Wojciech PIEKOSZEWSKI1 Ewa FLOREK2
Maksymilian KULZA2 Jolanta WILIMOWSKA’ UrszulaLOBA2
Opracowanie metody oznaczanie metabolitów nikotyny w moczu
'ZakładChemii Analitycznej, Uniwersytet Jagielloński,Kraków Kierownik: Prof, drhab.Paweł Kościelniak
laboratorium BadańŚrodowiskowych, Katedra iZakładToksykologii, Uniwersytet Medyczny
im. Karola Marcinkowskiego, Poznań Kierownik Laboratorium:
Prof,dr hab.Ewa Florek
’Pracownia Toksykologii Analityczneji Terapii Monitorowanej,Katedra Toksykologii iChorób Środowiskowych, Collegium Medicum UniwersytetJagielloński, Kraków KierownikPracowni: Dr Ewa Gomółka
Dodatkowesłowa kluczowe:
nikotyna
metabolity nikotyny mocz
Additional key words:
nicotine
nicotine metabolites urine
Adres do korespondencji:
Prof. dr hab. Wojciech Piekoszewski Zakład ChemiiAnalitycznej UniwersytetJagielloński
30-060 Kraków, ul. R. Ingardena 3 TeL (+12) 663 2045
pax. (+12)63405 15 e-mail: wpiekosz@tlen. pl
Najpopularniejszą i najbardziej wia
rygodną metodą w ocenie narażenia na dym tytoniowy jest oznaczanie biomar- kerów w materiale biologicznym. Do najbardziej specyficznych biomarke- rów dla dymu tytoniowego zalicza się nikotynę i jej metabolity. Obecnie naj
częściej wykorzystywana jest kotyni- na i trans-3'-hydroksykotynina. Celem pracy było opracowanie prostej i szyb
kiej metody oznaczania nikotyny i jej pięciu głównych metabolitów z zasto
sowaniem dostępnej w większości la
boratoriów metody HPLC. Nikotynę i jej metabolity w moczu (kotyninę, trans- 3'-hydroksykotyninę, nornikotynę, N- tlenek nikotyny, N-tlenek kotyniny) oznaczono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją spektrofotometryczną (HPLC-UV).
Analiza chromatograficzna została poprzedzona ekstrakcją badanych związków z moczu z wykorzystaniem techniki ciecz-ciecz. Opracowana technika HPLC okazała się metodą przydatną do oznaczania nikotyny i jej czterech metabolitów u osób palących tytoń. Nie mniej konieczne są dalsze badania nad powyższą metodą. Wyma
gana jest dalsza modyfikacja procedu
ry, ze względu na interferencje N-tlen- ku kotyniny z tłem biologicznym mo
czu, co uniemożliwia jego oznaczanie.
Zwiększenie wydajności ekstrakcji ni
kotyny i nornikotyny umożliwiłoby ich oznaczenie również u osób narażo
nych na środowiskowy dym tytoniowy (ETS). Powyższe badania potwierdza
ją doniesienia innych autorów, że trans-3'-hydroksykotynina może być równorzędnym z kotyniną miernikiem narażenia na dym tytoniowy, wymaga to jednak dalszych analiz.
Wstęp
Obecność nikotyny lub jej metabolitów w płynach biologicznych czytkankach jest specyficznymmiernikiem narażenia organi zmuna działanie dymu tytoniowego,a tym samym wszystkich zawartych w nimsub stancji toksycznych. Pomiarzawartości ni kotynyi jej pochodnych w płynach ustrojo wych jest najbardziej czułym markeremtej ekspozycji.
W ocenie narażenia na działanie dymu
The assay of biomarkers in biologi
cal material is the most popular and reliable method in estimate exposure to tobacco smoke. Nicotine and its metabolites qualify to the most spe
cific biomarkers for tobacco smoke.
Currently the most often used are cotinine and trans-3'-hydroxycotinine.
The aim of this study was development of easy and quick method of determin
ing nicotine and its main metabolites with high performance liquid chroma
tography - available in most laborato
ries. Nicotine and its metabolites in urine (cotinine, trans-3'-hydroxy- cotinine, nornicotine and nicotine N- oxide) was determined by means of high performance liquid chromatogra
phy with spectrometry detection (HPLC-UV). the determined com
pounds were extracted from urine by means of the liquid-liquid technique, before analysed by the HPLC method.
Developed technique of high perform
ance liquid chromatography proved to be useful to assessment nicotine and its four metabolites in smokers, though further research are necessary.
The further modification of procedure is required, because of the interfer
ences of cotinine N-oxide with matrix, which prevent determination. Increas
ing the efficiency of extraction nicotine and nornicotine could enable the de
termination in people exposed on en
vironmental tobacco smoke (ETS).
This study confirm other authors' ob
servations that 3'-hydroxycotinine might be equivalent with cotinine pre
dictor of tobacco smoke exposure, however further studies are required.
tytoniowego główną rolęodgrywa kotyniną -najważniejszy ilościowo i jeden z najbar dziej stabilnych produktów metabolizmu ni kotyny.Jej stężenie jest wprost proporcjo nalne doilości wchłanianej nikotyny, szyb
kości jej metabolizowania i szybkości elimi nowania z krążenia [18].
Wśród metod stosowanych do oznacza nia nikotyny i jej metabolitówwymienić na
leży chromatografięgazową i cieczowąoraz metodyimmunologiczne.
Chromatografia gazowa szczególnie sprzężona zespektrometrią mas jest przy datną metodą w analizie nikotyny i jej me tabolitów. Do tej pozycji przyczyniły się przede wszystkim niskie granice detekcji rzędu piko-, a nawet femtogramów oraz możliwość zastosowania wysokorozdziel czych kolumn i różnych detektorów [10].
Dużązaletątej metodyjest możliwośćrów noczesnego oznaczania metabolitów, np.
nikotyny ikotyniny,bądź kotyniny łącznie z 3'-hydroksykotyniną.
Do wadmetodynależy skomplikowana procedura przygotowania próbki badaneji eksponowanie analitów na stosunkowo wy sokie temperatury,co może przyczynić się do rozkładu cząstek ocharakterze polar
nym.
Metodą chromatografii gazowejzspek trometrem mas jako detektorem przepro
wadzono jednoczesną analizę nikotyny i ko
tyniny wmoczu [9]. W badaniu wykorzysta
no system Toxi-Lab, co ułatwiło i przyspie
szyłoproceswstępnejekstrakcji.
Metoda HPLC została wykorzystana do oceny narażeniana ETS przez Harlharana w 1988roku. Umożliwiała ona jednoczesne oznaczanie nikotyny i kotyniny w osoczu [8].
Zaznaczono wyższośćtej metody nad do
tychczas stosowanąchromatografią gazo
wą,która, pomimo dobrychparametrówroz dzielczości oznaczanej mieszaniny, wyka zuje ograniczoną stabilność detektora oraz samej kolumny kapilarnej. Jednocześnie zmodyfikowano metodę HPLC pod kątem rutynowej analizy jednocześnie dwóch ana
litów w małej objętościludzkiego osocza(1 ml). Wtym celu jakorozpuszczalnik wyko rzystano chlorek metylenu, który pozwolił na efektywniejszą ekstrakcję metabolitówz osoczaorazuniknięcie formowaniaemul
sji, coutrudniałoby późniejszeoznaczenie.
Wykazano liniowość metody w zakresie stę
żeń0-700 ng/ml,uzyskane wyniki mieściły się w granicach 5-48 ng/ml dla nikotyny i 180-460ng/mldla kotyniny.
W 2002 roku stosując chromatografię cieczową z tandemowąspektrometrią mas oznaczono jednocześnie pięć analitów w surowicy i moczu [13]. Metodę tę zastoso
wanodooznaczania nikotyny ijej metabo
litów: kotyniny, 3'-hydroksykotyniny, norni- kotyny oraz anabazyny - alkaloidu obecne
go w tytoniu. Zaletą tej modyfikacji było zwiększenie czułości i specyficzności me tody. Granice oznaczalności wynosiły: dla nikotynyi nornikotyny 2 ng/ml, dla anaba
zyny i kotyniny 1 pg/ml oraz dla 3'-hydrok- sykotyniny 5 ng/ml. Badaniepozwoliłoroz
różnić osoby, które nie były narażone na ETSod osób będących biernymi palacza mi,od byłych aktywnych palaczylubteż od osób aktywniepalącychczy stosujących ni kotynową terapię zastępczą.
Za pomocą testu radioimmunologiczne- go możliwe jest oznaczenie stężenia meta bolitów nikotyny w takimmaterialejak oso cze, surowica,ślina, mocz, płyn mózgowo- rdzeniowyoraz, coraz szerzej wykorzysty
wane, włosy [7].
W porównaniu z RIA metodyenzymo- immunologiczne wykazują szerszezasto
sowanie.Przyczynia się do tegoniższa se lektywność metody RIA, na wyniki której wpływa obecność trans-3-hydroksykotyni-
ny w moczu i krwi [16]. ELISAcharaktery zuje się dużą dokładnością, czułością ispe cyficznością, cozostało potwierdzonew po
równaniu z referencyjnąmetodąwysoko- sprawnej chromatografii cieczowej. Analiza porównawcza metody HPLC z detekcją spektrofotometrycznąpouprzedniej ekstrak
cji typu ciecz-cieczoraz metodą ELISA przy użyciu bezpośredniegotestu Cotinine Direct Elisa (BioOuant, USA) wykazała wysoki współczynnik korelacji r= 0,9056 pomiędzy wynikami oznaczenia kotyniny w moczu obiema metodami, co potwierdziło przydat ność metody enzymoimmunologiczejw oce nie narażenia na dym tytoniowy.
Obok moczu, jakomatrycę biologiczną stosuje się również surowicę.Zieglerw swo
ich badaniachocenynarażenia nadym ty
toniowy przyużyciu testu ELISAwykorzy
stał oba powyższemateriały [23].Wykaza nobardzodobrą czułość, precyzjęi odtwa rzalność kotyniny w tej analizie. Przedsta wionoistotnerozgraniczenie pomiędzyoso
bami palącymi, biernymi palaczami a oso bami nienarażonymi na dym w przypadku oznaczania moczu. Dla analizy surowicy kotyninajest doskonałym biomarkerem do rozróżniania aktywnych palaczy od osób niepalących/biernychpalaczy. Mocz i suro
wica ukazują przekonujące i porównywalne rezultaty ocenynarażeniana ETS.
Celem pracy było opracowanieprostej i szybkiej metody oznaczania nikotyny i jej pięciu głównych metabolitów z zastosowa
niem dostępnej w większości laboratoriów metodyHPLC.
Materiał i metody Odczynniki
Do badań użyto dichlorometando HPLC (Sigma), metanol doHPLC(Sigma),kotyninęstandard 1mg/ml (Sigma), kwas fosforowy stęż. (Sigma),kwas solnycz.d.a (roztwót 35 mMw metanolu) (Sigma), oraz wodę dejoni- zowaną(Sigma), oktanosulfoniansodu, 1,1g/l (Fluka) i wzorce metabolitów:nikotyna,trans-3'-hydroksykotynina, nornikotyna,N-tlenek nikotyny,N-tlenek kotyniny (Toronto Research Chemicals Inc.).
Aparatura
W badaniach wykorzystano wysokosprawny chro matograf cieczowyCRYSTAL 200 (ATI Unicam)zdo
zownikiem Rheodyne7125z pętlą dozująca pojemno ści 100 pi idetektorem spektrofotometrycznym UV-vis.
Wykonanie oznaczeń
Ekstrakcjęi rozdział chromatograficzny prowadzo
no wcześniej opracowaną metodą do oznaczeń kotyni ny z modyfikacją polegającą na zrezygnowaniu z wzor ca wewnętrznego,a obliczenia dokonywano w oparciu o polepodotrzymanymi pikami.
Ekstrakcję badanych metabolitówzapomocą 5 ml dichlorometanu prowadzono z jednego mililitra moczu badanegolub moczu, doktórego dodano nikotynę i jej metabolity (kotyninę, trans-3'-hydroksykotyninę, norniko- tynę, N-tlenek nikotynyi N-tlenekkotyniny)w stężeniu podanym wrozdzialeWynikiz dodatkiem 0,1 ml 1 M roztworu wodorotlenku soduw celuuzyskania pH=9.
Próbkiwytrząsano na Vorteksie przez 15 sekund, a na
stępnie dodano 5ml dichlorometanu i ekstrahowano przez 15 minut. Próbkęwirowano10 minut przy obro tach 3000/min., a następnie pobrano4 ml fazy organicz neji przeniesionodoprobówek stożkowych,dodano 100 pl 35mM kwasu solnego w metanolui odparowywano do sucha w strumieniu powietrza, w temperaturze 40°C.
Suchą pozostałość rozpuszczono w150 pl fazy rucho
mej.
Do rozdziałubadanych związkówzastosowano pre- kolumnę (3 cm)i kolumnę (25 cm) do chromatografii cie
czowejSupelcosil LC-8 (Supelco). Fazaruchomazawie
rała 88% wody, 12% acetonitrylu,1 g/l oktanosulfonianu
sodu i 5,95 g/l wodorofosforanu potasu; pH fazy rucho
mej ustalono na 5,5 stężonym kwasemfosforowym. Roz
dział chromatograficzny przeprowadzono w warunkach izokratycznych. W czasie pracy chromatografu przepływ fazybył stały i wynosił 1 ml/min. Objętośćdozowanej próbkiwynosiła100 pl. Pomiaru absorbancji dokonano przy długość fali X=260 nm.
W ramach walidacji metodywyznaczono: czasy re tencji badanychzwiązków, limit wykrywalności i ozna czalności, powtarzalność w ciągu dnia i pomiędzy dnia mi oraz odzysk.
W celu potwierdzenia opracowanej metody doozna
czanianikotynyi jej metabolitów przeprowadzono ich oznaczenie w 4 próbachmoczu pobranegood kobiet palących ponad 10 papierosów dziennie.
Wyniki
Rozdział chromatograficzny nikotyny, kotyniny, trans-3'-hydroksykotyniny, norniko tyny,N-tlenkunikotyny i N-tlenku kotyniny
W pierwszym etapie badań podjęto pró
bęrozdzielenia nikotyny ijej 5metabolitów (kotynina,trans-3'-hydroksykotynina, norni kotyna, N-tlenek nikotyny i N-tlenekkotyni ny) z wykorzystaniemizokratycznejchroma tografii cieczowej.
W wyniku przeprowadzonych badań z zastosowaniem wzorców badanych związ
ków rozpuszczonychw fazie ruchomej otrzy
mano wyniki przedstawione w tabeli I.
Otrzymanewyniki wskazują, że wszyst
kie badane związki ulegają rozdziałowi w opracowanychwarunkach.
Jednak przeprowadzone badaniaz ni
kotynąi jejmetabolitami dodanymi do mo
czu wykazały,że N-tlenek kotyniny nieule ga rozdzielaniu od tła jakiepowodują fizjo logiczne składniki moczu.
Walidacjametody oznaczanianikotyny, kotyniny, trans-3'-hydroksykotyniny, norniko tyny, N-tlenkunikotyny i N-tlenkukotyniny
Walidacja metodyoznaczanianikotyny i jejmetabolitów obejmowała określenie:li niowości metody, granicy wykrywalności (LOD),limitu oznaczalności(LOQ), powta rzalności w ciągu dnia i pomiędzy dniami orazodzysku.
Zakresliniowości dlawszystkich bada nych związkówwynosiłod 100 do 2000 ng badanych związków na ml moczu.
Opracowana metoda cechowała sięgra nicą wykrywalności i oznaczalności dla po
szczególnychzwiązków, które przedstawio
now tabeliII.
Kolejnym wyznaczonym parametrem walidacyjnym opracowanej metody była po
wtarzalnośćwciągudnia. Wynikitychba
dań zestawiono wtabeliIII.
We wszystkich przypadkach, z wyjąt
kiem nornikotyny w niskich stężeniach współczynnikzmienności (CV) był poniżej 10%.
Wynikiokreślenia zmiennościpomiędzy dniamizestawionow tabeli IV.
Powtarzalność pomiędzy dniami była zbliżona do powtarzalnościw ciągu dniaiw kilku przypadkach CV przekraczało 10%.
Ważnym elementem procesu walidacji jestokreślenie odzysku metody, który ma bezpośredni wpływ na jej czułość. W przy
padku tejmetodyekstrakcji odzysk metody był zróżnicowanydlaposzczególnych związ
ków.
Wyniki odzysku dla poszczególnych związkówzebrano w tabeli V.
Oznaczanie nikotyny i jejmetabolitów w
594 Przegląd Lekarski 2009 /66/ 10 W. Piekoszewski i wsp-
Tabela I
Czasy retencji nikotyny i ich metabolitów.
Reteniion limes ofnicotine andthe metabolites.
Związek Stężeniewzorców [ug/ml] Czas retencji[min.]
Nikotyna 10 22,16
Kotynina 1 9,27
Trans 3'-hydroksykotynina 1 5,66
Nomikolyna 0,2 19,78
N-tlenek nikotyny 1 8,44
N-tlenek kotyniny 0,5 3,77
Tabela II
Granice wykrywalności i oznaczalności nikotyny,kotyniny, trans-3'-hydroksykotyniny, nornikotyny, N-tlenku nikotyny i N-tlenkukotyniny w moczu.
Low limit of détection (LOD) and Iow limitof quantification (LOQ) of nicotine, cotinine, trans-3'-hydroxycotinine,N-
nicotine oxide and N-cotinineoxide. _____
Związek LOD ng/ml] ¡ LOQ[ng/ml]
Nikotyna 50 i 100
Kotynina 10 100
Trans-3'-hydroksykotynina 10 100
Nomikolyna 50 100
N-tleneknikotyny 5 100
N-tlenekkotyniny ND ND
ND - metodanieumożliwiaoznaczania N-tlenku kotyniny
Tabela III
Powtarzalnośćwewnątrzgrupowametody oznaczania nikotyny,kotyniny, trans-3'-hydroksykotyniny, nornikotyny,N-tlenku nikotynyi N-tlenku kotyninyw moczu.
Inter-day precisionof determination of:nicotine, cotinine, trans-3'-hydroxycotinine, N-nicotine oxide andN-cotinine oxide.
Parametr Stężeniezadane [ng/ml] Średnie stężenie oznaczone [ng/ml] CV [%]
Nikotyna
250 243 6,2
1500 1476 3,9
! Kotynina 250 253 2,9
1500 1537 4,1
Trans-3'-hydroksykotynina
250 231 9,4
1500 1428 6,2
Nomikotyna
250 201 12,7
1500 1603 9,9
I N-tleneknikotyny
250 237 4,8
1500 1472 3,5
I
N-tlenekkotyniny
250 ND ND
1500 ND ND
Próbach rzeczywistych
W celu zweryfikowania przydatności opracowanej metody dooznaczeń nikoty
ny,kotyniny, trans-3'-hydroksykotyniny, nor nikotyny,N-tlenku nikotyny i N-tlenku koty niny w materiale biologicznym przeprowa dzono oznaczanie tychzwiązków wmoczu Pobranym odpacjentów palącychtytońoraz ntepalących inienarażonych na dym.
W moczu pobranym od kobietniepalą
cych i nienarażonych na dym tytoniowy w Środowisku nie stwierdzono obecności ni kotyny ani jej metabolitów w stężeniach po
wyżej czułości metody.
Stężenia badanychzwiązków wyzna
czonew moczu kobietpalących ponad 10 Papierosów dziennie przedstawiono w ta
beli VI.
Przykładowy rozdział chromatograficz ny nikotyny, kotyniny, trans-3'-hydroksyko- tyniny, nornikotyny, N-tlenku nikotyny i N- tlenku kotyniny wmoczujednej zbadanych pacjentek przedstawionona rycinie 1.
Ze względuna dużą różnicę stężeńpo
między kotyniną, trans-3'-hydrosykotyninąi pozostałymimetabolitami koniecznym było przeprowadzenieoznaczeńprób bezpośred
nio po ekstrakcjioraz po 5- lub 10-krotnym rozcieńczeniu.
Dyskusja
Nikotyna będąca głównym alkaloidem tytoniu występuje zarówno w głównym stru
mieniu dymu,jak i w bocznym,na który na
rażeni sąbierni palacze. Oznaczanieniko
tyny może być wykorzystywane dooceny
narażenia na składniki dymu tytoniowego, ale ze względuna jej krótkibiologiczny okres półtrwania nieznalazło onozastosowania w praktyce. Natomiast podstawowy meta bolit nikotyny - kotynina, mająca biologicz ny okres półtrwania około 17 godzin, jest najczęstszym biomarkerem aktywnego i biernego palenia [9,14,21]. Innym po wszechniestosowanym biomarkerem nara
żenia na dym tytoniowyjest trans-3'-hydrok- sykotynina [2,12,20]. Łączne oznaczanie nikotyny, kotyniny, trans-3'-hydroksykotyni- ny i ichglukuronianów odpowiada za 80%
wchłoniętej nikotyny [3].
Do tej pory opracowano wiele metod pozwalających naoznaczenie nikotyny i jej metabolitów wróżnym materialebiologicz
nym (mocz, krew, surowica, ślina). Najczę
ściej stosowaną techniką analityczną jest chromatografia z różnymi detektorami;
spektrofotometrycznym, diodowym,a obec nie coraz częściej detektoremmasowym.
Obok metodHPLCrównież chromatografia gazowa, metody radioimmunologicznei en- zymoimmunologiczne znajdujązastosowa- niewtego typuoznaczeniach [6]. Zasadni
cze różnicepomiędzy tymi metodamidoty
czą ich czułości, co wiąże się z możliwo
ściami oznaczeń metabolitów w różnych materiałach. W przypadkusurowicy czyśli ny,w których związki tewystępują w niskich stężeniach koniecznym jest zastosowanie chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrem mas, umożliwiającym ozna czenieich w materialebiologicznymna po
ziomie 0,5-1 ng/ml [4,19]. W przypadku oznaczania nikotyny i jej metabolitów w moczu,w którym ich stężenie jestkilka, a nawetkilkaset razy wyższe, do oznaczeń można wykorzystać wysokosprawnąchro matografię cieczową z detektorem spektro fotometrycznym.
W badaniach przeprowadzonych w 2006roku [17] zwrócono uwagę na alterna tywne źródło danycho narażeniu na działa
nie nikotyny. Autorzypostanowili porównać pobraną dawkę nikotyny poprzez 3 różne analizy: analizęfiltra wypalonego papiero sazwykorzystaniem GC, oznaczanie po
ziomu kotyniny w ślinie oraz oznaczanie metabolitów nikotyny w24-godzinnejprób cemoczu za pomocąLC/MS-MS. Wykaza
nopozytywnestrony wykorzystania filtrów papierosowych do oceny narażeniana dym tytoniowy. Jest to jedna zmniejinwazyjnych opcji pozyskiwaniamateriałudobadań, któ
ra dostarcza informacji o stopniu indywidu alnejekspozycji nanikotynę. Istotnym jest, że nie zmienia codziennych nawyków zwią zanych z paleniem tytoniu. Autorzy dowie dli, że wszystkie wyniki uzyskane trzema drogamiznaczącoze sobą korelowały, naj
lepszą zaś korelacje wykazywały metody:
analiza filtra oraz analizanikotyny wmoczu i jej metabolitów(kotynina,3-hydroksykoty- nina oraz odpowiednie glukuronidy). Pod kreślono znaczenieanalizy filtrów jako me tody mało skomplikowanej i nieinwazyjnej, umożliwiającej polepszenie współpracy mię dzy osobami badanymi i badaczami wprzy szłości.
Do tejpory metoda HPLC z detektorem UV-VIS lub DAD stosowana była do ozna czeń nikotyny, kotyniny, trans-3'-hydroksy- kotyniny i ich glukuronidów [1,11,15], lecz
Tabela IV
Powtarzalność pomiędzy dniami metody oznaczania nikotyny,kotyniny, trans-3'-hydroksykotyniny, nornikotyny,N-tlenku nikotyny i N-tlenku kotyninyw moczu.
Intra-day precision of determination of:nicotine, cotinine, trans-3'-hydroxycotinine, N-nicotine oxideand N-cotinine oxide.
Parametr Stężenie zadane [ng/ml] Średniestężenie oznaczone [ng/ml] CV [%]
Nikotyna
250 231 11,3
1500 1432 7,6
Kotynina
250 259 6,2
1500 1597 6,5
Trans-3'-hydroksykotynina
250 226 12,5
1500 1401 8,7
Nornikotyna
250 197 15,8
1500 1378 11,3
N-tlenek nikotyny
250 263 6,9
1500 1582 9,9
N-tlenek kotyniny
250 ND ND
1500 ND ND
TabelaV
Odzysk badanych związków z moczu.
Recovery of analytes fromurine.
Związek Stężenie [ng/ml standardu lub moczu] Odzysk[%]
Nikotyna 10 43
Kotynina 1 87
Trans-3'-hydroksykotynina 1 71
Nornikotyna 0,2 31
N-tlenek nikotyny 1 82
N-tlenekkotyniny 0,5 ND
Tabela VI
Stężenienikotyny i jej metabolitów wmoczu kobiet palących tytoń.
Concentration of nicotine and metabolites in urine ofsmoking women.
Pacjentka
Stężenie w moczu[ng/ml]
Nikotyna Kotynina Trans-3'-hydroksy
kotynina Nornikotyna Tlenek nikotyny Tlenek kotyniny
1 326 1176 4254 375 241 ND
2 567 722 522 129 737 ND
3 637 2224 2005 140 439 ND
4 850 1077 2298 115 212 ND
nie stosowano jej do oznaczaniametaboli tów nikotyny występujących w mniejszych ilościach,takich jak: nornikotyna, N-tlenek nikotynyczy N-tlenek kotyniny.
W podjętych badaniach opracowano metodę HPLC z detektorem spektrofotome- trycznym umożliwiającą oznaczenie nikoty
ny i jej czterech metabolitów wmoczuosób palących tytoń.
Granicaopracowanej metodywynoszą
ca 100 ng/ml moczu, przyzałożeniuniektó rych autorów,żeuosób niepalącychana
rażonych na ETS stężenie kotyniny może osiągać 200 ng/ml [5] umożliwiawykorzy
stanie jejdo oznaczanianikotyny i metabo
litówu osób narażonychna wysokiestęże
nia nikotyny wpowietrzu. Dooznaczeń me
tabolitów na niższym poziomie konieczne jest zastosowanie metodychromatograficz
nej sprzężonej ze spektrometrią mas, a szczególnie z tandemem spektrometrów masowych.Stosując tę metodę Moyer był
w stanie oznaczać metabolity nikotyny na poziomie0,5-5 ng/ml [13].
Jeszcze niższestężenia nikotynyi jej metabolitów (0,1-0,2 ng/mlz wyjątkiemni kotyny 1 mg/ml) oznaczałXu opracowaną przez siebie metodą LC/MS-MS [22].W przeciwieństwie dotejmetody umożliwiają cej rozdzielenie nikotyny i jej5metabolitów (kotynina, trans-3'-hydroksykotynina,norni kotyna,N-tlenek nikotyny, N-tlenek kotyni
ny) w opracowanejmetodzie własnej N-tle
nek kotyniny był maskowanyprzezpiki po
chodzące od tła biologicznegomoczu i po
mimo zmiany warunków rozdziału z izokra- tycznych nagradientowe nieuzyskano cał kowitegorozdziału badanychzwiązków.
Powtarzalność opracowanej metody w ciągu dniabyła zadawalająca,współczyn
nikzmienności wynosił poniżej 10% i tylko w przypadkunornikotyny wniskim stężeniu (250 ng/ml) byłrówny 12,7%. Podobnewy niki uzyskał Xu [22].Również wbadaniach
własnych, pomimo,że współczynnikzmien
nościdla nikotyny wynosił poniżej 10% to jednak był najgorszy ze wszystkich ozna czanych związków i wynosił 9,0%.Znacz
nie większe współczynniki zmienności wcią gu dnia, jak i pomiędzy dniami w wielu wy padkach przekraczające 10% uzyskałw swoichbadaniach Moyer [13].
W przeprowadzonych badaniachwyko rzystano prostą metodę ekstrakcji ciecz- ciecz za pomocą dichlorometanuześrodo
wiska zasadowego (pH=10). Próba zastą
pieniadichlorometanuoctanemetylu popra
wiła wydajność ekstrakcji, ale zarazem zwiększyła interferencjębadanych związków zeskładnikamitła pochodzącymi od moczu.
Stosującekstrakcję SPE z wykorzysta niem kolumienekOasis HLB, Xu uzyskał dla wszystkichbadanych związków bardzo do bry odzyskprzekraczający 70% z wyjątkiem nornikotyny, dlaktórej wynosił 60%[22]. W badaniachwłasnych odzysk byłzbliżony dla kotyniny, trans-3'-hydroksykotyniny i N-tlen- ku nikotyny, ale około dwukrotniemniejszy dla nikotyny i nornikotyny. Podobnie niską wydajność dla nikotyny, poniżej 40% uzy
skał stosując opracowaną przez siebie me
todę ekstrakcji SPEMoyer,lecz w jego me
todzie odzysk trans-3'-hydroksykotyniny był około dwukrotnie mniejszy niż wopracowa nejmetodzie[13].
Wadą opracowanej metody była ko
nieczność dwukrotnej analizy ze względu na znaczne różnice pomiędzystężeniamipo
szczególnych metabolitów. Kotynina i trans- 3'-hydroksykotyninawystępują w znacznie wyższych stężeniach niż nikotyna i norni kotyna.
Przydatność opracowanej metody sprawdzono oznaczając metabolity u pa
cjentów: 4 kobietpalącychtytońi 3 niepalą cych.U żadnejz badanych kobiet niepalą
cych nie wykazano obecnościnikotynyi jej metabolitów. Natomiast oznaczenia wyko nanew moczu kobiet palących, co najmniej 10 papierosów dziennie wykazały obecność nikotynyi wszystkich badanych metabolitów tego alkaloidu. W badanych próbach wnaj większych stężeniachwystępowała kotyni na i trans-3'-hydroksykotynina. W dwóch próbach większe stężenie wykazano dla kotyniny, adla dwóch innych- trans-3'-hy- droksykotyniny. Pozostałe metabolitywystę
powaływ dwu dotrzykrotnie niższym stę
żeniu niż kotynina i trans-3'-hydroksykoty- nina.
Przeprowadzone badania wykazały przydatność opracowanej metody do ozna
czania nikotyny i jejmetabolitów jakkolwiek wymaga dalszychbadań w celuumożliwie
nia oznaczanie N-tlenku kotyniny i zwięk
szenia wydajnościekstrakcji.
Wnioski
1. Opracowana prostai szybka metoda HPLC pozwalana oznaczanienikotynyi jej czterech metabolitów (kotyniny, trans-3'- hydroksykotyniny, nornikotyny,N-tlenku ni
kotyny) na poziomiewystępującym w mo
czuosób palących tytoń.
2. Metoda wymaga dalszych modyfika cji pozwalających naoznaczenie kolejnego metabolitu - N-tlenku kotyniny, który obec
nie interferuje ze składnikami tła biologicz
nego moczu.
596 Przegląd Lekarski 2009 /66/10 W. Piekoszewski i wsp-
3. Zwiększenie wydajności ekstrakcji nikotyny i nornikotyny pozwoliłoby na ozna czanietych metabolitów uosóbnarażonych na dym tytoniowy w środowisku (ETS).
Piśmiennictwo
1. Baranowski J., Pochopień G., Baranowska I.: De termination of nicotine,cotinine and caffeine in meco nium using high-performance liquid chromatography.
J. Chromatogr. B. 1998, 707, 317.
2. Benowitz N.L., Jacob IIIP.: Trans-3'-hydroxycotinine:
disposition kinetics, effects and plasma levels dur ing cigarette smoking; Br. L. Clin. Pharmacol. 2001, 51,53.
3.Benowitz N.L., JacobP. 3rd,Fong I., Gupta S.:
Nicotine metabolicprofile inman:comparisonof ciga
rette smokingandtransdermalnicotine. J. Pharma col. Exp. Ther. 1994,268, 296.
4. BentleyM.C., AbrarM.,Kelk M. et al.: Validation of an assayforthe determination ofcotinine and 3- hydroxycotinine in human saliva usingautomated solid-phaseextractionand liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection. J.
Chromatogr. B. 1999, 723,185.
5.Dahlstrom A., Lundell B., Curvall M.,ThapperL:
Nicotine and Cotinine Concentrations in the Nursing Mother andHer Infant. ActaPaediatr. Scand. 1990, 79,142.
6.DavisR.A., Curvall M.:Determination of nicotine and itsmetabolites inbiologicalfluids: in vivo stud ies. [In:] Gorrod J.W., JocobP. (eds.)Analyticalde termination of nicotine andrelated compoundsand their metabolites. Amsterdam, ElsevierScience, 1999, 583.
7. Dhar R: Measuring tobaccosmoke exposure: quan
tifying nicotine/cotinine concentrationinbiological
samples by colorimetry, chromatographyand immu noassay methods. J. Pharm. Biomed.Anal. 2004,35, 155.
8. HariharanM., VanNoord T, GredenJ.F.: A high- performance liquid-chromatographic method for rou tine simultaneousdetermination ofnicotine and cotininein plasma. Clin.Chem. 1988, 34, 724.
9.Hutchinson J., Yousef T., RobertT.: Rapid method forthe simultaneous measurementofnicotineand cotinineinurineand serum bygas chromatography
mass spectrometry. J.Chromatogr. B. 1998,708,87.
10. Jacqz-Algrain E., Zhang D., Malllard G. et al.: Ma ternal smokingduringpregnancy and nicotine and cotinine concentrations in maternal and neonatal hair.
Br. J. Obstet. Gynaecol,2002,109, 909.
11.Kędziora H., Florek E.,Piekoszewski W.i. wsp.:
Stężenie kotyninyi trans-3’-hydroksykotyniny orazich glukuronidóww moczu kobiet ciężarnych palących tytoń. Przegl. Lek, 2007, 64,740.
12.Lerman C., Tyndale R., Patterson F. et al.: Nicotine metabolite ratio predictsefficacy oftransdermal nico
tine for smoking cessation.Clin. Pharmacol.Ther.
2006, 79, 600.
13.Moyer T.P., CharlsonJ.R.,EngerR.J. et al.: Simul
taneous analysis ofnicotine, nicotine metabolites, and tobacco alkaloids inserum or urine bytandem mass spectrometry with clinically relevant metabolic profiles.
Clin. Chem.2002, 48,1460.
14.Naldong W., Shou W., Chen Y,Jiang X.:Novel liq uid chromatographic-tandem massspectrometric methodsusingsilica columns and aqueous-organic mobilephases forquantitative analysis ofpolar ionic analytes in biological fluids. J. Chromatoqr. B, 2001, 754, 387.
15.NakajimaM., YamamotoT., KurolwaY., YokolI:
Improvedhighlysensitive method fordetermination of nicotine and cotinine inhuman plasma by high-
performance liquid chromatography. J. Chromatoqr.
B. 2000, 742,211.
16.Stanek A., PiekoszewskiW., Florek E. iwsp.:
Zastosowanie metodyenzymoimmunologicznej do oznaczaniakotyniny w moczu; Przegl. Lek. 2007, 64,734.
17. St.Charles F.K.,KrautterG.R., Dixon M., Mariner D.C.: A comparisonof nicotine dose estimates in smokers between filter analysis, salivary cotinine, and urinaryexcretion of nicotinemetabolites. Psy- cho-pharmacol.2006,189, 345.
18.Szymborski J., Laskowska-Klita T., Mazur J.:
Zdrowie naszychdzieci. Dzieciństwo wolne od tytoniu. Instytut Matki i Dziecka, Warszawa,2001.
19.TuomiI, JohnssonI, Reijula K.: Analysisof nico
tine, trans-3-hydroxycotinine, cotinine,and caffeine in urineof passive smokers byHPLC-tandemmass spectrometry. Clin. Chem. 1999,45, 2164.
20.Tyrpień K., Wielkoszyński T, Kowalska M. et al.:
Ocenaczęstości występowaniakotyniny i trans-3'- hydroksykotyniny w wybranychpróbkachpłynów ustrojowych. Przegl.Lek.2006,63, 897.
21.WiergowskiM., Nowak-Banasik L, Morkowska A. et al.: Problematyka oznaczania nikotyny i kotyniny wludzkim materiale biologicznym w aspekcie badań toksykologicznych. Przegl.Lek.
2006, 63, 892.
22.Xu X., tbaM.M., Weisel C.P.: Simultaneousand sensitive measurement of anabasine, nicotine, and nicotine metabolites in human urine by liquid ghroma-tography-tandem mass spectrometry. Clin.
Chem. 2004, 50, 2323.
23.Ziegler U.E., KauczokJ., DietzU.A. et al.:Clinical correlation between the consumption of nicotine and cotinineconcentrationsinurineandserumby com
petitiveenzyme-linked immunosorbent assay. Phar
macology 2004, 72, 254.
