[2007/Nr 4] Wpływ fluorku sodu i kofeiny na aktywność wybranych enzymów wątrobowych szczura

(1)

Ewa Grucka-Mamczar, Ewa Birkner, Jolanta Zalejska-Fiolka,

Tatianna Jamro´z-Szłapa

WPŁYW FLUORKU SODU I KOFEINY

NA AKTYWNOS

´

C

´

WYBRANYCH ENZYMO

´

W

WA˛TROBOWYCH SZCZURA

Zakład Biochemii Ogo´lnej Katedry Biochemii w Zabrzu S

´

la˛skiej Akademii Medycznej w Katowicach Kierownik: dr hab. n. med. E. Birkner

Celem pracy było zbadanie aktywnos´ci enzymo´w oceniaja˛cych stan wa˛troby: cholines-terazy (CHE), fosfatazay alkalicznej (FA) iγ-glutamylotranspeptydazy (γ-GT). Dos´wiad-czenie prowadzono na 18 szczurach (samcach) rasy Spraque-Dawley. Wykazano wzrost aktywnos´ci FA iγ-GT (pod wpływem NaF) charakterystyczny dla ostrej fazy wewna˛trz-wa˛trobowej. Kofeina niwelowała działanie NaF na wa˛troby szczuro´w.

Hasła kluczowe: enzymy wa˛trobowe, NaF, kofeina, szczury.

Key words: liver enzymes, NaF, caffeine, rats.

Badania dos´wiadczalne przeprowadzone in vivo na szczurach wykazały, z˙e

fluorek (w postaci NaF) jest szybko absorbowany z z˙oła˛dka i s´wiatła jelit. Szybkos´c´

absorbowania jest zwia˛zana z pH z˙oła˛dka.

Fluorek jest rozprowadzany z osocza do wszystkich tkanek i narza˛do´w. Szybkos´c´

„dostarczania” fluorku jest generalnie wyznaczana przez przepływ krwi do tkanek.

W konsekwencji stan ro´wnowagi ste˛z˙en´ fluorku mie˛dzy osoczem a takimi tkankami

jak serce, płuca, wa˛troba jest osia˛gany znacznie szybciej niz˙ odnos´nie mie˛s´ni

szkieletowych, sko´ry i tkanki tłuszczowej (1).

Szczego´lnie wraz˙liwymi tkankami na oddziaływanie fluorku sa˛ wa˛troba i nerki

(2, 3). Z kolei kofeina jest zwia˛zkiem silnie pobudzaja˛cym układ nerwowy. Usuwa

objawy zme˛czenia i sennos´ci. Poprawia ro´wniez˙ koncentracje˛ i sprawnos´c´ mys´lenia

(4, 5). Kofeina szybko sie˛ wchłania z przewodu pokarmowego. W wa˛trobie ulega

całkowitej biotransformacji przy udziale cytochromu P 450 1A (6, 7, 8).

Po przewlekłym naraz˙eniu na duz˙e dawki, kofeina prowadzi do zaburzen´

gospodarki wapniowo-fosforanowej. W ostatnich latach zaobserwowano, z˙e

kofei-na moz˙e zmniejszac´ toksycznos´c´ fluorku przez tworzenie zwia˛zko´w

komplek-sowych. Hamuje to wchłanianie fluorku i ogranicza objawy zatrucia (9).

Celem pracy było zbadanie wpływu skojarzonego podawania szczurom fluorku

sodu i kofeiny na aktywnos´c´ enzymo´w oceniaja˛cych stan wa˛troby takich jak:

cholinesteraza (CHE), fosfataza alkaliczna (FA) i

γ

-glutamylotranspeptydaza

(

γ

-GT) oznaczane w tym narza˛dzie.

(2)

CZE˛S

´

C

´

DOS

´

WIADCZALNA

Dos´wiadczenie prowadzono na 18 szczurach (samcach) rasy Spraque-Dawley. Zwierze˛ta podzielono na 3 grupy po 6 zwierza˛t kaz˙da. Zwierze˛ta miały zachowany naturalny cykl dzienno-nocny i swobodny doste˛p do standardowej paszy. Pierwsza grupa szczuro´w otrzymywała do picia wode˛ destylowana˛ i stanowiła grupe˛ kontrolna˛. Druga grupa zwierza˛t otrzymywała fluorek sodu w dawce 4,9 mg F–_/kg

m.c./dobe˛. Trzecia grupa szczuro´w otrzymywała taka˛ sama˛ dawke˛ F–_{oraz kofeine˛ w dawce 3 mg}

kofeiny/kg m.c./dobe˛.

Dos´wiadczenie trwało 50 dni. Po tym czasie szczury usypiano thiopentalem w dawce 30 mg/szczura. Do badan´ pobrano wa˛trobe˛ i sporza˛dzono w/v homogentaty (1 g tkanki + 9 cm3

ozie˛bionego 0,9% NaCl). Homogenat odwirowano i w supernatancie oznaczono aktywnos´ci naste˛puja˛cych enzymo´w:

1. cholinesterazy (CHE) (EC 3.1.1.8) zestawem Biochemtest (POCH Gliwice, Polska, nr kat. 178 140143).

2. fosfataze˛ alkaliczna˛ (FA) (EC 3.1.3.1) zestawem Biochemtest (POCH Gliwice, Polska, nr kat 178152149).

3. γ-glutamylotranspeptydazy (γ-GT) (EC 2.3.2.1) zestawem firmy Alpha Diagnostic Niemcy nr kat G 6570-100).

Wyniki przedstawiono w jednostkach IU w przeliczeniu na białko, kto´rego ste˛z˙enie oznaczono metoda˛ Lowry’ego (10).

A n a l i z a s t a t y s t y c z n a. Baze˛ danych utworzono w programie MS Excel 2000. W celu analizy statystycznej wykorzystano program Statistica PL. Jako wskaz´niki statystyki opisowej uz˙yto s´redniej (x) i odchylenia standardowego (SD). W celu poro´wnania ro´z˙nic mie˛dzy grupami zastosowano test U Manna-Whitney’a. Za znamienne statystycznie przyje˛to zmiany przy poziomie istotnos´ci p< 0.05.

WYNIKI

Wyniki przedstawiono w tab. I do III. Z tab. I widac´, z˙e aktywnos´ci CHE w homogenatach wa˛troby szczuro´w grupy kontrolnej, otrzymuja˛cej NaF i otrzymuja˛cej NaF z kofeina˛ nie uległa statystycznie znamiennym zmianom.

T a b e l a I

Aktywnos´c´ cholinesterazy w homogenatach wa˛troby szczuro´w T a b l e I

Activity of cholinesterase activity

Grupa Aktywnos´c´ CHE (IU/g białka)

x SD p

Kontrola 0,018 ±0,003 –

NaF 0,019 ±0,003 0,631

NaF + kofeina 0,017 ±0,005 0,749

Aktywnos´c´ FA u szczuro´w otrzymuja˛cych NaF w poro´wnaniu z grupa˛ kontrolna˛ wzrosła znamien-nie statystyczznamien-nie, natomiast dodatek kofeiny spowodował spadek FA do jej wartos´ci z grupy kontrol-nej (tab. II).

Jak widac´ z tab. III aktywnos´c´ γ-GT w grupie szczuro´w otrzymuja˛cych NaF wzrosła (wynik nieznamienny statystycznie), a dodatek kofeiny spowodował obniz˙enie znamienne statystycznie aktyw-nos´ci badanego enzymu.

W 1994 r. Chen i Whitford (11) stwierdzili, z˙e kofeina zwie˛ksza ste˛z˙enie jonu fluorkowego w osoczu szczuro´w. Autorzy odkryli, z˙e po 2 godz. od podania F–

w roztworze kofeiny, ste˛z˙enie jonu fluorkowego w osoczu było wyz˙sze niz˙ podawanego w wodzie. Fakt ten skłonił nas do przeprowadzenia niniejszego dos´wiadczenia, w kto´rym podawalis´my szczurom takie same dawki F–_{i kofeiny jak Chen i Whitford,}

spodziewaja˛c sie˛, z˙e wyz˙sze ste˛z˙enie jonu fluorkowego w osoczu mogłoby spowodowac´ wie˛ksza˛ jego kumulacje˛ w wa˛trobie i w konsekwencji uszkodzenie tego narza˛du. Kontrola ste˛z˙enia jono´w

(3)

fluor-T a b e l a II

Aktywnos´c´ fosfatazy alkalicznej w homogenatach wa˛troby szczuro´w T a b l e II

Activity of alkaline phosphatase in rat liver homogenates

Grupa Aktywnos´c´ FA (IU/g białka)

x SD p

Kontrola 1,30 ±0,22 –

NaF 1,67 ±0,29 0,025

NaF + kofeina 1,40 ±0,17 0,522

b T a b e l a III

Aktywnos´c´γ-glutamylotranspeptydazy w homogenatach wa˛troby szczuro´w T a b l e III

Activity ofγ-gluthamylotranspeptydase in rat liver homogenates Grupa Aktywnos´c´γ-GT (IU/g białka)

x SD p

Kontrola 1,94 ±0,98 –

NaF 3,92 ±2,39 0,109

NaF + kofeina 0,74 ±0,47 0,037

kowych w naszym dos´wiadczeniu przeprowadzona w surowicy krwi badanych zwierza˛t nie wykazała jednak zalez˙nosći odkrytej przez Chen’a i Whitford’a, poniewaz˙ ste˛z˙enie jono´w fluorkowych w obecno-sći kofeiny w surowicy było nieznamienne (2). Obserwuja˛c natomiast zmiany FA iγ-GT oznaczane w homogenatach wa˛troby szczuro´w moz˙na poczynic´ ciekawe obserwacje, dotycza˛ce zmian, kto´re miały miejsce w tym narza˛dzie. Jak wiadomo FA obecna w surowicy jest ro´wniez˙ pochodzenia wa˛trobowego (ok. 20%) (12). Jest to enzym kontroluja˛cy hydrolize˛ fosforano´w organicznych. Jego optimum pH wynosi 10, a jego aktywatorami sa˛ Mg(II), Co(II) i Mn(II). Inhibitorami sa˛ natomiast aniony fosforanowe, boranowe, szczawianowe i cyjanki (13). Wzrost jej aktywnosći charakterystyczny jest m.in. dla cholestazy wewna˛trzwa˛trobowej, co wynika z upos´ledzonego wydalania FA przez drogi z˙o´łciowe. Z koleiγ-GT jest enzymem zwia˛zanym z przemiana˛ aminokwaso´w. Katalizuje ona hydrolize˛ peptydo´w do aminokwaso´w lub drobnocza˛steczkowych peptydo´w.γ-GT wydalana jest z ustroju gło´wnie z z˙o´łcia˛. Enzym ten zwia˛zany jest z błonami komo´rkowymi, wyste˛puje gło´wnie w wa˛trobie, nerkach i trzustce. Wzrost aktywnosći tego enzymu jest najcze˛sćiej wskazńikiem cholestazy wewna˛trzwa˛t-robowej, spowodowanej upos´ledzonym wydalaniem enzymu z z˙o´łcia˛. Wydaje sie˛, z˙e w naszym dos´wiadczeniu (w kto´rym oba enzymy FA i γ-GT zwie˛kszały swoja˛ aktywnosć´ w wa˛trobie pod wpływem NaF) doszło do wytworzenia cholestazy wewna˛trzwa˛trobowej. Cholestaze˛ robowa˛ podzielic´ moz˙na na ostra˛, przewlekła˛ i nawracaja˛ca˛ sie˛. Do ostrej cholestazy wewna˛trzwa˛t-robowej, dochodzi po podaniu niekto´rych leko´w, pod wpływem oddziaływania trucizn, czy tez˙ po zakaz˙eniu wirusem (14). Moz˙na przypuszczac´, z˙e NaF w zastosowanej dawce zadziałał jako trucizna i wywołał ostra˛ cholestaze˛ wewna˛trzwa˛trobowa˛ (wzrost aktywnosći FA o 28%, aγ-GT o 102%).

O zmienionej czynnos´ci wa˛troby pod wpływem fluorku sodu donosza˛ Qujeg i wspo´łpr. (15). Autorzy podawali szczurom 10, 20 i 30 mg NaF/kg m.c. dziennie przez 90 dni i stwierdzili statystycznie znamienny wzrost transferazy w surowicy krwi.

Obserwuja˛c jednoczes´nie wyniki aktywnos´ci FA i γ-GT po dodaniu do NaF kofeiny moz˙na stwierdzic´, z˙e powyz˙szy stan (ostra cholestaza wewna˛trzwa˛trobowa) jest „znoszona” przez ten zwia˛zek. Jak wiadomo, kofeina działa hamuja˛co na fosfodiesteraze˛ rozkładaja˛ca˛ cykliczny AMP (cAMP). Powoduje to nagromadzenie cAMP w komo´rce, co aktywuje procesy metaboliczne (4). Warto podkres´lic´, z˙e w naszym dos´wiadczeniu zastosowalis´my dawke˛ „optymalna˛” kofeiny dla człowieka (3 – 6 mg kofeiny/kg m.c./dzien´) (16). Wydaje sie˛ jednak, z˙e dodatek kofeiny wpływa nie tylko korzystnie na organizm szczura, poniewaz˙ w poprzedniej naszej pracy (17) doszlis´my do wniosku, z˙e zaro´wno pod wpływem F–_{jak i F}–_{z kofeina˛ dochodzi u szczuro´w do ogo´lnych zaburzen´ funkcji wa˛troby.}

(4)

zahamowaniem syntezy cholesterolu i triacylogliceroli (F–

i F–

z kofeina˛). Ciekawe wyniki uzyskalis´my w badaniu aktywnosći CHE w surowicy krwi szczura (17). O ile NaF nie spowodował wie˛kszych zmian aktywnosći CHE to dodatek kofeiny spowodował statystycznie znamienny spadek jej aktywnosći w surowicy. Pamie˛tac´ nalez˙y, z˙e na ogo´ł spadek aktywnosći CHE w surowicy wia˛z˙e sie˛ m.in. z uszkodzeniem hepatocyto´w, czego nie nalez˙y w tym przypadku wykluczyc´.

Chen i Whitford (18) badali wpływ ro´z˙nych dawek kofeiny (3, 25 i 100 mg/kg m.c./dobe˛) przez okres

6 tyg. na ro´wnowage˛ metaboliczna˛ i ste˛z˙enie F–_{, wapnia i fosforu w tkankach szczuro´w. Autorzy}

wykazali, z˙e kofeina nie wpływa na wchłanianie, wydzielanie z moczem i ro´wnowage˛ fluorkowa˛ oraz jego ste˛z˙enie w osoczu, szkliwie i kos´ciach.

Reasumuja˛c wyniki naszego eksperymentu nalez˙y podkres´lic´, z˙e aczkolwiek kofeina działa prewen-cyjnie wobec przypuszczalnie ostrej cholestazy wewna˛trzwa˛trobowej, to biora˛c pod uwage˛ jej aktyw-nos´c´ metaboliczna˛ nalez˙ałoby z pewnos´cia˛ ograniczyc´ spoz˙ycie kofeiny.

WNIOSKI

1. NaF w zastosowanej dawce powoduje przypuszczalnie ostra˛ cholestaze˛

wewna˛trzwa˛trobowa˛.

2. Kofeina znosi powyz˙sze działanie NaF.

E. G r u c k a-M a m c z a r, E. B i r k n e r, J. Z a l e j s k a-F i o l k a, T. J a m r o´ z - S z ł a p a THE INFLUENCE OF SODIUM FLUORIDE AND CAFFEINE

ON THE ACTIVITY CHOSEN LIVER ENZYMES IN RATS S u m m a r y

The aim of the study was to investigate the effect of sodium fluoride (NaF) on the activity of liver enzymes, such as: cholinesterase (CHE), alkaline phosphatase (FA) and γ-glutamyltranspeptidase (γ-GT). Eighteen Spraque-Dawley male rats were used in the experiment. The results indicate an increase of FA andγ-GT (during NaF supplementation), which is characteristic of acute intrahepatic phase. Caffeine neutralized the effect that NaF had on rat livers.

PIS

´

MIENNICTWO

1. Enviromental Health Criteria 227 Fluorides. World Health Organization geneva 2002. – 2. Birkner

E., Grucka-Mamczar E., Zalejska-Fiolka J., Chlubek D., Kasperczyk S., Stawiarska-Pie˛ta B., Błaszczyk U.: Influence of sodium fluoride and caf eine on the concentration offluoride ions, glucose and urea of

blood serum and activity of protein metabolism enzymes in rat liver. Biol. Trace Elem. Res., 2006; 113: 1-6. – 3. Birkner E., Grucka-Mamczar E., Z

˙

wirska-Korczala K., Zalejska-Fiolka J., Stawiarska-Pie˛ta B., Kasperczyk S., Kasperczyk A.: Influence of sodium fluoride and caffeine on the kidney function and

free-radical process in that organ in adult rats. Biol. Trace Elem. Res., 2006; 109: 35-47. – 4. Danysz A.,

Kleinrok Z.: Podstawy farmakologii dla lekarzy, farmaceuto´w i studento´w medycyny. (red.) Danysz A.,

Klienrok Z.; Wrocław, Wyd. Volumed 1996; 404-405. – 5. Kolanowski W.: Kawa – charakterystyka i znaczenie zdrowotne. Z

˙

ywnosć´ i z˙ywienie a zdrowie., 1998; 3: 305-309. – 6. Senćzuk W.: Toksykologia. Wyd. Lek. PZWL, Warszawa, 1994; 241-242 i 379-381. – 7. Janus K.: Kofeina jako substancja modelowa słuz˙a˛ca do oceny metabolicznej wydolnosći wa˛troby. Problemy Terapii Monitoro-wanej, 1993; 4(1): 27-31. – 8. Daniel W.A., Syrek M., Ryłko Z., Wo´jcik J.: Effects of antidepressant drugs on the activity of cytochrome P-450 measured by caffeine oxidation in rat liver microsomes. Pol. J. Pharmacol., 2001; 53: 351-357. – 9. Cirksena W., Mitchell G., Samaras G., Wax C.: Fluoride metabolism. Vien: Verlag Wilheln Mandrich., 1980; 145-180. – 10. Lowry O.M., Rosenbrough N.J.,

Forr A.R., Randal R.L.: Protein measurement with Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951; 193:

(5)

11. Chen X., Whitford G.M.: Lack of significant effect of coffee and caffeine on fluoride metabolism in rats. J. Dent. Res., 1994; 73: 1173-1179. – 12. Kokot F., Kokot S.: Badania laboratoryjne. Wyd. Lek. PZWL, Warszawa 2002; 151-152. – 13. Jakubowski Z., Kabata J., Kalinowski L., Szczepan´ska-Konkel

M., Anglieski S.: Badania laboratoryjne w codziennej praktyce. Wyd. V., Gdan´sk 1998; Wyd. Med.

MAK med., 112-113. – 14. Brzozowski R. (red.): Choroby wa˛troby i dro´g z˙o´łciowych. Wyd. Lek. PZWL, Warszawa 1998; 110-111. – 15. Qujeg D., Laghale B., Ghalipour A., Solimani N., Hassenzadeh S.: Effect of sodium fluoride on total serum protein levels and transaminase activity. Biomed. Pharmacot-her., 2002; 56: 169-172. – 16. Magkos F., Kavouras S.A.: Caffeine and ephedrine. Physiological metaboilc and performance – enhancing effects. Sports. Med., 2004; 34: 871-889. – 17.

Grucka-Mamczar E., Birkner E., Zalejska-Fiolka J., Kasperczyk S., Kasperczyk A., Stawiarska-Pie˛ta B., Birkner B., Polaniak R.: Wpływ NaF i kofeiny na aktywnos´c´ wybranych enzymo´w i parametro´w

biochemicz-nych surowicy szczuro´w. Ann. Acad. Med. Siles., 2006; 60: 26-30. – 18. Chen X., Whitford G.M.: Effect of caffeine on fluoride, calcium, and phosphorus metabolism and calcited tissues in the rat. Arch. Oral Biol., 1999; 44: 33-39.