CHARAKTERYSTYKA I ZMIENNOŚĆ ADAPTACYJNA STRUKTUR
BIOFILMU TWORZONEGO PRZEZ STAPHYLOCOCCUS AUREUS
CHARACTERISTIC AND ADAPTIVE VARIABILITY OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS BIOFILM STRUCTURE
ORCID*: 0000-0002-6750-490X | 0000-0002-7559-8903 | 0000-0003-4186-4641 | 0000-0002-6542-2525 | 0000-0002-3034-02631 Sieć Badawcza ŁUKASIEWICZ – PORT Polski Ośrodek Rozwoju Technologii we Wrocławiu 2 Katedra i Zakład Mikrobiologii
Farmaceutycznej i Parazytologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu 3 Regionalny Szpital Specjalistyczny
im. dr. W. Biegańskiego w Grudziądzu 4 Instytut Technologii Chemicznej
Nieorganicznej i Inżynierii Środowiska Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie
} JOANNA CZAJKOWSKA
Sieć Badawcza ŁUKASIEWICZ – PORT Polski Ośrodek Rozwoju Technologii,
ul. Stabłowicka 147, 54-066 Wrocław, e-mail: czajkowskaj@hotmail.com Wpłynęło: 20.06.2019
Zaakceptowano: 03.07.2019 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2019030 *według kolejności na liście Autorów STRESZCZENIE: Gronkowiec złocisty, Staphylococcus aureus, jest jednym z najczęstszych
czynników etiologicznych infekcji szpitalnych. Drobnoustrój ten występuje przede wszystkim w formie biofilmu, czyli społeczności komórek otoczonej zewnątrzkomórkową macierzą (ma-trix), pełniącą funkcję ochronną, strukturalną, regulatorową i odżywczą. W przypadku S. aureus macierz biofilmowa może być tworzona przez lipidy, białka, zewnątrzkomórkowe DNA oraz egzopolisacharydy. Dokładne poznanie składu, struktury i funkcji macierzy biofilmu gronkow-ca złocistego może przyczynić się do opracowania nowych metod zapobiegania i zwalcza-nia infekcji wywoływanych przez ten drobnoustrój. Celem niniejszej pracy jest przegląd naj-nowszych doniesień dotyczących biofilmu S. aureus, ze szczególnym naciskiem na zależności pomiędzy występowaniem określonych typów macierzy zewnątrzkomórkowej a zmiennością adaptacyjną struktury biofilmu.
SŁOWA KLUCZOWE: macierz biofilmowa, Staphylococcus aureus, zmienność adaptacyjna biofilmu ABSTRACT: Staphylococcus aureus is one of the most common etiologic agent of nosocomial infections. These microorganisms predominantly live in a biofilm form. Biofilm is a communi-ty of microorganisms surrounded by extracellular matrix of protective, regulatory and nutritio-nal function. The extracellular polymeric substance secreted by S. aureus may consist of lipids, proteins, extracellular DNA and exopolysaccharides. Thorough knowledge of the structure and function of S. aureus biofilm matrix can lead to development of new method of prevention and treatment of infections caused by this pathogen. The aim of this review is to summarize the ne-west scientific reports on S. aureus biofilm with a special stress put on correlation between di-stinct types of extracellular matrix and within this biofilm structure adaptive variability. KEY WORDS: biofilm adaptation, biofilm matrix, Staphylococcus aureus
WSTĘP
Staphylococcus aureus jest Gram-dodatnią bakterią,
bę-dącą przyczyną licznych zakażeń. W warunkach szpitalnych źródłem infekcji tym drobnoustrojem może być zarówno personel medyczny oraz pacjent, jak i środowisko szpital-ne [48]. Szczepy S. aureus, szczególnie kliniczszpital-ne, charakte-ryzują się wysoką opornością na antybiotyki oraz antysep-tyki. Cecha ta warunkowana jest z jednej strony obecnością specyficznych mechanizmów oporności, a z drugiej zdolno-ścią gronkowców do tworzenia biofilmów, których wielo-warstwowa, reaktywna chemicznie struktura znacznie ob-niża aktywność środków przeciwdrobnoustrojowych. Bio-film jest społecznością drobnoustrojów otoczoną macierzą
zewnątrzkomórkową (ang. extracellular polymeric substan-ce – EPS). Mikroorganizmy żyjąsubstan-ce w tej strukturze zna-cząco różnią się od wolno pływających komórek w formie planktonicznej. Drobnoustroje w biofilmie charakteryzu-ją się między innymi wysoką różnorodnością fenotypową oraz zdolnością do zorganizowanego, wspólnego działania. Biofilm produkowany przez drobnoustroje o znaczeniu kli-nicznym może zawierać w swojej macierzy egzopolisacha-rydy, zewnątrzkomórkowe DNA (ang. extracellular DNA – eDNA), lipidy i białka [6, 19, 43]. Wytwarzanie biofilmu pozwala patogenom rozprzestrzeniać się w nowym środo-wisku oraz przetrwać w już skolonizowanym [15]. Budo-wa oraz mechanizmy zachodzące wewnątrz macierzy ze-wnątrzkomórkowej są gatunkowo zależne [19]. Proces
powstawania biofilmu można podzielić na etapy. Pierwszym z nich jest, w przypadku biofilmów osiadłych, adhezja do powierzchni biotycznej lub abiotycznej, a w przypadku bio-filmów pływających – autoagregacja.
Adhezja komórek jest zależna od grupy białek CWA (ang. cell wall-anchored proteins) zakotwiczonych w ścianie ko-mórkowej. Z reguły rozpoczyna się syntezą należących do nich bakteryjnych powierzchniowych substancji rozpo-znających adhezyjne molekuły macierzy, będącej ruszto-waniem dla komórek eukariotycznych (ang. microbial sur-face components recognizing adhesive matrix molecules – MSCRAMMs). Umożliwiają one kowalencyjne i nieko-walencyjne przyłączenie komórek do tkanki lub powierzch-ni abiotycznych opłaszczonych białkami gospodarza [20]. W przypadku powierzchni abiotycznych proces ten zacho-dzi przy uzacho-dziale odzacho-działywań van der Waalsa oraz elektrosta-tycznych [1]. Następną fazą formowania biofilmu jest aku-mulacja komórek bakteryjnych. U S. aureus można wyróż-nić mechanizmy akumulacji zależne od operonu ica, opar-te na produkcji polisacharydowej adhezyny międzykomór-kowej (PIA), inaczej poli-N-acetylo-β-(1-6)-glukozaminy (PNAG), oraz mechanizmy niezależne od operonu ica. Ope-ron ica jest obecny u większości szczepów S. aureus, a jego transkrypcję kontroluje mechanizm zmienności fazowej [7]. Jest to jeden z procesów adaptacyjnych prowadzących do zmian fenotypowych populacji bakteryjnej, co oznacza, że ekspresja operonu zależy od warunków panujących w śro-dowisku wzrostowym drobnoustrojów [11].
Dojrzewanie to kolejny etap rozwojowy struktury bio-filmu. Obejmuje on proliferację komórek, której towarzy-szą procesy ułatwiające ich agregację, dzięki czemu struk-tura biofilmu zwiększa swoją objętość. Znaczny wzrost bio-masy wymaga zapewnienia dróg transportowych, którymi składniki odżywcze będą docierać do komórek położonych w warstwach podstawnych biofilmu. Rolę taką spełniają ka-naliki wewnątrzbiofilmowe, za których powstanie odpowia-da – nie w pełni jeszcze zbaodpowia-dany – proces regulacyjny zabu-rzający agregację komórek [38]. Umożliwia on zachowanie równowagi pomiędzy przeciwstawnymi procesami prowa-dzącymi do degradacji macierzy (i tworzenia kanałów), od-powiedzialnymi za syntezę nowych cząsteczek egzopolime-ru. Wykazano kluczową rolę w tym zjawisku modulin PSM (ang. phenol-soluble modulins), czyli grupy małych amfi-lowych α-helikalnych monomerycznych peptydów o aktyw-ności surfaktantów [37]. Mają one zdolność agregacji i two-rzenia włókien przypominających strukturą włókna amylo-idowe. Podobnie jak one, PSM są nierozpuszczalne w siar-czanie dodecylu sodu i barwią się przy użyciu markerów specyficznych dla białek amyloidowych [23]. Wykazano, że PSM posiadają właściwości stabilizujące strukturę macierzy biofilmowej [40].
Faza propagacji biofilmu rozpoczyna się od degradacji składników macierzy biofilmowej przez drobnoustroje za
pomocą enzymów: głównie proteaz, nukleaz oraz monome-rycznych PSM [37]. Aktywność tych cząsteczek prowadzi do oderwania się fragmentów macierzy biofilmowej wraz z komórkami bakteryjnymi [47]. Migracja takich agregatów z płynami ustrojowymi (krwią, moczem, chłonką) prowadzi do kolonizacji kolejnych obszarów ciała pacjenta i tym sa-mym do rozprzestrzeniania się zakażenia.
MOLEKULARNE PODSTAWY TWORZENIA
BIOFILMU PRZEZ S. AUREUS
TWORZENIE BIOFILMU POD KONTROLĄ OPERONU
icaABCD
Poly-β-(1,6)-N-acetyloglukozamina (ang. PNAG-β-1-6- -polymer of N-acetyl glucosamine) – określana także mia-nem PIA (ang. polysaccharide intercellular adhesin) – jest głównym egzopolisacharydowym składnikiem macierzy bio-filmowej bakterii z rodzaju Staphylococcus. Jest to liniowy glu-kozoaminoglikan, który uczestniczy w procesie adhezji mię-dzykomórkowej i adhezji drobnoustrojów do powierzch-ni. Pełni także rolę strukturalną oraz ochronną [10]. Synte-za tego polisacharydu jest kontrolowana przez operon ica-"#$% -PDVT ica jest częścią pomocniczego regionu geno-mu, nie występuje zatem u wszystkich szczepów z gatunku
S. aureus [10, 11]. Obecny jest natomiast u większości
szcze-pów gronkowców wywołujących infekcje szpitalne. icaA ko-duje transmembranowy enzym o aktywności N-acetylogluko zaminylotransferazy, biorący udział w syntezie polimeru N--acetyloglukozaminy. Niezbędna do tego jest ekspresja genu
icaD. Gen icaC bierze natomiast udział w transporcie
poli-N--acetyloglukozaminy na powierzchnię komórki bakteryjnej, a produkt genu icaB uczestniczy w deacetylacji tej cząstecz-ki, czyli procesie utrwalającym polimer na powierzchni ko-mórki [27]. Poziom ekspresji locus ica jest zależny od regu-latora locus międzykomórkowej adezyny (icaR), którego ak-tywność modulowana jest przez czynniki SarA i σB. Czynnik SarA jest regulatorowym białkiem wiążącym się z DNA, kon-trolującym ekspresję wielu genów odpowiedzialnych za wiru-lencję u Staphylococcus [3, 8]. Jego związanie się z DNA akty-wuje także transkrypcję genów operonu ica. SarA natomiast aktywowany jest przez czynnik σB w odpowiedzi na stres śro-dowiskowy [64]. Hodowla in vitro oparta na pożywce suple-mentowanej NaCl lub etanolem powoduje aktywację trans-krypcji operonu ica przez operon icaR. Ekspresja lub wycisza-nie genów w obrębie operonu ica są zależne od mechanizmu zmienności fazowej. Inaktywacja genu icaC poprzez insercję sekwencji IS256 prowadzi do powstawania szczepów o feno-typie PIA/PNAG negatywnym [7, 36]. Zatem tzw. wyłączenie genu icaC jest mechanizmem zmiany fazy dla ekspresji PIA/ PNAG. Poziom transkrypcji operonu ica zależy również od
dostępności tlenu w środowisku, tzn. zmniejszona zawartość tego pierwiastka koreluje z indukcją ekspresji PIA [11].
TWORZENIE BIOFILMU NIEZALEŻNE OD OPERONU ica
-JD[OF CBEBOJB OBE NVUBOUBNJ S. aureus z delecją lo-cus ica wykazały, że szczepy mogą tworzyć biofilm w spo-sób niezależny od operonu ica i syntezy PIA/PNAG [4, 12, 13, 18]. Ponadto analiza składu macierzy zewnątrzkomór-kowej dowiodła, że zawiera ona nie tylko polisacharydy, lecz także (między innymi) eDNA, białka i kwasy tejchojo-we. Jednym z czynników wirulencji S. aureus są wzmianko-wane już powierzchniowe białka CWA, kowalencyjnie zwią-zane z peptydoglikanem ściany komórkowej. Ich ekspre-sja determinuje zdolność drobnoustrojów do adhezji do po-XJFS[DIOJ Jڀ JOJDKBDKJ GPSNPXBOJB CJPĕMNV NPHʇ POF UBL˃F pełnić funkcję strukturalną jako komponent macierzy biofil-mowej [13]. U szczepów S. aureus zidentyfikowano 24 biał-ka CWA, a ich ekspresja różni się w zależności od szczepu, fazy wzrostu oraz warunków hodowli [20]. Dokładny prze-bieg szlaków metabolicznych, w których uczestniczą omawia-ne białka, nie jest jeszcze znany, dlatego też ciężko sklasyfiko-wać je według funkcji. Ich obecny podział opiera się na różni-cach i podobieństwach strukturalnych lub zdolności do wią-zania się z określonymi ligandami. Pośród nich można wy-różnić kilka szczególnie istotnych podczas tworzenia biofil-mu. Jedną z grup są wcześniej wspomniane białka wiążące się z macierzą zewnątrzkomórkową, należące do grupy bak-teryjnych powierzchniowych substancji rozpoznających ad-hezyjne molekuły macierzy MSCRAMMs [20]. Należą do nich białka ClfA/B i SdrC oraz FnbpA/B [44]. Ich cechami wspólnymi są: N-terminalna sekwencja sygnałowa Sec, N- -terminalna domena A z dwoma domenami IgG podobnymi Jڀ$UFSNJOBMOBTFLXFODKB-195(SP[QP[OBXBOBQS[F[TPSUB-zę. N-końcowa domena A białka ClfA umożliwia wiązanie fi-brynogenu i fibronektyny. ClfA/B i FnbpA/B w sposób specy-ficzny wiążą białka osocza [46]. Badania funkcji białek FnbpA i B wykazały, że wiążą one fibrynogen, elastynę, fibronekty-nę oraz inicjują formowanie się biofilmu. C-końcowa domena białek FnbpA i B zawiera również rozpoznawany prze sortazę "ڀNPUZX-195( OJF[CʒEOZEPLPXBMFODZKOFHP[XJʇ[BOJB tych białek z peptydoglikanem ściany komórkowej. W części N-terminalnej znajduje się natomiast sekwencja sygnałowa S oraz trzy domeny N1, N2 i N3 [25]. Miejsce wiązania fibry-nogenu i elastyny tworzą domeny N2 i N3, a proces ten za-chodzi zgodnie z mechanizmem indukowanego dopasowa-OJB [XBOZN%-- BOHEPDL MPDL MBUDI<>
W procesie akumulacji biofilmu istotne jest tworzenie od-działywań między komórkami bakteryjnymi, umożliwiają-ce im przyleganie do siebie i tworzenie kolejnych warstw tej struktury. Uczestniczą w tym poszczególne białka z rodzi-ny CWA, między inrodzi-nymi Bap (ang. biofilm-associated pro-tein), białko inicjujące adhezję komórek bakteryjnych do
podłoża oraz umożliwiające im tworzenie oddziaływań mię-dzykomórkowych [12, 63]. Wyróżnić można również biał-ko A mające strukturę trzech alfa-helis, zawierające 6 homo-logicznych domen wiążących przeciwciała IgG, dzięki cze-mu ma ono zdolność do hamowania opsonofagocytozy [29]. Podwyższona ekspresja białka A na powierzchni bakterii in-dukuje proces agregacji. Dzieje się tak na skutek oddziały-wań pomiędzy białkami A znajdującymi się na powierzch-ni dwóch sąsiadujących ze sobą komórek. Białko SasG two-rzy fibryle na powierzchni komórek [9]. Jego funkcją jest łą-czenie ze sobą w fazie akumulacji poszczególnych komórek bakteryjnych [24]. Białko to w swojej strukturze zawiera N- -terminalną domenę A, a następnie liczne tandemowe po-wtórzenia GE [31]. Region odpowiada za udział białka SasG w fazie akumulacji biofilmu [24]. Na podstawie badań kry-stalograficznych domeny G5E stwierdzono, że składa się ona z β-kartek, co powoduje tworzenie się fibryli białkowych na powierzchni komórki [41]. Białka CWA umożliwiają komór-kom S. aureus związanie się do macierzy zewnątrzkomór-komórko- zewnątrzkomórko-wej komórek gospodarza oraz promują oddziaływania mię-dzykomórkowe, inicjując proces dojrzewania biofilmu [34]. Identyfikacja ligandów i miejsc wiążących charakterystycz-nych dla CWA, w tym MSCRAMMs, odpowiedzialcharakterystycz-nych za oddziaływania międzykomórkowe, jest niezbędna w opraco-wywaniu nowych środków mogących skutecznie usuwać doj-rzały biofilm oraz zakłócać jego powstawanie.
W tworzeniu biofilmu na powierzchniach abiotycznych CJPSʇSØXOJF˃VE[JBLXBTZUFKDIPKPXF<>,XBTZUFKDIP-jowe u S. aureus to polimery fosforanu rybitolu, podstawio-ne aminokwasami, na przykład D-alaniną, łączące się z pep-tydoglikanem ściany komórkowej. Obecność D-alaniny jako podstawnika jest warunkiem koniecznym tworzenia biofil-mu, co wykazano w badaniach na mutantach pozbawionych aktywnego operonu dltABCD (odpowiedzialnego za dołą-czanie reszt D-alaniny do kwasów tejchojowych). Powierzch-nia komórek bakteryjnych cechuje się ujemnym ładunkiem w obojętnym pH, czego powodem jest obecność większej ilości grup fosforanowych niż dodatnio naładowanych reszt D-alaniny związanych z kwasami tejchojowymi [60]. Dzię-ki obecności dużej ilości kwasów tejchojowych podstawio-nych D-alaniną ładunek komórek zmienia się w dodatni, co sprawia, że komórki S. aureus mogą przylegać do powierzch-ni ujempowierzch-nie naładowanych lub hydrofobowych, takich jak po-listyren [54]. Mutanty nieposiadające na swej powierzch-ni licznych reszt D-alapowierzch-niny powierzch-nie są zdolne do przylegapowierzch-nia do powierzchni abiotycznych (lub przylegają do nich w sposób ograniczony) [30]. Uzasadnia to podejmowane obecnie pró-by tworzenia powierzchni o określonym ładunku (poziomie hydrofobowości) w celu zmniejszenia zdolności gronkow-ców do osiadania na wykorzystywanych w medycynie im-plantach i hamowania rozwoju biofilmu [30].
W tworzeniu oraz stabilizacji struktury biofilmu S. aureus biorą również udział rozpuszczalne w fenolu moduliny PSM.
Są czynnikiem odpowiedzialnym za wirulencję S. aureus, a ich TUSVLUVSBKFTUOJF[NJFOOBXڀ[BMF˃OPʯDJPET[D[FQV,PEPXBOF są w trzech regionach genomu, przez operony alfa, beta i RNA III, odpowiedzialnych za ekspresję odpowiednio α-psm1-4, β1 oraz hemolizyny delta [65]. Operony te podlegają kontro-li systemu globalnej regulacji genów agr (ang. accessory gene regulator). W celu poznania roli PSM w tworzeniu biofilmu wykonano badania z zastosowaniem technik biologii mole-kularnej. Porównano zdolność do tworzenia biofilmu szcze-pów typu dzikiego oraz mutantów w obrębie genów psm i agr. Analiza wykazała, że PSM są niezbędne do rozwoju biofilmu. Biorą one bezpośredni udział w tworzeniu w jego strukturze kanałów, przez które docierają substancje odżywcze. Ponad-to uczestniczą w dyspersji biofilmu, umożliwiającej agregaPonad-tom komórkowym kolonizację innych obszarów [50].
ROLA eDNA W TWORZENIU BIOFILMU
Jednym z kluczowych składników macierzy biofilmo-wej tworzonej przez liczne gatunki drobnoustrojów jest
zewnątrzkomórkowe DNA [19, 39, 66]. Pełni funkcję struk-turalną oraz zwiększa tolerancję biofilmu na antybiotyki. Dodatkowo jest źródłem genów wykorzystywanych w pro-cesie ich horyzontalnego transferu [16, 28, 35, 39, 42]. eDNA bierze także udział w procesie tworzenia amyloidowych fi-bryli przez PSM [56]. Obecność eDNA w strukturze bio-filmu potwierdzono w badaniach in vitro oraz in vivo, któ-rych wyniki wskazują, że traktowanie biofilmu DNAzą ha-muje jego tworzenie i niszczy strukturę. Dodatkowo zwięk-sza jego wrażliwość na działanie antybiotyków [61]. Mecha-nizm wydzielania eDNA przez komórki bakteryjne nie jest jeszcze dokładnie poznany, jednak badania wskazują, że jest on oparty na procesie autolizy wybranej populacji komórek w obrębie biofilmu (Ryc. 1) [62].
Jest to tak zwana samobójcza śmierć komórki, w której bierze udział hydrolaza mureinowa AtlA [5]. Jest to enzym wydzielany podczas podziału komórkowego, a jego nade-kspresja skutkuje lizą komórki [5]. Utrata aktywności en-zymatycznej AtlA przyczynia się do hamowania procesu tworzenia biofilmu i spadku poziomu wydzielanego DNA [33, 39, 53].
Ryc. 1. Schemat cyklu życia biofilmu gronkowca złocistego objemujący poszczególne etapy. 1. Adhezja do powierzchni biotycznej/abiotycznej, pod-czas której zachodzą zmiany na powierzchni komórek oraz wydzielane są cząsteczki MSCRAMMs ułatwiające tworzenie wiązań z powierzchnią. 2. Faza agregacji komórek i akumulacji masy biofilmu, podczas której tworzona jest struktura biofilmu, w skład której wchodzą cząsteczki polisacharydu PIA/ PNAG, eDNA, moduliny rozpuszczalne w fenolu – PSM, kwasy tejchojowe ściany komórkowej; MSCRAMMs – bakteryjne powierzchniowe substancje rozpoznające adhezyjne molekuły macierzy. 3. Faza dojrzewania, podczas której tworzone są kanały umożliwiające transport składników odżywczych do wnętrza struktur biofilmu. 4. Faza propagacji prowadząca do kolonizacji kolejnych obszarów i rozprzestrzeniania zakażenia.
REGULACJA TWORZENIA BIOFILMU
Przeprowadzono wiele badań genetycznych, mających na celu określenie sposobu kontroli produkcji biofilmu przez gronkowce. Niestety proces ten cechuje się wysokim stop-niem złożoności, a na jego przebieg wpływają liczne czynni-ki, co sprawia, że zachodzić może w sposób odmienny na-wet w obrębie różnych szczepów tego samego gatunku drob-noustroju. Proces ten zależy nie tylko od produkcji substan-cji tworzących biofilm, lecz także od katabolizmu tych sub-stancji przez produkowane enzymy oraz PSM.
Systemy quorum sensing są sposobami komunikacji ko-mórek bakteryjnych, pozwalającymi na regulację istotnych procesów zachodzących wśród danej populacji, takich jak np.: ekspresja czynników wirulencji, tolerancja na stres oksydacyj-ny, oporność na antybiotyki. Systemy te są oparte na cząstecz-kach sygnalizacyjnych zwanych autoinduktorami. Przekrocze-nie progowego poziomu stężenia autoinduktora jest informa-cją dla populacji bakteryjnej o osiągnięciu gęstości (liczebno-ści) odpowiedniej do zainicjowania skoordynowanego czaso-wo działania, co w początkowym etapie przejawia się symulta-niczną modulacją ekspresji określonych genów [67].
Quorum sensing jest także jednym z mechanizmów odpo-wiadających za formowanie i funkcjonowanie biofilmu
u Sta-phylococcus. Jest on kodowany przez locus agr, które zawiera
w sobie dwa operony, P2 i P3, od których zależny jest proces transkrypcji locus RNAII i RNAIII [52]. Transkrypt RNAII obejmuje cztery geny: argA, argB, argC i argD. ArgA i ArgC to dwuskładnikowy system regulatorowy odpowiedzialny za sekrecję zewnątrzkomórkowego peptydu autoinduktora (ang. autoinducing peptide – AIP). ArgA jest czynnikiem trans-krypcyjnym, argC natomiast jest zakotwiczoną w błonie ko-mórkowej kinazą histydynową. ArgB to transbłonowa endo-peptydaza zaangażowana w transport i modyfikację argD, bę-dącego zewnątrzkomórkowym propeptydem AIP. AIP jest li-gandem białka sensorycznego systemu quorum sensing [26,
45, 49]. Transkrypt RNAIII to wewnątrzkomórkowa cząstecz-LBFGFLUPSPXBSFHVMVKʇDBTZTUFN"HS,PEVKFSØXOJF˃HFOhld, odpowiedzialny za ekspresję hemolizyny δ. Reguluje ekspre-sję genów systemu arg. Może również wpływać na ekspreekspre-sję sekrecyjnych czynników wirulencji i powierzchniowych ad-hezyn, takich jak białko A czy białko wiążące fibronektynę. System agr – poprzez zwiększenie produkcji AIP – przyczynia się do wzrostu ekspresji toksyn, proteaz serynowych, DNAz, fibrynolizyny i enterotoksyny [45].
Ważnymi regulatorami produkcji biofilmu u S. aureus są dwuskładnikowe systemy regulacyjne TCS (ang. two-com-ponent system), pośredniczące w odpowiedzi adaptacyjnej na stres, związanej z warunkami panującymi w środowi-sku wzrostu [21]. Jednym z nich jest system ArlRS, działa-jący niezależnie od operonu ica. Bierze on udział w tworze-niu biofilmu oraz w kontroli procesu autolizy komórek bak-teryjnych, wpływając zarazem na ilość wydzielanego eDNA. System GraRS (ang. glycopeptide resistance-associated) ma wpływ na oddziaływania międzykomórkowe oraz proces tworzenia biofilmu w obecności cytrynianu w pożywce ho-dowlanej. Jest również pozytywnym regulatorem ekspresji genu dlt, pośrednio wpływającego na ekspresję kwasów tej-chojowych na powierzchni komórki [58].
#BEBOJB XTLB[VKʇ ˃F TZTUFN SFHVMBDZKOZ 8BM,3 PE-działuje na agregację komórek i proces tworzenia biofilmu. Mutanty z inaktywowanym operonem kodującym system 8BM,3DFDIVKʇTJʒ[BCVS[POʇ[EPMOPʯDJʇEPUXPS[FOJBCJP-filmu i brakiem zdolności do agregacji [17].
,POUSPMʒ OBE UXPS[FOJFN CJPĕMNV TQSBXVKF SØXOJF˃ dwuskładnikowy system regulatorowy – operon lytSR, któ-ry wpływa na aktywność hydrolazy mureiny i zdolność do autolizy. Składnik LytS oddziałuje z LytR, aktywując trans-krypcję genów będących pod jego kontrolą. Celem tego sys-temu regulacji jest operon lrg/cid, który kontroluje śmierć komórkową oraz lizę komórek bakteryjnych podczas two-rzenia biofilmu (Ryc. 2) [55].
Ryc. 2. Powierzchnia biofilmu S. aureus ATCC 6538 obrazowana przy pomocy skaningo-wej mikroskopii elekronoskaningo-wej. Czerwone strzał-ki wskazują komórstrzał-ki ulegające autolizie. Mikro-skop skaningowy ZEISS Auriga 60, powiększe-nie ×10000. Zdjęcie z kolekcji Laboratorium Mi-krobiologii Polskiego Ośrodka Rozwoju Tech-nologii PORT.
METODY ZWALCZANIA BIOFILMU
TWORZONEGO PRZEZ SZCZEPY S. AUREUS
Zdolność drobnoustrojów do tworzenia biofilmu wią-że się bezpośrednio z ich patogenicznością oraz oporno-ścią na dotychczas stosowane metody eradykacji. W lecze-niu infekcji wywoływanych przez biofilm S. aureus niezwy-kle ważne jest jak najszybsze wdrożenie odpowiedniej tera-pii. Jeśli to możliwe, niezbędne jest również natychmiasto-we usunięcie źródła biofilmu, którym może być: szew, cew-nik oraz tkanka martwicza. Ma to na celu zapobieganie roz-przestrzenianiu się infekcji. Równolegle rozpoczyna się an-tybiotykoterapię, która nie zawsze jest skuteczna, co spo-wodowane jest wysoką tolerancją drobnoustrojów w for-mie biofilmu na antybiotyki. Antyseptyki stosowane w era-dykacji biofilmu miejscowo nie mogą być zastosowane ze względu ma lokalizację biofilmu na wszczepach implanto-wanych do jam ciała. Z tego względu istotne jest opracowa-nie nowych terapii, które będą oparte na stosowaniu innych niż antybiotyki (lub antyseptyki) środków przeciwdrobno-ustrojowych, a także metod zapobiegania rozwojowi infek-cji. W ostatnich latach wzrasta liczba infekcji związanych z wprowadzaniem do ciała pacjenta różnego rodzaju bio-materiałów medycznych. Z tego powodu wśród metod za-pobiegawczych można wyróżnić takie, których celem jest uniemożliwienie drobnoustrojom adhezji do powierzchni poprzez stosowanie powłok przeciwporostowych. Do mo-dyfikacji biomateriałów bardzo często wykorzystywany jest glikol polietylenowy – PEG. Polimer ten wiąże na swej po-wierzchni cząsteczki wody, które tworzą barierę fizyczną i energetyczną dla białek wykazujących tendencję do zwią-zania się z powierzchnią, ponadto jego długie łańcuchy po-wodują również ich steryczne odpychanie [59]. Inną stra-tegią jest wykorzystanie powłok antybakteryjnych mają-cych na celu eliminację drobnoustrojów w formie plank-tonicznej, nie dopuszczając do rozwoju formy biofilmowej na powierzchni biomateriału. Wiele z biomateriałów za-wiera nanocząstki oraz ich pochodne, takie jak: srebro, tle-nek srebra, tletle-nek tytanu, krzem, tletle-nek miedzi, tletle-nek cyn-ku, tlenek magnezu, które wykazują właściwości przeciw-drobnoustrojowe. Dokładny mechanizm ich działania nie został dokładnie opisany, jednak właściwości te przypisuje się wolnym jonom metali uwalnianym z powierzchni nano-cząstek oraz powstawaniu reaktywnych form tlenu (RFT), które są toksyczne dla drobnoustrojów [22]. Powłoki nie mogą zmieniać właściwości implantów i urządzeń, do któ-rych produkcji zostaną wykorzystane, oraz nie mogą wyka-zywać cytotoksyczności wobec komórek gospodarza. Uzy-skanie wszystkich tych cech jest procesem niezwykle skom-plikowanym i trudnym do osiągnięcia.Przedstawione wyżej rozwiązania służą jedynie do za-pobiegania infekcjom związanym z obecnością implan-tów, a nie znajdą zastosowania w przypadku zakażeń
rozwijających się w obrębie tkanek pacjenta. W 2018 roku wykazano natomiast możliwość wykorzystania w leczeniu infekcji kości związanych z obecnością biofilmu koniugatów zawierających antybiotyk cyprofloksacynę oraz bisfosfonian – lek, który dzięki wysokiemu powinowactwu do składni-ków mineralnych kości wbudowuje się w strukturę tej tkan-ki. Z kolei cyprofloksacyna, uwalniając się z koniugatu pod wpływem obniżonego pH wywołanego przez drobnoustroje stanu zapalnego, prowadzi do usunięcia mikroorganizmów z powierzchni kostnej. Aktywność tego koniugatu została potwierdzona w badaniach in vitro oraz in vivo [57].
Inną strategią walki z infekcjami wywoływanymi przez biofilm jest zaburzanie już powstałej, dojrzałej struktury biofilmu poprzez – między innymi – penetrację w jej głąb środków przeciwdrobnoustrojowych. W metodach tych wy-korzystywane są enzymy degradujące macierz zewnątrzko-mórkową biofilmu. Obecnie w badaniach nad niszczeniem struktury biofilmu wykorzystywana jest (w zależności bu- EPXZNBDJFS[ZEZTQFSTZOB# %/"[B QSPUFJOB[B, USZQ-syna, rozkładające odpowiednio część tworzoną z: polisa-charydu, zewnątrzkomórkowego DNA oraz białek. Dysper-syna B jest enzymem produkowanym przez
Aggregatibac-ter actinomycetemcomitans, degradującym
poliglukozoami-nę, jeden z głównych składników macierzy zewnątrzkomór-kowej biofilmu [51]. W badaniach in vivo wykazano jej ak-tywność w połączeniu z triklosanem – związkiem o właści-wościach bakteriostatycznych wobec gronkowca złocistego, będącego przyczyną zakażeń związanych z obecnością cew-nika [14]. Jednak w związku z wysokim i zależnym od wie-lu czynników zróżnicowaniem chemicznym oraz struktu-ralnym EPS-u, stosowanie wyżej wymienionych enzymów nie jest skuteczne wobec wszystkich rodzajów biofilmu [2]. Ponadto enzymy te nie są specyficzne wobec komponentów struktury biofilmu i mogą wykazywać aktywność lityczną także wobec tkanek ludzkich.
Ciągły brak dostępności na rynku farmaceutycznym środ-ków skutecznych wobec drobnoustrojów w formie biofil-mu jest bezpośrednią przyczyną prowadzenia szeroko za-krojonych badań skupionych wokół mechanizmów leżących u podstaw powstawania i funkcjonowania biofilmu. Dokład-ne poznanie tych procesów może w przyszłości pozwolić na stworzenie leków, których celem molekularnym będzie jeden (lub wiele) z przedstawionych w tej pracy mechanizmów.
KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.
PIŚMIENNICTWO
1. Abdallah M, Benoliel C, Jama C, Drider D, Dhulster P, Chihib NE. Thermodyna-mic prediction of growth temperature dependence in the adhesion of
Pseu-domonas aeruginosa and Staphylococcus aureus to stainless steel and
polycar-bonate. J Food Prot 2014;77(7):1116–1126.
2. Algburi A, Comito N, Kashtano, D, Dicks LMT, Chikindas ML. Control of biofilm formation: antibiotics and beyond. Appl Environ Microbiol 2017;83(3):1–16.
cus in Staphylococcus aureus. J Bacteriol 1996;178(15):4563–4570.
4. Beenken KE, Dunman PM, McAleese F et al. Global gene expression in
Staphy-lococcus aureus biofilms. J. Bacteriol 2004;186(14):4665–4684.
5. Bose JL, Lehman MK, Fey PD, Bayles KW. Contribution of the Staphylococcus
aureus Atl AM and GL murein hydroase activities in cell division, autolysis, and
biofilm formation. PLoS One 2012;7.
6. Branda SS, Vik Å, Friedman L, Kolter R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Mi-crobiol 2005;13(1):20–26.
7. Brooks JL, Jefferson KK. Phase variation of poly-N-acetylglucosamine expres-sion in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog 2014;10(7):e1004292.
8. Cheung AL, Bayer AS, Zhang G, Gresham H, Xiong YQ. Regulation of virulen-ce determinants in vitro and in vivo in Staphylococcus aureus. FEMS Immunol Med Microbiol 2004;40(1):1–9.
9. Corrigan RM, Rigby D, Handley P, Foster TJ. The role of Staphylococcus
au-reus surface protein SasG in adherence and biofilm formation. Microbiology
2007;153(8):2435–2446.
10. Cramton SE, Gerke C, Schnell NF, Nichols WW, Götz F. The intercellular adhe-sion (ica) locus is present in Staphylococcus aureus and is required for biofilm formation. Infect Immun 1999;67(10):5427–5433.
11. Cramton SE, Ulrich M, Götz F, Döring G. Anaerobic conditions induce expres-sion of polysaccharide intercellular adhesin in Staphylococcus aureus and
Sta-phylococcus epidermidis. Infect Immun 2001;69(6):4079–4085.
12. Cucarella C, Solano C, Valle J, Amorena B, Lasa I, Penades JR. Bap,
a Staphy-lococcus aureus surface protein involved in biofilm formation. J Bacteriol
2001;183(9):2888–2896.
13. Cucarella C, Tormo MA, Ubeda C et al. Role of biofilm-associated prote-in bap prote-in the pathogenesis of bovprote-ine Staphylococcus aureus. Infect Immun 2004;72(4):2177–2185.
14. Darouiche RO, Mansouri MD, Gawande PV, Madhyastha S. Antimicrobial and antibiofilm efficacy of triclosan and DispersinB® combination. J Antimicrob Chemother 2009;64(1):88–93.
15. Davey ME, O’toole GA. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev 2000;64(4):847–867.
16. Dominiak DM, Nielsen JL, Nielsen PH. Extracellular DNA is abundant and im-portant for microcolony strength in mixed microbial biofilms. Environ Micro-biol 2011;13(3):710–721.
17. Dubrac S, Boneca IG, Poupel O, Msadek T. New insights into the WalK/WalR (YycG/YycF) essential signal transduction pathway reveal a major role in con-trolling cell wall metabolism and biofilm formation in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol 2007;189(22):8257–8269.
18. Fitzpatrick F, Humphreys H, O’Gara JP. Evidence for icaADBC-independent bio-film development mechanism in methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical isolates. J Clin Microbiol 2005;43(4):1973–1976.
19. Flemming HC, Wingender J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol 2010;8(9):623–633.
20. Foster TJ, Geoghegan JA, Ganesh VK, Höök M. Adhesion, invasion and evasion: the many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus. Nat Rev Microbiol 2014;12(1):49–62.
21. Fournier B, Hooper DC. A new two-component regulatory system involved in adhesion, autolysis, and extracellular proteolytic activity of Staphylococcus
au-reus. J Bacteriol 2000;182(14):3955–3964.
22. Francolini I, Vuotto C, Piozzi A, Donelli G. Antifouling and antimicrobial bioma-terials: an overview. APMIS 2017;125(4):392–417.
23. Gebbink MF, Claessen D, Bouma B, Dijkhuizen L, Wösten HA. Amyloids – a functional coat for microorganisms. Nat Rev Microbiol 2005;3(4):333–341. 24. Geoghegan JA, Corrigan RM, Gruszka DT et al. Role of surface protein SasG in bio-film formation by Staphylococcus aureus. J Bacteriol 2010;192(21):5663–5673. 25. Geoghegan JA, Monk IR, O’Gara JP, Foster TJ. Subdomains N2N3 of
fibro-nectin binding protein a mediate Staphylococcus aureus biofilm forma-tion and adherence to fibrinogen using distinct mechanisms. J Bacteriol 2013;195(11):2675–2683.
26. George EA, Muir TW. Molecular mechanisms of agr quorum sensing in virulent staphylococci. Chembiochem 2007;8(8):847–855.
27. Gerke C, Kraft A, Süßmuth R, Schweitzer O, Götz F. Characterization of the N- -acetylglucosaminyltransferase activity involved in the biosynthesis of the
Staphylococcus epidermidis polysaccharide intercellular adhesin. J Biol Chem
1988;273:18586–18593.
28. Gloag ES, Turnbull L, Huang A et al. Self-organization of bacterial biofilms is fa-cilitated by extracellular DNA. Proc Natl Acad Sci 2013;110(28):11541–11546. 29. Graille M, Stura EA, Corper AL et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus
protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibo-dy: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activi-ty. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97(10):5399–5404.
ge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect Immun 2001;69(5):3423–3426.
31. Gruszka DT, Wojdyla JA, Bingham RJ et al. Staphylococcal biofilm-for-ming protein has a contiguous rod-like structure. Proc Natl Acad Sci 2012;109(17):E1011–E1018.
32. Heilmann C, Hussain M, Peters G, Götz F. Evidence for autolysin-mediated pri-mary attachment of Staphylococcus epidermidis to a polystyrene surface. Mol Microbiol 1997;24(5):1013–1024.
33. Houston P, Rowe SE, Pozzi C, Waters EM, O’Gara JP. Essential role for the major autolysin in the fibronectin-binding protein-mediated Staphylococcus aureus biofilm phenotype. Infect Immun 2011;79(3):1153–1165.
34. Josefsson E, Hartford O, O’Brien L, Patti JM, Foster T. Protection against experi-mental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A, a novel virulence determinant. J Infect Dis 2001;184(12):1572–1580. 35. Kiedrowski MR, Kavanaugh JS, Malone CL et al. Nuclease modulates biofilm
formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus
au-reus. PLoS One 2011;6.
36. Kiem S, Oh WS, Peck KR et al. Phase variation of biofilm formation in
Staphylo-coccus aureus by IS 256 insertion and its impact on the capacity adhering to
polyurethane surface. J Korean Med Sci 2004;19(6):779–782.
37. Le KY, Dastgheyb S, Ho TV, Otto M. Molecular determinants of staphylococ-cal biofilm dispersal and structuring. Front Cell Infect Microbiol 2014;4:167. 38. Lister JL, Horswill AR. Staphylococcus aureus biofilms: recent developments in
biofilm dispersal. Front Cell Infect Microbiol 2010;4:178.
39. Mann EE, Rice KC, Boles BR et al. Modulation of eDNA release and degradation affects Staphylococcus aureus biofilm maturation. PLoS One 2009;4(6):e5822. 40. Marinelli P, Pallares I, Navarro S, Ventura S. Dissecting the contribution of
Sta-phylococcus aureus α-phenol-soluble modulins to biofilm amyloid structure.
Sci Rep 2016;6:34552.
41. Merino N, Toledo-Arana A, Vergara-Irigaray M et al. Protein A-mediated mul-ticellular behavior in Staphylococcus aureus. J Bacteriol 2009;191(3):832–843. 42. Molin S, Tolker-Nielsen T. Gene transfer occurs with enhanced efficiency in
biofilms and induces enhanced stabilisation of the biofilm structure. Curr Opin Biotechnol 2003;14(3):255–261.
43. Montanaro L, Poggi A, Visai L et al. Extracellular DNA in biofilms. Int J Artif Or-gans 2011;34(9):824–831.
44. Ní Eidhin D, Perkins S, Francois P, Vaudaux P, Hook M, Foster TJ. Clumping fac-tor B (ClfB), a new surface-located fibrinogen-binding adhesin of
Staphylococ-cus aureus. Mol Microbiol 1988;30(2):245–257.
45. Novick RP. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphy-lococcal virulence. Mol Microbiol 2003;48(6):1429–1449.
46. O’Connell DP, Nanavaty T, McDevitt D, Gurusiddappan S, Höök M, Foster TJ. The fibrinogen-binding MSCRAMM (clumping factor) of Staphylococcus aureus has a Ca 2+-dependent inhibitory site. J Biol Chem 1988;273(12):6821–6829. 47. Otto M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation
and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu Rev Med 2013;64:175–188.
48. Otto M. Staphylococcus colonization of the skin and antimicrobial peptides. Expert Rev Dermatol 2010;5(2):183–195.
49. Peng HL, Novick RP, Kreiswirth B, Kornblum J, Schlievert P. Cloning, characteri-zation and sequencing of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus
aureus. J Bacteriol 1988;170(9):4365–4372.
50. Periasamy S, Joo HS, Duong AC et al. How Staphylococcus aureus biofilms deve-lop their characteristic structure. Proc Natl Acad Sci U S A 2012;109(4):1281–1286. 51. Ramasubbu N, Thomas LM, Ragunath C, Kaplan JB. Structural analysis of di-spersin B, a biofilm-releasing glycoside hydrolase from the periodontopatho-gen Actinobacillus actinomycetemcomitans. J Mol Biol 2005;349(3):475–486. 52. Recsei P, Kreiswirth B, O’Reilly M, Schlievert P, Gruss A, Novick RP. Regulation
of exoprotein gene expression in Staphylococcus aureus by agr. Mol Gen Ge-net 1086;202(1):58–61.
53. Rice KC, Mann EE, Endres JL et al. The cidA murein hydrolase regulator contri-butes to DNA release and biofilm development in Staphylococcus aureus. Proc Natl Acad Sci 2007;104(19):8113–8118.
54. Rijnaarts HHM, Norde W, Bouwer EJ, Lyklema J, Zehnder AJB. Reversibili-ty and mechanism of bacterial adhesion. Colloids Surfaces B: Biointerfaces 1995;4(1):5–22.
55. Sadykov MR, Bayles KW. The control of death and lysis in staphylococ-cal biofilms: a coordination of physiologistaphylococ-cal signals. Curr Opin Microbiol 2012;15(2):211–215.
56. Schwartz K, Ganesan M, Payne DE, Solomon MJ, Boles BR. Extracellular DNA facilitates the formation of functional amyloids in Staphylococcus aureus bio-films. Mol Microbiol 2016;99(1):123–134.
luation of a novel bone-targeting bisphosphonate-ciprofloxacin conjugate for the treatment of osteomyelitis biofilms. J Med Chem 2017;60(6):2326–2343. 58. Shanks RMQ, Meehl MA, Brothers KM et al. Genetic evidence for an alternative
citrate-dependent biofilm formation pathway in Staphylococcus aureus that is dependent on fibronectin binding proteins and the grars two-component re-gulatory system. Infect Immun 2008;76(6):2469–2477.
59. Skovdal SM, Jørgensen NP, Petersen E et al. Ultra-dense polymer brush coating reduces Staphylococcus epidermidis biofilms on medical implants and impro-ves antibiotic treatment outcome. Acta Biomater 2018;76:46–55.
60. Sonohara R, Muramatsu N, Ohshima H, Kondo T. Difference in surface proper-ties between Escherichia coli and Staphylococcus aureus as revealed by electro-phoretic mobility measurements. Biophys Chem 1995;55(3):273–277. 61. Tetz GV, Artemenko NK, Tetz VV. Effect of DNase and antibiotics on biofilm
cha-racteristics. Antimicrob Agents Chemother 2009;53(3)1204–1209.
Organs 2009;32(9):537–544.
63. Valle J, Latasa C, Gil C et al. Bap, a biofilm matrix protein of Staphylococcus
au-reus prevents cellular internalization through binding to GP96 host receptor.
PLoS Pathog 2012;8.
64. Valle J, Toledo-Arana A, Berasain C et al. SarA and not sigmaB is essen-tial for biofilm development by Staphylococcus aureus. Mol Microbiol 2003;48(4):1075–1087.
65. Wang R, Braughton KR, Kretschmer D et al. Identification of novel cytolytic peptides as key virulence determinants for community-associated MRSA. Nat Med 2007;13(12):1510–1514.
66. Whitchurch CB, Tolker-Nielsen T, Ragas PC, Mattick JS. Extracellular DNA requ-ired for bacterial biofilm formation. Science 2002;295(5559):1487.
67. Yarwood JM, Bartels, DJ, Volper EM, Greenberg EP. Quorum sensing in
