Artyku³ przegl¹dowy Review
Listeria monocytogenes jest bakteri¹ wykazuj¹c¹ dwa odrêbne sposoby bytowania: saprofityczny w gle-bie oraz paso¿ytniczy w tkankach ssaków i ptaków (22). Komórki L. monocytogenes s¹ niewielkimi (0,5 × 0,5-2 µm), Gram-dodatnimi pa³eczkami. Nie tworz¹ otoczek ani endospor, wykazuj¹ ruchliwoæ tylko w przedziale temperaturowym 10-25°C. Bakte-rie te s¹ fakultatywnie tlenowe, wytwarzaj¹ katalazê, nie produkuj¹ oksydazy. Maj¹ zdolnoæ wzrostu w zakresie temperatur 0-45°C i pH 4,4-9,6. S¹ po-wszechnie wystêpuj¹cymi w przyrodzie drobnoustro-jami, obecnymi w wodach powierzchniowych, cie-kach, glebie, tkankach rolinnych i zwierzêcych. Rok 1924 uwa¿any jest za datê odkrycia L. monocyto-genes, gdy Murray i wsp. wyizolowali bakteriê, która wywo³a³a posocznicê u królików i winek morskich wykorzystywanych do badañ w ich laboratorium (24). Bakterie s¹ zdolne prze¿ywaæ w warunkach proce-sów technologicznych zwi¹zanych z produkcj¹ ¿yw-noci, miêdzy innymi toleruj¹ du¿¹ koncentracjê soli
i niskie pH. S¹ w stanie namna¿aæ siê w temperaturze ch³odniczej w zakresie od 1°C do 4°C. Zdolnoæ ta sprawia, ¿e g³ównym ród³em zaka¿enia cz³owieka jest zanieczyszczona ¿ywnoæ, zw³aszcza miêso, wêdzo-ne ryby, surowe mleko, sery, jaja i surowe warzywa (9).
Ogólna charakterystyka listeriozy
Schorzenia wywo³ywane przez L. monocytogenes u ludzi i zwierz¹t okrelane s¹ nazw¹ listerioza. Pierw-szy potwierdzony klinicznie przypadek tej choroby u ludzi opisano w 1929 r. w Danii. Przez wiele lat pod³o¿e choroby pozostawa³o niezbadane, ze wzglê-du na trudnoci w pozyskaniu izolatów bakteryjnych. W 1983 r. odnotowano serie zachorowañ na listeriozê w Ameryce Pó³nocnej i Europie, co sprawi³o, ¿e zaczêto postrzegaæ chorobê jako realne zagro¿enie epidemiologiczne. L. monocytogenes by³a obiektem zainteresowañ naukowców jeszcze zanim zaliczono j¹ do grupy czynników chorobotwórczych
niebezpiecz-Molekularne aspekty chorobotwórczoci
Listeria monocytogenes
KATARZYNA DMOWSKA, JACEK OSEK
Zak³ad Higieny ¯ywnoci Pochodzenia Zwierzêcego Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Dmowska K., Osek J.
Molecular aspects of Listeria monocytogenes pathogenicity
Summary
Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen. It is commonly found in environments such as surface water, soil, plant and animal tissues. L. monocytogenes is also widely distributed in food, especially in meat, smoked fish, raw milk, cheese, eggs and raw vegetables. These bacteria are able to survive in conditions of processes related to food production, e.g. cooling temperature. That capacity makes contaminated food the main source of human infections. The number of consumed bacteria in food and the health of the human influence the course of the infection. People with intact immune systems usually show harmless symptoms: abdominal pains, diarrhea and increased body temperature. In the case of people with deficient immunity, especially pregnant women and elderly, infection can lead to a serious disease called listeriosis. In the last years listeriosis has become one of the most dangerous food-borne diseases with a high mortality rate: 20-30%. According to the EFSA report the number of cases of the disease in the European Union in 2007 was 1,558. L. monocytogenes is able to produce various virulence factors linked to the pathogenesis that allow the bacteria to avoid or significantly reduce the effects of the host immune responses. Mechanisms responsible for the pathogenic properties of bacteria are objects of research interest. The results of these studies will create more effective ways of preventing and treating the disease, e.g. by producing inhibitory substances for controlling bacteria growth in foods or identifying targets for new antimicrobial agents. Despite molecular biological tools that have contributed to significant progress in research on genes related to the pathogenesis of L. monocytogenes infections several aspects of the disease still need to be researched to understand its processes.
nych dla ludzi. Wykorzystywano j¹ bowiem do badañ immunologicznych jako prototyp wewn¹trzkomórko-wego patogenu. Modelowe infekcje L. monocyto-genes prowadzone na myszach pozwoli³y zrozumieæ mechanizmy wystêpuj¹ce podczas odpowiedzi immu-nologicznej, np. udzia³ przeciwcia³ w zwalczaniu za-ka¿eñ wywo³anych wewn¹trzkomórkowymi patoge-nami czy te¿ znaczenie makrofagów w eliminacji bak-terii z organizmu (24).
Na podstawie dostêpnych informacji zak³ada siê, ¿e efekt kliniczny zaka¿enia L. monocytogenes jest za-le¿ny od: liczby komórek bakterii, jakie dostaj¹ siê do organizmu np. wraz z ¿ywnoci¹, w³aciwoci pato-gennych szczepu oraz statusu immunologicznego or-ganizmu ¿ywiciela. W przypadku osób z poprawnie funkcjonuj¹cym uk³adem odpornociowym niewielka iloæ bakterii obecna w spo¿ytym pokarmie zwykle nie wywo³uje ¿adnych objawów klinicznych. W innych warunkach zmiany chorobowe zale¿¹ od w³aciwoci chorobotwórczych L. monocytogenes i przejawiaj¹ siê najczêciej bólami brzucha, biegunk¹, podwy¿szon¹ ciep³ot¹ cia³a. Pierwsze objawy s¹ widoczne po oko³o 12 godzinach od zaka¿enia. Inne w skutkach s¹ infek-cje osób z obni¿on¹ odpornoci¹ (24). Listerioza jest szczególnie niebezpieczna dla kobiet w ci¹¿y, nowo-rodków oraz osób w podesz³ym wieku (16). Mo¿e tak¿e wyst¹piæ u osób z os³abionym uk³adem odpor-nociowym na skutek chorób nowotworowych, hemo-dializ, niewydolnoci w¹troby, cukrzycy, zaka¿enia wirusem HIV (13). W tych przypadkach czêsto wy-stêpuj¹ ciê¿kie objawy chorobowe, do których nale¿¹: zapalenie opon mózgowych, poronienia u kobiet w ci¹-¿y, posocznica u noworodków (9). L. monocytogenes wykazuje ró¿ne powinowactwo do tkanek gospoda-rza i na podstawie klinicznych form listeriozy stwier-dzono, ¿e szczególny tropizm posiada do macicy, p³o-du oraz orodkowego uk³ap³o-du nerwowego. Bakterie przedostaj¹ siê do p³odu za porednictwem ³o¿yska, w efekcie czego mo¿e dojæ do przedwczesnych poro-dów czy poronieñ. Natomiast infekcja centralnego uk³adu nerwowego objawia siê przede wszystkim jako zapalenie opon mózgowych, w przebiegu którego ob-serwuje siê czêsto obecnoæ ognisk zapalnych w pniu mózgu (24). U ludzi 96% przypadków choroby wy-wo³ywane jest przez 3 serotypy L. monocytogenes: 1/2a, 1/2b, 4b (16). Z tej grupy najwiêcej zachorowañ powoduje serotyp 4b, co mo¿e sugerowaæ jego wiêk-sz¹ zjadliwoæ ni¿ pozosta³ych (14).
Listerioza jest stosunkowo rzadko wystêpuj¹c¹ cho-rob¹ odzwierzêc¹, jednak z uwagi na wysok¹ mier-telnoæ, która waha siê w granicach 20-30%, powiê-ca jej du¿o uwagi (23). Europejski Urz¹d ds. Bezpie-czeñstwa ¯ywnoci (EFSA), zajmuj¹c siê monitoro-waniem czynników zakanych wystêpuj¹cych w ¿yw-noci w Europie, w swoim raporcie z 2007 r. poda³, ¿e liczba przypadków listeriozy w pañstwach Unii Euro-pejskiej wynios³a 1558, a wspó³czynnik zachorowañ wyniós³ 0,3 w przeliczeniu na 100 000 osób (25). Pod
wzglêdem liczby zachorowañ L. monocytogenes zna-laz³a siê na 5. miejscu za Campylobacter, Salmonella, Yersinia i Escherichia coli O157:H7 (25, 26). W Pol-sce stwierdzono w tym czasie 43 potwierdzone labo-ratoryjnie przypadki choroby. Pañstwami europejski-mi, gdzie zaobserwowano najwiêksz¹ liczbê zachoro-wañ w 2007 r. by³y Niemcy (356 zachorozachoro-wañ), Fran-cja (319 przypadków) i Wielka Brytania (261 zacho-rowañ). G³ównym ród³em zaka¿eñ cz³owieka jest ¿ywnoæ, dlatego bardzo wa¿ne s¹ wiarygodne infor-macje na temat obecnoci L. monocytogenes w ró¿ne-go rodzaju rodkach spo¿ywczych. ¯ywnoæ, w której zawartoæ bakterii nie przekracza 100 komórek/g nie jest zwykle zagro¿eniem dla zdrowego organizmu. W 2007 r. odsetek przebadanych próbek, w których L. monocytogenes znalaz³a siê powy¿ej tego limitu wa-ha³ siê od 0% do 2,2%. Najwiêksz¹ grupê produktów zanieczyszczonych tymi bakteriami stanowi¹ ryby wêdzone i produkty rybne gotowe do spo¿ycia. Prze-kroczenia granicy bezpieczeñstwa by³y tak¿e obser-wowane w odniesieniu do innych produktów spo¿yw-czych, takich jak miêso i sery. rodki te zosta³y uznane przez EFSA za najbardziej niebezpieczne, jeli chodzi o mo¿liwoæ zaka¿enia L. monocytogenes, zarówno w 2006, jak i 2007 r. (25, 26).
Proces patogenezy
Podczas inwazji tkanek ¿ywiciela L. monocytoge-nes w³¹cza mechanizmy, które pozwalaj¹ jej unikn¹æ lub znacznie ograniczyæ efekty odpowiedzi immuno-logicznej gospodarza, dziêki czemu jest w stanie wy-dostaæ siê z fagosomu do cytoplazmy, tam namna¿aæ i rozprzestrzeniaæ do s¹siednich komórek (20). Prze-wód pokarmowy stanowi drogê wejcia patogenu do organizmu cz³owieka (24). Bakterie, które przetrwa³y kontakt z kwasowym rodowiskiem ¿o³¹dka, enzyma-mi proteolitycznyenzyma-mi, a tak¿e innyenzyma-mi czynnikaenzyma-mi stre-sowymi na swojej drodze dokonuj¹ inwazji tkanek ¿y-wiciela za porednictwem nab³onka jelitowego (17). Po przekroczeniu bariery jelitowej rozprzestrzeniaj¹ siê przez krew i limfê. W badaniach przeprowadzo-nych na do¿ylnie zainfekowaprzeprowadzo-nych myszach zaobser-wowano, ¿e bakterie s¹ dosyæ szybko usuwane z krwio-biegu przez makrofagi, a nastêpnie, w oko³o 90%, s¹ akumulowane w w¹trobie. Istniej¹ dwa sposoby, na drodze których Listeria mo¿e dostaæ siê do w¹troby. Mo¿e to zrobiæ za pomoc¹ komórek uk³adu siateczko-wo-ródb³onkowego komórek Kupfflera lub te¿ przez bezporedni¹ inwazje hepatocytów przez przestrzeñ Dissego. Dziêki swoim zdolnociom czêæ bakterii prze¿ywa pierwszy kontakt z makrofagami gospoda-rza. G³ównym miejscem namna¿ania siê drobnoustro-jów s¹ hepatocyty. Bezporednie przejcie bakterii z hepatocytu do hepatocytu prowadzi do powstania ogniska infekcji. Listeria rozprzestrzenia siê w w¹tro-bie nie nara¿ona na kontakt z przeciwcia³ami gospo-darza, co wyjania, dlaczego nie odgrywaj¹ one zna-cz¹cej roli w odpowiedzi immunologicznej. Jeli
in-fekcja nie zostanie opanowana na etapie wstêpnego namna¿ania siê Listeria w komórkach w¹troby, to do-chodzi do uwolnienia bakterii do krwiobiegu, sk¹d przedostaj¹ siê one do organów docelowych, np. ma-cicy czy orodkowego uk³adu nerwowego (24).
Mechanizm patogenezy listeriozy mo¿na podzieliæ na 4 etapy: adhezja do komórek gospodarza, proces wnikania, ucieczka z pêcherzyka fagocytarnego do cytoplazmy, namna¿anie i rozprzestrzenianie siê do innych komórek (10).
Adhezja. Listeria jest w stanie dokonaæ inwazji za-równo komórek fagocytuj¹cych, jak i pozbawionych tej zdolnoci, np. komórek nab³onkowych, dendrytycz-nych, fibroblastów czy hepatocytów (20). Rozpozna-nie przez bakterie odpowiednich komórek gospoda-rza i adhezja do nich zapocz¹tkowuj¹ proces patoge-nezy schorzenia. Przyczepnoæ ta jest mo¿liwa dziêki temu, ¿e Listeria wykazuje powinowactwo do ró¿nych receptorów obecnych na komórkach eukariotycznych. W procesie adhezji bior¹ udzia³ m.in. bia³ka nale¿¹ce do grupy internalin, jak równie¿ bia³ko p60 (24).
Wnikanie. Po etapie przyczepiania siê do komórek gospodarza bakterie przedostaj¹ siê do ich wnêtrza w postaci pêcherzyka fagocytarnego. W zale¿noci od tego, jaki rodzaj komórki jest celem ataku Listeria, mo¿emy mówiæ o procesie fagocytozy naturalnej i in-dukowanej. W pierwszym przypadku jest ona prze-prowadzana przez makrofagi, natomiast w komórkach nie fagocytuj¹cych proces ten jest indukowany za po-rednictwem bia³ek powierzchniowych obecnych na komórkach gospodarza. W jego wyniku dochodzi do rozwoju zmian w cytoszkielecie komórki i do reorga-nizacji struktury ciany komórkowej, a nastêpnie wch³oniêcia bakterii (20).
Ucieczka z fagosomu. Kolejnym etapem w cyklu rozwojowym patogenu w organizmie jest ucieczka z pêcherzyka fagocytarnego. Stwierdzono, ¿e ju¿ po 30 minutach od zamkniêcia bakterii w fagosomie za-czynaj¹ one niszczyæ jego b³onê, a po dwóch godzi-nach od momentu przedostania siê do komórki po³o-wa bakterii znajduje siê ju¿ poza nim (24). Ucieczkê z fagosomu umo¿liwiaj¹ enzymy wytwarzane przez L. monocytogenes m.in. listeriozyna i fosfolipazy (20). Proliferacja i rozprzestrzenianie. Znajduj¹ce siê w cytoplazmie bakterie zaczynaj¹ siê namna¿aæ i w ci¹gu godziny podwajaj¹ swoj¹ liczbê. Jak wykaza³y badania, in vivo proces ten odbywa siê 3 razy wolniej ni¿ ma to miejsce in vitro na pod³o¿u bogatym we wszystkie sk³adniki od¿ywcze. Bakterie powsta³e po proliferacji s¹ szybko otaczane przez filamenty akty-nowe, które na jednym biegunie tworz¹ ogon aktyno-wy o d³ugoci oko³o 40 µm. Element ten zbudowany jest z dwóch rodzajów filamentów: d³ugich, u³o¿onych osiowo oraz krótkich, rozmieszczonych przypadkowo. Struktury te umo¿liwiaj¹ przemieszczanie siê bakterii wewn¹trz komórek gospodarza z prêdkoci¹ 0,3 µm/s. Drobnoustroje przedostaj¹ siê nastêpnie do s¹siednich komórek w postaci pêcherzyka fagocytarnego. W
ci¹-gu kolejnych 5 minut patogen uwalnia siê z fagosomu do cytoplazmy, gdzie inicjuje kolejn¹ rundê podzia-³ów wewn¹trzkomórkowych. W formowaniu siê fila-mentów i przemieszczaniu siê bakterii z komórki do komórki poredniczy bia³ko powierzchniowe ActA (24).
Czynniki wirulencji
i geny odpowiedzialne za ich ekspresje L. monocytogenes jest w stanie wytworzyæ szereg czynników chorobotwórczoci, odgrywaj¹cych wa¿-n¹ rolê w procesie patogenezy listeriozy.
Internalina A to bia³ko o masie 88 kDa, które jest produktem ekspresji genu inlA wchodz¹cego w sk³ad operonu inlAB (15). Receptorem powierzchniowym dla internaliny A jest glikoproteina transb³onowa E-katheryna, obecna w ró¿nych komórkach makroor-ganizmu. Podczas kontaktu bakterii z komórkami ma-kroorganizmu bia³ko rozpoznaje zewn¹trzkomórkow¹ domenê E-katheryny, efektem czego jest powstanie kompleksu bakteriakomórka receptorowa. W konsek-wencji struktura przestrzenna glikoproteiny zmienia siê, a cytoszkielet komórki gospodarza ulega reorga-nizacji i bakterie zostaj¹ wch³oniête do wnêtrza (20).
Internalina B jest bia³kiem o masie cz¹steczkowej 65 kDa, kodowanym przez gen inlB (17). Receptorem dla tego bia³ka na komórkach ssaków jest transb³ono-wy czynnik wzrostu hepatocytów c-Met, który posia-da aktywnoæ kinazy tyrozynowej. Innym miejscem adhezji internaliny B jest glikoproteina gC1q-R. In-ternalina B jest bia³kiem odpowiedzialnym za indu-kowanie fagocytozy w komórkach, które nie posiada-j¹ normalnie tej zdolnoci, np. komórkach nab³onka, ródb³onka czy hepatocytach. W miarê postêpu badañ nad modelem patogenezy listeriozy opisywane s¹ ko-lejne bia³ka nale¿¹ce do tej rodziny, posiadaj¹ce ce-chy wzbudzania fagocytozy w komórkach gospoda-rza; do tej pory odkryto ich oko³o 25 (20).
Bia³ko p60 inaczej nazywane bia³kiem Cwh A (cell wall hydrolase A) jest kodowane przez gen iap (inva-sion associated protein). Wystêpuje ono w podobnej formie we wszystkich szczepach Listeria (24). Zak³a-da siê, ¿e ze wzglêdu na charakter zasadowy bia³ka jego receptor na powierzchni komórki eukariotycznej ma charakter kwasowy. Oprócz funkcji adhezyjnej posiada te¿ zdolnoæ hydrolizowania mureiny. Na pod-stawie badañ prowadzonych na mysim modelu infek-cji L. monocytogenes stwierdzono, ¿e delecja genu odpowiedzialnego za ekspresjê bia³ka p60 skutkuje znacznym obni¿eniem zdolnoci adhezyjnych bakte-rii, m.in. przez zaburzenie dystrybucji internaliny A. Podobnym do wy¿ej wymienionego bia³ka jest prote-ina Ami, która równie¿ bierze udzia³ w adhezji i hyd-rolizie mureiny komórek gospodarza (20).
Bia³ko Auto jest produktem genu aut. Jak wykaza³y ostatnie badania, nie ma ono w³aciwoci adhezyjnych, a jego funkcja polega na kontroli struktury ciany mórkowej podczas procesu wnikania Listeria do
ko-mórek organizmu. Bia³ko Auto jest czynnikiem wp³y-waj¹cym na zwiêkszon¹ zjadliwoæ bakterii. Jego obecnoæ jest wymagana podczas wnikania bakterii do komórek, które nie s¹ zdolne do fagocytozy. Na pod-stawie badañ prowadzonych na myszach i winkach morskich, którym podano L. monocytogenes pozba-wione aktywnoci genu aut, zaobserwowano znacz-nie mznacz-niejsz¹ zjadliwoæ takich bakterii dla organizmu w porównaniu do drobnoustrojów z prawid³owo funk-cjonuj¹cym genem aut (5).
Bia³ko FbpA ma masê cz¹steczkow¹ 55,3 kDa i jest produktem ekspresji genu fbpA. Wykazuje ono powi-nowactwo do fibronektyny komórek ludzkich, z któr¹ ³¹czy siê in vivo, zapewniaj¹c adhezjê powierzchnio-w¹ komórek L. monocytogenes. Stwierdzono równie¿, ¿e bia³ko FbpA pe³ni funkcjê regulacyjn¹ w stosunku do listeriozyny i internaliny B, która polega na stabili-zacji i ochronie bia³ek przed degradacj¹ podczas ich transportu i wydzielania.
Sortaza A jest bia³kiem o masie cz¹steczkowej 24 kDa, kodowanym przez gen strA. Rozpoznaje ono charakterystyczny fragment w cz¹steczce bia³ka, wcho-dzi z nim w interakcje i przez to bierze uwcho-dzia³ w wy-dzielaniu i stabilizacji internalin w cianie komórki bakteryjnej (20).
Listeriozyna O (LLO) jest enzymem nale¿¹cym do hemolizyn zale¿nych od cholesterolu, tzn. rozk³a-daj¹cych b³ony biologiczne, zawieraj¹ce w swoim sk³a-dzie cholesterol. Jest to bia³ko o masie cz¹steczkowej 58 kDa, bêd¹ce produktem ekspresji genu hly. Opra-cowano model listeriozyny, który zawiera cztery do-meny: jedna z nich ma za zadanie wi¹zaæ siê z b³on¹ komórek makroorganizmu, a pozosta³e bior¹ udzia³ w tworzeniu w niej porów. Oddzia³ywanie listeriozy-ny z cholesterolem powoduje zmialisteriozy-ny w strukturze bia³-ka: z hydrofilowego staje siê hydrofobowe. Cz¹stecz-ki toksyny fragmentami zakotwiczone w b³onie ko-mórkowej zaczynaj¹ polimeryzowaæ miêdzy sob¹, for-muj¹c struktury porów. Zamkniêcie bakterii w fago-somie obni¿a pH, co poci¹ga za sob¹ aktywacjê liste-riozyny. Po wydostaniu siê bakterii z pêcherzyka jego zawartoæ miesza siê z cytoplazm¹, powoduj¹c wzrost pH i inaktywacjê toksyny. Badania in vitro wskazuj¹, ¿e listeriozyna O nie jest cytotoksyczna dla komórek, w których wnêtrzu siê znajduje. Dla potwierdzenia w³aciwoci i funkcji listeriozyny na poziomie komór-kowym u¿yto m.in. mikroskopu elektronowego i stwier-dzono, ¿e bakterie posiadaj¹ce gen hly s¹ w stanie wydostaæ siê z fagosomu, w przeciwieñstwie do drob-noustrojów nie maj¹cych tego markera genowego (15). Fosfolipaza A, enzym bior¹cy udzia³ w ucieczce bakterii z fagosomu, jest kodowany przez gen plcA. Jego masa cz¹steczkowa wynosi 33 kDa. Fosfolipaza A charakteryzuje siê du¿¹ specyficznoci¹ substrato-w¹, wykazuje najsilniejsze powinowactwo do fosfa-tydyloinozytolu. Enzym ten wspomaga listeriozynê O w czasie ucieczki z fagosomu. Podobnie jak listerio-zyna, fosfolipaza A tak¿e dzia³a w kwanym pH (15).
Fosfolipaza B jest to enzym katalizuj¹cy hydrolizê wi¹zania glicerolo-fosforanowego w cz¹steczce fos-folipidów. Koduje j¹ gen plcB. Wyniki badañ in vitro wskazuj¹ na fosfolipazê B jako kolejny czynnik wp³y-waj¹cy na dezintegracje cian fagosomu. Fosfolipaza B, w przeciwieñstwie do odmiany A, wykazuje szero-kie spektrum dzia³ania i ma zdolnoæ reakcji z kilko-ma substratami komórkowymi. Enzym ten powstaje w komórkach L. monocytogenes w formie nieaktyw-nej, a za przekszta³cenie proenzymu we w³aciwy en-zym odpowiedzialna jest metaloproteaza, bêd¹ca pro-duktem genu mpl. Aktywnoæ metaloproteazy zale¿-na jest od stê¿enia jonów wodorowych we wnêtrzu komórki gospodarza. Niskie pH powoduje aktywacjê metaloproteazy, która indukuje przemiany proenzymu w aktywn¹ formê fosfolipazy B (15).
Deacetylaza peptydoglikanu, enzym kodowany przez gen pgdA, stanowi kolejny czynnik wp³ywaj¹cy na prze¿ycie L. monocytogenes w komórkach organiz-mu gospodarza. Jak wykaza³y badania in vitro, enzym ten poredniczy w deacetylacji N-acetyloglukozami-ny wchodz¹cej w sk³ad peptydoglikanu buduj¹cego cianê komórkow¹ bakterii (8). Deacetylaza istotnie wp³ywa na w³aciwoci chorobotwórcze bakterii. W wyniku modyfikacji peptydoglikanu ich ciana ko-mórkowa staje siê bardziej oporna na dzia³anie lizo-zymu, powstaj¹cego w efekcie reakcji obronnej uk³adu immunologicznego gospodarza. Stwierdzono, ¿e bak-terie, które zosta³y pozbawione aktywnoci genu pgdA, by³y niezwykle wra¿liwe na dzia³anie lizozymu, a w konsekwencji szybko niszczone przez makrofagi. De-acetylacja peptydoglikanu jest bardzo skutecznym mechanizmem wykorzystywanym przez L. monocyto-genes w celu unikniêcia nieswoistych mechanizmów obronnych organizmu, zw³aszcza zwi¹zanych z fago-cytoz¹ (3).
Dysmutaza ponadtlenkowa (MnSOD) jest enzy-mem kodowanym przez gen sod. Podobnie jak po-przednie bia³ko, równie¿ dysmutaza przyczynia siê porednio do wzrostu liczby komórek bakteryjnych, które prze¿y³y nieswoiste odczyny obronne organizmu. W reakcjach metabolicznych w komórkach gospoda-rza powstaj¹ reaktywne formy tlenu, np. anionorodni-ki tlenu, tlen singletowy, nadtlenanionorodni-ki. S¹ one mediatora-mi w destrukcyjnej dla drobnoustrojów dzia³alnoci fagocytów, a ich ograniczenie ilociowe jest wa¿nym elementem w dalszym przebiegu patogenezy listerio-zy. Dysmutaza ponadtlenkowa katalizuje reakcjê dys-mutacji (równoczesne utlenianie jednych i redukcji in-nych cz¹steczek tej samej substancji) dwóch cz¹ste-czek anionorodnika ponadtlenkowego do tlenu cz¹s-teczkowego i nadtlenku wodoru rozk³adanego nastêp-nie przez katalazy i peroksydazy. Stwierdzono, ¿e de-lecja genu koduj¹cego MnSOD w komórkach L. mo-nocytogenes spowodowa³a wzrost liczby bakterii unieszkodliwionych przez makrofagi makroorga-nizmu, co sugeruje, ¿e zdolnoæ do przeciwdzia³ania aktywnym formom tlenu jest powa¿nym elementem
bior¹cym udzia³ w patogenezie schorzeñ na tle L. mo-nocytogenes (1).
Bia³ko ActA, kodowane przez gen actA, odpowia-da za przemieszczanie siê bakterii w obrêbie komórek gospodarza. Ruch ten mo¿liwy jest m.in. dziêki poli-meryzacji filamentów aktynowych. Badania potwier-dzaj¹ce kluczow¹ rolê bia³ka ActA w procesie ruchu L. monocytogenes polega³y m.in. na transfekcji genu actA do komórek pochodz¹cych od ssaków, w których nastêpnie obserwowano formowanie siê filamentów aktynowych. Inne dowiadczenia obejmowa³y niepa-togenne szczepy Listeria innocua, które po transfek-cji by³y w stanie produkowaæ bia³ko ActA, zyskuj¹c jednoczenie zdolnoæ do ruchu. W mechanizm prze-mieszczania siê L. monocytogenes zaanga¿owane s¹ równie¿ inne bia³ka np. VASP, które zajmuje miejsce miêdzy ActA a monomerami aktyny. Jest ono odpo-wiedzialne za pobudzanie aktyny do polimeryzacji i de-terminowanie kierunku formowania siê kompleksu lokomotorycznego. Innym czynnikiem odgrywaj¹cym pewne funkcje w procesie patogenezy listeriozy jest kompleks bia³kowy Arp2/3, który powoduje groma-dzenie siê filamentów aktyny na powierzchni bakterii. Sk³ada siê on z 7 bia³ek, z których dwa mog¹ odgry-waæ role pierwszych monomerów podczas formowa-nia siê ogona aktynowego. Znana z udzia³u w prze-mieszczaniu siê bakterii wewn¹trz komórek, jak te¿ miêdzy komórkami gospodarza, jest tak¿e profilina, która przyspiesza ruch oraz kofalina o bli¿ej nieokre-lonej funkcji (7).
Bakterie, przedostaj¹c siê do makroorganizmu, na-potykaj¹ czêsto na czynniki, które wymagaj¹ od nich podjêcia dzia³añ umo¿liwiaj¹cych prze¿ycie w warun-kach stresowych. Kwasowe rodowisko ¿o³¹dka, sole ¿ó³ciowe, niskie pH, a tak¿e podwy¿szona osmotycz-noæ wymuszaj¹ na drobnoustrojach produkcjê ró¿nych czynników, które zapewni¹ im przetrwanie. Opornoæ komórki bakteryjnej na dzia³anie kwasów ¿ó³ciowych warunkuje system BilE (bile exclusion). Pocz¹tkowo uwa¿ano, ¿e produkty genów nazywanych lmo 1421 i lmo 1422 s¹ sk³adnikami bior¹cymi udzia³ w regu-lacji osmotycznoci. Jednak, jak wykaza³y badania in vitro, system ten ma raczej zwi¹zek z neutralizacj¹ ro-dowiska kwasowego gospodarza, w jakim znajduj¹ siê bakterie. Z tego te¿ powodu wy¿ej wymienione geny nazwano zgodnie z pe³nion¹ funkcj¹ bilE. Inn¹ form¹ obrony bakterii przed rodowiskiem kwasowym jest ich aktywnoæ hydrolityczna, maj¹ca na celu neutrali-zacjê kwasów ¿ó³ciowych. Aktywnoæ ta jest warun-kowana ekspresj¹ genu bsh (bile salt hydrolaze). Ba-dania przeprowadzone na myszach wykaza³y, ¿e bia³-ko bia³-kodowane przez ten gen bierze udzia³ w patogene-zie listeriozy na etapie kolonizacji przewodu pokar-mowego przez L. monocytogenes.
Innym czynnikiem, wytwarzanym przez chorobo-twórcze L. monocytogenes, maj¹cym wp³yw na poko-nanie bariery ¿o³¹dkowo-jelitowej gospodarza, s¹ de-karboksylazy kwasu glutaminowego (GAD). S¹ to
enzymy powstaj¹ce w wyniku ekspresji genów gadA i gadB, stwierdzone u wiêkszoci patogennych szcze-pów L. monocytogenes. W wyniku reakcji katalizo-wanej przez te enzymy z glutaminianu powstaje kwas ã-aminomas³owy (GABA), który nastêpnie wydalany jest na zewn¹trz komórki, a do wnêtrza wnika gluta-minian. W czasie reakcji poch³aniane s¹ protony znaj-duj¹ce siê w cytoplazmie, co skutkuje wzrostem pH. Wyniki badañ sugeruj¹, ¿e produkty spo¿ywcze boga-te w glutaminiany mog¹ zwiêkszaæ zdolnoæ L. mono-cytogenes do tolerowania niskiego pH. Wykazano rów-nie¿, ¿e niektóre patogenne izolaty L. monocytogenes posiada³y geny koduj¹ce enzymy, umo¿liwiaj¹ce prze-mianê argininy w ornitynê z uwolnieniem amoniaku. W efekcie tych reakcji równie¿ nastêpuje wzrost pH w rodowisku obecnoci bakterii, a tym samym zwiêk-sza to zwiêk-szansê na ich prze¿ycie i rozwój schorzenia u ludzi.
Czynnikiem stresowym, z którym bakterie spotyka-j¹ siê w trakcie przejcia z ¿o³¹dka do jelita cienkiego, jest tak¿e wysokie cinienie osmotyczne. W odpowie-dzi na te warunki komórki L. monocytogenes wykszta³-ci³y system transportu b³onowego zwany OpuC (osmo-protectant uptake). W warunkach niekorzystnych dla bakterii, a takie s¹ obecne w jelitach, uk³ad ten wy-chwytuje niektóre substancje ze rodowiska i ma-gazynuje je w cytoplazmie, utrzymuj¹c równowagê osmotyczn¹ i zapobiegaj¹c w ten sposób utracie wody z w³asnej komórki. Za mechanizm ten odpowiedzial-ne s¹ obecodpowiedzial-ne w b³onie komórkowej bia³ka transportu-j¹ce BetL i Gbu kodowane przez geny betL i gbu (11).
Regulacja ekspresji genów wirulencji
Kluczowe dla procesu patogenezy listeriozy geny znajduj¹ siê w obrêbie tzw. wyspy patogennoci (LIPI; Listeria pathogenicity island) (24). Ekspresja poszcze-gólnych genów regulowana jest przez bia³ko o masie cz¹steczkowej 27 kDa, okrelone jako PrfA pozy-tywny regulator transkrypcji A (15, 24). Najwa¿niej-sze z punktu widzenia procesu patogenezy schorzenia geny, nale¿¹ce do wyspy patogennoci, to: prfA, hly, plcA, plcB, actA, mpl, hpt, inlA, inlB, inlC. Bia³ko PrfA odbiera sygna³y pochodz¹ce od bakterii oraz ze rodowiska, dziêki czemu zapewnia odpowiedni¹ eks-presjê genów w cytoplazmie gospodarza, a zahamo-wanie w innym rodowisku, które nie wymaga ich ak-tywacji. Regulacja aktywnoci genów zale¿nych od PrfA opiera siê m.in. na zmianie koncentracji PrfA w komórkach L. monocytogenes, a tak¿e jego aktyw-noci warunkowanej obecaktyw-noci¹ kofaktorów (22).
Regulator PrfA mo¿e powstawaæ m.in. z transkryp-tu nios¹cego informacjê koduj¹c¹ tylko jedno bia³ko lub te¿ zawieraj¹cego geny PrfA i fosfolipazy A. Pro-motorami dla prfA s¹ P1prfA i P2prfA, których g³ów-nym zadaniem jest zapewnienie sta³ej obecnoci nie-wielkiej iloci transkryptów w cytoplazmie komórki bakteryjnej (20). Bia³ko regulatorowe mo¿e wystêpo-waæ w formie nisko lub wysoko aktywnej, a zmiany
jego aktywnoci s¹ wynikiem przekszta³ceñ konfor-macyjnych zachodz¹cych za porednictwem kofakto-rów. Komórki L. monocytogenes obecne w rodowi-sku, które nie indukuje ekspresji genów zjadliwoci, np. w niskiej temperaturze i przy niewielkiej iloci kofaktorów, wytwarzaj¹ PrfA z transkryptów obecnych stale w cytoplazmie komórki bakteryjnej. Taka iloæ bia³ka jest wystarczaj¹ca, aby stymulowaæ ekspresjê genów hly i plcA jednak zbyt ma³a, by indukowaæ eks-presjê innych czynników wirulencji (22). Z drugiej stro-ny, gdy bakterie znajd¹ siê w odpowiednim rodowi-sku i temperaturze, dochodzi do aktywacji regulatora PrfA, który indukuje ekspresjê genów wyspy pato-gennoci oraz genu odpowiedzialnego za produkcjê samego bia³ka PrfA (24). Regulacja markera prfA jest termozale¿na, tzn. pozwala na szybk¹ syntezê PrfA w chwili przedostania siê bakterii do rodowiska o wy¿-szej temperaturze, np. krwiobiegu gospodarza. W tych warunkach PrfA indukuje w³asn¹ produkcjê na zasa-dzie sprzê¿enia zwrotnego (22).
Podsumowanie
Wskanik miertelnoci ludzi w przypadku zacho-rowañ na listeriozê jest znacznie wy¿szy ni¿ przy in-nych chorobach bakteryjin-nych, bêd¹cych efektem spo-¿ycia zanieczyszczonej ¿ywnoci. Z uwagi na to, ¿e proces patogenezy oraz bior¹ce w nim udzia³ czynniki chorobotwórczoci L. monocytogenes nie s¹ do koñca wyjanione, w ostatnim okresie coraz wiêcej uwagi powiêca siê molekularnym aspektom patogennoci tych bakterii. Poznanie mechanizmów odpowiedzial-nych za adhezjê do komórek gospodarza, przenikanie mikroorganizmów przez nab³onek jelitowy oraz spo-sób namna¿ania siê w makroorganizmie mo¿e wp³y-n¹æ na opracowanie skuteczniejszych sposobów ochro-ny przed infekcjami. Genom L. monocytogenes wyka-zuje du¿e podobieñstwo z materia³em genetycznym innych gatunków nale¿¹cych do Listeria. Z drugiej jednak strony, istniej¹ znaczne ró¿nice w potencjale chorobotwórczym miêdzy poszczególnymi mikroor-ganizmami. Dodatkowo, równie¿ serotypy L. mono-cytogenes ró¿ni¹ siê miêdzy sob¹ pod wzglêdem wi-rulencji, co mo¿e sugerowaæ ich odmienny rozwój fi-logenetyczny (4).
Pimiennictwo
1.Archambaud C., Nahori M. A., Pizarro-Cerda J., Cossart P., Dussurget O.: Control of Listeria superoxide dismutase by phosphorylation. J. Biol. Chem. 2006, 281, 31812-31822.
2.Biju J., Wemer G.: Life of Listeria monocytogenes in the host cells cytosol. Microbes Infect. 2007, 9, 1188-1195.
3.Boneca I. G., Dussurget O., Cabanes D., Nahori M. A., Sousa S., Lecuit M., Psylinakis E., Bouriotis V., Hugot J. P., Giovannini M., Coyle A., Bertin J., Namane A., Rousselle J. C., Cayet N., Prevost M. C., Balloy V., Chignard M., Philpott D. J., Cossar P., Girardin S. E.: A critical role for peptidoglycan N-deacetylation in Listeria evasion from the host innate immune system. PNAS 2007, 104, 997-1002.
4.Buchrieser C.: Biodiversity of the species Listeria monocytogenes and the genus Listeria. Microbes Infect. 2007, 9, 1147-1155.
5.Cabanes D., Dussurget O., Dehoux P., Cossart P.: Auto, a surface associated autolysin of Listeria monocytogenes required for entry into eukaryotic cells and virulence. Mol. Microbiol. 2004, 51, 1601-1614.
6.Chico-Calero I., Suárez M., González-Zorn B., Scortti M., Slaghuis J., Goebel W., Vázquez-Boland J. A.: Hpt, a bacterial homolog of the micro-somal glucose-6-phosphate translocase, mediates rapid intracellular prolife-ration in Listeria. PNAS 2002, 99, 431-436.
7.Cossart P.: Molecular and cellular basis of the infection by Listeria mono-cytogenes: an overview. Int. J. Med. Microbiol. 2002, 291, 401-409. 8.Cossart P., Toledo-Arana A.: Listeria monocytogenes, a unique model in
infection biology: an overview. Microbes Infect. 2008, 10, 1041-1050. 9.Farber J. M., Peterkin P. I.: Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen.
Microbiol. Rev. 1991, 55, 476-511.
10.Franciosa G., Maugliani A., Floridi F., Aureli P.: Molecular and experimental virulence of Listeria monocytogenes strains isolated from cases with invasive listeriosis and febrile gastroenteritis. Immunol. Med. Microbiol. 2005, 43, 431-439.
11.Gahan C. G., Hill C.: Gastrointestinal phase of Listeria monocytogenes infection. J. Appl. Microbiol. 2005, 98, 1345-1353.
12.Gouin E., Mengaud J., Cossart P.: The virulence gene cluster of Listeria monocytogenes is also present in Listeria ivanovii, an animal pathogen, and Listeria seeligeri, a nonpathogenic species. Infect. Immun. 1994, 62, 3550--3553.
13.Goulet V., Hedberg C., Le Monnier A., De Valk H.: Increasing incidence of listeriosis in France and other European countries. Emerg. Infect. Dis. 2008, 14, 734-740.
14.Jacquet C., Gouin E., Jeannel D., Cossart P., Rocourt J.: Expression of ActA, Ami, InlB, and listeriolysin O in Listeria monocytogenes of human and food origin. Appl. Environ. Microbiol. 2002, 68, 616-622.
15.Jagielski T., Osiñska O., Bielecki J.: Molekularne determinanty wirulencji Listeria monocytogenes II. Czynniki wirulencji uczestnicz¹ce w wewn¹trz-komórkowym etapie patogenezy: listeriolizyna O (LLO), fosfolipaza B (PlcB), metaloproteaza (Mpl), fosfolipaza A (PlcA) i bia³ko ActA. Post. Mikrobiol. 2006, 45, 303-315.
16.Kreft J.,Vazquez-Boland J. A.: Regulation of virulence genes in Listeria. Int. J. Med. Microbiol. 2001, 291, 145-157.
17.Liu D.: Identification, subtyping and virulence determination of Listeria monocytogenes, an important foodborne pathogen. J. Med. Microbiol. 2006, 55, 645-659.
18.Liu D., Lawrence M. L., Ainsworth A. J., Austin F. W.: Toward an improved laboratory definition of Listeria monocytogenes virulence. Int. J. Food Microbiol. 2007, 118, 101-115.
19.Machesky L. M.: Cell motility: complex dynamics at the leasing edge. Curr. Biol. 1997, 7, 164-197.
20.Osiñska O. A., Jagielski T., Bielecki J.: Molekularne determinanty wirulen-cji Listeria monocytogenes. I. Patogeneza listeryjna. Czynniki wirulenwirulen-cji: bia³ka powierzchniowe uczestnicz¹ce w adhezji do komórek gospodarza. Post. Mikrobiol. 2006, 45, 209-220.
21.Ramaswamy V., Cresence V. M., Rejitha J. S., Lekshmi M. U., Dharsana K. S., Prasad S. P., Vijila H. M.: Listeria review of epidemiology and patho-genesis. J. Microbiol. Immunol. Infect. 2007, 40, 4-13.
22.Scortti M., Monzó H. J., Lacharme-Lora L., Lewis D. B., Vázquez-Boland J. A.: The PrfA virulence regulon. Microbes Infect. 2007, 9, 1196-1207. 23.Swaminathan B., Gerner-Smidt P.: The epidemiology of human listeriosis.
Microbes Infect. 2007, 9, 1236-1243.
24.Vázquez-Boland J. A., Kuhn M., Berche P., Chakraborty T., Domínguez--Bernal G., Goebel W., González-Zorn B., Wehland J., Kreft J.: Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clin. Microbiol. Rev. 2001, 14, 584-640.
25.The community summary report on trends and sources of zoonoses and zoonotic agents in the European Union in 2007. The EFSA Journal 2009, 223, 1-320.
26.The community summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents, antimicrobial resistance and foodborne outbreaks in the European Union in 2006. The EFSA Journal 2007, 130, 1-352.
Adres autora: prof. dr hab. Jacek Osek, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: josek@piwet.pulawy.pl
