Wpływ imperatoryny na fibroblasty mysie TCTC - Biblioteka UMCS

ANNALEŚ

UNI VERSIT ATIS MARIAE C U R I E - S K Ł O D O W S K A LUBLIN—POLONIA

VOL. XLIV, 6 SECTIO C 1989

Instytut Biologii UMCS Zakład Biologii Komórki

Antoni GAWRON, Maria SŁOTWIŃSKA

Wpływ imperatoryny na fibroblasty mysie TCTC BjiKHiiMe MMnepaTopmia Ha 4>n6ponjiacTbi Mbiiueii TCTC The Effect of Imperatorine on Mouse TCTC Fibroblasts

Imperatoryna jest związkiem z grupy psoralenów, stosowanym w leczeniu bie- lactwa, łuszczycy oraz innych chorób skóry związanych z nadmierną proliferacją naskórka (4, 12). Mechanizm działania psoralenów polega na tworzeniu krzyżowych połączeń pomiędzy nićmi DNA po fotoaktywacji tych związków promieniowaniem ultrafioletowym (UVA) o długości 320—400 nm (10). Wytworzenie połączeń pomiędzy zasadami pirymidynowymi zmienia strukturę podwójnej heliksy i zaburza procesy komórkowe (9, 10). Chociaż psoraleny bez fotoaktywacji nie tworzą połączeń z kwa­

sami nukleinowymi ani nie zmieniają ich struktury, to jednak ich obecność nie jest obojętna dla komórki. Jak wykazały badania, wywierają one widoczny wpływ na proliferację hodowanych w ciemności limfocytów (1, 6).

W przedstawionych badaniach dokonano oceny wpływu niefotoaktywowanej imperatoryny na namnażanie się in nitro mysich fibroblastów.

MATERIAŁ I METODY

Badania przeprowadzono na hodowlach fibroblastów mysich szczepu TCTC. Ko­

mórki hodowano w pożywce Eagle’a (MEM 1959) z 5% dodatkiem inaktywowanej surowicy cielęcej oraz 20 pg gentamycyny na 1 ml pożywki. Do naczyń Leightona wysiewano po 2 ml zawiesiny zawierającej 2X10s komórek. Hodowlę inkubowano przez 24 godz. w temp. 37°C. Następnie zmieniano pożywkę na podłoże zawierające 0, 5, 10 i 20 pg/ml imperatoryny. Analitycznie czystą, w postaci krystalicznej, impe- ratorynę otrzymano z Zakładu Farmakognozji Akademii Medycznej w Lublinie.

Substancję rozpuszczano w spektralnie czystym dwumetylosulfotlenku — DMSO (Merck). Stężenie DMSO w pożywce nie przekraczało 0,2%. Pożywka w hodowlach kontrolnych zawierała 0,2% DMSO. Zmianę pożywki wykonywano przy rozproszo­

nym świetle żarówki. Inkubacja odbywała się w zupełnej ciemności. Po 24 i 48 godz.

inkuba :ji pobierano po 3 hodowle z każdej grupy doświadczalnej i kontrolnej. Ko­

mórki utrwalano w alkoholu metylowym i barwiono hematoksyliną Harrisa i eozyną.

H 'ć W ■■ 3 •’ ' i' : ■■ >i 8 ; ’ >- Zdolność do tworzenia kolonii oceniano wysiewając po ok. 1000 komórek do płytek Petriego o średnicy 10 cm. Po 24 godz. zmieniano podłoże na zawierające impe- ratorynę, a następnie inkubowano w ciemności przez 7 dni w temp. 37°C, w atmo­

sferze zawierającej 5% CO2. Podbarwione hematoksyliną Harrisa kolonie liczono pod mikroskopem. Do szczegółowej oceny kolonie barwiono hematoksyliną i eozyną.

Otrzymane wyniki weryfikowano statystycznie przy pomocy testu x2, przyjmu­

jąc jako kryterium znamienności p<0,05.

OMÓWIENIE WYNIKÓW

Imperatoryna w stężeniach 10 i 20 pg/ml pożywki powodowała obniże­

nie liczby dzielących, się komórek (tab. 1). Wskaźnik mitotyczny w ho­

dowli zawierającej imperatorynę w stężeniu 20 pg/ml był ponad 6-kro- tnie niższy od hodowli kontrolnej. Natomiast imperatoryna w stężeniu 5 pg/ml powodowała niewielki wzrost wskaźnika mitotycznego. Różnica ta jednak nie była znamienna statystycznie.

W hodowlach z imperatoryną stwierdzono także różnice w liczbie komórek w poszczególnych stadiach mitozy (tab. 2). Imperatoryna w stę­

żeniu 5 ąg/ml powodowała zwiększenie liczby komórek w stadium pro- fazy, a zmniejszenie w stadium telofazy. Natomiast w stężeniu 10 ug/ml zanotowano zmniejszenie liczby pnofaz i zwiększenie się liczby komórek

olbrzymich i wielojądrzastych

The effect of imperatorine (8-isoamylenoxypsoralen) on mitotic index and occurrence of polynuclear and giant cells

inkubacjiCzas godz.

Incubation hrs.time

Stężenie imperatoryny

Imperatorine concentration

pg/ml

Wskaźnik mitotyczny

Mitotic index

%o

Komórki olbrzymie

Giant cells

%

Komórki z 2 jądrami

Cells with two nuclei

Komórki zawierające 3 jądra i więcej

Cells with three or morę nuclei

% kontrola

control 26,4 1,5 0,3 0,3

24 5 30,1 1,5 0,6* 0,4

10 18,4* 1,8 0,7* 0,5*

20 3,9* 2,4* 1,0* 0,8*

kontrola

control 28,8 1,6 0,4 0,4

48 5 31,5 1,8 0,4 0,4

10 19,2* 2,0* 0,8* 0,6*

20 4,0* 2,6* 1,2* 0,8*

W każdej grupie doświadczalnej oceniano 10 000 komórek.

* p<0,05.

After each experimental group 10,000 cells were estimated.

* p<0.05.

S fi* 0^5

Wpływ imperatoryny na fibroblasty mysie TCTC 113

2?

<v

£ il kO £ O a<u

8ł-t G <

W 6

£ a£

© © d ©

©” oo

—< co

© 00© oo co o?

d

•2«g|a«S’£

G (**) I-< r-« rrt <~i '—' - T3 M "2 O

OJ O G ~

§ °

2-e

o

o c ° O

> 3<h

w .§•*«: a o

CO d ^CD in oTin co © co

Tab.2.Wpływimperatorynynafazymitozyorazwystępowaniezaburzeńpodziałówkomórek Theeffectofimperatorineonphasesofmitosisandoccurrenceofdisturbancesofcelidivision MO co C W

£ t-d®

T3 JO

>3

£CO o t £ a

05 ►—i

>1 w N O O -a S5 £

£ e_•H*

rt o

u) ca i!

■4-» -Z3

w «43 PU

CU

« n o; “ u o

■S °-°£ o G cN ** c t.

□ £3 E

^■s

►> tu S3 a a o 91 i (h

a o o J8 "e a> ®-Sls £

£ 5 «; s.

Mft&S O o

•G *■"*s £ G

‘o .-2 .

w CO o

fi "O £ G u N — o 4J u5 S3--543

.£

© CO O O 4 o 00

w ©

© ^ © © CO C*^© © d

CO ^©

© ©" co”

© © © CD CŃHCON

'•I* co © CO ©

© lO ©^©^

<o oT «3

COCOd-tf

© © © © CO © »-< ID 00 © ©

fiO S^3 © © © G fi

24 °o °

^00 ®©

©''©*©©

-H ,-i d

© © ©

Ninw ©

d

co© © ©*

t> O

00 © 05 05 d d co d

© © ^ co

o

©‘.-T©

co co d ©

O © © f- o d © ,-«

© © ©

fio o

t-4 ź—4

,»_» Jj m © © G G - “ 24 oo o

0)W

5a

o

i °t/5 ' CO H-g

•

a sCO CO Uu

S I

fi

CO re •£

n £■

ca _2

*-> 33 ca "

-+-> r o *-■

O1/3

fi fi N -C

£ a o PJ-. G a o*

© © W a a

t, .aj 5 a £ 13 Ja £

n o <u£-2 o

□ 22H a S fi

io © d

o ^oo t>

© © ^ d

24

*o ; i i

24 J

GO

24O

Q> CO

a £

jj S.

o. =•

£ .§

£ o>> -4->

a £ 0)

CO Q

43 H ca c*

H

249

*o£O w

72o 2

>>c o ,

© •—< i

Tf* r-» ,

?1 S !

£.s

N T3 .2 fi

— o -o &

O-o

'o w

‘OJ 0)

O -G

•N £ G § 0) o N °

o £

4tf Z

<3

43

7

, O 24 O

qi N (-i «—i CZ5

.g» o ‘O u>:g

o G G fi 05

>» O G C G o

<u -fi

’GS£-

■&2 £ §'??

w a. a”

° 2 'a

■S ~-s

£ 2 .5 *-•

d © © t*

Tł« co c- © mcoruco

»-< d

rt

2* £ © © © G fi 28

8 Annales, sectio C, vol. XL.IV

w stadium telofazy. Wśród nielicznych komórek mitotycznych w hodo­

wlach z 20 pg/ml imperatoryny większość komórek była w stadium me- tafazy.

Imperatoryna we wszystkich badanych stężeniach zwiększała częstość występowania nieprawidłowych mitoz (tab. 2). Obserwowano skupianie się kondensującej chromatyny w kilku centrach jądra lub w pobliżu bło­

ny jądrowej. Komórki często zawierały zniekształcone płytki metafazalne, niekiedy wyglądem przypominające literę Y. Poza obrębem płytki meta- fazalnej pozostawały pojedyncze chromosomy. Obserwowano także nie­

równomierne rozchodzenie się chromosomów do biegunów. W stadium telofazy występowały asymetryczne podziały cytoplazmy, dzielące nie­

kiedy komórkę na więcej niż 2 części.

Imperatoryna w stężeniu 10 i 20 p-g/ml powodowała zwiększenie w ho­

dowli liczby komórek olbrzymich oraz komórek wielojądrzastych (tab. 1).

Obniżała także zdolność komórek do tworzenia kolonii (tab. 3). Komórki tworzyły nie tylko mniej kolonii, ale również kolonie te składały się z mniejszej liczby komórek. Podczas gdy przeciętna liczba komórek w kolonii kontrolnej wynosiła 84,3 komórek, to w obecności imperatoryny w stężeniu 10 ug/ml — 39,1, a w stężeniu 20 iig/ml — tylko 5,6. W nie­

licznych i małych koloniach, powstających w środowisku zawierającym 20 ug/ml imperatoryny, po 7 dniach inkubacji nie obserwowano w ogóle komórek mitotycznych (tab. 3). Mniej było także mitoz w koloniach w obecności imperatoryny w stężeniu 10 pg/ml. Natomiast więcej komórek mitotycznych niż w kontroli zawierały kolonie w pożywce z 5 ug/ml im­

peratoryny. Wśród komórek mitotycznych w koloniach zaobserwowano

olbrzymich i wielojądrzastych w koloniach

The effect of imperatorine on mitotic index and occurrence of polynuclear and giant cells in colonies

Stężenie imperatoryny

Imperatorine concentration

Ug/ml

Liczba ocenianych

komórek Number of estimated

cells

Wskaźnik mitotyczny

Mitotic index

'/o.

Komórki olbrzymie

Giant cells

%

Komórki z 2 jądrami

Cells with two

nuclei

%

Komórki zawierające

3 jądra i więcej Cells with three

or morę nuclei

% kontrola

control 5 10 20

42164213 1958 950

19,2 2,6 0,5

22,5 1,5 0,7

11,0* 5,4* 1,5*

0 — —

0,30,5 7,1*

p<0,05.

p<0.05.

Wpływ imperatoryny na fibroblasty mysie TCTC

115 więcej niż w kontroli nieprawidłowych podziałów. Podczas gdy w kon­

troli nieprawidłowe mitozy stanowiły 6%, to imperatoryna w stężeniu 5 pg/ml zwiększała liczbę nieprawidłowych mitoz do 7,5%, a w stężeniu 10 |xg/ml do 17%.

W koloniach powstających w obecności imperatoryny w stężeniu 10 pg/ml stwierdzono także większą liczbę komórek olbrzymich i wielo- jądrzastych (tab. 4). Liczba komórek olbrzymich była 2-krotnie większa niż w analogicznych koloniach kontrolnych. Natomiast liczba komórek zawierających więcej niż 2 jądra była ponad 20-krotnie większa od kon­

troli; 3-krotnie więcej było komórek z 2 jądrami.

DYSKUSJA

W przedstawionych badaniach oceniano wpływ imperatoryny (8-izo- amylenoksypsoralenu) na proliferację mysich fibroblastów. Szczegółowa analiza hodowli komórek inkubowanych z imperatoryną przez 24 i 48 godz.

oraz kolonii komórek powstających podczas tygodniowej inkubacji wy­

kazała silne oddziaływanie tego związku na komórki in vitro. Wynika z nich jednoznacznie, że imperatoryna bez fotoaktywacji wywiera hamu­

jący wpływ na komórki w stężeniu 10 ug/ml. Zmiany wywołane przez imperatorynę nie tylko znacznie ograniczały zdolność komórek do po­

działów, ale też zaburzały mitozę, zmieniając czas trwania jej stadiów oraz powodując ich nieprawidłowy przebieg, co prowadziło do tworzenia się komórek olbrzymich i wielojądrzastych. Powstawanie komórek olbrzy­

mich i wielojądrzastych pod wpływem 8-metoksypsoralenu obserwowali także Om ar i wsp. (11). Ich zdaniem, komórki wielojądrzaste były wy­

nikiem podziałów amitotycznych. Jak wynika z naszych badań, są one raczej rezultatem nieprawidłowo przebiegającej mitozy. Być może, jest to wynik dezorganizacji aparatu podziałowego, podobnie jak to ma miej­

sce u roślin pod wpływem kumaryny (5). Zniekształcone płytki metafa- zalne oraz wielobiegunowe anafazy, obserwowane przez nas, wskazują na możliwość zmian we wrzecionie podziałowym. Przyczyną tego mogą być interakcje imperatoryny z białkami biorącymi udział w procesie po­

działu komórkowego. Jak wykazali La sk in i wsp. (7), miejscem spe­

cyficznego wiązania psoralenów w komórce jest przede wszystkim cyto- plazma. Należy wziąć pod uwagę także możliwość oddziaływania impe­

ratoryny na białka enzymatyczne, których inaktywacja może doprowa­

dzić do zmian metabolicznych ograniczających zdolność do podziału ko­

mórek. Badania nasze prowadzone były w ciemności i dotyczyły wpływu imperatoryny bez jej fotoaktywacji. Istnieje jednak możliwość aktywo­

wania imperatoryny w komórce bez udziału światła. Letteron i wsp.

(8) wykazali, że 8-metoksypsoralen jest aktywowany przez cytochrom P-450 do chemicznie reaktywnych metabolitów, które wiążą się kowalen­

cyjnie z mikrosomalnymi białkami. W rozważaniach nad mechanizmem działania imperatoryny należy wziąć pod uwagę zarówno oddziaływanie niekowalencyjne, jak i możliwość tworzenia trwałych połączeń. Rezul­

taty tych oddziaływań mogą dotyczyć bardzo ważnych regulatorów me­

tabolizmu komórkowego. Albrightson i wsp. (2) wykazali, że 8-me- toksypsoralen powoduje bardzo szybki wzrost cAMP w leukocytach, praw­

dopodobnie w wyniku hamowania fosfodiesterazy. Jak wynika z tych uwag, mechanizm działania psoralenów, a także imperatoryny jest zło­

żony i właściwie mało znany. Lepiej poznane zostało działanie na DNA, które jednak bez fotoaktywacji nie powoduje skutków biologicznych (3).

Wyniki naszych badań wykazują, że imperatoryna, działając nie tylko na DNA, lecz również na inne cytoplazmatyczne składniki komórki, po­

woduje zahamowanie proliferacji komórek oraz zaburza przebieg mitozy.

PIŚMIENNICTWO

1. Abel G., S c h i m m e r O.: Effect on Chromosomes by Coumarin Derivatives in the Dark. Planta Medica 42, 333—343 (1981).

2. Albrightson Ch. R., F e r t e 1 R. H., Brown B. S, S t e p h e n s R.:

Psoralens Increase the Concentration of Cyclic AMP in Humań Cells in nitro.

J. Invest. Derm. 85, 264—268 (1985).

3. Dal l’A c q u a F., Terbojevich M., Marciani S., Vedaldi D, Re- cher M.: Investigation on the Dark Interaction Between Furocoumarins and DNA. Chem. Biol. Interact. 21, 103—115 (1978).

4. Edelson R., Berger C. L., Gasparro F., Lee K., Taylor J.: Treatment of Leukemie Cutaneous T-Cell Lymphoma with Extracorporeally Photoactivated 8-methoxypsoralen. Clin. Res. 31, 467A (1983).

5. Feuer G.: The Metabolism and Biological Actions of Coumarins. Prag. Med.

Chem. 10, 85—158 (1973).

6. Gawron A., Górski G, G ło wniak K.: Increased Proliferation of PHA- -stimulated Humań Leucocytes after 8-methoxypsoralen Treatment. J. Pharm.

Pharmacol. 42, 194—195 (1900).

7. L a s k i n J. D., Lee E., Y o u r k o w E. J., L a s k i n D. L., Galio M. A.:

A Possible Mechanism of Psoralen Phototoxicity Not Involving Direct Inter­

action with DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6158—6162 (1985).

8. Lett er on Ph., Descatoire V., Larrey D.. Tinel M., Geneve J, Pessayre D.: Inactivation and Induction of Cytochrome P-450 by Various Psoralen Derivatives in Rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 238, 685—692 (1986).

9. Moreno G.: Photosensitization of Mammalian Cells by Psoralens and Por- phyrins. Biochimie 68, 869—873 (1986).

10. Murray R. D. H, Mendez I., Brown S. A.: The Natural Coumarins. Ed.

John Walley and Sons LTD. New York 1982.

11. O mar A., W i es mann U. N., Krebs A.: Induction of Multinucleate Cells by 8-MOP and UV Treatment in nitro and fn vivo. Dermatologica 155, 65—75 (1977).

Wpływ imperatoryny na fibroblasty mysie TCTC

117

A.: Photochemotherapy of Psoriasis with Orał Methoxalen and Longwave Ultra- violet Light. New. Engl. J. Med. 291, 1207—1211 (1974).

PE3IOME

MccJie/iOBajiM Bjinanne nMnepaTopmia (8-M3oaMbiJieHOKCnncopaJieH) na KyjibTn- BMpoBannbie b TeMiioTe cj>M6ponjiacTbi Mbiinefł TCTC. KoncTarapoBajiH, hto nMiie- paTopnn KonneiiTpannn 5 mt/mji Bbi3biBaeT neóojibuioii cTMMyjinpyiomnń 3dxt>eKT,

b to BpeMH KaK MMnepaTopMii KOHpeHTpapnM 10 n 20 mt/mji ciiHJKaeT MnTOTWiecKMii MHfleKC u cnoeobHOCTb kjictok k o6pa30Banmo kojioiium. KpoMe Toro, HMnepaTopnu Bcex 3thx KOHuenTpaibtti Hapyuiaji npaBHjibHbiii npopecc MMTO3a, MHflyuwpOBaJi 06pa3OBanne MiioroHflepnbix n rnranTCKMx kjictok. 3tm HabjnoflennH CBn^erejib- CTByiOT o nnTOTOKcnnecKOM BO3^eiłcTBtin HMnepaTopniia na kjictkh in vitro TaKJKe be3 ee <t>OToaKTHBaunn.

SUMMARY

The effect of imperatorine (8-isoamylenoxypsoralen) on mouse TCTC fibro- blasts cultured in the dark was studied. It was found that imperatorine at a dose of 5 pg/ml had a slight stimulating effect while at 10 and 20 pg/ml it lowered the mitotic index and the ability of cells to form colonies. At all concentrations studied, imperatorine disturbed regular mitosis. It also induced formation of polynuclear and giant cells. These observations demonstrate a cytotoxic action of imperatorine upon cells in vitro, also without its photoactivation.

. . .. . j

■

■ .

. . I