Odpowiedź fibroblastów na obecność biofilmów tworzonych przez patogeny izolowane z przewlekłych owrzodzeń żylnych

Rozprawa doktorska

Odpowiedź fibroblastów na obecność biofilmów tworzonych przez patogeny izolowane z przewlekłych owrzodzeń żylnych

The fibroblast response to the presence of biofilms formed by pathogens isolated from the chronic venous ulcers

Joanna Czajkowska

Praca doktorska wykonana pod kierunkiem

Promotora: dr hab. inż. Agaty Markowskiej-Szczupak, prof. ZUT Promotora pomocniczego: dr hab. Adama Feliksa Junki, prof. UMW

Szczecin 2022

Niniejsza rozprawa doktorska została wykonana w ramach I edycji projektu

„Doktorat Wdrożeniowy” finansowanego ze środków Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego (nr 29/DW/2017).

Pani Promotor dr. hab. inż. Agacie Markowskiej-Szczupak, prof. ZUT, składam serdeczne podziękowania za opiekę merytoryczną, cenne wskazówki, poświęcony czas i wyrozumiałość w trakcie realizacji niniejszej pracy.

Serdecznie dziękuję Promotorowi pomocniczemu, dr. hab. Adamowi Junce, prof. UMW za nieocenioną pomoc w części eksperymentalnej, cenne uwagi merytoryczne, okazane zaangażowanie

i nieustanną mobilizację do pracy, które przyczyniły się do powstania niniejszej rozprawy.

Pragnę serdecznie podziękować:

zespołowi Laboratorium Mikrobiologii Łukasiewicz – PORT, za stworzenie wspaniałej atmosfery pracy, inspirującej do rozwoju naukowego oraz za pomoc i wsparcie nawet w najtrudniejszych chwilach.

Moim Rodzicom i Rodzeństwu, za wiarę we mnie.

Narzeczonemu, za wyrozumiałość i nieustające wsparcie,

szczególnie w chwilach zwątpienia.

1

SPIS TREŚCI

WSTĘP ... 11

1. CZĘŚĆ TEORETYCZNA ... 13

1.1 Rany przewlekłe ... 13

1.1.1 Biologia procesu gojenia rany ... 14

1.1.2 Rodzaje i etiologia ran przewlekłych ... 18

1.1.3 Mikrobiom ran przewlekłych ... 20

1.1.4 Strategia leczenia ran przewlekłych ... 23

1.2 Koncepcja tworzenia biofilmów ... 26

1.2.1 Charakterystyka typowych mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcje ran przewlekłych. ... 26

1.2.2 Mechanizmy tworzenia i rozprzestrzeniania biofilmów ... 30

1.2.3 Modele infekcji biofilmowych stosowane w badaniach ran przewlekłych ... 38

1.3 Diagnostyka i zwalczanie infekcji ran przewlekłych ... 41

1.3.1 Metody diagnostyczne stosowane do identyfikacji zakażeń ran ... 41

1.3.2 Metabolomika jako nowe narzędzie diagnostyczne infekcji ran przewlekłych ... 46

1.3.3 Przegląd strategii zwalczania biofilmów w ranach przewlekłych ... 47

2. CEL PRACY ... 53

3. MATERIAŁY I METODY ... 54

3.1 Charakterystyka i sposoby hodowli testowanych drobnoustrojów i linii komórkowych ... 54

3.1.1 Szczepy drobnoustrojów ... 54

3.1.2 Linia komórkowa fibroblastów ... 56

3.2 Metody analizy wzrostu biofilmu ... 58

3.2.1 Metoda oceny ilościowej tworzonego biofilmu ... 59

3.2.2 Metoda określenia biomasy biofilmu metodą barwienia fioletem krystalicznym ... 59

3.2.3 Metoda oznaczenie aktywności metabolicznej biofilmów metodą redukcji TTC ... 60

3.3 Kokultura drobnoustrojów z komórkami fibroblastów ... 62

3.3.1 Metoda oceny żywotności fibroblastów i drobnoustrojów w kokulturach ... 62

3.3.2 Metoda obrazowania kokultur drobnoustrojów z komórkami fibroblastów z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej ... 63

3.4 Badania metabolomiczne ... 65

3.4.1 Sposób przygotowania do analiz metabolitów zewnątrzkomórkowych ... 65

3.4.2 Sposób przygotowanie próbek do analizy metabolitów wewnątrzkomórkowych ... 65

2

3.4.3 Sposób przeprowadzenie analiz z wykorzystaniem spektroskopii jądrowego rezonansu

magnetycznego ... 66

3.5 Badania genetyczne ... 67

3.5.1 Izolacja genomowego DNA ... 67

3.5.2 Ocena czystości genomowego DNA ... 68

3.5.3 Izolacja całkowitego RNA ... 68

3.5.4 Sposób prowadzenia łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR) oraz analizy ekspresji wybranych genów zaangażowanych w tworzenie biofilmów ... 69

3.5.5 Sposób prowadzenia rozdziałów elektroforetycznych DNA i RNA ... 74

4. OMÓWIENIE WYNIKÓW ... 75

4.1 Analiza wzrostu biofilmów... 75

4.2 Kokultury komórek fibroblastów z drobnoustrojami tworzącymi biofilmy ... 92

... 104

4.3 Analiza metabolomiczna ... 107

4.3.1 Analiza metabolitów zewnątrzkomórkowych ... 107

4.3.2 Analiza metabolitów wewnątrzkomórkowych ... 117

4.4 Analiza genetyczna ... 125

4.4.1 Ocena czystości uzyskanego materiału genetycznego ... 125

4.4.2 Ocena ekspresji wybranych genów związanych z procesem apoptozy ... 127

5 DYSKUSJA ... 144

STRESZCZENIE ... 165

ABSTRACT ... 167

LITERATURA ... 169

SPIS TABEL ... 199

SPIS RYSUNKÓW ... 199

3

Wykaz ważniejszych stosowanych symboli i akronimów Symbole

A - absorbancja

C - jednostka temperatury (stopnie) Celsjusza

h - godzina

H widma 2H (deuterowe)

Hz - herc, jednostka miary częstotliwości K - jednostka temperatury (stopnie) Kelwina M - jednostka ilości substancji

pH - wykładnik stężenia jonów wodorowych ppm - liczba części na milion (ang. parts per million)

s - sekunda

U - jednostka aktywności enzymów (ang. unit) Litery greckie

 - przesunięcie chemiczne (ang. chemical shift)

λ - długość fali

Akronimy/zwroty obcojęzyczne

act1 - gen kodujący β – aktynę, (ang. β-actin) AckA - enzym, kinaza octanowa (ang. acetate kinase) AcP - acetylofosforan (ang. acetyl-phosphate)

ADH - enzym, dehydrogeneza alkoholowa (ang. alcohol dehydrogenase) agr - gen regulatorowy genów pomocniczych S. aureus (ang. accessory

gene regulatory)

AHL - acylowane laktony homoseryny (ang. N-acyl homoserine lactone)

AIDS -

zespół nabytego niedoboru odporności, zespół nabytego upośledzenia odporności (ang. Acquired Immunodeficiency Syndrome lub Acquired Immune Deficiency Syndrome)

AIP - autoinduktor, peptyd zewnątrzkomórkowy (ang. autoinducing peptide)

Als białka o sekwencji podobnej do aglutynin z C. albicans (ang.

agglutinin-like sequence)

als - geny kodujące białka ALS (ang. agglutinin-like sequence) AMP - peptydy obronne gospodarza (ang. antimicrobial peptides)

4

APEC - szczepy E. coli wywołujący kolibakteriozę u ptaków (ang. avian pathogenic E. coli)

arg - operon argininowy

at - czas akwizycji (ang. acquisition time)

ATCC - kolekcja szczepów wzorcowych mikroorganizmów (ang. American Type Culture Collection)

AtlA - autolizyna (hydrolaza) S. aureus (ang. Autolysin A) ATP - adenozyno-5′-trifosforan,

bax - gen kodujący białko proapoptotyczne BAX (ang. Bcl-2 associated X-protein)

Bap - białko związane z rozwojem biofilmu (ang. biofilm-associated protein)

BAX - białko biorące udział w apoptozie, z rodziny białek Bcl-2 Bcl - rodzina białek regulujących apoptozę (ang. B-cell lymphoma 2) bcr-1 - gen kodujący czynnik transkrypcyjny, wymagany do tworzenia

biofilmu, (ang. Biofilm and cell wall regulator 1)

Bcr1 - białko odpowiedzialne za tworzenie biofilmu C. albicans (ang.

biofilm and cell wall regulator 1)

BHI - wyciąg mózgowo-sercowy (ang. Brain Heart Infusion)

BPA - marker aktywności proteazy bakteryjnej (ang. bacterial protease activity)

BudA1 - enzym, dekarboksylaza α-acetomleczanowa (ang. α-acetolactate decarboxylase)

BudB - enzym, syntaza acetylomleczanowa (ang. acetolactate synthase) C3a i C5a - anafilatoksyny, białka dopełniacza

casp - geny kodujące enzym kaspazy (ang. Caspase) CBD - model Calgary (ang. Calgary Biofilm Device)

CDC - Amerykańskie Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorób (ang.

Center for Disease Control)

c-di-GMP - cykliczny kwas diguanylowy, cykliczny diguanylan, 3',5'-cykliczny kwas diguanylowy (ang. cyclic diguanylate)

clfA - gen kodujący czynnik skupiania A (ang. Clumping Factor A) clfB - gen kodujący czynnik skupiania B (ang. Clumping Factor B)

CoA - koenzym A

Cyclic di-GMP cykliczny kwas diguanylowy (ang. cyclic di-GMP, cyclic diguanylate)

cDNA - komplementarny DNA (ang. complementary DNA) uzyskany poprzez odwrotną transkrypcję na matrycy mRNA

CFU - jednostki tworzące kolonię (ang. Colony Forming Unit)

ClfA - czynnik wirulencji S. aureus odpowiadający za krzepnięcie osocza (ang. Clumping Factor A)

5

ClfB - czynnik skupiania B (ang. clumping factor B)

CPGM - metoda echa spinowego Carra-Purcella-Meibooma-Gilla Cph1 - czynnik transkrypcyjny (ang. transcription factor 1) CRP - białko C-reaktywne (ang. C-reactive protein)

csgA - gen kodujący transkrypcyjne białko regulatorowe operonu CsgABC csrA - gen kodujący białko regulatorowe CsrA (ang. Carbon storage

regulator A)

CsrA - białko regulatorowe E. coli (ang. Carbon storage regulator A) CT - tomografia komputerowa CT (ang. Computed Tomography) CV - fiolet krystaliczny C25H30N3Cl (ang. crystal violet solution) CWA - rodzina białek zakotwiczonych w ścianie komórkowej (ang. cel

wall-anchored protein)

DAEC - enterotodyfuzyjne szczepy E. coli (ang. enteroaggregative E. coli) DEC - patogeny jelitowe Escherichia coli (ang. diarrheagenic E. coli) DEPC - woda do biologii molekularnej, wolna od RNAz i DNAz (ang.

deionized, diethylpyrocarbonate treat) dl - opóźnienie relaksacji (ang. relaxation delay)

dATP - trifosforan dezoksyadenozyny (ang. deoxyadenosine triphosphate) dCTP - trifosforan dezoksycytydyny (ang. deoxycytidine triphosphate) dGTP - trifosforan dezoksyguanozyny (ang. deoxyguanosine triphosphate) DNA - kwas deoksyrybonukleinowy, DNA (ang. DeoxyriboNucleic Acid) DNAzy - enzymy hydrolityczne z grupy nukleaz katalizujące hydrolizę

łańcucha DNA na krótsze łańcuchy lub pojedyncze nukleotydy.

DSF - dyfuzyjny współczynnik sygnału (ang. diffusible signal factor)

dNTPs - deoksynukleotydy

dTTP - trifosforan dezoksytymidyny (ang. deoxythymidine triphosphate) Eap1 - białko (adhezyna) ściany komórkowej C. albicans (ang. cell wall

adhesin)

eap1 - gen kodujący adhezynę ściany komórkowej C. albicans (ang. cell wall adhesin)

EAEC - enterotoagregacyjne szczepy E. coli (ang. enteroaggregative E. coli) ECM - macierz zewnątrzkomórkowa, macierz pozakomórkowa, istota

międzykomórkowa (ang. extracellular matrix)

ECODAB - baza antygenów O bakterii E. coli (ang. Escherichia coli O-antigen database)

eDNA - zewnątrzkomórkowe DNA (ang. extracellular DNA)

ebpS - gen kodujący białko wiążące elastynę (ang. elastin-binding protein)

6

EDTA - kwas wersenowy, kwas edetynowy (ang. ethylenediaminetetraacetic acid)

Efg1 - białko wzmacniające wzrost nitkowaty C. albicans (ang. enhanced filamentous growth protein 1)

EGF - czynnik wzrostu naskórka (ang. epidermal growth factor)

EHEC/STEC - enterotokrwotoczne szczepy E. coli (ang. enterohaemorrhagic E. coli, Shiga toxin-producing E. coli);

EIEC - enterotoinwazyjne szczepy E. coli (ang. enteroinvasive E. coli) eno - gen kodujący białko wiążące laminę (ang. encoding laminin binding

protein)

EnPEC - szczepy E. coli wywołujące zapalnie miednicy oraz endometriozę u bydła po porodzie (ang. endometrial pathogenic E. coli).

EPEC - enteropatogenne szczepy E. coli (ang. enteropathogenic E. coli ) EPS - pozakomórkowe substancje polimerowe (ang. extracellular

polymeric substance)

ETEC - enterotoksynogenne szczepy E. coli (ang. enterotoxigenic E. coli) EWMA - Europejskie Stowarzyszenie Leczenia Ran (ang. European Wound

Management Association).

ExPEC - patogenne pozajelitowe szczepy E. coli (ang. extraintestinal pathogenic E coli)

FBS - bydlęca surowica płodowa (ang. Fetal Bovine Serum)

FGF - czynnik wzrostu fibroblastów (ang. fibroblast growth factors)

fnbpA i B - gen kodujący białka wiążące fibronektynę A i B (ang. fibrinogen binding protein A or B)

fib - gen kodujący białko wiążące fibrynogen (ang. fibrinogen binding protein)

fim - gen kodujący białka fimbrii u E. coli

fimA - gen kodujący białko stanowiące główny komponent włókna fimbrii typu 1 (ang. type-1 fimbrial protein, A chain)

fimB - gen kodujący białko stanowiące główny komponent włókna fimbrii typu 1 (ang. type-1 fimbrial protein, B chain)

Flu - antygen powierzchniowy 43 E. coli K12

FnbpA/B - białka wiążące fibronektynę A i B (ang. fibronectin binding proteins A and B)

FV - obrazowanie autofluorescencyjne (ang. fluorescence visualization) gadph - gen kodujący dehydrogenazę aldehydu 3- fosfoglicerynowego (ang.

glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)

GPI-CWPS - rodzina białek ściany komórkowej Candida albicans (ang. glycosyl- phosphatidylinositol-cell wall proteins)

GT - glikozylotransferazy – enzymy, które tworzą naturalne wiązania glikozydowe

gyrA - gen kodujący gyrazę DNA A (ang. DNA gyrase subunit A)

HAI lub HCAI - zakażenia szpitalne i związane z opieką medyczną (ang. hospital- acquired infections lub healthcare-associated infections)

7

HIV - ludzki wirus nabytego niedoboru odporności (ang. human immunodeficiency virus)

HKG - geny metabolizmu podstawowego (ang. housekeeping gene) Hsp90 - białko szoku cieplnego 90 (ang. heat shock protein 90)

hwp-1 - gen kodujący jedno z białek ściany komórkowej C. albicans, (ang.

hyphal wall protein 1)

Hwp - białka (adhezyny) strzępkowe C. albicans (ang. hyphal wall protein) icaABCD - operon icaABCD, związany z procesem tworzenia biofilmu

u S. aureus

il-6 - gen kodujący białko interleukinę 6 z grupy cytokin (ang. interleukin 6)

jkt - jednostki tworzące kolonie

KGF - czynnik wzrostu keratynocytów (ang. keratinocyte growth factor) KLRP Kompleksowe Leczenie Ran Przewlekłych

lb stała poszerzenia linii (ang. line broadening)

LCBW - model Lubbock (ang. Lubbock Chronic Wound Biofilm) LDH dehydrogenaza mleczanowa (ang. lactate dehydrogenase) LPS - lipopolisacharyd (ang. Lipopolysaccharides)

LQ - jakości życia (ang. Life Quality)

MAC - kompleks atakujący błonę (ang. membrane attack complex)

MAC-T - linia nabłonka sutka bydlęcego (ang. Mammary Alveolar Cells-large T antigen)

MAREC - wielooporna Escherichia coli (ang. multiresistant Escherichia coli) MIP - polimery z odciskiem molekularnym (ang. molecularly imprinted

polymer)

MMP - metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej (ang. matrix metalloproteinases)

MPEC - szczepy E. coli wywołujące infekcje i stany zapalenie gruczołu mlekowego u krów mlecznych (ang. mammary pathogenic E. coli) MRI - rezonans magnetyczny (ang. Magnetic Resonance Imaging)

mRNA - mRNA, informacyjny RNA, matrycowy RNA (ang. messenger RNA)

MRSA - oporny na metycylinę Staphylococcus aureus (ang. methicillin- resistant S. aureus)

MSCRAMMs - bakteryjne adhezyjne molekuły macierzy (ang. microbial surface components recognizing adhesive matrix)

NAD⁺ - forma utleniona dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego

NADH - forma zredukowana NAD

8

NCBI - Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej (ang. The National Center for Biotechnology Information)

NCD - choroby niezakaźne NCD (ang. noncommunicable diseases) Ndt80 - czynnik transkrypcyjny C. albicans (ang. transcription factor)

NFZ - Narodowy Fundusz Zdrowia

NMEC - szczepy E. coli powodujące zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u niemowląt (ang. neonatal meningitis E. coli)

NMR - magnetyczny rezonans jądrowy (ang. Nuclear Magnetic Resonance) Nrf2 - czynnik transkrypcyjny 2 (ang. nuclear factor 2-related factor 2) Nuc1 - nukleazy gronkowca S. aureus (ang. nuclease 1)

PAD - choroba tętnic obwodowych (ang. peripheral artery disease)

PANAM - dendrymery poliamidoaminowe (ang. polyamidoamine dendrimers) PBS - roztwór soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (ang. Phosphate

Buffered Saline)

PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction) PDGF - płytko pochodny czynnik wzrostu (ang. platelet derived growth

factor)

PEG - glikol polietylenowy (ang. polyethylene glycol)

PET - pozytonowa tomografia emisyjna (ang. Positron Emission Tomography)

PGA - poli-β-1,6-N-acetylo-D-glukozamina (ang. poly-beta-1,6-N-acetyl- D-glucosamine)

pgaABCD - operon E. coli (ang. pgaABCD operon)

pgaC - gen kodujący syntazę poli-beta-1,6-N-acetylo-D-glukozaminy (ang.

poly-beta-1,6-N-acetyl-D-glucosamine synthase PGA)

PGNA - poli-N-acetylo-b-(1-6)glukozamina (ang. poly-N-acetyl-β-(1-6)- glucosamine)

PHMB - poliheksametylen biguanidu (ang. polyhexamethylene biguanide) PI - jodek propidyny (ang. propidium iodide)

PIA - polisacharydowa adhezyna międzykomórkowa (ang. polysaccharide intercellular adhesin)

PNŻ - przewlekła niewydolność żylna

POM -

polioksometalany grupa związków nieorganicznych, odpowiadających ogólnemu wzorowi [XxMmOy]q, w którym M oznacza atom molibdenu, wolframu, rzadziej wanadu, niobu lub tantalu, w ich najwyższym stopniu utlenienia, X jest atomem dowolnego pierwiastka, np. fosforu, boru

PSMs - moduliny (amyloidy bakteryjne) rozpuszczalne w fenolu (ang.

phenol soluble modulins)

Pta - fosfotransacetylaza (ang. phosphotransacetylase)

9

OC - odpowiedzialność cywilna

qPCR - ilościowe reakcja PCR

QS - system komunikacji komórek drobnoustrojów (ang. Quorum Sensing)

RAW 264.7 - linia komórek makrofagów, uzyskana z guza samca myszy indukowanego wirusem mysiej białaczki Abelsona

Rbt1 - białko ściany komórkowej C. albicans (ang. cell wall protein) RNA - kwasy rybonukleinowy (ang. RiboNucleic Acid)

rRNA - rybosomalny, rybosomowy RNA (ang. ribosomal RiboNucleic Acid)

RNAz -

enzymy, z klasy hydrolaz (podklasa nukleazy), dzielące cząsteczki RNA na krótsze łańcuchy lub pojedyncze nukleotydy przez hydrolizę wiązań fosfodiestrowych

rpm - jednostka miary częstotliwości obrotu, obroty na minutę (ang.

revolutions per minute)

RPMI - pożywka do hodowli komórek adherentynych (ang. Roswell Park Memorial Institute)

Rob1 - czynnik transkrypcyjny Zn(II)2Cys6; wymagany do tworzenia biofilmu u C. albicans (ang. Zn(II)2Cys6 transcription factor) ROS - reaktywne formy tlenu RFT (ang. Reactive Oxygen Species)

RT-PCR - łańcuchowa reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. real- time PCR)

RTG - technika obrazowania wykorzystująca promieniowanie rentgenowskie/promieniowanie X/Roentgena (ang. radiography) SarA - gronkowcowy regulator pomocniczy (ang. Staphylococcal accessory

regulator)

sasG - białko powierzchniowe G u S. aureus (ang. S. aureus surface protein G)

SdrC - białko powierzchniowe C, występujące u S. aureus (ang. Serine- aspartate repeat-containing protein C)

SEM - skaningowa mikroskopia elektronowa (ang. Scanning Electron Microscopy)

SEPEC - szczepy E. coli wywołujące sepsę (ang. sepsis-causing E. coli) SPECT - tomografia emisyjna pojedynczych fotonów (ang. Single-Photon

Emission Computed Tomography)

STEC - enterotokrwotoczne szczepy E. coli (ang. enterohaemorrhagic E. coli, Shiga toxin-producing E. coli)

SYTO-9 - zielony fluorescencyjny barwnik kwasów nukleinowych (ang. green fluorescent nucleic acid stain bound to DNA)

SW szerokość spektralna widma, szerokość okna spektralnego SW (ang.

spectra width)

TCA - cykl kwasu cytrynowego, cykl kwasów trikarboksylowych lub cykl Krebsa (ang. tricarboxylic acid cycle)

TCC - metoda spektrofotometryczna z chlorkiem trójfenylotetrazoliowym Tec1 - aktywator transkrypcji (ang. Transcription activator)

10

TFP - 1,3,5-trifenyloformazan (ang. 1,3,5-trifenyloformazan)

TGF α i β - transformujące czynniki wzrostu komórek (ang. transforming growth factor α and β)

TIME/TIMERS - sposób postępowania z raną przewlekłą według EWMA Tris - bufor, chlorowodorek Tris(hydroksymetylo)aminometanu TSA - agar tryptozowo-sojowy (ang. tryptic soy agar)

TSP - 3-(trimetylosililo)-propianosulfonian sodu (ang. 3-(N,N- Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate)

TTC - chlorek 2,3,5-trójfenylotetrazoliowy (ang. 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)

TAE bufor octanowy do elektroforezy (ang. Tris-acetate-EDTA)

UDP-GlcNAc - enzym UDP-N-acetyloglukozoamina (ang. uridine diphosphate N- acetylglucosamine)

UPEC - szczepy uropatogenne E. coli (ang. uropathogenic E. coli) USG - ultrasonografia (ang. ultrasonography)

VBNC - formy „żywe lecz nie dające się hodować” (ang. viable but nonculturable)

VEGF - czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (ang. vascular endothelial growth factor)

VLU - owrzodzenie żylne goleni (ang. venous leg ulcer)

WHO - Światowa Organizacja Zdrowia (ang. World Health Organization) WTA - kwasy tejchojowe ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich

(ang. wall teichoic acids)

YcfR(BhsA) - białko E. coli zwiększające odporność bakterii na niekorzystne czynniki środowiskowe (ang. multiple stress resistance protein) Ywp1 - białko (adhezyna) ściany komórkowej C. albicans (ang. yeast-form

wall protein)

ywp1 - gen kodujący białko ściany komórkowej C. albicans (ang. yeast- form wall protein Ywp1)

ZSC - zespół stopy cukrzycowej

11

WSTĘP

Starzejące się społeczeństwo i coraz większa częstotliwość występowania chorób cywilizacyjnych takich jak otyłość, cukrzyca i choroby układu krążenia sprawia, że obciążenie systemów opieki zdrowotnej związane z ranami przewlekłymi stale rośnie.

W związku z tym przybiera na znaczeniu potrzeba opracowania nowych metod leczenia ran przewlekłych. Wdrożenie nowych strategii profilaktycznych i terapii wymaga długotrwałych badań klinicznych oraz analiz ekonomicznych ich opłacalności. Ponadto by rozpocząć prace nad ich opracowaniem i wdrożeniem niezbędne jest poszerzenie świadomości rosnącego wyzwania klinicznego jakim są rany przewlekłe. Ma to również znaczenie w kwestiach opracowywania dobrych praktyk medycznych, które zapewnią sprawne działanie systemu opieki zdrowotnej w zakresie opieki nad chorymi i ułatwi postępowanie diagnostyczne.

Dostępna literatura naukowa podkreśla brak pełnej wiedzy na temat procesów biologicznych zachodzących w ranie przewlekłej, których poznanie jest konieczne do opracowania diagnostyki oraz terapii leczniczych [1-10]. Jednym z kluczowych czynników negatywnie wpływającym na stan rany i podnoszącym ryzyko jej przejścia w stan przewlekły jest obecność drobnoustrojów. W ranie rozwijają się one w formie biofilmów, czyli złożonych i dobrze zorganizowanych społeczności, które są oporne na eradykację standardowo dostępnymi metodami oraz trudne (we wczesnym etapie rozwoju) do wykrycia technikami diagnostycznymi. Chociaż w czasie ostatniej dekady dość dobrze opisano właściwości biofilmów rozwijających się w warunkach laboratoryjnych, to niewiele wiadomo o ich metabolizmie i zmienności adaptacyjnej zachodzących w środowisku rany przewlekłej. Dało to asumpt do podjęcia badań mogących stanowić punkt wyjścia do opracowania i wdrożenia skutecznej, nieinwazyjnej metody diagnostyki infekcji rany przewlekłej.

Metabolomika to intensywnie rozwijająca się nauka „omiczna”, obejmująca kompleksową charakterystykę metabolitów i metabolizmu w układach biologicznych.

Ostatnie postępy w technologiach metabolomicznych prowadzą do rosnącej liczby zastosowań biomedycznych. W szczególności metabolomika jest coraz częściej wykorzystywana do diagnozowania chorób i poznawania ich mechanizmów, identyfikowania nowych celów leków, dostosowywania terapii i monitorowania wyników terapeutycznych, co może się przyczynić do wieloaspektowej poprawy jakości życia pacjentów. Głównym ograniczeniem analityki metabolomicznej jest brak możliwości

12

scharakteryzowania całego fenotypu drobnoustrojów. Dlatego wydaje się, że przyszłe cele metabolomiczne będą obejmować rozwój bardziej kompleksowych platform analitycznych oraz integrację danych metabolomicznych otrzymanych z wykorzystaniem różnych narzędzi badawczych. Nowatorskie lub/oraz zintegrowane techniki analityczne, takie jak obrazowanie metabolitów, algorytmy statystyczne i obliczeniowe, są pilnie potrzebne by uczynić z metabolomiki stałe narzędzie użyteczności klinicznej. Nasza wiedza, na temat profilu metabolicznego ran przewlekłych i jego roli w procesach gojenia, jest ograniczona, ponieważ metabolom procesu gojenia się ran nie został jak do tej pory zbadany. Wiadomo jednak, że zrozumienie związku między różnymi zbiorowiskami drobnoustrojów w ranie a ostatecznym wynikiem gojenia się rany umożliwi manipulowanie mikrobiomem w stanach chorobowych za pomocą terapii celowanej. Aby ułatwić wdrożenie nowych biomarkerów, w tym markerów metabolicznych, w postępowaniu klinicznym niezbędne staje się przeprowadzenie badań na dużą skalę z zastosowaniem solidnych kryteriów walidacji oraz zrozumienie interakcji między wszystkimi czynnikami biologicznymi (genami, transkryptami, białkami i metabolitami). Podążając tą ścieżką badawczą zaproponowano przeprowadzenie badań metabolomicznych i genetycznych w środowisku odzwierciedlającym warunki w zainfekowanej ranie przewlekłej. Otrzymane rezultaty badań wniosą wkład w znajomość patomechanizmu tworzenia biofilmu w ranach przewlekłych, co może się przyczynić do wdrożenia nowatorskiej, przystępnej kosztowo, metody diagnostyki ran przewlekłych.

13

1. Część teoretyczna

1.1 Rany przewlekłe

Rana przewlekła definiowana jest jako przerwanie ciągłości skóry, wykazujące zaburzony i trwający powyżej 3 miesięcy proces gojenia [1], [2]. Częstotliwość występowania ran wynosi 1,67 na 1000 osób i wzrasta wraz z wiekiem pacjentów [1], [3].

Pojawienie się ran przewlekłych związane jest z licznymi stanami chorobowymi, do których zaliczane są m.in. niewydolność tętnicza i żylna [4]–[6], cukrzyca [7]–[10], otyłość [11] oraz choroby układu immunologicznego. Wzrost częstości występowania ran przewlekłych związany jest zatem z rosnącą liczbą chorych na wyżej wymienione schorzenia. W przypadku osób w podeszłym wieku, u których na skutek naturalnych procesów starzenia dochodzi do spadku elastyczności skóry i obniżonego poziomu syntezy kolagenu, wyższe jest ryzyko mechanicznego wystąpienia uszkodzenia i powstania rany, która (na skutek chorób towarzyszących) może przejść w stan chroniczny [12], [13]. Rany przewlekłe dzielone są na: odleżyny, owrzodzenia cukrzycowe, owrzodzenia żylne, owrzodzenia związane z niewydolnością tętnic oraz oparzenia (niezależnie od etiologii).

Rany przewlekłe należą do schorzeń utrzymujących się u pacjentów od kilku miesięcy do nawet kilkunastu lat. Ich powstawanie przekłada się na istotne ograniczenia w życiu codziennym i prywatnym wielu osób. Wykazano, że wiąże się to z podniesionym ryzykiem zachorowania na depresję, obniżeniem poczucia własnej wartości, co w efekcie prowadzi do zmniejszeniem jakości życia (ang. Life Quality, LQ), zarówno pacjentów jak i ich rodzin [14]. Może to prowadzić do wykluczenia zawodowego lub konieczności przejścia na wcześniejszą emeryturę. W skrajnych przypadkach, rozwój rany przewlekłej może prowadzić do niepełnosprawności, a nawet śmierci pacjenta. Według danych statystycznych, występowanie przewlekłych owrzodzeń koreluje z koniecznością przeprowadzenia 85% wszystkich amputacji, natomiast owrzodzenia związane z cukrzycą są przyczyną aż 70% amputacji kończyn dolnych. Opieka nad raną przewlekłą wiąże się również z obciążeniami finansowymi, zarówno dla pacjentów, ich rodzin, jak i służby zdrowia. Ocenia się, że koszt leczenia ran przewlekłych może pochłaniać od 2 do 4%

środków przeznaczonych na opiekę zdrowotną w krajach wysokorozwiniętych [15], [16].

W Stanach Zjednoczonych Ameryki Północnej, odnotowywanych jest 5,7 milionów przypadków nowych ran przewlekłych rocznie (ok. 2% populacji). Tylko w USA, koszty związane z ich leczeniem przekraczają co roku 20 miliardów dolarów [15]. Natomiast starty ekonomiczne związane z wykluczeniem zawodowym pacjentów, cierpiących

14

z powodu ran przewlekłych oraz z wynikającym z tego zmniejszeniem produktywności społeczeństwa, są trudne do oszacowania [15]. Ze względu na to, że obecność ran przewlekłych bywa następstwem innych chorób, często leczona jest przez specjalistów z różnych dziedzin medycyny. Wpływa to negatywnie na wytworzenie jednolitych standardów i algorytmów nie tylko profilaktyki, ale również leczenia. Ponadto znacząco opóźnia diagnostykę oraz przyczynia się do niewłaściwej opieki nad pacjentami. Mając na względzie postępujący proces starzenia się populacji krajów wysokorozwiniętych oraz narastającą zapadalność na choroby przewlekłe (będące głównymi przyczynami powstawania ran), rozwój diagnostyki, algorytmów leczenia oraz samo poznanie mechanizmów biologicznych zachodzących w ranach, staje się istotną potrzebą nie tylko środowisk naukowych oraz medycznych, ale i całego społeczeństwa.

1.1.1 Biologia procesu gojenia rany

Gojenie się rany jest procesem wykształconym w czasie milionów lat rozwoju filogenetycznego człowieka. Od czasów przednaukowych pozostawał w centrum zainteresowań medycyny klasycznej i ludowej, jednak dopiero odkrycia technologiczne ostatnich dziesięcioleci pozwoliły na zrozumienie podstaw tego złożonego procesu.

Poznanie prawidłowego procesu gojenia ran jest warunkiem koniecznym do rozpoznania (poprzez odróżnienie) procesów patologicznych w niej zachodzących.

Gojenie i regeneracja tkanek dotyczy w zróżnicowanym stopniu wszystkich organów organizmu człowieka, jednak kluczową rolę odgrywa w funkcjonowaniu ludzkiej skóry.

Organu w największym stopniu narażonego na potencjalnie szkodliwe oddziaływanie środowiska zewnętrznego. Rana definiowana jest jako uszkodzenie lub zakłócenie prawidłowej anatomicznej struktury i funkcji skóry, które może rozciągać się do głębiej położonych warstw, uszkadzając ścięgna, mięśnie, naczynia, nerwy, a nawet kości [17].

Prawidłowo przebiegający proces gojenia się rany wymaga współdziałania różnego rodzaju komórek, czynników wzrostu oraz cytokin podczas poszczególnych faz tego procesu. W prawidłowym przebiegu gojenia rany wyróżnić można fazy: wysiękową, oczyszczania, proliferacyjną oraz przebudowy [18]. Wymienione etapy oraz czas ich trwania schematycznie przedstawiono na rysunku 1.

15 Rys. 1 Fazy prawidłowego procesu gojenia ran [19].

Jak wynika z rysunku 1 etapy te zachodzą (w znaczeniu czasowym) na siebie, a powyżej przytoczony, uproszczony podział (zaprezentowany na Rysunku 1) ma służyć zrozumieniu tego skomplikowanego procesu. Ponadto różne obszary rany (w znaczeniu topologicznym) mogą znajdować się w różnych fazach gojenia. Pierwsza faza gojenia – homeostaza rozpoczyna się w chwili zranienia i trwa przez kolejne kilka godzin. Stanowi ona etap charakterystyczny dla ran ostrych, którym towarzyszy krwotok. Powoduje aktywację kaskady krzepnięcia krwi, chroniącą układ naczyniowy i tworzącą struktury dla komórek odgrywających istotną rolę w kolejnych etapach gojenia [19]. Pod wpływem czynników krzepnięcia tworzą się skrzepy krwi składające się między innymi z fibryny i płytek krwi [20]. Po opanowaniu krwawienia komórki nabłonkowe i śródbłonkowe, komórki tuczne, fibroblasty, neutrofile i makrofagi migrują – w kierunku utworzonej macierzy. Komórki zapalne stymulowane są chemotaktycznie przez związki wydzielane z płytek krwi, które niezbędne są w fazie zapalnej tj. cytokiny (np. interleukiny), czynniki wzrostu (np. PDGF, FGF, EGF, TGF-α i TGF-β) oraz histaminę, serotoninę, bradykininy, prostaglandyny, i tromboksany [21]. Ich wydzielanie inicjuje kolejne etapy gojenia rany.

W fazie wysiękowej, inaczej zwanej zapalną, następuje wzmożenie humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej, mającej stanowić ochronę przed mikroorganizmami. Faza ta rozpoczyna się w ciągu pierwszych 24 godzin od uszkodzenia ciągłości skóry i przy prawidłowym przebiegu procesu gojenia trwa ok. 2 tygodnie (Rys.

16

1) [22]. Ze względu na przebieg można podzielić ją na dwa kluczowe stadia tzw. wczesny i późny stan zapalny. W początkowym etapie dochodzi do aktywacji układu dopełniacza, którego funkcją efektorową jest niszczenie patogenów poprzez tworzenie kompleksów atakujących błonę MAC (ang. membrane attack complex) oraz wytwarzanie opsonin, które wpływają pozytywnie na fagocytozę oraz ograniczają zakażenie poprzez rozwój odczynu zapalnego. W tym stadium główną rolę odgrywają, przyciągane do miejsca zranienia przez składniki układu dopełniacza białka anafilatoksyny (C3a i C5a) oraz neutrofile. Ich rolą jest fagocytoza, oczyszczenie rany z drobnoustrojów i tkanki martwiczej oraz uwalnianie enzymów proteolitycznych [23]. W kolejnej fazie istotną rolę pełnią makrofagi, których napływ do światła rany jest stymulowany poprzez wcześniej wymienione przekaźniki chemiczne. Do głównych funkcji makrofagów należy fagocytoza i destrukcja bakterii oraz wytwarzanie cytokin prozapalnych, które istotnie wpływają na proces gojenia się rany, poprzez pobudzenie angiogenezy i produkcji kolagenu [24]. Następnie w ranie pojawiają się limfocyty T, które odgrywają między innymi rolę w regulacji procesu gojenia rany i tworzeniu rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej oraz struktur kolagenu.

Zaburzenie w przebiegu tej fazy np. poprzez niekontrolowaną nadprodukcję proteaz, może doprowadzić do zniszczenia macierzy zewnątrzkomórkowej i powstania rany przewlekłej.

Faza proliferacyjna rozpoczyna się, gdy rana jest prawidłowo oczyszczona. Ten etap obejmuje angiogenezę, tworzenie ziarniny i odkładanie się kolagenu oraz epitelializację (naskórkowanie). Bardzo istotnym rodzajem komórek biorącym udział w tej fazie są fibroblasty. Intensywnie proliferując, produkują hiauloronian, fibronektynę oraz prokolagen typu I i III oraz odpowiadają za syntezę tkanki ziarninowej [25]. Kolagen, powstający z prokolagenu, odpowiada za utrzymacie strukturalnej integralności tkanek, ich wytrzymałość oraz tworzenie elastycznego rusztowania (ang. scaffold) dla zewnątrzkomórkowej macierzy ECM. W tkance ziarninowej obserwuje się w szczególności wzrost (do około 40 %) zawartości kolagenu typu III, podczas gdy prawidłowo rozwinięta skóra młodego człowieka zawiera około 80% kolagenu typu I i 15% typu III [26], [27], [28]. Proliferacja i migracja fibroblastów do obszaru rany regulowana jest przez wcześniej wspomniane czynniki TGF-β i PDGF. Natomiast regulacja procesu angiogenezy jest zależna od cytokinin i czynników wzrostu m.in. FGF-2 i VEGF. Formowaniu się nowych naczyń krwionośnych zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych towarzyszy produkcja enzymów proteolitycznych – metaloproteinaz (MMPs). Fibroblasty, makrofagi oraz MMPs przemieszczają się w obręb miejsca powstania rany w tym samym czasie. Proces angiogenezy stymulowany jest

17

również przez warunki mikrośrodowiska rany. Czynnikami sprzyjającymi temu procesowi są niskie stężenie tlenu i pH oraz wysoki poziom mleczanu [29], [30].

Tworzenie nowych naczyń krwionośnych jest nieodzowne do podtrzymania metabolizmu nowo utworzonej tkanki ziarninowej. Komórki ulegają procesowi adhezji, a ich wzmożona proliferacja prowadzi do powstania struktur nowych naczyń krwionośnych. Na początku procesu są one delikatne i przepuszczalne, co sprzyja utrzymaniu obrzęku w ranie [29]. Kolejnym ważnym elementem tej fazy gojenia rany jest epitelializacja, czyli tworzenie naskórka. Polega ona na migracji komórek z brzegu rany do jej środka, dzięki utworzonej ziarninie. Czynniki wzrostu, takie jak EGF, KGF i TGF-α, wiążąc się do receptorów komórek epitelialnych (nabłonkowych) i stymulują je do proliferacji oraz migracji. Związanie czynników wzrostu powoduje rozpuszczenie struktur międzykomórkowych, ściśle łączących sąsiednie komórki (desmosomów) oraz łączących komórki naskórka z błoną podstawną (hemidesmosomów). Pozwala to na uwolnienie komórek, które migrują jako spłaszczona monowarstwa po tkance ziarninowej. Migrujące komórki nie są zdolne do proliferacji, wydzielają jednak ułatwiające przemieszczanie się enzymy proteolityczne. Proces migracji trwa do momentu utworzenia w pełni konfluentnej¹ warstwy. Nowo utworzona, pojedyncza warstwa naskórka może przejść w tryb proliferacji, a następnie rozpocząć dojrzewanie i rogowacenie (keratynizację).

Odbudowywane są również połączenia międzykomórkowe, tworzone przez kompleksy białek adhezyjnych (kadheryn) [31], [32]. Ostatnim etapem jest przebudowa tkanki ziarninowej rany i powstawanie prawidłowej skóry właściwej. Towarzyszą temu zjawiska reorganizacji, degradacji i resyntezy macierzy zewnątrzkomórkowej. W obszarze tkanki ziarninowej obserwuje się podwyższone tempo metabolizmu i zwiększenie syntezy białek niezbędnych do odbudowy tkanki. Ponadto dochodzi również do zmniejszenia liczby naczyń włosowatych i ich agregacji w większe naczynia [33]. W wyniku zmiany kolagenu typu III na kolagenem typu I zwiększa się wytrzymałość ziarniny na rozciąganie. Struktura kolagenu jest organizowana na nowo, a jej wytrzymałość wzmacniana jest przez sieciowanie kowalencyjne za które odpowiada wydzielany przez fibroblasty enzym – oksydaza lizylowa [34]. W etapie tym zachodzi również przebudowa białek macierzy zewnętrznej, warunkowana aktywnością enzymów proteolitycznych. Mimo to, wytrzymałość rany z nowo powstałym nabłonkiem jest dużo niższa niż tkanki prawidłowej. Od skóry właściwej odróżnia ją rozbudowana sieć nowych naczyń

1 Konfluencja - miara liczby komórek wyrażona jako procent zajmowanej powierzchni

18

krwionośnych, zwiększona gęstość fibroblastów i makrofagów oraz nieuporządkowana sieć kolagenu.

Proces gojenia ran przewlekłych trwa dłużej od prawidłowego procesu gojenia ran ostrych oraz skutkuje gorszymi wynikami anatomicznymi. Rany przewlekłe zazwyczaj przez długi czas pozostają w fazie zapalnej lub proliferacyjnej. Niezależnie od etiologii, można zaobserwować w nich podwyższony (w porównaniu do ran ostrych) poziom cytokin, enzymów proteolitycznych, reaktywnych form tlenu oraz występowanie infekcji bakteryjnych [35]–[37]. Utrzymujący się napływ czynników prozapalnych prowadzi do wzrostu stężenia i aktywności enzymów proteolitycznych w tworzonym wysięku.

Niekontrolowana nadprodukcja metaloproteinaz (MMPs) prowadzi do degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej, czynników wzrostu komórek i zatrzymania procesu gojenia. Jeśli gojenie rany zachodzi w sposób prawidłowy, komórki odpornościowe produkują reaktywne formy tlenu, RFT (ang. Reactive Oxygen Species, ROS). Ich poziom jest ściśle regulowany, najprawdopodobniej przez czynnik transkrypcji NRF2 [38]. W ranach przewlekłych, gdy stan zapalny jest przedłużony, poziom sekrecji RFT wzrasta w sposób niekontrolowany i powoduje uszkodzenia komórek oraz białek macierzy zewnątrzkomórkowej [36]. W przedłużającej się fazie zapalnej można zaobserwować również obniżoną aktywność fagocytarną komórek odpornościowych. Powoduje to zaleganie tkanki martwiczej, której usunięcie wymaga zastosowania zewnętrznych metod oczyszczania rany [39]. Wydłużenie czasu trwania fazy proliferacyjnej prowadzi do starzenia się fibroblastów, makrofagów, keratynocytów oraz spadku ich zdolności do proliferacji i migracji. Ponadto odnotowano obniżony poziom czynników wzrostu m.in.

TGF-β, co wpływa na hamowanie proliferacji oraz utworzenie włóknistej tkanki bliznowatej [40].

1.1.2 Rodzaje i etiologia ran przewlekłych

Rany przewlekłe cechują się rożną etiologią, występują u pacjentów w różnym wieku i z różnymi chorobami towarzyszącymi. Cukrzyca - to jedno ze schorzeń najczęściej przyczyniających się do wzrostu ryzyka wystąpienia rany przewlekłej. Z powodu szybszego tworzenia się blaszki miażdżycowej w tętnicach, diabetycy mają gorsze krążenie. Bezpośrednim tego skutkiem jest mniejsza ilość tlenu i czynników, które odpowiedzialne są za gojenie ran [9]. Ponadto, cukrzyca powoduje między innymi neuropatię, uszkodzenie tętnic i tkanek. Mniejszy przepływ krwi powoduje utrudnioną eliminację uszkodzonych i martwych tkanek, prowadząc do owrzodzeń stóp, które

19

dotykają ok. 15% chorych [41]. Do innych schorzeń sprzyjających powstawaniu ran przewlekłych należą choroby układu krążenia np. przewlekła niewydolność żylna (PNŻ), choroba tętnic obwodowych PAD (ang. peripheral artery disease), choroba wieńcowa i wiele innych [11]. Czynniki sprzyjające wystąpieniu ran przewlekłych zestawiono w tabeli 1.

Tabela 1 Czynniki ryzyka sprzyjające wystąpieniu rany przewlekłej.

Wewnętrzne czynniki ryzyka

Zewnętrzne czynniki

ryzyka Źródło literaturowe cukrzyca,

osłabiony układ, immunologiczny, choroby naczyniowe,

anemia, podeszły wiek, nieprawidłowa dieta,

otyłość,

środki terapeutyczne (np.

niesteroidowe leki przeciwzapalne, steroidy),

terapie onkologiczne (np.

radioterapia, chemioterapia) używki (np. alkohol, palenie)

zakażenia, oparzenia, siedzący tryb życia, immobilizacja (odleżyny),

[10], [42]

[11]

[11]

[15]

[16]

[3]

[43]

Do najczęściej powstających ran przewlekłych należą:

a) Owrzodzenia żylne goleni (VLU) – (ang. venous leg ulcer) powodowane są przez nadmierne ciśnienie żylne w kończynach dolnych i nieprawidłowy przepływ krwi żylnej na skutek niewydolności zastawek żylnych i pompy mięśniowej łydki.

Prowadzi to do przepływu wstecznego krwi żylnej, powstania obrzęku, a następnie owrzodzenia. Najpowszechniej występujące rodzaje rany przewlekłej to: żylne owrzodzenie podudzi (70%), tętnicze owrzodzenie podudzi (10%), mieszane tętniczo-żylne owrzodzenie podudzi (10 – 15%) [4], [6].

b) Zespół Stopy Cukrzycowej (ZSC) – jest to płytkie albo głębokie przerwanie ciągłości skóry, zlokalizowane zwykle poniżej kostki, na części podeszwowej stopy. Ryzyko powstawania owrzodzenia w ciągu całego życia chorego na cukrzycę wynosi 12 – 25%, a 85% przypadków wystąpienia stopy cukrzycowej kończy się amputacją kończyny [42], [44].

c) Odleżyny – to ograniczona martwica tkanek, spowodowana przez ucisk lub tarcia skóry. Miejscowe niedokrwienie i związane z tym niedotlenienie tkanek, bardzo często prowadzi do wtórnego zakażenia bakteryjnego. Odleżyny najczęściej występują u osób długotrwale hospitalizowanych, przewlekle chorych,

20

przebywających w domach opieki i hospicjach lub stale unieruchomionych np. po urazach kręgosłupa. Dwa razy częściej tworzą się u osób po siedemdziesiątym roku życia niż u pacjentów młodszych. Tworzeniu odleżyn sprzyjają niewłaściwa bielizna i pościel (np. zagnieciona) oraz nieprawidłowa opieka nad pacjentem, prowadząca zarówno do wysuszenia skóry, jak i jej stałego zawilgocenia (np.

potem, moczem). Ich bezpośrednią przyczyną jest stały lub powtarzający się cyklicznie nacisk prowadzący do urazu niedokrwienno-reperfuzyjnego oraz upośledzenie stanu skóry [45].

1.1.3 Mikrobiom ran przewlekłych

Infekcje ran i rozwój biofilmu to czynniki negatywnie wpływające na stan rany, jak i proces jej gojenia. Badania dowodzą, że mikroorganizmy (głównie bakterie), wywołujące infekcję rany są w przeważającej mierze pochodzenia endogennego [46]. Jednym z najczęściej izolowanych z przewlekłych owrzodzeń żylnych drobnoustrojów (ok. 90%

przypadków) jest Gram-dodatnia bakteria – Staphylococcus aureus, w tym jej szczepy oporne na metycylinę (MRSA). Ponadto, za pomocą metod klasycznej mikrobiologii, wyizolowano z ran takie patogeny jak: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Proteus vulgaris, P. morabilis, Escherichia coli.

Wśród grzybów dominowały drożdżaki Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. smithsonii, rzadziej przedstawiciele grzybów pleśniowych z rodzaju Aspergillus sp.

[45]. Zastosowanie metod molekularnych bazujących na porównaniu zmienności, występującego we wszystkich komórkach prokariotycznych fragmentu 16S rRNA, wykazało nawet piętnaście razy większe zróżnicowanie gatunków mikroorganizmów tlenowych i beztlenowych, kolonizujących/infekujących ranę [46], [47]. Na tej podstawie wykryto w ranach nietypowe patogeny rzadko występujące u człowieka, takie jak:

Pseudomonas stutzeri, Alcaligenes faecalis, Citrobacter amalonaticus, Kocuria kristinae oraz występujące w zbiornikach wodnych Mycobacterium marinum i Mycobacterium ulcerans [47], [48].

Badanie porównawcze zdrowej skóry oraz ran przewlekłych przed i po oczyszczeniu chirurgicznym, wykazało, że oczyszczanie nie prowadzi do znaczących zmian w mikrobiomie rany. Powiązano natomiast występowanie bakterii fakultatywnie beztlenowych z opóźnieniem procesu gojenia ran. Najczęściej reprezentowane, w próbkach pochodzących ze zdrowej skóry oraz ran, bakterie należą do gromad:

Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria i Bacteroides. Drobnoustroje wchodzące

21

w skład flory fizjologicznej skóry, najczęściej należały do rodzajów: Staphylococcus sp., Corynebacteria sp., Propionibacteria sp., Pseudomonas sp., Micrococcus sp., Enhydrobacter sp. i Kocuria sp. W składzie mikrobiomu ran najliczniej występującym rodzajami były: Staphylococcus sp. (z przewagą S. aureus) oraz Corynebacteria sp., Pseudomonas sp., Proteus sp., Enterobacter sp., Campylobacter sp., Porphyromonas sp., Streptococcus sp., Bacteroides sp. i Anaerococcus sp. [46], [47], [49]. Z kolei oparte na sekwencjonowaniu badania nad mykobiomem ran (ogół grzybów zasiedlających) wykazały, że powszechnie występującymi grzybami były Cladosporidium herbarum (obecny w 41% ran) oraz Candida albicans (obecny w 21% ran) [50].

Nawet 99% bakterii występuje w ranie w formie biofilmu, a nie pojedynczych komórek. Z definicji biofilm to złożona wielokomórkowa struktura mikroorganizmów, otoczona warstwą produkowanych przez nie substancji organicznych i nieorganicznych, wykazująca adhezję zarówno do powierzchni biologicznych, jak i abiotycznych. Termin biofilm bakteryjny został wprowadzony w 1978 roku przez Costertona i współpracowników, ale pierwszy udokumentowany raport naukowy na temat biofilmu został opublikowany już w roku 1683 przez Antonie van Leeuwenhoeka [11], [51].

Komórki w biofilmie pokryte są macierzą ochronną o zróżnicowanym składzie. W obrębie biofilmu można wyróżnić kanały, służące do przepływu, nie tylko związków odżywczych i metabolitów, ale także fragmentów DNA (np. eDNA, plazmidów), potencjalnie zawierających geny warunkujące oporność na antybiotyki [37]. Uszkodzony naskórek stwarza doskonałe warunki bytowania drobnoustrojów, a rozwój biofilmu bardzo często prowadzi do poważnych zakażeń, które przez krew mogą rozprzestrzenić się na cały organizm. Okresowo z biofilmu uwalniają się agregaty komórek, które migrują (aktywnie lub biernie) i zasiedlają kolejne nisze. Rana przewlekła stanowi pod wieloma względami idealne środowisko dla rozwoju biofilmu. Wynika to z osłabionej aktywności komórek efektorowych układu immunologicznego oraz stałego napływu substancji odżywczych do wnętrza rany. W szczególności dotyczy to ran silnie wysiękujących w których występuje wysoka wilgotność. Zgodnie z najnowszymi doniesieniami literaturowymi proces infekcji rany przewlekłej zachodzi według koncepcji tzw. kontinuum zakażenia rany (ang. Wound Infection Continuum). Kontinuum to ciągła sekwencja zdarzeń w której sąsiednie elementy nie różnią się od siebie zauważalnie, natomiast efekt końcowy jest bardzo wyraźny.

Rozwój infekcji rany zależy od różnych czynników, zarówno bakteryjnych jak i żywiciela.

Ponieważ nie istnieje żaden pojedynczy test, który mógłby zdiagnozować zakażenie na danym etapie kontinuum, na ogół od lekarza zależy rozpoznanie jego symptomów [52].

22

Wyróżniono, sześć głównych etapów infekcji rany. Kontinuum infekcji rany zaczyna się od zanieczyszczenia (ang. contamination). Na tym etapie obecność drobnoustrojów w łożysku rany, najczęściej stanowiących naturalny mikrobiom pacjenta, jest prawie niemożliwa do wykrycia. W następnym stadium kolonizacji (ang. colonization) obserwuje się rozwój i namnażanie drobnoustrojów w łożysku rany. Proliferacja bakterii nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej (w postaci stanu zapalnego) i nie ma negatywnego wpływu na stan rany. Etap krytycznej kolonizacji (ang. critical colonization) opisuje stan, w którym następuje namnażanie się mikroorganizmów, a ich liczba i wirulencja negatywnie wpływają na stan rany. Wciąż nie pojawiają się oczywiste oznaki infekcji, takie jak: gorączka i stan zapalny, ale można zaobserwować obecność przebarwień i zapachu. Poziom obciążenia biologicznego powyżej 10⁵ bakterii na gram tkanki jest progiem, przy którym krytyczna kolonizacja przechodzi w kolejny etap infekcji – zakażenie miejscowe (ang. local infection). Przy liczbie bakterii powyżej 10⁶ bakterii na gram tkanki, gojenie rany staje się utrudnione. Na etapie zakażenia miejscowego inwazja proliferujących bakterii obejmuje nie tylko powierzchnię rany, ale także zdrowe tkanki na jej obwodzie. Powoduje to zaburzenie procesów gojenia rany. Następnym etapem kontinuum infekcji jest zakażenie rozprzestrzeniające się (ang. spreading infection), spowodowane pojawieniem się drobnoustrojów w obrębie tkanek głębokich, mięśni i powięzi oraz organów. Na tym etapie następuje nasilenie objawów związanych z zakażeniem. Ostatnim etapem jest zakażenie ogólnoustrojowe (ang. systematic infection), któremu towarzyszy rozprzestrzenienie się mikroorganizmów w całym organizmie poprzez układ krwionośny lub naczyniowy. Może to prowadzić do rozwoju sepsy² [53]. Schemat kontinuum infekcji oraz proponowane na poszczególnych etapach zalecenia postępowania przedstawiono na rysunku 2.

2 Sepsa, posocznica, endotoksemia (łac. sepsis) – specyficzna reakcja organizmu na zakażenie. Sepsa nie jest samodzielną jednostką chorobową, a obecnie definiuje się ją jako zagrażającą życiu dysfunkcję narządową spowodowaną zaburzoną regulacją odpowiedzi ustroju na zakażenie.

23 Rys. 2 Rozwój zakażenia w ranie przewlekłej [53].

1.1.4 Strategia leczenia ran przewlekłych

Wpływ infekcji rany na proces gojenia może zależeć od etiologii rany, jej rozmiaru, zajętych tkanek, lokalizacji, odpowiedzi immunologicznej gospodarza, składu gatunkowego mikroorganizmów oraz stanu infekcji (występowania form planktonicznych lub/i biofilmu). Do niedawna leczenie ran przewlekłych prowadzono zgodnie z tzw.

strategią o akronimie TIME, opracowaną w 2003 roku przez specjalistów z Europejskiego Stowarzyszenia Leczenia Ran EWMA (ang. European Wound Management Association).

W roku 2018 roku została ona rozszerzona o kolejne etapy i oznaczona akronimem TIMERS [54]. Na rysunku 3 przestawiono schemat postępowania TIMERS wraz z rozszerzeniem akronimu, którego każda litera oznacza określony aspekt oceny i postępowania z raną.

24 Rys. 3 Schemat postępowania TIMERS [54].

Pierwszy krok w strategii TIMERS to T od ang. tissue debridement. Obejmuje on ocenę stanu rany oraz identyfikację i usunięcie tkanki martwiczej. Odpowiednie przygotowanie łożyska rany poprawia funkcjonowanie i odbudowę macierzy zewnątrzkomórkowej i zmniejsza ryzyko infekcji. W przypadku ran przewlekłych, w celu stwarzania jak najkorzystniejszych warunków dla procesu gojenia, konieczne jest regularne powtarzanie zabiegu oczyszczania. Wyróżnia się kilka metod oczyszczania ran m.in. mechaniczne, autolityczne, enzymatyczne i biologiczne. Zabieg oczyszczania chirurgicznego polega na mechanicznym usunięciu tkanki i najczęściej wykonywany jest, gdy w ranie występuje duża ilość tkanki martwiczej oraz gdy istnieje ryzyko infekcji.

Koncepcja oczyszczanie autolitycznego została opracowana w 1979 roku przez Turnera.

Polega ona na wykonaniu opatrunku utrzymującego wilgotność rany tzw. wilgotnego opatrunku (ang. wet-to-moist dressing). Nawodnienie „pobudza” działanie endogennych enzymów proteolitycznych i komórek odpornościowych organizmu, odpowiedzialnych za proces autolitycznego (samoistnego) oczyszczania rany. Większa wilgotność stymuluje produkcję enzymów, czynników wzrostu oraz innych molekuł biorących udział w tworzeniu nowej tkanki. Ponadto, wiele ze stosowanych opatrunków może zawierać substancje o działaniu przeciwdrobnoustrojowym (np. jony srebra, poliheksametylen biguanidu (PHMB), miód Manuka i inne) [55]. Oczyszczanie enzymatyczne polega na

T

(ang. Tissue debridement)

I

(ang. Infection and Inflamation control)

M

(ang. Moisture balance)

E

R

• REGENERACJA (ang. Regeneration)

S

• CZYNNIKI SPOŁECZNE

(ang. Social- and patient-related factors)

25

zastosowaniu preparatów zawierających enzymy proteolityczne, takie jak papainy (np.

z melonowca właściwego Carica papaya L.) lub kolagenazy (np. klostridiopeptydaza A z Clostridium histolyticum), które rozkładają tkankę martwiczą [56]. Biologiczne oczyszczanie ran polega na zastosowaniu sterylnych larw muchówki Lucilia sericata L.

Larwy za pomocą żuwaczek (mechanicznie) oczyszczają ranę z martwych tkanek.

Ponadto, w trakcie eksploracji łożyska rany, wydzielane zewnętrznie są enzymy hydrolityczne, które niszczą biofilm bakteryjny i stymulują proces gojenia oraz regeneracji tkanek. Wyróżniono ok. 70 substancji czynnych, które mogą być wydzielane przez larwy w łożysku rany i umożliwiają jej wielopoziomowe leczenie [57].

Kolejnym etapem strategii TIMES jest kontrola infekcji i stanu zapalnego – I (ang.

infection and inflammation control). W tym stadium pojawiają się takie objawy jak podwyższona temperatura, wzmożony ból, obrzęk, rumień, zwiększona ilość wysięku, nieprzyjemny zapach i zaczerwienienie. Ponieważ wysychanie rany opóźnia proces gojenia, niezwykle ważne jest utrzymanie prawidłowej wilgotności w łożysku rany, co sprzyja procesowi gojenia [58], [59]. Należy jednak zauważyć, że nadmierna ilość wysięku może prowadzić do maceracji tkanek, nadmiernej aktywności metaloproteinaz i proteaz serynowych, wydzielanych z macierzy pozakomórkowej oraz opóźnienia procesu gojenia ran [60]–[62]. Dlatego też istotne jest, by utrzymać wilgotność rany na zrównoważonym poziomie i osiągnąć tzw. idealną równowagę wilgotności – M (ang. moisture balance).

W tym celu stosuje się odpowiednio dobrane i zaprojektowane opatrunki. Najczęściej wyróżniane cechy idealnego opatrunku to: zdolność do usunięcia nadmiaru wysięku (przy utrzymaniu odpowiedniego poziomu wilgotności), ochrona przed środowiskiem zewnętrznym (przy zachowaniu prawidłowej wymiany gazowej), brak toksyczności oraz możliwość zmiany nie powodująca uszkodzenia mechanicznego tkanek [55].

W następnym kroku strategii TIMERS monitorowany jest stan brzegów rany oraz stopień zmniejszenia jej powierzchni i zachodzenia epitelializacji – E (ang. edges, epidermization, stimulation). Na podstawie otrzymanych danych uzyskuje się informacje dotyczące konieczności prowadzenia dodatkowej interwencji chirurgicznej lub zastosowanie terapii przyśpieszających reepitelializację (powtórne nabłonkowanie) [53], [62]. Celem następnego etapu R, czyli regeneracji (ang. regeneration) jest zamknięcie rany, poprzez stymulację tkanek czynnikami wzrostu, terapią tlenową lub poprzez zastosowanie komórek macierzystych [63]. Ostatnim etapem koncepcji TIMERS jest zdefiniowanie czynników społecznych – S (ang. social and patient-related factors), wpływających na czas gojenia się rany. Głównym celem tego postępowania jest oprócz

26

holistycznej oceny pacjenta, zaangażowanie go w terapię, co znacząco może zwiększyć prawdopodobieństwo prawidłowego przebiegu leczenia. W ocenie społecznych (tzw.

nieklinicznych) czynników ryzyka związanych z pacjentem uwzględnia się czynniki psychospołeczne i fizyczne oraz choroby współistniejące. Obejmują one wszystkie aspekty zdrowia, począwszy od przestrzegania zaleceń dotyczących stosowania leków (w tym częstotliwość ich dawkowania, czas stosowania leku itp.), po ograniczenia dietetyczne oraz zmiany zachowania i stylu życia. Zwykle oczekuje się, że jeśli pacjent postępuje zgodnie z zaleceniami lekarza, to w krótkim czasie pojawią się optymalne korzyści z leczenia [1], [2], [54], [64].

Przedstawiony model oceny stanu rany TIMERS, pozwala na ujednolicenie schematu postępowania i zastosowanie odpowiedniego sposobu terapii. Nadrzędnym celem stosowania tego schematu postępowania jest utrzymanie optymalnych warunków np. wilgotnościowych w ranie, co będzie sprzyjało kontroli stanu mikrobiomu, ochronie odbudowanych już tkanek i brzegów rany.

1.2 Koncepcja tworzenia biofilmów

1.2.1 Charakterystyka typowych mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcje ran przewlekłych.

W rozdziale 1.1.3. opisano rozwój infekcji bakteryjnej oraz formę w jakiej drobnoustroje występują w ranach przewlekłych. Chociaż koncepcja występowania biofilmu w ranie przewlekłej jest powszechnie akceptowana, to jego diagnostyka oraz zwalczanie nie zostały do końca poznane [51], [53], [65]. Identyfikacja mikroorganizmów w biofilmie jest jednym z najważniejszych aspektów pielęgnacji i leczenia ran przewlekłych. Od stopnia zmniejszenia obecności biofilmu zależy bowiem przebieg procesu gojenia. Chociaż w ponad 60% ran przewlekłych występuje biofilm, wielu pracowników służby zdrowia nie jest w stanie zidentyfikować krytycznego momentu jego powstania u swoich pacjentów. Szacuje się, że za 80% infekcji szpitalnych odpowiedzialne są mikroorganizmy w formie biofilmu. Ponadto 70% przewlekłych ran goi się w sposób utrudniony, ponieważ występuje w nich struktura biofilmu [11], [51].

Zakażenia wywoływane przez mikroorganizmy oporne na leki przeciwdrobnoustrojowe od lat stanowią poważnym problem terapeutyczny w szpitalach na całym świecie [66]. Badania nad biofilmami ujawniły, że liczne infekcje, zwłaszcza ran przewlekłych, mają charakter wielobakteryjny/wielogrzybowy lub mieszany [51], [65]. Jak

27

powszechnie wiadomo, dany gatunek mikroorganizmu, rosnący w formie biofilmu, może mieć inną wrażliwość na antybiotyk, niż ten sam organizm rosnąc w formie planktonicznej. Niestety, obecne metody oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów są prowadzone względem wolno żyjących, metabolicznie aktywnych, bakterii planktonicznych, podczas gdy bakterie w formie biofilmu są (zazwyczaj) osiadłe i zróżnicowane pod względem aktywności metabolicznej. Może to prowadzić do mylnych wniosków i w konsekwencji skutkować złym dobrem strategii leczenia [67].

Z najnowszych doniesień literaturowych wynika, że niektóre mikroorganizmy mają szczególnie rozwinięte zdolności tworzenia biofilmów [51], [65], [66]. Bakterie z rodzaju Staphylococcus sp. posiadają zdolności do tworzenia wysoce rozwiniętych struktur biofilmowych i są jednym z głównych czynników przyczyniającym się do opóźnionego gojenia ran [46], [51], [52]. Gronkowiec złocisty Staphylococcus aureus jest nieruchliwą i nietworzącą przetrwalników bakterią Gram-dodatnią, będącą częścią naturalnego mikrobiomu człowieka. Najczęściej występuje na skórze i błonach śluzowych [68], [69].

Szczepy S. aureus mogą powodować infekcje skóry i tkanek miękkich, w tym ran przewlekłych oraz zapalenie kości i szpiku, infekcje stawów, protez płuc, zapalenie opon mózgowych i zespół wstrząsu toksycznego [69], [70], [71]. Gronkowiec złocisty jest również patogenem oportunistycznym, będącym przyczyną licznych zakażeń szpitalnych określanych jako HAI lub HCAI (ang. hospital-acquired infections lub healthcare- associated infections). Ponadto, S. aureus ma duży wpływ na zdrowie publiczne, ze względu na pojawianie się nowych szczepów lekoopornych takich jak np. oporny na metycylinę – MRSA (ang. methicillin-resistant S. aureus). Szczepy MRSA występują na całym świecie, a szacunkowy wskaźnik ich kolonizacji waha się od 11 do 40%. Szacuje się, że każdego roku z powodu infekcji spowodowanych tą bakterią, umiera łącznie więcej Amerykanów niż z powodu HIV/AIDS, choroby Parkinsona, rozedmy płuc oraz zabójstw [72], [73]. Poza rosnącą lekoopornością, wyzwaniem dla klinicystów pozostaje utrudniona diagnostyka, szczególnie w przypadku izolatów z ran przewlekłych. Wynika to z faktu, że obecnie stosowane metody pobierania próbek mogą powodować zaburzenia procesu gojenia, a nawet być przyczyną zakażenia rany [74].

Z literatury wiadomo, że również infekcje powodowane przez pałeczkę okrężnicy Escherichia coli są trudne do eradykacji ze względu na zjawisko tworzenia biofilmów [75]–[81]. Względnie tlenowa pałeczka Gram-ujemna E. coli stanowi część naturalnego mikrobiomu zwierząt stałocieplnych i człowieka. Kolonizuje głównie układ pokarmowy i moczowy, ale przede wszystkim występuje w śluzówce okrężnicy. Szczepy komensalne