Spis treści
I.WSTĘP ... 5
II. PODSTAWY TEORETYCZNE ... 6
1. Ogólna charakterystyka flawonoidów ... 6
1.1. Budowa i występowanie flawonoidów ... 6
1.2. Rola i znaczenie flawonoidów ... 7
1.2.1. Funkcje flawonoidów w roślinach ... 8
1.2.2. Wpływ flawonoidów na zdrowie człowieka ... 8
2. Techniki identyfikacji flawonoidów ... 10
2.1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa jako główna technika identyfikacji flawonoidów ... 11
2.1.1. Detektory ... 12
2.2. Budowa i zasada działania spektrometru mas ... 12
2.2.1. Jonizacja poprzez elektrorozpraszanie ... 13
2.2.2. Analizator kwadrupolowy ... 14
3. Tandemowa spektrometria mas ... 15
3.1. Potrójny analizator kwadrupolowy ... 16
3.1.1 Tryby monitorowania ... 16
3.2. Fragmentacja flawonoidów ... 17
4. Inne techniki analizy flawonoidów ... 19
III. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA ... 21
1. Odczynniki i aparatura ... 21
1.1. Aparatura ... 21
1.2. Odczynniki ... 21
2. Przygotowanie próbki ... 21
3. Parametry pracy aparatu ... 22
4. Uzyskane wyniki analizy flawonoidów ... 24
5. Wnioski ... 32
Literatura ... 33
Wykaz skrótów
API Atmospheric Pressure Ionization jonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym APCI Atmospheric Pressure Chemical jonizacja chemiczna pod ciśnieniem
Ionization atmosferycznym
BPC Base Peak Chromatogram chromatogram głównych pików CE Capillary Electrophoresis elektroforeza kapilarna
CE Collision Energy energia kolizji
CID Collision(ally) Induced rozpad pobudzony przez kolizję Dissociation
dc direct current napięcie stałe
ESI Electrospray Ionization jonizacja przez elektrorozpraszanie
GC Gas Chromatography chromatografia gazowa
HPLC High Pressure Liquid wysokosprawna chromatografia Chromatography cieczowa
LC Liquid Chromatography chromatografia cieczowa
MI Mother Ion tryb monitorowania jonu macierzystego
MRM Metastable Reaction Monitoring tryb monitorowania reakcji metastabilnych
MS Mass Spectrometry spektrometria mas
MSMS Tandem Mass Spectrometry tandemowa spektrometria mas m/z mass to charge ratio stosunek wartości masy do liczby
ładunków
NL Neutral Loss tryb monitorowania jonów tracących
fragmenty obojętne o stałej masie
PI Product Ion tryb rejestrowania jonów potomnych
Q Quadrupol analizator kwadrupolowy
RDA Retro Diels-Alder (Reaction) (reakcja) retro Dielsa-Aldera rf radio-frequency zmienne napięcie o częstotliwości
radiowej
SIM Selected Ion Monitoring tryb monitorowania wybranych jonów
TIC Total Ion Current całkowity prąd jonowy
TOF Time of Flight analizator czasu przelotu
I.WSTĘP
Spektrometria mas jest uniwersalną techniką analityczną, którą wykorzystuje się w wielu dziedzinach, np. ochronie środowiska, kontroli antydopingowej, narkotykowej, farmakologii czy diagnostyce medycznej. Zastosowanie odpowiedniego sposobu jonizacji próbki pozwala także na łączenie jej z różnymi technikami chromatograficznymi, które umożliwiają rozdzielanie składników badanej mieszaniny. Jednym z częściej stosowanych układów tego typu jest sprzężenie wysokosprawnej chromatografii cieczowej z tandemowym spektrometrem mas z jonizacja poprzez elektrorozpraszanie (HPLC–ESI MS/MS). Pozwala on identyfikować związki nie tylko w oparciu o informacje dotyczące ich retencji, ale także dostarcza danych o ich budowie strukturalnej. Rodzaj uzyskanych informacji zależy od wielu czynników, jak np. typu stosowanego analizatora, rodzaju polaryzacji czy parametrów pracy aparatu. Decydujący wpływ na jakość rejestrowanych chromatogramow i widm mas mają tryby zbierania jonów, dzięki którym detektor spektrometrii mas może być skutecznym narzędziem stosowanym zarówno w analizie jakościowej, jak i ilościowej. Podstawowe informacje dotyczące mas cząsteczkowych związków można uzyskać w wyniku skanowania pełnego zakresu jonów, podczas gdy zastosowanie trybów takich jak monitorowanie jonów potomnych bądź macierzystych, a także przemiatanie jonów tracących fragmenty obojętne o stałej masie pozwalają ustalić obecność określonych grup funkcyjnych lub układów atomów w cząsteczce. Tryby monitorowania wybranych jonów bądź reakcji następczych dodatkowo zwiększają czułość prowadzonych analiz i stanowią podstawę badań ilościowych.
Celem pracy było przeprowadzenie analizy mieszaniny wybranych flawonoidów (fizetyny, izoramnetyny, kwercetyny oraz genisteiny) z zastosowaniem układu HPLC–ESI QqQ MS w różnych trybach monitorowania jonów, a także porównanie i określenie ich wpływu na jakość zarejestrowanych chromatografów oraz widm mas.
II. PODSTAWY TEORETYCZNE 1. Ogólna charakterystyka flawonoidów
Związki flawonoidowe stanowią liczną grupę metabolitów wtórnych, powszechnie występujących w świecie roślin. Są one obecne m.in. w liściach, kwiatach, owocach, korze oraz nasionach i pełnią wiele bardzo ważnych funkcji. Ponadto są składnikami wielu substancji pokarmowych, przez co stanowią ważny element diety człowieka. Przez wieki były one jednak cenione nie tylko ze względu na swą znaczną aktywność biologiczną, ale były także wykorzystywane jako barwniki zaprawowe stosowane do farbowania odzieży, skór, papieru, przygotowywania pigmentów malarskich. Obecnie poznano 6000 różnych flawonoidów, jednak liczba ta stale ulega zmianie [1].
1.1. Budowa i występowanie flawonoidów
Flawonoidy należą do grupy związków o budowie polifenolowej. Ich podstawowa struktura złożona jest z dwóch pierścieni aromatycznych A i B połączonych wiązaniem podwójnym oraz grupą karbonylową (rysunek 1) [2]. Trójwęglowy mostek jest przekształcany w pierścień heterocykliczny tzw. γ-piron (rysunek 2) [3]. Tak więc flawonoidy tworzą charakterystyczny układ pierścieni aromatycznych, tzw. jednostkę C6-C3- C6 (rysunek 3) [4].
Rysunek 1. Charakterystyczny dla flawonoidów układ C6-C3-C6
Rysunek 2. γ-Piron (linia ciągła) Rysunek 3. Wzór ogólny flawonoidów O
O C
B A
O
H H
B A
O
O C
B A
Flawonoidy można podzielić na szereg podstawowych klas, wśród których wyróżniamy:
flawonole, flawony, flawanony, flawon-3-ole, izoflawony oraz chalkony (tabela 1) [5], wśród których istnieje duże zróżnicowanie budowy związane ze stopniami utlenienia węgla w pierścieniu heterocyklicznym [6]. Również inne różnice w budowie flawonoidów są wykorzystywane podczas klasyfikacji i dotyczą one:
liczby i lokalizacji grup hydroksylowych oraz metoksylowych w pierścieniu,
liczby przyłączonych cząsteczek cukrów (najczęściej glukozy lub galaktozy),
rodzaju wiązania glikozydowego (C- lub O- ) występującego pomiędzy aglikonem a jednostką cukrową,
rozmiaru cząsteczek [7].
Tabela 1. Wybrane klasy flawonoidów i ich przedstawiciele [8]
Klasa flawonoidów Wzór Przykłady związków
flawonole kwercetyna, kempferol,
myrycetyna, moryna
flawony luteolina, apigenina
flawanony hesperydyna, naryngenina
flawan-3-ole katechina, tefalwin
izoflawony daidzeina, genisteina, glicyteina
chalkony mareina, kartamina, saflominy
1.2. Rola i znaczenie flawonoidów
Flawonoidy odgrywają znaczącą rolę w fizjologii roślin, przyczyniając się do ich prawidłowego funkcjonowania. W związku z powyższym wiele roślin, w których występują flawonoidy, jest wszechstronnie wykorzystywanych w profilaktyce i leczeniu rozmaitych schorzeń. Zachowanie odpowiedniego poziomu ich spożycia jest bardzo ważnym elementem w profilaktyce powstawania wielu chorób [7].
O
O O
O
O
O O O
OH O
O OH
1.2.1. Funkcje flawonoidów w roślinach
Flawonoidy spełniają różnorodne funkcje w procesach fizjologicznych i biochemicznych zachodzących w komórkach roślinnych, m.in.:
warunkują ubarwienie roślin (flawonole, flawony i chalkony są odpowiedzialne za żółte zabarwienie fragmentów roślin, natomiast antocyjany warunkują ubarwienie niebieskie, fioletowe lub czerwone) [6];
determinują smak i zapach owoców oraz kwiatów (rośliny oraz owoce są rozpoznawalne dla ptaków, ssaków i owadów przenoszących pyłek lub nasiona) [6];
odstraszają (glikozydowe pochodne flawonoidów odgrywają rolę naturalnych repelentów, czyli czynników odstraszających inne organizmy, np. zwierzęta roślinożerne) [7];
chronią przed promieniowaniem nadfioletowym (flawonoidy stanowią barierę ochronną roślin przed szkodliwym działaniem promieniowania nadfioletowego dzięki występowaniu w cząsteczce układów chromoforowych) [6];
modulują transport auksyn zachodzący przy udziale białek nośnikowych i transporterów [7].
1.2.2. Wpływ flawonoidów na zdrowie człowieka
Bogatym źródłem flawonoidów jest codzienna dieta. Związki te są składnikami wielu produktów żywnościowych, m.in. warzyw (np. soja), owoców, herbaty (gł. zielonej), kawy, kakao oraz czerwonego wina (tabela 2) [2]. Związki te występują w dwóch formach: wolnej, w postaci aglikonów oraz w połączeniu z cukrami, czyli tzw. glikozydów [9]. Obie te formy są wchłaniane w jelicie. Dzienne ich spożycie jest zróżnicowane, gdyż zależy od nawyków żywieniowych poszczególnych populacji, przez co waha się od kilku miligramów do jednego grama [1].
Tabela 2. Przedstawiciele głównych klas flawonoidów oraz ich występowanie [2]
Związek Występowanie
daidzeina genisteina soja
kwercetyna cebula,
herbata, jabłka
O
O
OH O
H
O
O O H
OH OH
OH OH
O
OH O
OH
O H
Związek Występowanie
apigenina luteolina seler ,
czerwona papryka
hespertyna naryngenina pomarańcze,
grejpfruty
epikatechina kiwi,
czerwone wino, zielona herbata,
czekolada
Flawonoidy postrzegane są jako substancje odpowiedzialne za prawidłową pracę narządów oraz kontrolę procesów zachodzących w poszczególnych organach [7], dlatego też wykorzystywane są jako naturalne leki w terapii różnych schorzeń (tabela 3).
Tabela 3. Wybrane flawonoidy oraz ich wpływ na procesy zachodzące w organizmie ludzkim [7]
Działanie Mechanizm działania Związek czynny Roślina/organ antyoksydacyjne hamują aktywność
enzymów tworzących wolne rodniki, chelatują jony metali
przejściowych, redukują reaktywne formy tlenu, zapobiegają utlenianiu witaminy C
ginkgetyna biolbetyna
liść miłorzębu
przeciwzapalne i przeciwagregacyjne
zmniejszają syntezę czynników prozapalnych i proagregacyjnych
bajkalina wogonina ginkgolid
liść miłorzębu
przeciwzapalne, przeciwbólowe, przeciwobrzękowe, przeciwgorączkowe
hamują syntezę histaminy kwercetyna kempferol hiperozyd tilirozyd nepetryna
kwiat jasnoty, kwiat bzu, kwiatostan lipy, liść rozmarynu
naczynioochronne (uszczelniają nabłonek naczyń)
hamują działanie hialuronidazy i elastazy (wzmacniają tkankę)
witeksyna kwercetyna hiperozyd
kwiatostan głogu, kwiat i liść kasztanowca, pączki kwiatowe perełkowca
O
O O H
OH
OH
O
O O H
OH OH
OMe
O
O O H
OH OH
OH OH
O O OH
O H
OH OH
OH O
O H
OH O
Działanie Mechanizm działania Związek czynny Roślina/organ spazmolityczne -
rozkurcz mięśni gładkich, naczyń krwionośnych serca, jelit, dróg żółciowych i moczowych, oskrzeli
hamują fosfodiesterazę cAMP
naringenina apigenina luteolina izosalipurpozyd
kwiatostan kocanek, kwiatostan i owoce głogu
hipotoniczne - obniżają ciśnienie krwi i opory obwodowe
hamują działanie enzymu konwertującego
angiotensynę
pueraryna astragalina
korzeń opornika, kwiatostan i owoc głogu, kwiatostan arniki moczopędne rozkurczają mięśnie
gładkie dróg moczowych, drażnią ściany kanalików nerkowych i utrudniają resorpcję zwrotną
kwercetyna ekwizetryna luteolina
liść brzozy, liść
ortosyfonu, ziele skrzypu, ziele nawłoci
hepatoprotekcyjne (działanie ochronne na miąższ wątroby)
aktywują syntezę białka uszczelniającego błony komrkowe hepatocytów
sylimaryna - zespół flawonolignanów
owoc ostropestu
uzupełniające niedobory
estrogenów wiążą się z receptorami estrogenowymi
genisteina soja
zmniejszające chęć
spożycia alkoholu opóźniają metabolizm alkoholu, prowadzą do nagromadzenia się w organizmie aldehydu octowego
nieznany korzeń ołownika
2. Techniki identyfikacji flawonoidów
Związki flawonoidowe w przyrodzie najczęściej występują w postaci mieszanin, dlatego przed przystąpieniem do ich identyfikacji konieczne jest rozdzielanie jej składników.
Najczęściej w tym celu stosowane są: elektroforeza kapilarna (CE) oraz techniki chromatograficzne (chromatografia gazowa i cieczowa).
Elektroforeza kapilarna (CE) umożliwia jednoczesne rozdzielanie zarówno związków polarnych, jak i niepolarnych [7], nie jest jednak skuteczna przy rozdzielaniu flawonoidów [7]. W technice tej stosowane są niewielkie przepływy elektrolitu w wyniku czego przy połączeniu jej z detektorem spektrometrii mas niezbędne jest zastosowanie roztworu uzupełniającego. Fakt ten, jak i mała objętość próbki wprowadzanej do kapilary wpływają niekorzystnie na czułość połączenia CE–MS. Dodatkowe rozcieńczenie próbki przyczynia się do braku wyraźnego sygnału na elektroferogramie. Obecność stałych soli w buforach
stosowanych w elektroforezie kapilarnej utrudnia wykonanie analizy w sprzężeniu ze spektrometrią mas, gdyż powodują one zanieczyszczenia szczelin analizatora oraz komory jonizacyjnej [7], a także obniża wydajność procesu jonizacji [7].
Ważne w identyfikacji flawonoidów są techniki chromatograficzne. Chromatografia jest fizykochemiczną metodą rozdzielania, w której składniki mieszaniny ulegają podziałowi między dwie fazy; fazę stacjonarną oraz fazę ruchomą [10], a rozdzielanie jest funkcją efektów termodynamicznych i kinetycznych zachodzących w układzie chromatograficznym.
Fazą ruchomą może być gaz, ciecz lub płyn w stanie nadkrytycznym, a fazą nieruchomą – ciało stałe lub ciecz [11].
Chromatografia gazowa (GC) jest głównie wykorzystywana do analizy małocząsteczkowych, niepolarnych oraz stabilnych termicznie związków organicznych [12].
Substancje polarne i termolabilne wymagają przekształcenia w związki bardziej lotne i termicznie trwałe w wyniku derywatyzacji polegającej na blokowaniu polarnych grup funkcyjnych (hydroksylowych, aminowych, karboksylowych) odpowiednimi grupami chemicznymi, np.: podczas reakcjach silanowania [12]. Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania flawonoidów, z uwagi na ich małą lotność, wymaga dodatkowego przygotowania próbki [13]. Ponadto w ich analizie mogą przeszkadzać występujące często w próbce metabolity pierwotne (np. cukry) [12].
Chromatografia cieczowa jest najbardziej uniwersalną metodą ze względu na możliwości analizy produktów naturalnych o szerokim zakresie właściwości fizykochemicznych [12].
2.1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa jako główna technika identyfikacji flawonoidów
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest jedną z najpowszechniejszych i najbardziej uniwersalnych technik analitycznych stosowanych obecnie w laboratoriach. Jest ona również techniką wykorzystywaną podczas rozdzielania związków flawonoidowych. Jest używana do rozdzielania związków polarnych, niepolarnych [13] oraz substancji trudnolotnych, w przypadku których zastosowanie chromatografii gazowej jest niemożliwe [13]. Znajduje ona zastosowanie w: przemyśle spożywczym, analizach sądowych, branży farmaceutycznej i petrochemicznej, przy opracowaniu nowych leków oraz w badaniach środowiskowych. Chromatografia cieczowa jest techniką rozdzielania związków, a więc konieczne jest zastosowanie odpowiedniego detektora.
2.1.1. Detektory
Detektory stosowane w połączeniu z wysokosprawną chromatografią cieczową można podzielić na trzy grupy: spektroskopowe, elektrochemiczne i radiochemiczne [14]. Do identyfikacji flawonoidów najczęściej stosowane są detektory zaliczane do pierwszej z nich, tj. detektor spektrofotometryczny w zakresie UV, detektor spektrofluorometryczny oraz detektory spektrometrii mas [15].
Detekcja w nadfiolecie polega na rejestracji chromatogramów przy długościach fali dobranej indywidualnie dla danego związku na podstawie maksimum ich krzywych absorpcji.
Widma UV flawonoidów posiadają dwa maksima, jedno występuje przy długości fali 240 – 285 nm i odpowiada pierścieniom aromatycznym, natomiast drugie, obecne w zakresie 300 – 350 nm jest zależne od występujących grup funkcyjnych. Analiza jakościowa flawonoidów nastręcza jednak pewnych problemów, m.in. uniemożliwia dokładną charakterystykę budowy glikozydów, czy określenie rozmieszczenia podstawników przy głównych pierścieniach [15].
Zastosowanie detekcji fluorymetrycznej jest możliwe wówczas, gdy związek posiada naturalną zdolność do fluorescencji. Wśród flawonoidów zdolność taką posiadają:
izoflawony, katechiny oraz flawony metoksylowe. Niektóre związki (m.in. mirycetyna, kwercetyna, kwercytryna i kaemferol) są jednak niewykrywalne tą techniką. Jej zastosowanie jest możliwe dopiero po przeprowadzeniu reakcji kompleksowania, m.in. z kationami glinu, co powoduje wzrost fluorescencji. Pozwala to osiągnąć większą czułość i selektywność w stosunku do detekcji w nadfiolecie [15].
2.2. Budowa i zasada działania spektrometru mas
Spektrometria mas zajmuje uprzywilejowane miejsce wśród technik instrumentalnej analizy. Podstawę pomiaru stanowi stosunek masy do ładunku (m/z). Każdy spektrometr mas składa się z następujących elementów: układu wprowadzania próbki, komory jonizacyjnej, analizatora jonów, detektora oraz rejestratora (rysunek 4).
Rysunek 4. Schemat blokowy spektrometru mas [16]
Pierwszym podzespołem jest układ wprowadzania próbki. Istnieją trzy sposoby wprowadzania próbki do spektrometru mas, które są wykorzystywane w zależności od
Detektor jonów i rejestrator Układ
wprowadzania próbki
Komora
jonizacyjna Analizator jonów
charakteru badanej substancji. Pierwszym z nich jest wprowadzanie bezpośrednie, które jest stosowane w przypadku ciał stałych i jednorodnych chemicznie. W przypadku próbek jednorodnych i łatwo lotnych stosuje się nastrzyknięcie do zbiornika podciśnieniowego. Z kolei do badania substancji niejednorodnych wykorzystuje się wejście poprzez chromatograf [16].
Kolejnym elementem spektrometru mas jest komora jonizacyjna w której substancje są poddawane procesowi jonizacji. Wykorzystanie w analizie odpowiedniego spektrometru związane jest z danym rodzajem chromatografii. Z wysokosprawną chromatografią cieczową łączy się najczęściej detektory pracujące pod ciśnieniem atmosferycznym. Należą do nich:
jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI), fotojonizacja (APPI), i jonizacja poprzez elektrorozpraszanie (ESI).
Wiązka jonów z komory jonizacyjnej kierowana jest do analizatora, w którym następuje ich rozdzielanie ze względu na stosunek ich mas do ładunku (m/z). Wśród najczęściej stosowanych analizatorów wyróżnić można: analizatory kwadrupolowe, analizatory czasu przelotu jonów oraz pułapki jonowe [14]. Jony z analizatora docierają do detektora i powodują przepływ prądu o natężeniu proporcjonalnym do ich liczby. Zmiany te są przetwarzane i przedstawiane w postaci widma mas, które stanowi zależność intensywności sygnałów od stosunku masy jonów do ich ładunku (m/z).
2.2.1. Jonizacja poprzez elektrorozpraszanie
Jonizacja poprzez elektrorozpraszanie (ESI) jest najczęściej stosowaną metodą jonizacji w spektrometrii mas. Ma na celu wytworzenie jonu z obojętnej cząsteczki. Zachodzi pod ciśnieniem atmosferycznym przy użyciu napięcia rzędu 2000-5000 V [17].
Rysunek 5. Schemat jonizacji poprzez elektrorozpraszanie
wysoka próżnia ciśnienie atmosferyczne
próbka
wysokie napięcie
gaz rozpylający
1. Powstawanie naładowanych kropli
2. Odparowanie roztworu
3. Odparowanie jonów z powierzchni
gaz osłonowy
gaz osłonowy napięcie na
fragmentatorze analizator
mas
Roztwór analitu przepuszczany jest przez kapilarną rurkę. Różnica potencjałów występująca pomiędzy zakończeniem rurki a pobliską elektrodą powoduje wytworzenie pola elektromagnetycznego. Wypływająca ciecz ulega naładowaniu i rozproszeniu tworząc mgiełkę kropel, z których następnie pod wpływem gorącego gazu odparowuje rozpuszczalnik.
Krople stają się coraz mniejsze, a ładunki zbliżają się do siebie i przesuwają się do powierzchni kropli, z których w dalszej kolejności uwalniane są cząsteczki analitów w postaci jonów (rysunek 5). W wyniku tak prowadzonej jonizacji otrzymuje się jony pseudocząsteczkowe, które mogą powstawać w wyniku protonowania lub deprotonowania.
Podczas protonowania, czyli przyłączenia protonu (jonu wodoru) otrzymuje się jon pseudocząsteczkowy w postaci [M+H]+, natomiast w wyniku deprotonowania jon [M-H]-.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas z jonizacją poprzez elektrorozpraszanie (HPLC-ESI MS) stanowi skuteczne narzędzie analityczne do analizy różnego rodzaju związków organicznych o szerokim zakresie polarności i mas (rysunek 6).
Rysunek 6. Zależności masy i polarności różnych technik jonizacji zachodzących pod ciśnieniem atmosferycznym [18]
2.2.2. Analizator kwadrupolowy
Analizator kwadrupolowy, nazywany filtrem kwadrupolowym, jest urządzeniem sekwencyjnym (skanującym) [19]. Składa się z czterech równolegle rozmieszczonych prętów o kulistym przekroju. Przeciwlegle pręty są połączone w pary, do których to przykładane są jednocześnie dwa rodzaje napięć: zmienne napięcie o częstotliwości radiowej (ang. radio- frequency, rf) oraz napięcie stałe (ang. direct current, dc) [19]. Wiązka jonów przemieszcza się wewnątrz analizatora po złożonych trajektoriach (torach przelotu). Jedynie jony o określonym stosunku m/z są przepuszczane selektywnie przez analizator i trafiają do detektora. Pozostałe jony o innym m/z ulegają rozogniskowaniu, przez co zderzają się z prętami, ulegają zobojętnieniu i nie docierają do detektora [16]. Aby móc zarejestrować sygnały jonów o innym stosunku m/z należy zmieniać wartości przykładanych napięć.
APCI APPI
ESI
Rys.5. Schemat jonizacji poprzez elektrorozpraszanie
polarność masa
Analizator kwadrupolowy posiada wiele zalet, ale również i pewne ograniczenia [16].
Najważniejszą zaletą jest prosta budowa oraz związane z nią małe wymiary analizatora. Oba czynniki przyczyniają się do jego niskiej ceny.
Rysunek 7. Budowa analizatora kwadrupolowego [14]
3. Tandemowa spektrometria mas
Tandemowa spektrometria mas (MS/MS) w drugiej połowie lat 90-tych XX wieku uzyskała wielkie zainteresowanie w analityce ze względu na unikatowe cechy, takie jak duża czułość, dokładność i selektywność. Metoda ta dostępna jest dzięki zastosowaniu spektrometrów posiadających dwa analizatory np.: kwadrupol i analizator czasu przelotu (QTOF) lub analizator wyposażony w pułapkę jonów. Polega na wyizolowaniu jonu macierzystego (ang. parent scan), poddaniu go fragmentacji a następnie obserwacji jonów potomnych (ang. daughter scan) [20]. W zależności od rodzaju zastosowanego spektrometru fragmentacja może odbywać się np. poprzez zderzenia jonów macierzystych z cząsteczkami gazu obojętnego (CID, ang. Collisionally Induced Dussociation).
Tandemowa spektrometria mas połączona z wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC) należy do najszybciej rozwijających się technik analizy związków organicznych.
Znalazła zastosowanie w wielu dziedzinach nauki i techniki. Jest stosowana m.in. w medycynie, farmacji, ochronie środowiska, badaniu żywności oraz kryminalistyce [21].
Sprzężenie obydwu układów daje szczególnie korzystne wyniki w analizie skomplikowanych mieszanin i możliwość uzyskania informacji o strukturze składników. Ponadto istnieje wiele zalet wynikających z połączenia efektywnej techniki rozdzielenia (HPLC) oraz selektywnej techniki detekcji (MS), wśród których wyróżniamy m.in.: dużą selektywność (umożliwia to oznaczanie badanej substancji w złożonych mieszaninach bez konieczności ich całkowitego rozkładu), czułość mniejszą nawet o jeden rząd wielkości w porównaniu do innych technik,
z
r0
x y
3.1. Potrójny analizator kwadrupolowy
W spektrometrii mas wykorzystuje się połączenia analizatorów. Przykładem łączenia filtrów jest potrójny analizator kwadrupolowy, który jak sama nazwa wskazuje posiada trzy analizatory połączone w sposób szeregowy (rysunek 8).
Rysunek 8. Schemat tandemowego spektrometru mas z potrójnym analizatorem kwadrupolowym [19]
Pomiędzy kwadrupolem pierwszym (Q1) a kwadrupolem trzecim (Q3) występuje komora kolizyjna (Q2). Pierwszy analizator służy do filtrowania wybranych jonów. W drugim analizatorze może zachodzić dysocjacja w której jony ulegają fragmentacji z utworzeniem jonów potomnych. W ostatnim kwadrupolu zachodzi proces skanowania umożliwiający detekcję jonów, pochodzących z komory kolizyjnej [23].
3.1.1 Tryby monitorowania
Spektrometry mas z analizatorem kwadrupolowym umożliwiają monitorowanie wybranych jonów w prosty sposób. Wartości napięcia przykładanego do prętów kwadrupola ulegają szybkim zmianom, co pozwala na detekcję kolejnych jonów o różnych masach [19].
Zmiany te mogą być regulowane płynnie w danym zakresie lub w sposób skokowy, indywidualnie przez każdy z kwadrupoli. Możliwość kombinacji różnych sposobów pracy poszczególnych analizatorów pozwala na pracę spektrometru w kilku trybach monitorowania jonów [23].
Rejestrowanie jonów potomnych (ang. Product Ion Scan), które polega na wybraniu w kwadrupolu pierwszym (Q1) jonu pierwotnego (macierzystego), a następnie odnalezieniu wszystkich jonów potomnych w kwadrupolu trzecim (Q3) powstających bezpośrednio w wyniku jego fragmentacji (Q2).
wprowadzenie próbki
kwadrupol Q1
kwadrupol Q2 (komora kolizyjna)
kwadrupol Q3
detektor oktopol
Rejestrowanie jonów macierzystych (ang. Precursor Ion Scan), polegające na wybraniu jonu potomnego (fragmentacyjnego) w kwadrupolu trzecim (Q3), a następnie odnalezieniu wszystkich jonów macierzystych (Q1) z rozpadu których powstał ten jon.
Śledzenie jonów tracących fragmenty obojętne o stałej masie (ang. Constant Neutral Loss Scan), polegające na wybraniu obojętnego fragmentu odrywanego podczas fragmentacji i odnalezieniu wszystkich jonów macierzystych, które podczas rozpadu tracą cząstkę obojętną o wybranej masie.
Różne tryby monitorowania jonów dostarczają informacji pozwalających na określenie struktury badanych związków. Informacje o masie cząsteczkowej związku chemicznego, jakich dostarcza zwykły spektrometr mas, często nie wystarczają do jego identyfikacji.
Analiza ścieżek fragmentacji w tandemowych spektrometrach mas umożliwia identyfikację wielu związków chemicznych.
3.2. Fragmentacja flawonoidów
Fragmentacja flawonoidów polega głównie na pękaniu wiązań w pierścieniu C. Opis każdej ścieżki fragmentacji na początku zawiera numer wiązania, które uległo rozpadowi, a następnie podawany jest fragment pierścienia, który pozostał (rysunek 9).
Q2 Q3
Q1
CID
Q2 Q3
Q1
CID
Q2 Q3
Q1
CID
Rysunek 9. Zasady oznaczenia ścieżek fragmentacji flawonoidów, gdziei, j - wiązania które ulegają pęknięciu;
A,B - fragmenty powstełe w wyniku rozerwania
Fragmentacja może być prowadzona w różnych polaryzacjach m.in. w trybie jonów dodatnich czy ujemnych przy zastosowaniu odpowiednich energii kolizji (rysunek 10) [24].
Rysunek 10. Ścieżki fragmentacji flawonoidów w trybie jonów dodatnich
Charakterystyczną reakcją, która zachodzi podczas fragmentacji flawonoidów w obu trybach jest reakcja retro Dielsa-Aldera (RDA) [24], polegająca na pękaniu wiązania 1 i 3, co prowadzi do powstania jonu 1,3B oraz obojętnego fragmentu pochodzącego od pierścienia A.
Flawonoidy ulegają również fragmentacji w trybie jonów ujemnych, która także polega na pękaniu wiązań w pierścieniu C w wyniku czego otrzymujemy odpowiednie jej ścieżki (rysunek 11).
Rysunek 11. Ścieżki fragmentacji flawonoidów w trybie jonów ujemnych O
O C
B A
O
O C
B A
0 1
2 3 4
5
i,jA
i,jB
3 2 4 5
0
A C
O B
O
1
3 2 4 5
0
A C
O B
O
1
3 2 4 5
0
A C
O B
O
1
3 2 4 5
0
A C
O B
O
1 0,2A+
1,3A+
[1,4A+2H]+
0,2B+
[0,4B-H2O]+ [1,3B-2H]+
1,3A+
1,3B+
1,2B+
[1,2A-H2O]+
0,4B+
0,2B+
3 2 4 5
0
A C
O B
O
1
3 2 4 5
0
A C
O B
O
1 1,3 A-
1,2 A-
0,3 B-
1,2 B -
1,3 B-
0,4 A-
[1,4B+2H]-
Podczas fragmentacji od cząsteczek flawonoidów odrywają się także małe fragmenty obojętne (tabela 4).
Tabela 4. Przykłady cząsteczek odrywanych podczas fragmentacji flawonoidów [24]
Cząsteczka odrywana podczas fragmentacji Masa, Da
CH3 15
H2O 18
CO 28
CH2O 30
C2H2O 42
CO2 44
4. Inne techniki analizy flawonoidów
Analiza flawonoidów jest bardzo popularna, gdyż bada się związki flawonoidowe obecne w herbatach, owocach czy też roślinach. Dokonuje się tego w różnych trybach monitorowania z zastosowaniem odpowiednich kolumn, eluentów, metod rozdzielania, detektorów czy przy różnych energiach kolizji (tabela 5).
Tabela 5. Zestawienie różnych technik analizy flawonoidów przy użyciu odpowiednich detektorów, eluentów, kolumn itp.
Związki Kolumna Eluent Metoda rozdzielenia Detektor Polaryzacja Tryb Frag. CE Zakres mas Lit.
glikozydy (6)
C–18 0,1% kwas mrówkowy (A), acetonitryl (B)
przepływ: 0,7 mL.min-1 0 min – 13% B, 8 min – 20% B,
10 min – 100% B
QQQ ujemna NL,
PI
310 V 30 V 100 – 700 m/z 25
flawonoidy (14)
C–18 98% kwas mrówkowy (A), acetonitryl (B)
przepływ: 0,3 mL.min-1 0 min – 30%B, 12 – 70% B,
19 – 80% B, 22 – 30% B
QQQ ujemna SIM nie
podano
35 – 55V
117, 181, 193, 208, 237 m/z
26
flawonoidy (6)
C–18 1% kwas mrówkowy (A), acetonitryl (B)
przepływ: 0,8 mL.min-1 0 min – 20% B, 30 min – 28% B,
45 – 100% B
Q TRAP ujemna IDA 100 V 40 eV 200 – 800 m/z 27
glikozydy (11)
kolumna ODS UG
5
0,1% kwas mrówkowy w wodzie (A) i 0,1%
kwasu mrówkowego w 80% acetonitrylu (B)
przepływ: 0,8 mL.min-1 0 min – 10% B, 1 min – 15% B,
25 – 27% B
QQQ dodatnia NL 150 V 15 – 30 eV
300 – 700 m/z 28
glikozydy (6)
C–18 acetonitryl (A), kwas mrówkowy i woda
100:0.1, v/v (B)
przepływ: 1,0 mL.min-1 0 min – 10% B, 50 min – 30% B,
65 – 55% B , 75 min – 95% B
Q TRAP ujemna NL 350 V nie
podano
100 – 500 m/z 29
glikozydy (12)
C–18 0,1% kwas mrówkowy w wodzie (A) i 0,1%
kwasu mrówkowego w 80% acetonitrylu (B)
przepływ: 0,8 mL.min-1 0 min – 8% B, 18 min – 15% B, 40 min – 25% B, 75 min – 45% B, 85min – 70% B, 90 min – 100% B
Q-TOF ujemna, dodatnia
NL 120 V 5 – 60 V
100 – 3000 m/z
30
flawonoidy (9)
C–18 metanol (A), 0,1%
kwas octowy (B)
przepływ: 0,8 mL.min-1 0 min – 22% B, 4 min –50% B, 9 min – 95% B, 13 min – 100% B
Q TRAP ujemna MRM nie
podano
21, 25, 26, 30, 31, 32, 42, 50 eV
zróżnicowany 31
glikozydy (8)
C–18 0,1% kwas mrówkowy w wodzie (A), metanol
(B)
przepływ: 0,25 mL.min-1 0min – 0% B, 10min – 25% B, 18 min – 53% B, 20 min – 55% B
QQQ dodatnia, ujemna
MRM nie
podano
20, 35, 40 eV
100 – 1000 m/z
32
III. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA 1. Odczynniki i aparatura
1.1. Aparatura
Pompa HPLC, 1100 Series, Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy
Spektrometr mas z jonizacją poprzez elektrorozpraszanie, 6460 Triple Ruad LC/MS, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA
Odgazowywacz, 1100 Series Micro Vacuum Degaser, Agilent Technologies, Japonia
Dozownik, Reodyne, 7725i, Cotati, CA, USA
Kolumna HPLC, Zorbax SB-C18 4,6 x 150 mm z pętlą o objętości 20 µL, o średnicy uziarnienia 3,5 µm, Agilent Technologies, USA
Przedkolumna do HPLC, Zorbax SB C-18, 4,6 x 12,5 mm, o średnicy uziarnienia 5 µm Agilent Technologies, USA
Płuczka ultradźwiękowa, RK 52, Bandelin electronic, Niemcy
System oczyszczania wody Elix 3, Millipore, Saint-Quentin, Francja
Oprogramowanie sterujące układem HPLC–ESI QqQ MS, MassHunter Workstation, Agilent Technologies, USA
Oprogramowanie do automatycznego dobierania parametrów w metodach MRM, MassHunter Optimizer, Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy
1.2. Odczynniki
Metanol, Honeywell, Honeywell Burdach and Jackson, Muskegon, MI, USA
Kwas mrówkowy, Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey, USA
Fizetyna ≥ 99% (TLC) Flucka Chemie, GmbH, Steinheim, Niemcy
Kwercetyna ≥ 98% (HPLC) Flucka Chemie, GmbH, Steinheim, Niemcy
Izoramnetyna ≥ 97% (HPLC) Flucka Chemie, GmbH, Steinheim, Niemcy
Genisteina ≥ 99% (TLC) Flucka Chemie, GmbH, Steinheim, Niemcy
Woda demineralizowana o oporności 10–15 MΩ.cm-1 2. Przygotowanie próbki
Roztwory wzorcowe substancji barwiących (fizetyny, kwercetyny, izoramnetyny i genisteiny) o stężeniu 0,2 mg.mL-1 otrzymano w wyniku rozpuszczenia 2 mg substancji w 10 mL metanolu. Roztwory przesączono przez sączki strzykawkowe o średnicy porów 0,45 µm, pierwsze 5 kropli odrzucono, pozostałość po przesączeniu przygotowano do analizy.
Mieszaninę związków barwiących o stężeniu 10 µg.mL-1 otrzymano przez zmieszanie równych objętości poszczególnych roztworów i rozcieńczenie jej za pomocą fazy ruchomej tak, aby ogólny stosunek metanolu do fazy wodnej w próbce odpowiadał początkowej zawartości tych faz w eluencie (2:3, v/v). Tak przygotowaną próbkę poddano kolejnym analizom z zastosowaniem różnych trybów monitorowania.
3. Parametry pracy aparatu
Badania wykonywano za pomocą układu HPLC–ESI QqQ MS w określonych warunkach pracy aparatów (tabela 6).
Tabela 6. Parametry pracy układu aparaturowego
Aparat Parametry
HPLC kolumna Zorbax SB C-18
przepływ 0,5 mL.min-1
program gradientu 0 min, 40 % B; 20 min, 90 % B; 21 min, 40 % B
objętość pętli 20 µL
ESI QqQ MS śledzone masy 100 – 350 m/z
stałe czas skanowania 500 min
fragmentator 100
tryb ujemny
krok skanowania 0,1 amu
temperatura gazu 300 oC przepływ gazu 4 L.min-1
energia kolizji 30V
temperatura gazu osłonowego 380 oC przepływ gazu osłonowego 12 L.min-1 napięcie elektrorozpraszające 3000 V
zmienne tryb skanowania
- zakres jonów 150 – 350 m/z tryb monitorowania wybranych jonów
- jony 315, 301, 285, 269 m/z
tryb monitorowania jonów potomnych
- jony macierzyste 315, 301, 285, 269 m/z - zakres jonów potomnych 50 – 330 m/z
tryb monitorowania jonów macierzystych
- potomne jony 151, 133, 121, 107 m/z - zakres jonów macierzystych 150 – 350 m/z
tryb monitorowania utraty cząstek obojętnych - masy traconych fragentów
obojętnych
15, 18, 28, 30, 42, 150, 164, 208 Da - zakres jonów macierzystych 150 – 330 m/z
tryb monitorowania reakcji metastabilnych oprogramowanie do optymalizacji
parametrów pracy
Mass Hunter Optimizer zakres zmian napięcia
fragmentatora
50 – 250 V zakres zmian energii kolizji 0 – 60 V
Aparat Parametry
wybrane reakcje metastabilne jon
macierzysty fragmentator jon
potomny CE
315 130 V 300 16 V
151 24 V
107 28 V
63 48 V
301 130 V 179 8 V
151 16 V
107 24 V
65 40 V
285 130 V 163 8 V
135 12 V
121 20 V
91 32 V
269 170 V 133 28 V
132 44 V
66 44 V
63 44 V
4. Uzyskane wyniki analizy flawonoidów
Roztwory były analizowane przy zastosowaniu ujemnej polaryzacji w kilku trybach monitorowania: skanowania, monitorowania wybranych jonów (SIM), rejestrowania jonów potomnych (PI), rejestrowania jonów macierzystych (MI), śledzenia jonów tracących fragmenty obojętne o stałej masie (NL) oraz monitorowania reakcji metastabilnych (MRM).
Na chromatogramie zarejestrowanym w trybie skanowania zaobserwowano cztery piki, których czasy retencji odpowiadały czterem flawonoidom występującym w badanej mieszaninie (rysunek 12).
Rysunek 12. Chromatogramy zarejestrowane w trybie skanowania dla mieszaniny flawonoidów: a) chromatogram całkowitego prądu jonowego (TIC), (b-e) chromatogramy pików głównych odtworzone dla wybranych jonów (o m/z 315, 301, 285 i 269)
Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx105
5
TIC
2 BPC 315
5 BPC 301
Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx104
min
5 10 15
min
5 10 15
min
5 10 15
A B
C D a)
b)
c)
BPC 285
5 BPC 269
Intensywność, cpsx104
5 10 15 min
min
5 10 15
d) 5
e)
100 200 300
0
315,0
175,0
0
301,0 175,0
100 200 300
0
100 200
285,0 175,0
300
0
269,0
100 200 300
Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx105
5
TIC
2 BPC 315
5 BPC 301
Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx104
min
5 10 15
min
5 10 15
min
5 10 15
A B
C D a)
b)
c)
BPC 285
5 BPC 269
Intensywność, cpsx104
5 10 15 min
min
5 10 15
d) 5
e)
100 200 300
0
315,0
175,0
0
301,0 175,0
100 200 300
0
100 200
285,0 175,0
300
0
269,0
100 200 300
Intensywność, cpsx105
5
TIC
2 BPC 315
5 BPC 301
Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx104
min
5 10 15 min
5 10 15
min
5 10 15 min
5 10 15
min
5 10 15 min
5 10 15
A B
C D a)
b)
c)
BPC 285
5 BPC 269
Intensywność, cpsx104
5 10 15 minmin
5 10 15
min
5 10 15 min
5 10 15
d) 5
e)
100 200 300
0
315,0
175,0
100 200 300
100 200 300
0
315,0
175,0
0
301,0 175,0
100 200 300
0
301,0 175,0
100 200 300
0
100 200
285,0 175,0
300
100 200
285,0 175,0
300
0
269,0
100 200 300
0
269,0
100 200 300
Na podstawie widm mas odtworzonych dla obserwowanych sygnałów jonów pseudocząsteczkowych [M-H]- odpowiadających poszczególnym substancjom stwierdzono, że:
pik A o czasie retencji 13,7 min świadczy o obecności fizetyny (m/z 285, [M-H]- ),
pik B – 14,9 min odpowiada kwercetynie (m/z 301, [M-H]-),
pik C – o czasie retencji 17,1 min odpowiada genisteinie (m/z 269, [M-H]-),
pik D – 18,1 min zarejestrowano dla izoramnetyny (m/z 315, [M-H]-).
Obecność poszczególnych pików obserwowano jednocześnie na chromatogramach odtworzonych dla każdego z wymienionych jonów (rysunek 12 b-e).
W następnym etapie analizę prowadzono z zastosowaniem trybu monitorowania wybranych jonów (SIM), uwzględniając jedynie jony pseudocząsteczkowe poszczególnych związków. Tak jak poprzednio na chromatogramie zarejestrowano cztery piki (rysunek 13), niemniej jednak tryb ten pozwolił na obniżenie linii bazowej w wyniku ograniczenia liczby rejestrowanych jonów i wyeliminowania powstających na skutek jonizacji składników matrycy.
Rysunek 13. Chromatogram całkowitego prądu jonowego otrzymany dla mieszaniny flawonoidów zarejestrowany w trybie monitorowania wybranych jonów
Kolejnym trybem stosowanym podczas rejestracji chromatogramów był tryb monitorowania jonów potomnych (rysunek 14), w którym obserwowano jony powstałe w wyniku fragmentacji jonów macierzystych jonów pseudocząsteczkowych badanych flawonoidów (o m/z 269, 285, 301, 315). Na otrzymanych widmach mas obserwowano od
0,5 2,5 4,5
TIC
5 10 15 min
Intensywność, cpsx105
A B
C
D
0,5 2,5 4,5
TIC
5 10 15 min
Intensywność, cpsx105
A B
C
D
107, 135 czy 151 występowały jednocześnie na dwóch bądź trzech widmach, podczas gdy inne były charakterystyczne dla określonych związków, np. jon o m/z 271 i 300 dla izoramnetyny, a m/z 133 dla genisteiny.
Rysunek 14. Chromatogram otrzymany dla mieszaniny flawonoidów zarejestrowany w trybie monitorowania jonów potomnych, powstałych dla jonów macierzystych o m/z 269, 285, 301 i 315; a) chromatogram całkowitego prądu jonowego, b) chromatogram pików głównych
0,3 0,6 0,9
1 3 5 Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx103
a)
b)
5 10 15 min
5 10 15 min
TIC
BPC
A B
C
D 0,3
0,6 0,9
1 3 5 Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx103
a)
b)
5 10 15 min
5 10 15 min
TIC
BPC
A B
C
D
