Reakcja łańcuchowa polimerazy – PCR
Celem doświadczenia jest amplifikacja jednego z fragmentów promotora genu IGF-1.
Sekwencje starterów:
1 IGF1: 5’ GCTGAACATAGTGCACCATTGACACAAC 3’
2 IGF1: 5’ GCAAAAGCCCAGAGCAGACATAC 3’
Wielkość amplifikowanego fragmentu ok. 300 pz.
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej:
Składnik Objętość na 1 próbkę (l) MIX do PCR*
Starter 1 (50 pmol/l) Starter 2 (50 pmol/l) DNA (matryca)
Woda
--- Razem
12,5 l 1 l 1 l 3 l 7,5 l
--- 25 l
*MIX do PCR zawiera w odpowiednim stężeniu: polimerazę DNA, dNTP oraz bufor.
Warunki reakcji:
Etap Temperatura (oC) Czas (s)
Denaturacja wstępna Denaturacja
Wiązanie starterów Synteza
Synteza końcowa Przechowywanie Liczba cykli
95 95 62 72 72 4 36
300 15 15 25 300
Elektroforeza
Przygotowanie 2% żelu agarozowego:
- 1 g agarozy
- 10 ml buforu 5 x TBE - woda do 50 ml
Zagotować, ostudzić, dodać 2,5 l bromku etydyny (10 mg/ml) i przelać do saneczek.
Do aparatu wlać bufor 1x TBE i umieścić saneczki z żelem.
Do produktu PCR dodać 3 l barwnika obciążającego (6x stężonego).
Produkt PCR z barwnikiem umieścić w kieszonce żelu.
Elektroforezę prowadzić przez ok. 20 min. przy napięciu 100V.
Bufor TBE x 5 - 54 g TRIS
- 27,5 g kwasu borowego - 4,65 g wersenianu di-sodu - rozpuścić w 1 litrze wody
Barwnik obciążający (6x stężony) - 0,09% błękitu bromofenolowego - 0,09% ksylencjanolu
- 60% glicerolu - 60 mM EDTA