk fat globule membrane proteome. J. Dairy Res. 2006, 73, 406-416.
32.Riccio P.: The proteins of the milk fat globule membrane in the balance. Trends Food Sci. Tech. 2004, 15, 458-461.
33.Shahriar F., Ngeleka M., Gordon J. R., Simko E.: Identification by mass spectroscopy of F4ac-fimbrial-binding proteins in porcine milk and charac-terization of lactadherin as an inhibitor of F4ac-positive Escherichia coli attachment to intestinal villi in vitro. Dev. Comp. Immunol. 2006, 30, 723--734.
34.Singh H.: The milk fat globule membrane A biophysical system for food applications. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2006, 11, 154-163. 35.Spitsberg V. L.: Bovine milk fat globule membrane as a potential
nutraceuti-cal. J. Dairy Sci. 2005, 88, 2289-2294.
36.Spitsberg V. L., Gorewitz R. C.: Solubilization and purification of xanthine oxidase from bovine milk fat globule membrane. Protein Expres. Purif. 1998, 13, 229-234.
37.Storch J., Thumser A. E. A.: The fatty acid transport function of fatty acid--binding proteins. Biochim. Biophys. Acta 2000, 1486, 28-44.
38.Taylor M. R., Peterson J. A., Ceriani R. L., Couto J. R.: Cloning and sequence analysis of human butyrophilin reveals a potential receptor function. Bio-chim. Biophys. Acta 1996, 1306, 1-4.
39.Vanderghem C., Blecker C., Danthine S., Deroanne C., Haubruge E., Guil-lonneau F., De Pauw E., Francis F.: Proteome analysis of the bovine milk fat globule: Enhancement of membrane purification. Int. Dairy J. 2008, 18, 885-893.
40.Walstra P.: Physical chemistry of milk fat globules, [w:] Advanced Dairy Chemistry T. 2: Lipids. Wyd. P.F. Fox, Chapman&Hall, London 1995, 131--178.
41.Wilson N. L., Robinson L. J., Donnet A., Bovetto L., Packer N. H., Karlsson N. G.: Glycoproteomics of milk: Differences in sugar epitopes on human and bovine milk fat globule membranes. J. Proteome Res. 2008, 7, 3687-3696. 42.Wu C. C., Howell K. E., Neville M. C., Yates III J. R., McManaman J. L.:
Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secre-tory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis 2000, 21, 3470--3482.
43.Yang Y., Spitzer E., Kenney N., Zschiesche W., Li M., Kromminga A., Mul-ler T., Spener F., Lezius A., Veerkamp J. H., Smith G. H., Salomon D. S., Grosse R.: Members of the fatty acid binding protein family are differentia-tion factors for the mammary gland. J. Cell Biol. 1994, 127, 1097-1109. Adres autora: dr in¿. Micha³ Smoczyñski, ul. Oczapowskiego 7, 10-719 Olsztyn; e-mail: michal.smoczynski@uwm.edu.pl
