Michał Starzycki, Eligia Starzycka, Jan Krzymański, Marcin Matuszczak Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Zakład Roślin Oleistych w Poznaniu
Alloplazmatyczny rzepak ozimy otrzymany
z krzyżowań międzygatunkowych
w rodzinie Brassicaceae K.
Alloplazmatic forms of winter oilseed rape created by interspecific
crossing within Brassicaceae K. family
Słowa kluczowe: Brassica napus, rzepak ozimy, Brassica oleracea, kapusta, mieszańce między-
gatunkowe, hodowla zarodków in vitro
Key words: Brassica napus, winter oilsed rape, Brassica oleracea, cabbage, interspecific
hybridization, in vitro embryos culture Prezentowana praca miała na celu otrzymanie genotypów rzepaku ozimego (Brassica napus) z cytoplazmą B. oleracea. Przy użyciu zmody-fikowanej metody hodowli izolowanych zarod-ków in vitro otrzymano nowe mieszańce rzepaku posiadające cytoplazmę: brukselki, jarmużu lub kapusty pastewnej. Po 4–5 krotnych wstecznych krzyżowaniach mieszańców międzygatunkowych z rzepakiem ozimym, otrzymano nowe formy rzepaku morfologicznie podobne do roślin z zapylających linii B. napus. Przeprowadzone analizy cytogenetyczne potwierdziły mieszań-cowy charakter otrzymanych roślin. W pracy wykonano również analizy DNA przy użyciu metod PCR i RAPD, które miały na celu znale-zienie markerów charakterystycznych dla cyto-plazm użytych w krzyżowaniu form B. oleracea.
Studies on the interspecific hybrids within
Brassicaceae K. family were done to increase
the diversity of economically important traits of oilseed rape. The objective of this work was to obtain new genotypes of oilseed rape having
Brassica oleracea L. cytoplasm. Embryo rescue
method connected with in vitro culture was used to produce hybrids between B. oleracea var.
gemmifera (D.C.), B. oleracea var. acephala or B. oleracea var. acephala subvar. laciniata and B. napus. The hybrids obtained from
interspecific crosses were 4–5 times backcrossed with B. napus as pollinator. Obtained new lines were morphologically similar to male parental form (B. napus). Cytogenetical analyses proved hybridity of obtained plants. In this work also analyses of DNA with applying of PCR and RAPD methods were done aiming to find characteristic markers of B. oleracea cytoplasm.
Wstęp
Na świecie problematyką związaną z otrzymaniem mieszańców między-gatunkowych w obrębie rodziny Brassicaceae K. zajmowało się i dalej zajmuje się
wielu autorów (Batra i in. 1990; Brown i in. 1997; Earle i in. 1992; Gundimeda i in. 1992; Landgren i Glimelius 1994; Liu i in. 1995; Nanda Kumar i Shivanna 1993; Nothnagell i in. 1997; Sundberg i Glimelius 1991; Wojciechowski 1985; Wojciechowski i in. 1997). Badania te w zdecydowanej większości miały na celu otrzymanie nowych form łączących w sobie cechy obojga rodziców. W Instytucie Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Poznaniu od wielu lat wykonywane są prace związane z mieszańcami międzygatunkowymi w obrębie rodziny Brassicaceae. Celem tych prac jest wytworzenie genotypów rzepaku z cytoplazmą B. oleracea, które cechowałyby się zwiększoną zimotrwałością oraz odpornością na patogeny pochodzenia grzybowego.
W prezentowanej pracy dla otrzymania form rzepaku z cytoplazmą
B. oleracea zastosowano metodę krzyżowań wstecznych mieszańców
między-gatunkowych z zapylającą formą rodzicielską. W literaturze spotyka się prace wskazujące na możliwość wykorzystania sond mtDNA i ptDNa oraz markerów izoenzymatycznych (Nothnagel i in. 1997; Brown i in. 1997, Earle 1992, Landgren i Glimelius 1994) dla potwierdzenia mieszańcowego charakteru otrzymanych roślin. W niniejszej pracy mieszańcowy charakter roślin pokolenia BC4 próbowano
ustalić na podstawie analizy DNA — PCR i RAPD.
Materiały i metody
Do krzyżowania użyto roślin matecznych następujących gatunków: kapusta brukselska — B. oleracea var. gemmifera, kapusta pastewna — B. oleracea var.
acephala, kapusta jarmuż - B. oleracea var. acephala subvar. laciniata (wszystkie
2n = 18 chromosomów). Formą zapylającą był każdorazowo rzepak ozimy B. napus o liczbie chromosomów 2n = 38.
Zarodki mieszańcowe dla ich uchronienia przed zamieraniem izolowano trzy tygodnie po zapyleniu. Formy kuliste zielone (globularne), wykładano na pożywkę B5, wzbogaconą 10% sacharozą. Zarodki starszych stadiów rozwojowych
wykładano także na pożywkę B5, lecz o obniżonym do 3% stężeniu sacharozy.
Zregenerowane z zarodków rośliny ukorzeniano w kulturach hydroponicznych, a następnie przesadzano do doniczek z ziemią. Przez kolejne cztery lata mieszańce międzygatunkowe krzyżowano wstecznie z B. napus, użytym jako forma ojcowska. Krzyżowanie wstecznie prowadzono w sposób pokazany na schemacie 1.
U form rodzicielskich oraz u mieszańców F1 i BC4 określono liczbę
chromo-somów przy pomocy metody orceinowej. Celem znalezienia markerów charakte-ryzujących cytoplazmę form B. oleracea użytych w krzyżowaniach, w pokoleniu BC4 wykonano analizy DNA. Izolację całkowitego DNA wykonano metodą
B. oleracea x B. napus I rok (n = 9) (n = 19)
F1 x B. napus II rok
(hybryd 28)
BC1 x B. napus III rok
BC2 x B. napus IV rok
BC3 x B. napus V rok
BC4 x B. napus VI rok
Schemat 1. Krzyżowanie wsteczne mieszańców międzygatunkowych z rzepakiem ozimym
Interspecific hybrids backcross with winter oilseed rape
Do amplifikacji fragmentu genu coxIII (Xiao-Ru Wang i in. 1996) wyko-rzystano parę starterów:
starter pierwszy — 5’ TTACATACAACCGAGGCAAAGTG 3’ starter drugi — 5’ AATCCACTGTTTCGTTCCTTCAT 3’.
Mieszanina reakcyjna dla PCR w objętości 25 µl zawierała następujące skład-niki: dATP, dGTP, dCTP, dTTP (Sigma) każdy o stężeniu 100 µM, 5,0 pmola star-tera, 0,75 jednostek Taq Polimerazy (Eurobio), MgCl2 o stężeniu 1,5 mM, 70 ng
genomowego DNA. Amplifikację DNA przeprowadzono w termocyklerze GeneAmp PCR System 2400 firmy Perkin-Elmer zachowując następujące parametry reakcji: wstępna denaturacja matrycy 98oC — 7 min., jeden cykl; namnażanie DNA: 30 cykli, denaturacja 94oC — 1 min., hybrydyzacja 55oC — 1 min., polimeryzacja 72oC — 2,5 min.; koniec polimeryzacji 72oC — 10 min., jeden cykl.
Do analizy RAPD użyto oddzielnie dwóch starterów: OPY10 — 5’ CAAACGTGGG 3’
OPW05 — 5’ GGCGGATAAG 3’.
Mieszanina reakcyjna dla RAPD w objętości 12,5 µl zawierała następujące składniki: dATP, dGTP, dCTP, dTTP (Sigma) każdy o stężeniu 150 µM, 0,2 pmola startera, 0,4 jednostek Taq Polimerazy (Eurobio), MgCl2 o stężeniu 1,9 mM, 3,5 ng
genomowego DNA. Amplifikację DNA przeprowadzono w termocyklerze GeneAmp PCR System 2400 firmy Perkin-Elmer zachowując następujące parametry reakcji: wstępna denaturacja 95oC — 0,5 min., jeden cykl; namnażanie DNA: 45 cykli, denaturacja 95oC — 0,5 min., hybrydyzacja 35oC — 1 min., polimeryzacja 72oC — 2,5 min.; koniec polimeryzacji 72oC — 5 min., jeden cykl. Produkty reakcji PCR i RAPD analizowano za pomocą elektroforezy na 1,2% żelu agarozowym.
Po rozdzieleniu fragmentów DNA w polu elektrycznym żele wybarwiano w bromku etydyny i obserwowano wynik w świetle UV. Jako wzorca długości amplifikowanego DNA w obu metodach użyto DNA faga λ trawionego enzymami
HindIII i EcoRI (Eurobio).
Wyniki
Ogółem wykonano ponad 430 krzyżowań międzygatunkowych pomiędzy różnymi formami kapust a rzepakiem ozimym. Z 2821 zalążków powstałych z tych krzyżowań wyizolowano 80 zarodków. Liczby zarodków hodowanych w warun-kach in vitro oraz liczby zregenerowanych roślin w poszczególnych kombinacjach krzyżowania przedstawiono w tabeli 1. W pokoleniu F1 wszystkie rośliny
mie-szańcowe posiadały w komórkach somatycznych 28 (ACC = 28), a w pokoleniu BC4 38 chromosomów. Charakter mieszańcowy niepłodnych roślin pokolenia
F1 był widoczny fenotypowo w każdej kombinacji krzyżówkowej, a rośliny
pokrojowo łączyły cechy obu rodziców.
Tabela 1 Zestawienie liczby zarodków hodowanych in vitro oraz liczby otrzymanych roślin mieszańcowych — Composition of the number of cultured in vitro embryos and obtained
hybrid plants Formy rodzicielskie Parental forms Liczba izolowanych „zalążków” Number of isolated ovules Liczba otrzymanych zarodków Number of obtained embryos Liczba otrzymanych roślin * Number of obtained plants
B. oleracea var. gemmifera x B. napus („00”) 1500 12 65
B. oleracea var. acephala subvar. Lacinista
x B. napus („00”)
700 53 20
B. oleracea var. acephala x B. napus („00”) 621 15 53
Suma 2821 80 138
* — rośliny otrzymane w wyniku klonowania roślin mieszańcowych plants obtained after cloning of hybrid plants
W celu potwierdzenia obecności cytoplazmy kapusty w otrzymanych mie-szańcowych roślinach rzepaku pokolenia BC4, wykonano analizy DNA przy
λ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
λ
„a" coxIII
λ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
λ
„b” OPY10
λ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
λ
„c” OPW05
1 —B. oleracea var. gemmifera — brukselka Brussels sprouts
2 —B. oleracea var. acephala subvar. laciniata — jarmuż wrinkled kale
3 —B. oleracea var. acephala — kapusta pastewna pasture cabbage
4 —B. napus L. — rzepak ozimy — winter oilseed rape
5 —F1 B. oleracea var. acephala × B. napus L.
F1 pasture cabbage x winter oilseed rape
6 —F1 B. oleracea var. gemmifera × B. napus L.
F1 Brussels sprouts x winter oilseed rape
7 —BC4 B. oleracea var. gemmifera × B. napus L.
BC4 Brussels sprouts x winter oilseed rape
8 —BC4 B. oleracea var. acephala subvar. Laciniata × B. napus
BC4 wrinkled kale x winter oilseed rape
9 —BC4 B. oleracea var. acephala × B. napus L.
BC4 pasture cabbage x winter oilseed rape
λ — wzorzec długości DNA — DNA size marker
Rys. 1. Wyniki PCR „a", Wyniki RAPD „b”, „c” — Results PCR „a", Results RAPD „b”, „c”
Para starterów mitochondrialnego genu coxIII amplifikowała DNA we wszystkich kombinacjach. Wzór prążkowy RAPD w pokoleniu BC4 był identyczny
dla roślin z cytoplazmą wszystkich kapust. Największe dostrzegane różnice odno-towano w pokoleniu mieszańcowym F1. Jarmuż w dużym stopniu układem
prążkowym przypominał rzepak, a użyte startery dobrze różnicowały trzy bota-niczne odmiany kapust.
Dyskusja i podsumowanie
Większość światowych publikacji na temat mieszańców międzygatunkowych w rodzinie Brassicaceae, to prace związane z krzyżowaniem dość odległych taksonomicznie gatunków, takich jak: S. alba x B. napus czy S. alba x B. oleracea (Nothnagel i in. 1997; Brown i in. 1997). W pierwszej kombinacji krzyżowania dla
otrzymania dużej liczby roślin mieszańcowych stosowano hodowlę izolowanych zarodków in vitro, a w drugiej fuzję protoplastów. W naszych badaniach do krzyżowań użyto tylko gatunków B. oleracea i B. napus, a dla otrzymania roślin mieszańcowych zastosowano technikę kultur in vitro izolowanych zarodków.
Przy krzyżowaniu oddalonych gatunków natrafia się na różnego rodzaju bariery. Najpowszechniejszą z nich jest niezgodność polegająca na zahamowaniu kiełkowania ziaren pyłku na znamieniu, a także zahamowaniu wnikania łagiewek pyłkowych do dalszych części słupka. U roślin z rodziny Brassicaceae występuje sporofityczny system niezgodności (Nettancourt 1969). W wielu wypadkach pokonanie barier niezgodności sporofitycznej możliwe jest poprzez zastosowanie kultur in vitro. Po zapyleniu krzyżowym przy braku łuszczyn można między innymi wnioskować o niezgodności sporofitycznej, a przy zdeformowanych zarodkach o niezgodności bielmowej. W krzyżówkach międzygatunkowych har-monia pomiędzy bielmem, zarodkiem, okrywą nasienną i owocnią zostaje zachwiana, a pierwsze oznaki zaburzeń występują w bielmie w postaci nietypowych mitoz i tumorowego wzrostu. Nienormalność takiego bielma przyczynia się do osłabienia i obumierania zarodka. Zarodki izolowane dosta-tecznie wcześnie mogą rozwijać się prawidłowo na pożywce w warunkach in vitro. W naszych badaniach nie obserwowano zaburzeń rozwoju embrionów mie-szańcowych na pożywkach, kiedy z łuszczyn preparowano zarodki w stadium sercowatym i torpedalnym. Stadia małe kuliste (globularne) po wyłożeniu na pożywki z reguły zamierały. Badania cytologiczne przeprowadzone na roślinach F1
jednoznacznie wykazały hybrydowy charakter otrzymanych roślin, ponieważ we wszystkich kombinacjach otrzymano rośliny o 28 chromosomach (ACC = 28). Dodatkową informacją wskazującą na ich mieszańcowy charakter była sterylność związana z brakiem pyłku, a także morfologia liści i pokrój całych roślin, które swoim wyglądem przypominały formy mateczne. Rośliny z pokolenia BC4 były
podobne pokrojem do rzepaku i trudne do odróżnienia od form tradycyjnych. Aby je identyfikować podjęto próby znalezienia cytoplazmatycznych markerów molekularnych. Marker coxIII amplifikował DNA we wszystkich analizowanych próbach, co wskazuje jedynie na właściwy wybór metody do izolacji cytoplaz-matycznego DNA. Ponieważ marker ten nie różnicował cytoplazmy kapusty i rzepaku, użyto wybrane z katalogu markery RAPD. Wzór prążkowy RAPD dla pokolenia BC4, okazał się także mniej przydatny w odróżnianiu nowych form
rzepaku z cytoplazmą kapust, w związku z czym kontynuowane są poszukiwania cytoplazmatycznych markerów.
Literatura
Batra V., Prakash S., Shivanna K.R. 1990. Intergeneric hybridization between Diplotaxis siifolia, a wild species and crop Brassicas. Theor. Appl. Genet., 80: 537-541.
Brown J., Brown A.P., Davis J.B., Erickson D. 1997. Intergeneric hybridization between Sinapis alba and Brassica napus. Euphytica, 93: 163-168.
Earle E.D., Temple M., Walters T.W. 1992. Organelle assortment and mitochondrial DNA rearrangements in Brassica somatic hybrids and cybrids. Physiologia Plantarum, 85: 325-333. Gundimeda H.R., Prakash S., Shivanna K.R. 1992. Intergeneric hybridization between
Enarthrocarpus lyratus, a wild species and crop brassicas. Theor. Appl. Genet., 83: 655-662.
Landgren M., Glimelius K. 1994. A high frequency of intergenomic mitochondrial recombination and an overall biased segregation of B. campestris or recombined B. campestris mitochondria were found in somatic hybrids made within Brassicaceae. Theor. Appl. Genet., 87: 854-862.
Liu J.H., Dixelius C., Eriksson I., Glimelius K. 1995. Brassica napus (+) B. tournefortii, a somatic hybrid containing traits of agronomic importance for rapeseed breeding. Plant Science, 109: 75-86.
Nanda Kumar P.B.A., Shivanna K.R. 1993. Intergeneric hybridization between Diplotaxis siettiana and crop brassicas for the production of alloplasmic lines. Theor. Appl. Genet., 85: 770-776. Nothnagel T., Budahn H., Straka P., Schrader O. 1997. Successful backcrosses of somatic hybrids
between Sinapis alba and Brassica oleracea with the Brassica oleracea parent. Plant Breeding, 116: 89-97.
Nettancourt, 1969. Badation effects on one Locus-gametophytic system on Self- incompatibility in higher plants. Theor. Appl. Genet., 39: 187-196.
Pastuglia M., Ruffio-Chable V., Delorme V., Gaude T., Dumas C. Cock M. 1997. A functional s locus anther gene is not required for the self – incompatibility response in Brassica oleracea. The Plant Cell., Vol. 9: 2065-2076.
Sundberg E., Glimelius K. 1991. Production of cybrid plants within Brassicaceae by fusing protoplasts and plasmolytically induced cytoplasts. Plant Science, 79: 205-216.
Wojciechowski A. 1985. Interspecific hybrids between Brassica campestris L. and B. oleracea L. I. Effectiveness of Crossing, Pollen Tube Growth, Embriogenesis. Genetica Polonica, 26/4: 423-436.
Wojciechowski A., Nowak K., Olejniczak J. 1997. Wstępne wyniki krzyżowań międzygatunkowych pomiędzy Brassica napus, B. oleracea, B. campestris i B. fruticulosa. Rośliny Oleiste, XVIII: 91-98.
Xiao-Ru Wang, Szmidt A.E. , Meng-Zhu Lu. 1996. Genetic evidence for the presence of cytoplasmic DNA in pollen and megagametophytes and maternal inheritance of mitochondrial DNA in Pinus. Forest Geneties, 3 (1): 37-44.
