• Nie Znaleziono Wyników

Hodowle komórkowe: Biologia komórki, AD 2008

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Hodowle komórkowe: Biologia komórki, AD 2008"

Copied!
3
0
0

Pełen tekst

(1)

Hodowle komórkowe: Biologia komórki, AD 2008 1. Wstęp

Jedną z najczęściej stosowanych we współczesnej biologii technik laboratoryjnych są hodowle komórkowe in vitro. Strategia ta oparta jest na inkubacji, względnie namnaŜaniu komórek roślinnych i zwierzęcych poza organizmem. Jedną z największych korzyści płynących ze stosowania techniki hodowli komórkowych jest moŜliwość ścisłego

kontrolowania warunków doświadczalnych i stosunkowa łatwość modyfikacji właściwości mikrośrodowiska komórek poprzez aplikację substancji biologicznie czynnych (np.

hormonów, czynników wzrostowych, białek macierzy zewnątrzkomórkowej itd.), celem wszechstronnych analiz ich aktywności biologicznej.

Stosowanie hodowli komórek in vitro umoŜliwia prowadzenie całych cykli

doświadczeń przy uŜyciu takiego samego materiału biologicznego oraz stwarza warunki do porównywania wyników badań prowadzonych przez róŜne pracownie. Spore znaczenie mają równieŜ uwarunkowania ekonomiczne, gdyŜ eksperymenty wykorzystujące komórki

hodowane in vitro są z reguły tańsze od analogicznych doświadczeń prowadzonych na zwierzętach doświadczalnych. Nie oznacza to jednak, Ŝe techniki in vitro w pełni zastąpią techniki in vivo, gdyŜ naleŜy pamiętać, Ŝe komórki w hodowlach przebywają w warunkach dla nich sztucznych, a więc ich reakcje na zadany bodziec równieŜ mogą być „sztuczne”, czyli ilościowo i jakościowo odbiegające od tych potencjalnie obserwowanych w warunkach in vivo. Ponadto w zaleŜności od pochodzenia, populacje komórek w hodowlach mogą mieć charakter mniej lub bardziej heterogenny, co równieŜ moŜe mieć przełoŜenie na wynik doświadczenia i jego interpretację. Oznacza to, Ŝe analizy in vitro i in vivo mają charakter wzajemnie dopełniający się (komplementarny).

Z drugiej strony przy uŜyciu technik in vitro moŜna przeprowadzać bardzo wiele doświadczeń z wykorzystaniem strategii trudnych technicznie lub niemoŜliwych do wykonania in vivo, na przykład analizy migracji pojedynczych komórek, określenie zaleŜności wzrostu i róŜnicowania komórek od typu białka macierzy międzykomórkowej, kwantyfikacja komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych lub oznaczenie fazy cyklu komórkowego, w której nastąpiło zatrzymanie proliferacji komórek pod wpływem danej substancji biologicznie aktywnej.

Celem proponowanego doświadczenia jest zapoznanie się z podstawowymi czynnościami związanymi z prowadzeniem hodowli komórkowych.

2. Hodowle komórkowe - metodyka

W hodowlach in vitro przetrzymywać moŜna zarówno komórki aktywnie namnaŜające się jak i komórki terminalnie zróŜnicowane, które zwykle zatraciły zdolność do proliferacji. O ile w drugim przypadku metodyka hodowli sprowadza się do izolacji specyficznej tkankowo i jednolitej fenotypowo populacji komórek i umiejętnej jej inkubacji in vitro, o tyle komórki aktywnie namnaŜające się, a więc dysponujące potencjałem mitotycznym, moŜna propagować in vitro, zapewniając im warunki hodowli korzystne dla proliferacji. Dzięki temu jesteśmy w stanie namnaŜać materiał biologiczny potrzebny do doświadczeń, przy zachowaniu jego cech fizjologicznych. W przypadku hodowli komórek dzielących się, a więc aktywnych

mitotycznie, podstawową czynnością umoŜliwiającą namnoŜenie materiału biologicznego potrzebnego do doświadczeń jest tzw. PASAś, czyli przeniesienie komórek z jednego naczynia hodowlanego do jednego lub kilku następnych. Łączy się to z redukcją liczby komórek przypadającej na pole powierzchni naczynia (np. komórki prawidłowe - hamowane kontaktowo), lub objętość poŜywki (np. komórki nowotworowe hodowane w zawiesinie).

(2)

3. Wykonanie ćwiczenia:

1. Podzielić się na 5 zespołów

2. Przeczytać przed ćwiczeniami niniejszą instrukcję

3. Wysłuchać uwaŜnie co prowadzący ma do powiedzenia na temat ogólnych zasad pracy z hodowlami

4. Włączyć lampy UV w komorach laminarnych

5. Przygotować mikroskopy kontrastowo-fazowe do pracy, celem ich późniejszego wykorzystania do oznaczania gęstości zawiesiny komórek przy uŜyciu komory Buerkera

6. Wyłączyć lampy UV i włączyć nawiew w komorach laminarnych

7. Zapoznać się rozkładem przestrzennym komór (w tym: z rozmieszczeniem i

przeznaczeniem akcesoriów, t.j. pipet, końcówek, pojemników na zlewki, wacików, spirytusu, naczyń hodowlanych, probówek, poŜywek i innych roztworów niezbędnych do pasaŜu, etc.)

8. Wykonać pasaŜ komórek hodowanych w otrzymanym naczyniu (będą to komórki linii melanoma B16 lub komórki mięsakoraka XC.

a) ocenić liczebność komórek w hodowli pod mikroskopem odwróconym, jak równieŜ obserwując „pod światło” dno naczynia hodowlanego

b) z naczynia zlać płyn hodowlany po czym natychmiast:

c) delikatnie zalać komórki ok. 2 ml roztworu PBS, przepłukać je, po czym roztwór usunąć i natychmiast:

d) komórki zalać ok. 2 ml roztworu 0.25% trypsyny na ok. 10 sekund;

e) następnie usunąć nadmiar trypsyny pozostawiając w naczyniu jej niewielką objętość, komórki inkubować w obecności trypsyny od 20 sekund do 2 minut, kontrolując (pod światło” stopień odrywania się komórek od podłoŜa

(ewentualnie naczynie wstrząsnąć celem przyspieszenia procesu).

Uwaga: czas trypsynizacji zaleŜy od aktywności trypsyny i typu oraz

„kondycji” komórek !!!

f) Natychmiast po oderwaniu się komórek od podłoŜa (obserwowanym „pod światło” lub w mikroskopie odwróconym), komórki zawiesić w 2ml poŜywki hodowlanej (MEM + 5% surowicy cielęcej + antybiotyki), w ten sposób inaktywując trypsynę

g) Uzyskaną zawiesinę przenieść pipetą do probówki kalibrowanej, zatkać korkiem i wirować 5 min. przy 1000 obr./min.

h) po odwirowaniu nadsącz zlać, peletkę zalać 1-2 ml świeŜej poŜywki, a komórki dokładnie lecz delikatnie rozpipetować

i) oznaczyć gęstość zawiesiny komórek w komorze Buerkera (wedle schematu uzgodnionego wcześniej w obrębie zespołów)

j) do probówek płaskodennych odpipetować 2 ml poŜywki hodowlanej, a następnie dodać zawiesinę komórek w objętościach zawierających,

odpowiednio, 20 000 i 60 000 komórek. Naczynia zatkać korkiem, podpisać i pozostawić w cieplarce w 37°C.

(3)

10. W sposób analogiczny wykonać pasaŜ fibroblastów mysich 3T3 zwracając uwagę na dostosowanie czasu trwania trypsynizacji do szybkości odrywania się komórek od podłoŜa hodowlanego.

4. ZAKRES MATERIAŁU OBOWIĄZUJĄCY DO ĆWICZEŃ:

1. „Hodowla komórek i tkanek in vitro”. CYTOFIZJOLOGIA pod redakcją K.Ostrowskiego i J.Kawiaka. 1990; rozdz II, str 49-63;

2. „Wzrost komórek”. CYTOFIZJOLOGIA pod redakcją K.Ostrowskiego i J.Kawiaka.

1990; rozdz X, str 345-65;

3. „Metody badań budowy i funkcji komórek”. SEMINARIA Z CYTOFIZJOLOGII pod redakcją J.Kawiaka i M.Zabla. 2002; rozdz 14, str 364-9;

4. „Oddziaływanie komórek z podłoŜem i sąsiednimi komórkami”. PODSTAWY CYTOFIZJOLOGII pod redakcja J Kawiaka i wsp.. 1998. str. 488-504

5. OBSŁUGA KOMORY BUERKERA

6. Mammalian Cell Culture. Methods. Dieter F. Huelser.

7. Materiały zawarte w instrukcjach do ćwiczeń.

Cytaty

Powiązane dokumenty

W ciągu ostatnich trzydziestu lat udowodniono także, że różnicowanie komórkowe jest procesem odwracal- nym, co przełożyło się na praktyczne możliwości cofa- nia tego

fragment N-końcowy po zewnętrznej stronie błony komórkowej, fragment C- stronie błony komórkowej, fragment C-. końcowy po

 chromogeny – nadrzędne geny uczynniające zespoły genów struktury w takcie różnicowania komórkowego pojawiającego się w określonym czasie.  geny segmentacji i

Kaspazy odpowiadają za zniszczenie komórki skazanej na samobójstwo pośrednio, doprowadzają do pocięcia białek i DNA na drobne fragmenty (wielkości 180 par zasad, lub ich

Rodzaje lipidów błonowych Rodzaje białek błonowych Funkcje błony komórkowej Transport przez błony, 6. Endocytoza, egzocytoza, fagocytoza, pinocytoza 8. Lizosomy,

O WYBÓR SPECJALIZACJI BIOLOGIA KOMÓRKI realizowanej na Wydziale Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii. NAZWISKO I IMIĘ STUDENTA:

Wszelkie informację dotyczące egzaminu można będzie uzyskać w

[r]