Artyku³ przegl¹dowy Review
W³aciwy przebieg oogenezy oraz follikulogenezy jest jednym z najwa¿niejszych etapów wp³ywaj¹cych na formowanie zdolnego do rozwoju zarodka. U ssa-ków, pojedyncze komórki jajowe ró¿ni¹ siê znacznie pod wzglêdem zdolnoci do zap³odnienia oraz pó-niejszego rozwoju zarodka. Proces ró¿nicowania siê komórki jajowej do opisywanej wy¿ej struktury wy-maga uruchomienia wielu przemian biochemicznych, molekularnych oraz komórkowych, które s¹ okrela-ne jako kompetencja-potencja³ rozwojowy (develop-mental competence). Termin ten obejmuje przemiany,
jakie zachodz¹ w komórce jajowej, które wiadcz¹ o jej zdolnoci do dojrzewania, zap³odnienia, osi¹g-niêcia stadium blastocysty, implantacji oraz narodzin zdrowego potomstwa (11). Techniki wspomaganego rozrodu u zwierz¹t, pos³uguj¹c siê metodami moleku-larnymi jak transkryptomika czy proteomika umo¿-liwiaj¹ dok³adne okrelenie kompetencji rozwojowej. Niestety, z uwagi na ich wysok¹ inwazyjnoæ w sto-sunku do analizowanego materia³u biologicznego nie mog¹ byæ stosowane jako jeden z elementów uzupe³-niaj¹cych techniki wspomaganego rozrodu u zwierz¹t. Z uwagi na brak mo¿liwoci powtórnego wykorzysta-nia badanych komórek wci¹¿ poszukuje siê nowych
Czynniki warunkuj¹ce potencja³ rozwojowy
oocytów ssaków w wietle badañ molekularnych
i mikrofluidycznych*
)
BARTOSZ KEMPISTY, HANNA PIOTROWSKA*, RAFA£ WALCZAK**,
PATRYCJA NIADEK**, JAN DZIUBAN**, DOROTA BUKOWSKA***, PAWE£ ANTOSIK***, MARTA JACKOWSKA***, MAGDALENA WONA***, JÊDRZEJ M. JAKOWSKI***
Katedra i Zak³ad Histologii i Embriologii Wydzia³u Lekarskiego II UM, ul. wiêcickiego 6, 60-781 Poznañ *Katedra Toksykologii Wydzia³u Farmaceutycznego UM w Poznaniu, ul. Dojazd 30, 60-631 Poznañ
**Zak³ad Mikroin¿ynierii i Fotowoltaiki Wydzia³u Elektroniki Mikrosystemów i Fotoniki PWr., ul. Zygmunta Janiszewskiego 11/17, 50-372 Wroc³aw
***Katedra Weterynarii Wydzia³u Hodowli i Biologii Zwierz¹t UP, ul. Wojska Polskiego 52, 60-628 Poznañ
Kempisty B., Piotrowska H., Walczak R., niadek P., Dziuban J., Bukowska D., Antosik P., Jackowska M., Wona M., Jakowski J. M.
Factors with an influence on mammalian oocytes developmental potential in light of molecular and microfluidic research
Summary
Several morphological, molecular and cellular changes lead to the differentiation of primordial germ cells (PGC) into gametes, eggs and spermatozoa. This process is followed by the migration of these cells to gonads and several cell division cycles (mitotic and meiotic) as well as cell differentiations where these cells are changed into fully mature gametes. The process of gametes maturation is composed of several stages of specific biochemical changes that include changes in the nucleus as well as the changes in oocytes cytoplasm. The main factor which determines the formation of the developmental competence of oocytes is the long stage of mRNA and proteins storage (cytoplasmic maturation) that plays the main role in the blastocyst formation process.
In this article selected issues associated with the regulation of each of the stages of oocytes differentiation as well as their influence of selected factors such as follicular size or formation of oocytes transcriptome have been presented. Moreover, a new-noninvasive system of oocytes/embryos quality assessment by using microfluidic techniques was presented.
Keywords: lab-on-chip, oocytes quality, oocytes developmental potential
*) Praca finansowana przez Uniê Europejsk¹ z Europejskiego Funduszu
ma³o inwazyjnych lub nieinwazyjnych metod umo¿-liwiaj¹cych okrelenie potencja³u rozrodczego gamet i zarodków (18).
Charakterystyka pierwotnych komórek linii p³ciowej (primordial germ cells, PGC)
Komórki linii p³ciowej zapewniaj¹ utrwalenie zró¿-nicowanej informacji genetycznej przekazywanej na-stêpnym pokoleniom na skutek zap³odnienia. Podczas rozwoju organizmu wielokomórkowego powstaj¹ pier-wotne komórki linii p³ciowej (primordial germ cells), które podczas wielu podzia³ów ró¿nicuj¹ siê w plem-niki oraz komórki jajowe. Proces ten wymaga urucho-mienia szeregu mechanizmów komórkowych i moleku-larnych, które staj¹ siê nastêpnie podstaw¹ zdolnoci do rozrodu, rozwoju oraz dziedziczenia i utrwalania wybranych cech. W literaturze opisywane s¹ dwie dro-gi, które prowadz¹ do wykszta³cenia w pe³ni wyspe-cjalizowanych komórek p³ciowych. Pierwsza z nich, okrelana jako preformation zak³ada, ¿e komórki zarodkowe dziedzicz¹ informacjê genetyczn¹ z komór-ki jajowej. Druga teoria, okrelana jako epigeneza wskazuje, ¿e formowanie pluripotentnej komórki od-bywa siê we wczesnych stadiach rozwoju na skutek sygna³ów dostarczanych z otaczaj¹cych tkanek, któ-rych efektem jest powstanie komórki linii p³ciowej. Badania Saitou i wsp. (33) wykaza³y, ¿e formowanie komórek p³ciowych u myszy oraz, jak siê sugeruje, u wiêkszoci ssaków, odbywa siê na drodze epigene-zy. Interesuj¹ce jest, ¿e w przypadku obu tych teorii zahamowanie indukcji programu somatycznego wy-daje siê kluczowym momentem w tym procesie (33). Jednak¿e sygna³y molekularne kieruj¹ce tym proce-sem s¹ ró¿ne w poszczególnych grupach organizmów (13, 34). Wykazano tak¿e, ¿e proces ró¿nicowania siê komórek PGC jest cile regulowany ze strony kon-serwatywnych mechanizmów molekularnych, wp³ywa-j¹cych na ich proliferacjê, prze¿ywalnoæ oraz rozwój, co stanowi dowód na wysok¹ specyficznoæ tych me-chanizmów u wszystkich gatunków ssaków. Procesy te w znacznym stopniu wp³ywaj¹ na zdolnoæ zarod-ków do aktywacji genomu zarodkowego, osi¹gniêcia stadium blastocysty oraz skutecznej implantacji (13, 34).
Istniej¹ wyniki badañ sugeruj¹ce, ¿e follikulogeneza jest etapem, który wydaje siê kluczowym w osi¹ganiu przez komórki jajowe pe³nego potencja³u rozwojowe-go (12). Przyk³adem terozwojowe-go jest fakt, ¿e oocyty izolowane z pêcherzyków preantralnych s¹ niezdolne do dokoñ-czenia podzia³u mejotycznego po zatrzymaniu w pro-fazie I, natomiast te pozyskiwane z bardzo ma³ych pê-cherzyków antralnych (u byd³a < 0,9 mm) s¹ zdolne do wejcia w metafazê I. Komórki jajowe pochodz¹ce z du¿ych pêcherzyków antralnych osi¹gaj¹ stadium me-tafazy II (14, 26, 29, 30). Ponadto, oocyty o bardzo zbli¿onej budowie morfologicznej izolowane z du¿ych pêcherzyków antralnych s¹ zdolne do dokoñczenia eta-pu dojrzewania j¹drowego oraz skutecznego
zap³od-nienia. Wykazuj¹ jednoczenie znaczne ró¿nice w zdol-noci do osi¹gniêcia stadium blastocysty (5, 14, 22, 26, 29, 30). Wiele badañ wskazuje na istnienie trzech hipotez wyjaniaj¹cych niewidoczne morfologicznie ró¿nice w kompetencji rozwojowej oocytów. Pierw-sza z nich wskazuje na przyczyny tych procesów w po-jawiaj¹cych siê uszkodzeniach DNA, w³¹czaj¹c w to mitochondrialny DNA (10). Druga obrazuje zmiany epigenetyczne skutkuj¹ce niew³aciwym imprintin-giem, trzecia natomiast odnosi siê do zgromadzenia w komórce jajowej niewystarczaj¹cej iloci czynników cytoplazmatycznych (mRNA oraz bia³ka), które skut-kuj¹ brakiem zdolnoci do dokoñczenia etapu dojrze-wania cytoplazmatycznego. Wysoce specyficzne zmia-ny genetyczne i epigenetyczne s¹ trudne do analizo-wania w aspekcie globalnym, dlatego te¿ wiêkszoæ prowadzonych badañ skupia siê na czynnikach cyto-plazmatycznych (15, 28). Z uwagi na trudnoæ w do-stêpie do du¿ej iloci materia³u, rzadko wykonuje siê analizy proteomiczne. Zmiany o charakterze moleku-larnym identyfikuje siê w formie zmian w transkryp-tomie komórki jajowej. W wielu opracowaniach wska-zuje siê na istnienie markerów mRNA kompetencji rozwojowej oocytów.
Rola wybranych markerów mRNA oraz wielkoci pêcherzyków jajnikowych w okrelaniu kompetencji rozwojowej oocytów Jednym z czynników powi¹zanych z kompetencj¹ rozwojow¹ oocytów bydlêcych jest wielkoæ pêche-rzyków jajnikowych (14, 16, 23, 26, 30). Przytoczone wyniki badañ wskazuj¹ jednoznacznie, ¿e odsetek za-rodków, które osi¹gaj¹ stadium blastocysty jest zna-cz¹co wy¿szy w przypadku, gdy oocyty izolowane s¹ z pêcherzyków wiêkszych ni¿ 5 mm, w porównaniu do pêcherzyków ma³ych, o rozmiarach 2-3 mm. Udo-wodniono, ¿e zarodki osi¹gaj¹ce stadium 8-komórko-we, po aktywacji genomu zarodkowego (embryonic genome activation, EGA), na podstawie przeprowa-dzonych badañ z w³¹czaniem 3H-urydyny, posiadaj¹ wyciszon¹ maszyneriê transkrypcyjn¹ (9, 14, 35). Tak wiêc s³usznym wydaje siê stwierdzenie, ¿e gro-madzony w oocytach materia³ matczyny w postaci zmagazynowanego mRNA jest jednym z g³ównych markerów okrelaj¹cych kompetencjê rozwojow¹ tych komórek. Najczêciej wymienianymi markerami mRNA potencja³u rozwojowego oocytów s¹ geny ko-duj¹ce czynniki transkrypcyjne, jak: Oct4, Msx1, bia³-ko o strukturze palców cynbia³-kowych (Znf198), bia³bia³-ko wi¹¿¹ce histony (SLBP), cyklina A, bia³ko szoku ciepl-nego 40/DNA-J (Dja4), bia³ko interreaguj¹ce z NEDD4 (NDFIP1), kompleks 3 bia³ek transportuj¹cych (Trappc) oraz bia³ko GDF9. Wród wymienionych wy¿ej ge-nów, czynniki transkrypcyjne, uczestnicz¹ce w regu-lacji syntezy RNA, wydaj¹ siê pe³niæ istotn¹ rolê w ma-gazynowaniu odpowiedniej iloci RNA w dojrza³ych oocytach, wp³ywaj¹c tym samym na uzyskiwanie przez te komórki kompetencji. Geny koduj¹ce bia³ka
zaan-ga¿owane w regulacjê procesu podzia³u komórkowe-go, jak cyklina A, w sposób znacz¹cy wp³ywaj¹ na aktywacjê genomu zarodkowego. W podobnych ba-daniach Mourot i wsp. (27) oraz Robert i wsp. (31) wskazuj¹ na istotn¹ rolê kolejnych transkryptów w osi¹-ganiu przez oocyty bydlêce zdolnoci do dojrzewania i aktywacji genomu zarodkowego. Ponadto Mourot i wsp. (27) okrelili wp³yw na te procesy takich czyn-ników, jak: wielkoæ pêcherzyków jajnikowych oraz po¿ywki wzbogaconej o FSO. Wykazano równie¿ zna-cz¹cy wp³yw wielkoci pêcherzyków na ekspresjê ko-lejnych regulatorów cyklu komórkowego, jak: PTTG1 oraz CCNB2. Udowodniono nastêpnie zwi¹zek eks-presji tych genów z wzrastaj¹c¹ kompetencj¹ rozwo-jow¹ oocytów oraz stymulacjê ich ekspresji podczas wczesnych podzia³ów blastomerów zarodkowych (27). Lonergan i wsp. (25) wykazali, ¿e zarodki we wczes-nych stadiach podzia³owych charakteryzuj¹ siê bardzo wysokim potencja³em rozwojowym. Bior¹c pod uwa-gê, ¿e wymienione wy¿ej geny stanowi¹ jedynie nie-liczn¹ frakcjê wszystkich czynników uczestnicz¹cych w procesie kszta³towania siê kompetencji rozwojowej oocytów, sugeruje siê, ¿e proces ten jest regulowany ma³ymi ilociowymi zmianami RNA wielu genów. Tak wiêc wydaje siê s³usznym, ¿e pe³ne okrelenie kompetencji rozwojowej oocytów wymaga analizy, pos³uguj¹c siê mikromacierzami ekspresyjnymi cDNA, ca³ego transkrypomu komórek o zró¿nicowanym po-tencjale rozwojowym (25).
Podobne badania, w których zwierzêciem modelo-wym by³y winie, odnosz¹ce siê do wp³ywu wielkoci pêcherzyków jajnikowych na ekspresjê wybranych genów, zosta³y przeprowadzone przez Antosika i wsp. (1). W badaniach tych analizowano ekspresjê genów koduj¹cych bia³ka odpowiedzialne za zdolnoæ oocy-tów do zap³odnienia, jak: glikoproteiny os³onki przej-rzystej (pZP1, pZP2, pZP3, pZP3 á) oraz integryny (ITGB2, ITGB3). Wyniki przeprowadzonych analiz wskazuj¹, ¿e wielkoæ pêcherzyków jajnikowych, z ja-kich pozyskiwane by³y oocyty, w znacznym stopniu wp³ywaj¹ na ekspresjê badanych genów. Najwy¿sz¹ ekspresjê zarówno mRNA, jak i bia³ka wykazano w oocytach pochodz¹cych z du¿ych pêcherzyków (> 5 mm), w porównaniu do rednich (3-5 mm) oraz ma³ych (< 3 mm). Sugeruje siê tym samym, ¿e wiel-koæ pêcherzyków jajnikowych wp³ywa nie tylko, jak wskazywano dotychczas, na zdolnoæ oocytów do dojrzewania czy osi¹gniêcia kompetencji rozwojowej, ale i na zdolnoæ tych komórek do zap³odnienia, cze-go porednim dowodem jest ekspresja genów odpo-wiedzialnych za ten proces (1).
Caixeta i wsp. (7) analizowali wp³yw wielkoci pêcherzyków jajnikowych na ekspresjê wybranych genów, bêd¹cych potencjalnymi markerami kompeten-cji rozwojowej oocytów. Badaniom molekularnym poddano takie geny, jak: H1Foo, H2A, H3A, GHR, GDF9, BMP15, OOSP1, których ekspresjê analizo-wano w oocytach oraz FSHR, EGFR, GHR, PTX3,
IGFII w komórkach wzgórka jajononego. Wykaza-no, ¿e odsetek uzyskiwanych blastocyst by³ znacz¹co wy¿szy w przypadku oocytów pozyskiwanych z pê-cherzyków wiêkszych ni¿ 6 mm. Ponadto ekspresja mRNA H2A wzrasta³a wraz z wielkoci¹ ków (wy¿sza w oocytach pochodz¹cych z pêcherzy-ków ³ 8 mm, w porównaniu do pêcherzypêcherzy-ków < 6 mm). Podobnie ekspresja mRNA FSHR, EGFR i GHR by³a zale¿na od wielkoci pêcherzyków, z jakich izolowa-ne by³y oocyty. Wykazano tym samym, ¿e poziom mRNA H2A jest zale¿ny od wielkoci pêcherzyków jajnikowych oraz gen ten mo¿e byæ uznany za marker w okrelaniu kompetencji rozwojowej komórek jajo-wych (7).
Badania Rosen i wsp. (32) polega³y na wykazaniu zale¿noci pomiêdzy wielkoci¹ pêcherzyków jajni-kowych u kobiet a zdolnoci¹ oocytów do dojrzewa-nia, zap³odnienia oraz zarodków do rozwoju. Wyniki przeprowadzonych analiz wskazuj¹ na znacz¹co ob-ni¿aj¹c¹ siê zdolnoæ do dojrzewania w przypadku oocytów izolowanych z ma³ych pêcherzyków jajniko-wych. Podobnie odsetek zap³odnionych oocytów by³ ni¿szy o 28% w odniesieniu do komórek pochodz¹-cych z pêcherzyków jajnikowych o wielkoci 16-18 mm. Ponadto procent polispermii wzrasta³ wraz z ob-ni¿aj¹c¹ siê wielkoci¹ pêcherzyków jajnikowych. Wielkoæ pêcherzyków jajnikowych nie wp³ywa³a na liczbê komórek zarodkowych, aczkolwiek znaczn¹ fragmentacjê cytoplazmy tych komórek odnotowano w przypadku, gdy zarodki te pochodzi³y z oocytów izolowanych z ma³ych pêcherzyków (32). Przytoczo-ne wyniki badañ sugeruj¹, ¿e oocyty pochodz¹ce z ma³ych pêcherzyków jajnikowych mog¹ osi¹gaæ stadium metafazy II oraz byæ skutecznie zap³odnione, jednak¿e procent uzyskiwanych prawid³owych zarod-ków jest znacznie obni¿ony w odniesieniu do grupy komórek pozyskiwanych z du¿ych pêcherzyków jaj-nikowych.
Osi¹gniêcie przez oocyty pe³nej kompetencji roz-wojowej jest uzale¿nione od zdolnoci tych komórek do dojrzewania (6). Jednym z g³ównych czynników warunkuj¹cych prawid³owy przebieg tego procesu jest w³aciwa komunikacja pomiêdzy komórkami wzgórka jajononego a oocytem. Szlak komunikacji pomiêdzy komórkami somatycznymi a gamet¹ regulowany jest obecnoci¹ po³¹czeñ typu gap junction. Sugeruje siê, ¿e po³¹czenia te odgrywaj¹ kluczow¹ rolê w z³o¿onym procesie osi¹gania przez oocyty pe³nej kompetencji rozwojowej. Szlak komunikacji pomiêdzy komórka-mi somatycznykomórka-mi a komórk¹ jajow¹ jest regulowany poprzez specyficzne bia³ka, tworz¹ce strukturê gap junction, nale¿¹cych do grupy koneksyn (conexins, Cx), (g³ównie jest to koneksyna 43, 45 i 37) oraz kinaz zale¿nych od cylin (cyclin dependent kinases, Cdk) (3, 4, 24). Jednak¿e w pimiennictwie brak by³o dotychczas informacji odnosz¹cych siê do zwi¹zku pomiêdzy wielkoci¹ pêcherzyków jajnikowych a eks-presj¹ wybranych bia³ek tworz¹cych strukturê gap
junc-tion. Zagadnienie to sta³o siê przedmiotem badañ Anto-sika i wsp. (4). Wykorzystuj¹c model wiñski, analizo-wano ekspresjê bia³ek Cx43 oraz Cdk4 w oocytach izolowanych z du¿ych (> 5 mm), rednich (3-5 mm) oraz ma³ych (< 3 mm) pêcherzyków jajnikowych. Wyniki analiz ekspresji bia³ka wykaza³y wy¿szy jej poziom w przypadku bia³ka Cdk4 w oocytach izolo-wanych z du¿ych pêcherzyków w odniesieniu do red-nich oraz ma³ych. Nie wykazano natomiast ró¿nic w ekspresji Cx43 pomiêdzy trzema analizowanymi grupami komórek. Badania z wykorzystaniem mikro-skopii konfokalnej wskazywa³y na ró¿n¹ lokalizacjê bia³ka Cdk4 w zale¿noci od wielkoci pêcherzyków jajnikowych, z jakich pozyskiwane by³y oocyty. Bia³-ko Cdk4 wykazywa³o wyran¹ lokalizacjê b³onow¹ oraz w os³once przejrzystej w przypadku komórek ja-jowych izolowanych z du¿ych pêcherzyków, natomiast jego lokalizacja i ekspresja cytoplazmatyczna by³a szczególnie widoczna w przypadku komórek pocho-dz¹cych z pêcherzyków rednich oraz ma³ych. Auto-rzy sugeruj¹, ¿e ró¿na lokalizacja bia³ka Cdk4 w oocy-tach pozyskiwanych z pêcherzyków jajnikowych ró¿-nej wielkoci mo¿e wskazywaæ na istnienie specyficz-nego mechanizmu translokacji tego bia³ka pomiêdzy b³on¹ komórkow¹, os³onk¹ przejrzyst¹ a cytoplazm¹ oraz ¿e mechanizm ten podlega regulacji ze strony w³anie tego parametru. Ponadto wykazano wy¿sz¹ ekspresjê obydwu analizowanych bia³ek w oocytach po dojrzewaniu in vitro (in vitro maturation, IVM) w od-niesieniu do komórek przed hodowl¹, co wskazuje, ¿e ró¿na ekspresja Cx43 i Cdk4 w komórkach niedoj-rza³ych oraz dojniedoj-rza³ych mo¿e byæ wynikiem wp³ywu IVM na formowanie po³¹czeñ typu gap junction (4).
Ocena morfologii oocytów z wykorzystaniem technik molekularnych oraz mikrofluidycznych Jakoæ oocytów w sposób istotny wp³ywa na ich zdolnoæ do dojrzewania, monospermicznego zap³od-nienia, rozwoju zarodków w stadium blastocysty oraz prawid³owej implantacji (6). Jednym z najwa¿niej-szych elementów okrelaj¹cych klasê jakociow¹ oocy-tów jest ich budowa morfologiczna. W klasyfikacji morfologicznej komórek jajowych uwzglêdnia siê ta-kie elementy, jak: kompleks komórek wzgórka jajo-nonego (cumulus complex), ocena stopnia ziarnisto-ci oraz zabarwienie cytoplazmy, ziarnisto-cia³ko kierunkowe, przestrzeñ periwitelinow¹ i os³onkê przejrzyst¹ oraz wrzeciono podzia³owe (2, 3, 17, 20, 21).
Badania wykaza³y, ¿e budowa morfologiczna ko-mórki jajowej w istotny sposób wp³ywa na ekspresjê mRNA genów odpowiedzialnych za zap³odnienie u wiñ (geny koduj¹ce bia³ka os³onki przejrzystej oraz integryny) czy genów odpowiedzialnych za formowa-nie po³¹czeñ typu gap junction (2, 3, 17).
Analizy mikrofluidyczne odnosz¹ce siê do pomia-rów wartoci spektralnych badanych komórek (oocy-ty, zarodki w stadium przedimplantacyjnym) opieraj¹ siê na wskanikach morfologicznych os³onki
przejrzy-stej oraz cytoplazmy. Najczêciej wykorzystuje siê krzem monokrystaliczny i szk³o jako podstawowe materia³y s³u¿¹ce do wytworzenia systemu lab-on-chip. Mikrocytometr weterynaryjny jest chipem krzemowym z umieszczonymi w nim kana³ami mikrofluidyczny-mi, komor¹ pomiarow¹ i zintegrowanymi wiat³owo-dami w³óknistymi. Ca³oæ konstrukcji po³¹czona jest ze szklan¹ pokryw¹ posiadaj¹c¹ otwory wlotowy i wylotowy, umo¿liwiaj¹ce swobodne wprowadzenie i wyjêcie komórki (36, 37).
Parametryczny uk³ad pomiarowy odnosi siê do gru-boci os³onki oraz stopnia ziarnistoci i zabarwienia cytoplazmy komórki (36, 37). Uwzglêdniaj¹c te dwa wskaniki morfologiczne, system mikrofluidyczny okrela absorbancjê wiat³a przez komórki poddane analizie. Na podstawie wartoci absorbancji wiat³a o odpowiedniej ró¿nej dla poszczególnych typów morfologicznych komórek, okrela siê w³aciwoci spektralne analizowanej komórki, a nastêpnie odwiednio siê j¹ klasyfikuje. Opracowany uk³ad po-miarowy stanowi now¹, nieinwazyjn¹ metodê oceny jakoci oocytów/zarodków. Przeprowadzone wyniki badañ, na podstawie wskaników spektralnych, wska-zuj¹, ¿e zarówno wielkoæ pêcherzyków jajnikowych, jak klasa jakociowa oocytów maj¹ istotny wp³yw na odczytywane wartoci absorbancji. Dlatego te¿ mo¿-na w chwili obecnej uzmo¿-naæ system mikrofluidyczny za dodatkowe narzêdzie badawcze, które w sposób nie-inwazyjny dostarcza informacji na temat jakoci ko-mórek jajowych oraz zarodków (18).
Podsumowanie
Kompetencja rozwojowa oocytów jest okrelana przez ich zdolnoæ do dojrzewania (j¹drowego i cyto-plazmatycznego), zap³odnienia oraz rozwoju zarodków do stadium blastocysty. Wród czynników w znacz¹-cy sposób wp³ywaj¹znacz¹-cych na potencja³ rozwojowy ko-mórek jajowych wymienia siê gromadzenie podczas przebiegu follikulogenezy oraz oogenezy znacznych iloci mRNA oraz bia³ek. Funkcja tych cz¹steczek polega g³ównie na podtrzymywaniu i regulowaniu wielu przemian biochemicznych, molekularnych i ko-mórkowych, skutkuj¹cych w³aciw¹ implantacj¹ oraz narodzinami zdrowego potomstwa. Oprócz metod bio-logii molekularnej, s³u¿¹cych do oceny kompetencji rozwojowej oocytów, istnieje dodatkowe narzêdzie w postaci systemu mikrofluidycznego typu Lab-on--Chip, bêd¹ce now¹, nieinwazyjn¹ technik¹ s³u¿¹cej do klasyfikacji komórek jajowych/zarodków.
Pimiennictwo
1.Antosik P., Kempisty B., Bukowska D., Jackowska M., W³odarczyk R., Budna J., Brüssow K. P., Lianeri M., Jagodziñski P. P., Jakowski J. M.: Follicular size is associated with the levels of transcripts and proteins of selected molecules responsible for the fertilization ability of oocytes of puberal gilts. J. Reprod. Dev. 2009, 55, 588-593.
2.Antosik P., Kempisty B., Jackowska M., Bukowska D., Lianeri M., Brüssow K. P., Wozna M., Jaskowski J. M.: The morphology of porcine oocytes is associated with zona pellucida glycoprotein 3 and integrin beta 2protein levels. Vet. Med. 2010, 55, 154-162.
3.Antosik P., Kempisty B., Jackowska M., Bukowska D., Wona M., Lianeri M., Brüssow K. P., Jakowski J. M.: Assessment of transcripts and protein con-tents contributing to cell cycle control and gap junction connections in mor-phologically variable groups of porcine cumulus-oocyte complexes. Vet. Med. 2010, 55, 512-521.
4.Antosik P., Kempisty B., Jackowska M., Wona M., Bukowska D., Brüssow K. P., Bryja A., Jakowski J. M.: Are the levels of Cdk4 and Cx43 proteins of porcine oocytes associated with follicular size? Animal Biology 2011 (w druku).
5.Blondin P., Sirard M. A.: Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Mol. Re-prod. Dev. 1995, 41, 54-62.
6.Bukowska D., Kempisty B., Antosik P., Jakowski J. M., Olechnowicz J.: Selected aspects of canine oocytes maturation, fertilization and embryo development in dogs. Medycyna Wet. 2008, 64, 628-631.
7.Caixeta E. S., Ripamonte P., Franco M. M., Junior J. B., Dode M. A.: Effect of follicle size on mRNA expression in cumulus cells and oocytes of Bos indicus: an approach to identify marker genes for developmental competence. Reprod. Fertil. Dev. 2009, 21, 655-664.
8.Carabatsos M. J., Sellitto C., Goodenough D. A., Albertini D. F.: Oocyte--granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Develop. Biol. 2000, 226, 167-179.
9.Crozet N., Kanka J., Motlik J., Fulka J.: Nucleolar fine structure and RNA synthesis in bovine oocytes from antral follicles. Gamete Res. 1986, 14, 65-73.
10.Cummins J. M.: The role of mitochondria in the establishment of oocyte functional competence. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2004, 115, 23-29.
11.Duranthon V., Renard J. P.: The developmental competence of mammalian oocytes: a convenient but biologically fuzzy concept. Theriogenology 2001, 55, 1277-1289.
12.Eppig J. J.: Coordination of nuclear and cytoplasmic oocyte maturation in eutherian mammals. Reprod. Fertil. Dev. 1996, 8, 485-489.
13.Extavour C. G., Akam M.: Mechanisms of germ cell specification across the metazoans: epigenesis and preformation. Development 2003, 130, 5869-5884. 14.Fair T., Hyttel P., Greve T.: Bovine oocyte diameter in relation to maturatio-nal competence and transcriptiomaturatio-nal activity. Mol. Reprod. Dev. 1995, 42, 437-442.
15.Gresham D., Ruderfer D. M., Pratt S. C., Schacherer J., Dunham M. J., Botstein D.: Genome-wide detection of polymorphisms at nucleotide resolu-tion with a single DNA microarray. Science 2006, 311, 1932-1936. 16.Hagemann L. J., Beaumont S. E., Berg M., Donnison M. J., Ledgard A.,
Peterson A. J., Schurmann A., Tervit H. R.: Development during single IVP of bovine oocytes from dissected follicles: interactive effects of estrouscycle stage, follicle size and atresia. Mol. Reprod. Dev. 1999, 53, 451-458. 17.Jackowska M., Kempisty B., Antosik P., Bukowska D., Budna J., Lianeri M.,
Rosiñska E., Wona M., Jagodziñski P. P., Jakowski J. M.: The morphology of porcine oocytes is associated with zona pellucida glycoprotein transcript contents. Reprod. Biol. 2009, 9, 79-85.
18.Jakowski J. M., Kempisty B., Wona M., Walczak R., Szczepañska P., Dziuban J., Antosik P.: Wybrane metody oceny kompetencji rozwojowej oraz selekcji oocytów i zarodków bydlêcych. Medycyna Wet. 2010, 66, 740-744. 19.Kastrop P. M., Bevers M. M., Destrée O. H., Kruip T. A.: Protein synthesis and phosphorylation patterns of bovine oocytes maturing in vivo. Mol. Reprod. Dev. 1991, 29, 271-275.
20.Kempisty B., Antosik P., Bukowska D., Jackowska M., Lianeri M., Jakowski J. M., Jagodziñski P. P.: Analysis of selected transcript levels in porcine sper-matozoa, oocytes, zygotes and two-cell stage embryos. Reprod. Fertil. Dev. 2008, 20, 513-518.
21.Kempisty B., Antosik P., Bukowska D., Jackowska M., Lianeri M., Jakowski J. M., Jagodziñski P. P.: Assessment of zona pellucida glycoprotein and inte-grin transcript contents in porcine oocytes. Reprod. Biol. 2009, 9, 71-78. 22.Krisher R. L.: The effect of oocyte quality on development. J. Anim. Sci.
2004, 82, 14-23.
23.Lequarre A. S., Vigneron C., Ribaucour F., Holm P., Donnay I., Dalbies--Tran R., Callesen H., Mermillod P.: Influence of antral follicle size on oocyte characteristics and embryo development in the bovine. Theriogenology 2005, 63, 841-859.
24.Li T. Y., Colley D., Barr K. J., Yee S. P., Kidder G. M.: Rescue of oogenesis in Cx37-null mutant mice by oocyte-specific replacement with Cx43. J. Cell. Scien. 2007, 120, 4117-4125.
25.Lonergan P., Khatir H., Piumi F., Rieger D., Humblot P., Boland M. P.: Effect of time interval from insemination to first cleavage on the develop-mental characteristics, sex ratio and pregnancy rate after transfer of bovine embryos. J. Reprod. Fertil. 1999, 117, 159-167.
26.Lonergan P., Monaghan P., Rizos D., Boland M. P., Gordon I.: Effect of follicle size on bovine oocyte quality and developmental competence fol-lowing maturation, fertilization, and culture in vitro. Mol. Reprod. Dev. 1994, 37, 48-53.
27.Mourot M., Dufort I., Gravel C., Algriany O., Dieleman S., Sirard M. A.: The influence of follicle size, FSH-enriched maturation medium, and early cleavage on bovine oocyte maternal mRNA levels. Mol. Reprod. Dev. 2006, 73, 1367-1379.
28.ONeill L. P., Ver Milyea M. D., Turner B. M.: Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat. Genet. 2006, 38, 835-841.
29.Otoi T., Yamamoto K., Koyama N., Tachikawa S., Suzuki T.: Bovine oocyte diameter in relation to developmental competence. Theriogenology 1997, 48, 769-774.
30.Pavlok A., Lucas-Hahn A., Niemann H.: Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Mol. Reprod. Dev. 1992, 31, 63-67.
31.Robert C., Barnes F. L., Hue I., Sirard M. A.: Subtractive hybridization used to identify mRNA associated with the maturation of bovine oocytes. Mol. Reprod. Dev. 2000, 57, 167-175.
32.Rosen M. P., Shen S., Dobson A. T., Rinaudo P. F., McCulloch C. E., Cedars M. I.: A quantitative assessment of follicle size on oocyte developmental competence. Fertil. Steril. 2008, 90, 684-690.
33.Saitou M.: Specification of the germ cell lineage in mice. Front. Biosci. 2009, 14, 1068-1087.
34.Seydoux G., Braun R. E.: Pathway to totipotency: lessons from germ cells. Cell 2006, 127, 891-904.
35.Sousa P. A. de, Watson A. J., Schultz G. A., Bilodeau-Goeseels S.: Oogenetic and zygotic gene expression directing early bovine embryogenesis: a review. Mol. Reprod. Dev. 1998, 51, 112-121.
36.Szczepanska P., Walczak R., Dziuban J., Jackowska M., Kempisty B., Jaskowski M. J., Bargiel S.: Lab-on-chip quality classification of porcine/ bovine oocytes. Proc. Chemistry 2009, 1, 341-344.
37.Szczepañska P., Walczak R., Dziuban J., Kempisty B., Jackowska M., Antosik P., Jakowski J., Bargiel S.: Ocena jakociowa komórek rozrodczych zwierz¹t hodowlanych z wykorzystaniem mikrocytometru typu lab-chip. Elek-tronika 2010, 6, 93-96.
Adres autora: dr Bartosz Kempisty, ul. wiêcickiego 6, 60-781 Poznañ; e-mail: etok@op.pl
