Podstawowe zasady racjonalnej serodiagnostyki autoprzeciwcia³ markerowych w uk³adowych chorobach tkanki ³¹cznej
Principles of the reasonable serodiagnostic of the “marker” autoantibody in Ctd-s
JJaakkuubb ZZ¹¹bbeekk
Zak³ad Mikrobiologii i Serologii Instytutu Reumatologii im. prof. dr hab. med. Eleonory Reicher w Warszawie, kierownik Zak³adu doc. dr hab. n. biol. Jakub Z¹bek
S
S³³oowwaa kklluucczzoowwee:: autoimmunizacja, autoprzeciwcia³a markerowe, kaskadowy system ustalania swoistoœci ANA, kliniczna wartoœæ przeciwcia³ ANA.
K
Keeyy wwoorrddss:: autoimmunity, autoantibodies marker, “cascade” system of ANA specificities assessment, clinical value of ANA-s.
S t r e s z c z e n i e
W wiêkszoœci chorób z autoimmunizacj¹ obserwuje siê charakte- rystyczn¹ dla tych chorób odpowiedŸ komórkow¹ i humoraln¹ w postaci obecnoœci autoprzeciwcia³ i autoreaktywnych limfocy- tów, skierowan¹ przeciwko antygenom w³asnoustrojowym. Fe- nomen ten wystêpuje w uk³adowych chorobach tkanki ³¹cznej;
takich jak SLE, zespó³ Sjögrena, MCTD, sklerodermia, zapalenie wielomiêœniowe czy RZS.
Obecnoœæ autoprzeciwcia³ jest uwa¿ana za istotny fakt, który po- winien byæ brany pod uwagê przy ustalaniu diagnozy i dlatego niektóre z autoprzeciwcia³ zosta³y zakwalifikowane do kryteriów diagnostycznych chorób z autoimmunizacj¹. S¹ one tak¿e u¿y- tecznymi markerami prognostycznymi i w niektórych przypad- kach ukierunkowuj¹ postêpowanie terapeutyczne.
Wed³ug autora najczulszym i najbardziej wiarygodnym testem jest metoda poœredniej IF oraz metoda Colorzyme (z zastosowa- niem komórek Hep-2), szczególnie jako testy skryningowe.
W póŸnych latach 60. opracowano nowe testy immunoenzyma- tyczne – ELISA, Western-blotting, stosowane obecnie powszech- nie do identyfikacji swoistoœci autoprzeciwcia³.
W prawid³owo prowadzonej strategii oznaczania przeciwcia³ ANA stosowana jest kaskadowa (4-etapowa) metoda oznaczania autoprzeciwcia³. W pierwszym etapie stosuje siê testy skryningo- we (IIF-ANA-screen czy ANA-ELISA-screen). Nastêpnie (jeœli ANA s¹ dodatnie) ustalamy swoistoœæ przeciwcia³ ANA (2. etap), a po- tem (3. etap) swoistoœci dla podtypów antygenu ANA (ang. fine specificities). Etap 4. wykonujemy tylko wtedy, gdy nie mo¿emy wy¿ej opisanymi metodami opisaæ ¿adnej z typowych swoistoœci autoprzeciwcia³ i zwykle dokonuje siê tego kombinowanymi me- todami biochemiczno-immunochemicznymi.
S u m m a r y
In most of the autoimmune diseases, a humoral and cellular immune response is characteristically seen, with autoantibodies and cells directed to distinct nuclear antigens (ANA). This phenomenon can be shown in systemic diseases like sclerosis, systemic lupus erythematosus, Sjögren’s syndrome, mixed connective tissue disease, polymyositis and rheumatoid arthritis.
The presence of autoantibodies is important items to be considered in establishing a diagnosis and because of that autoantibodies are included in the diagnostic criteria of many autoimmune diseases.
They are useful prognostic markers in some situations and facilitate clinical and treatment follow-up.
It seems to us the indirect immunofluorescence method (IIF) was a most powerful, sensitive and comprehensive test for screening of autoantibodies, until an immunoenzymatic (EIA) methods (ELISA, Western-blotting) in late 60’s was worked out. The immunoenzymatic tests are very useful because of their simplicity and realiability. But there is one more excellent test named “Colorzyme” (presented by Immuno-Concept Corporation from USA) worked out by combining of the EIA and IIF tests.
More and more new-founded resources of marker autoantibodies and methods force to introduction into standardization both methods and specimens on which they are marked.
During properly executed strategy of ANA assessment usually a multi-stage (“cascade”) methodology is used. In the first stage a screening test (usually IIF-ANA or immunoperoxidase “Colorzyme”
method based in Hep-2 cells and ELISA-screen are used).
Next (second) step – if ANA are positive we intend to establish of ANA specificity and eventually in the third step so called ANA fine-
Adres do korespondencji:
doc. dr hab. n. biol. Jakub Z¹bek, Zak³ad Mikrobiologii i Serologii, Instytut Reumatologii, ul. Spartañska 1, 02-637 Warszawa, faks +48 22 844 20 31
Choroby z autoimmunizacj¹ to bardzo szeroka i zró¿- nicowana klinicznie grupa przewlek³ych, nierzadko po- wa¿nych w swych konsekwencjach schorzeñ o nieznanej etiopatogenezie. Schorzenia te obejmuj¹ wiele chorób, w tym tzw. uk³adowe choroby tkanki ³¹cznej (znane sze- rzej jako choroby reumatyczne) oraz takie jednostki, jak choroba Hashimoto, choroba Addisona, choroba Grave- sa-Basedova oraz wiele innych, zaliczanych do grupy chorób z autoimmunizacj¹ narz¹dowo swoist¹ [1, 2].
Wielu autorów podkreœla przypuszczaln¹ infekcyjn¹ etiopatogenezê chorób z autoimmunizacj¹, czego œla- dem mog³aby byæ krzy¿owa reaktywnoœæ wielu auto- przeciwcia³ markerowych z antygenami bakteryjnymi i wirusowym [3–7].
Cech¹ wspóln¹ tych jednostek chorobowych jest wystêpowanie w kr¹¿eniu autoreaktywnych przeciwcia³ (autoprzeciwcia³) oraz limfocytów skierowanych prze- ciwko antygenom w³asnym gospodarza [9–11]. Auto- przeciwcia³a mog¹ byæ skierowane przeciwko antyge- nom powszechnie wystêpuj¹cym w organizmie gospo- darza (mówimy wtedy o autoimmunizacji narz¹dowo nieswoistej lub uk³adowej) b¹dŸ antygenom swoistym tylko dla okreœlonej tkanki (jest to przypadek autoim- munizacji narz¹dowo swoistej).
W uk³adowych chorobach tkanki ³¹cznej wystêpuje wiele zaburzeñ mechanizmów odpornoœciowych, prowa- dz¹cych do wystêpowania tzw. autoprzeciwcia³, czyli przeciwcia³ skierowanych przeciwko wielu antygenom w³asnoustrojowym. Szczególnie istotne znaczenie dia- gnostyczne maj¹ przeciwcia³a skierowane przeciwko ró¿- nym sk³adnikom bia³kowym i niebia³kowym j¹dra komór- kowego (antygeny j¹drowe – dsDNA, ssDNA, histon, DNP, antygen Scl-70, bia³ka cetromerowe) oraz antygenom bia³kowym, wystêpuj¹cym w cytoplazmie, organellach komórkowych lub b³onie komórkowej, zaanga¿owanym w procesy zainicjowane w j¹drze komórkowym (bia³ka rybosomalne, antygen Jo-I oraz inne aminoacylo tRNA- -syntetazy) [8, 9]. Osobn¹ grupê stanowi¹ autoprzeciw- cia³a skierowane przeciwko niektórym bia³kom surowi- czym oraz komponentom tkanek, np. tkanki ³¹cznej lub miêœniowej. Oznaczenie obecnoœci oraz mian lub pozio- mów wy¿ej opisanych autoprzeciwcia³ przeciwko antyge-
nom komórkowym wykonuje siê zasadniczo z nastêpuj¹- cych powodów:
•obecnoœæ autoprzeciwcia³ mo¿e byæ patognomonicz- na dla danej choroby,
•miano niektórych autoprzeciwcia³ odzwierciedla ak- tywnoœæ procesu chorobowego,
•obecnoœæ danego autoprzeciwcia³a koreluje z okre- œlonymi objawami klinicznymi,
•autoprzeciwcia³o ma znaczenie prognostyczne (ro- kownicze).
Obecnie w diagnostyce uk³adowych chorób tkanki
³¹cznej ok. 30 autoprzeciwcia³ ma z ww. powodów zna- czenie diagnostyczne [9, 11, 12], a tylko kilkanaœcie z nich zakwalifikowano do kryteriów diagnostycznych danych jednostek jako tzw. przeciwcia³a markerowe [10]. Widaæ st¹d jasno, jak wielkie znaczenie do postawienia prawi- d³owej diagnozy ma w³aœciwe oznaczanie ich obecnoœci i poziomu. Niestety, znaczenie diagnostyczne tylko nie- wielu autoprzeciwcia³ jest dobrze ustalone, a znaczenie pozosta³ych, zw³aszcza nowo odkrytych (np. przeciwcia³ dla keratyn), jest przedmiotem znacznych kontrowersji i wymaga dalszych badañ [13, 14].
Aktualna sytuacja w serodiagnostyce autoprzeciwcia³ jest niezwykle skomplikowana, poniewa¿ z jednej strony dysponujemy coraz to wiêksz¹ liczb¹ nowych (czy nowo odkrytych) autoprzeciwcia³, o jeszcze nie do koñca usta- lonym walorze diagnostycznym, a z drugiej strony coraz wiêksz¹ liczb¹ testów komercyjnych – o bardzo zró¿nico- wanej wartoœci diagnostycznej, która jest wynikiem ró¿- norodnoœci zastosowanych technik (metod oznaczania) oraz zró¿nicowania zastosowanych antygenów (np. anty- geny naturalne b¹dŸ rekombinantowe). Ró¿nice (w war- toœci poszczególnych testów) wynikaj¹ te¿ z takich para- metrów, jak stopieñ natywnoœci i oczyszczenia danego antygenu, ale tak¿e z czynników czysto technicznych, czy- li np. z gêstoœci epitopów antygenu w teœcie ELISA na fa- zie sta³ej czy sk³adu chemicznego zastosowanych me- diów, np. si³a jonowa diluentów, pH czy obecnoœæ deter- gentów.
Wykaz metod stosowanych dotychczas do oznacza- nia autoprzeciwcia³ jest tak¿e niezwykle bogaty i zali- czamy do niego takie metody, jak immunoelektrofore- Przestrzeganie wy¿ej opisanych procedur zapewnia w wiêkszoœci
przypadków badanych surowic mo¿liwoœæ ustalenia swoistoœci ANA i powtarzalnoœci wyników, unika siê te¿ b³êdów diagno- stycznych i co nie mniej wa¿ne – uzyskuje rozs¹dne koszty pro- wadzonej diagnostyki. Coraz wiêksza liczba nowo odkrytych au- toprzeciwcia³ i metod diagnostycznych zmusza do wprowadzenia procedur standaryzacji zarówno metod, jak i testów, na których s¹ oznaczane autoprzeciwcia³a.
specificities are assessed of course if there is a clinical demand.
Fourth stage is needed only in case, when we were unable to confirm in the tested serum any typical specificity of ANA and it is usually done by combining biochemical and immunochemical methodology. Strict following of these procedures guaranting us in prevalence of the tested sera the possibility (more certainty) that specificities are assessed properly, reproducibility of results, let us to avoiding mistakes and what even more important – generation reasonable costs of diagnostics.
za, podwójna dyfuzja w ¿elach agarowych lub agarozo- wych, immunodyfuzja radialna, przeciwbie¿na immu- noelektroprecypitacja (tzw. metoda counter) oraz bar- dzo wiele metod tzw. immunoaglutynacyjnych [9, 15–18]. Wszystkie ww. metody, pomimo prostoty wyko- nania i braku koniecznoœci posiadania skomplikowanej aparatury, maj¹ okreœlone niedomogi, a s¹ nimi stosun- kowo du¿a objêtoœæ i niestabilnoœæ preparatów antyge- nów wymaganych do odczynu, trudnoœci w standaryza- cji ww. metod oraz ich zbyt niska czu³oœæ. Ca³oœciowa i bardzo wnikliwa ocena tych metod zosta³a opubliko- wana w 1991 r. przez Reissa [18, 19].
Metoda IIF stosowana dzisiaj najczêœciej w diagno- styce chorób z autoimmunizacj¹, m.in. do wykrywania przeciwcia³ dla antygenów j¹drowych, wywodzi siê w prostej linii od odczynów IF opracowanych przez Co- onsa i wsp. [9] do wykrywania w tkankach antygenów wirusowych za pomoc¹ swoistego przeciwcia³a zwi¹za- nego z fluorochromem (zwanego koniugatem) [16, 20].
Najnowsz¹ i najwartoœciowsz¹ modyfikacj¹, któr¹ wypada omówiæ na zakoñczenie fragmentu dotycz¹ce- go metod IF (choæ jest to metoda immunoenzymatycz- na), jest tzw. metoda Colorzyme [16]. W tej metodzie wyeliminowano koniecznoœæ stosowania œwiat³a UV (do wzbudzenia fluorescencji, zwi¹zanego z np. FITC ko- niugatu antyglobulinowego) przez zastosowanie koniu- gatów antyglobulin z peroksydaz¹ chrzanow¹ (HRP).
Wprowadzony do metody Colorzyme nowy substrat dla peroksydazy 4-chloro-1-naftol, stosowany tak¿e do ko- niugatów z peroksydaz¹ w metodzie Western-blotting, pozwala na zwiêkszenie czu³oœci odczytu poprzez fakt,
¿e metoda ta daje znaczne podniesienie mo¿liwoœci rozró¿nienia szczegó³ów struktur komórkowych (lub tkankowych) na obrazie mikroskopowym [20].
Technikami, które od po³owy lat 80. wypar³y wy¿ej opisane metody, s¹ testy immunoenzymatyczne – wszelkie odmiany testu ELISA, technika Western-blot- ting oraz DOT-blot [21–24]. Obecnie dominuj¹c¹ pozycjê wœród testów do wykrywania autoprzeciwcia³ zajmuje metoda ELISA, wykonywana na 96-do³kowych plastiko- wych, polietylenowych lub polipropylenowych p³ytkach titracyjnych, op³aszczonych wysoko oczyszczonymi pre- paratami antygenowymi.
Ogólna zasada racjonalnie prowadzonej serodia- gnostyki sprowadza siê do jej podzia³u na 3 (rzadko 4) zasadnicze etapy.
W
W 11.. eettaappiiee powinno siê ustaliæ, czy w danej surowi- cy (lub innym materiale biologicznym) wystêpuj¹ w ogóle jakiekolwiek autoprzeciwcia³a z interesuj¹cego nas zakresu (np. przeciwcia³a przeciwj¹drowe – ANA) oraz czy ich poziom przekracza ustalon¹ normê. Do te- go etapu u¿ywa siê zwykle testów przegl¹dowych (ang.
screening tests) bazuj¹cych na substratach tkankowych
(utrwalone przekroje narz¹dów, np. w¹troby, nerek ssa- ków) lub liniach komórkowych (komórki Hep-2), które z natury rzeczy s¹ bogate w autoantygeny j¹drowe, cy- toplazmatyczne czy cytoszkieletowe [25]. Do u¿ytku wesz³y te¿ testy przegl¹dowe bazuj¹ce na metodzie im- munoenzymatycznej ELISA, w których do sp³aszczania powierzchni p³ytek titracyjnych u¿ywa siê koktajlu wy- soko oczyszczonych metod¹ chromatografii powino- wactwa lub rekombinantowych antygenów j¹drowych albo pe³nego ekstraktu antygenów j¹drowych (np.
z okreœlonego narz¹du, grasicy – RTE czy œledziony ssa- ków – BSE).
W
W 22.. eettaappiiee ustalamy swoistoœæ (lub najczêœciej swoistoœci) autoprzeciwcia³a (oczywiœcie pod warun- kiem, ¿e test skryningowy, np. ANA-Hep-2, jest dodatni przy rozcieñczeniu badanej surowicy ≥1/100 – w przy- padku dzieci i≥1/320 u doros³ych). Metodami obecnie najczêœciej stosowanymi s¹: metoda ELISA, Western- -blotting lub DOT-blotting, gdzie konieczne jest ju¿ za- stosowanie bardzo wysoko oczyszczonych preparatów antygenów j¹drowych (lub antygenów rekombinanto- wych), by mo¿na by³o jednoznacznie stwierdziæ, ¿e w danej surowicy wystêpuje (lub wystêpuj¹) autoprze- ciwcia³a markerowe o okreœlonej swoistoœci.
Oczywiœcie jest zrozumia³e, ¿e w 2. etapie (tj. przy ustalaniu konkretnej swoistoœci autoprzeciwcia³a) ko- rzystamy ze wskazówki, jak¹ jest okreœlony typ (ang.
pattern) œwiecenia w metodzie IIF lub wybarwiania j¹- der komórek Hep-2 w metodzie immunoperoksydazo- wej (Colorzyme), gdy¿ zawê¿a on zakres poszukiwanych swoistoœci autoprzeciwcia³. Wynika to z lokalizacji okreœlonych autoantygenów w strukturach komórki u¿ytej jako substrat do testu i dlatego w np. przypadku tzw. plamistego typu œwiecenia (wybarwiania) j¹der ko- mórek Hep-2 nale¿y poszukiwaæ przeciwcia³ dla antyge- nu U1-snRNP, Sm oraz SSA (Ro) i SSB (La) [8, 9, 19].
E
Ettaapp 33.. (zazwyczaj ostatni) sprowadza siê do ustale- nia, czy w danej surowicy wystêpuj¹ autoprzeciwcia³a dla podtypów (ang. fine specificities) molekularnych da- nego autoantygenu (np. U1-snRNP-68 kD, A i C, Sm-BB’
czy D lub SSA-60 i 52 kD), ale nastêpuje to tylko wtedy, gdy przeciwcia³a dla danego podtypu autoantygenu maj¹ ewidentn¹ asocjacjê kliniczn¹ z okreœlonym ze- spo³em klinicznym (np. przeciwcia³a dla antygenu SSA- -52 kD koreluj¹ z tzw. noworodkowym ca³kowitym blo- kiem serca) [9, 12].
Jednak w ok. 25–50% przypadków surowic pobra- nych od chorych reumatycznych wynik ANA jest ujemny i wtedy nale¿y analizowaæ równie¿ przeciwcia³a dla anty- genów cytoplazmatycznych, do których nale¿¹ m.in.
przeciwcia³a dla antygenu Jo-I, rybosomalnego bia³ka P, bia³ek cytoszkieletu (cytokeratyna, aktyna, wimentyna), zw³aszcza przy objawach klinicznych wskazuj¹cych na
okreœlony typ schorzenia [26]. Nale¿y te¿ wzi¹æ pod uwa- gê autoprzeciwcia³a z grupy przeciwcia³ antyfosfolipido- wych (aPL), szczególnie przeciwcia³a antykardiolipinowe (aCl) oraz antykofaktorowe (anty-β2-GP-I, antyaneksyna V, anty-AT III, antyprotrombina itp.), cenne markery ze- spo³u APS, czêsto towarzysz¹cego chorobom reumatycz- nym [9, 15].
E
Ettaapp 44.. w typowaniu autoprzeciwcia³ jest konieczny tylko wtedy, gdy wyczerpaliœmy wszystkie mo¿liwoœci diagnostyczne przeciwcia³ ANA oraz innych autoprze- ciwcia³ markerowych i przy dodatnim odczynie ANA IIF czy technik¹ Colorzyme i konkretnym typie œwiecenia nie ustaliliœmy swoistoœci dostêpnymi testami. Taka sy- tuacja, na szczêœcie dla diagnostów, zdarza siê w ok.
1–5% przypadków i jest najczêœciej z jednej strony wy- nikiem niezwyk³ego bogactwa odpowiedzi autoprze- ciwcia³owej w chorobach reumatycznych, z drugiej zaœ strony stosunkowo niewielkiej liczby (rzêdu 20) auto- antygenów, dla których mo¿emy oznaczyæ autoprze- ciwcia³a. Wykluczam oczywiœcie b³êdy techniczne, pro- wadz¹ce do wyników fa³szywie ujemnych, ale te nie powinny siê zdarzyæ przy prawid³owo prowadzonej dia- gnostyce. Wyj¹tkiem s¹ tu zdarzaj¹ce siê, niestety, przypadki zubo¿enia epitopowego antygenów rekom- binantowych, stosowanych w testach diagnostycznych.
Rekomendowana przez ECSA (European Consensus Study on Autoantibodies) strategia kaskadowego usta- lania swoistoœci przeciwcia³ ANA jest przedstawiona na ryc. 1. [27, 28].
Ta dysproporcja bogactwa odpowiedzi przeciwcia³ z jednej strony i stosunkowo ograniczonych mo¿liwoœci diagnostycznych autoprzeciwcia³ z drugiej, zmusza do zastosowania w 4. etapie metodyki specjalnej – niesto- sowanej zwykle w diagnostyce rutynowej autoprzeciw- cia³, do której zaliczamy:
•zastosowanie wzorcowych przeciwcia³ monoklonal- nych dla rzadkich antygenów na zwykle stosowa- nych substratach (np. komórki Hep-2),
•zastosowanie immunosorpcji surowic badanych wy- soko oczyszczonymi antygenami (z u¿yciem rutyno- wych testów diagnostycznych),
•zastosowanie pe³nych ekstraktów tkanek lub komó- rek Hep-2, MOLT4czy innych, bogatszych w rzadkie antygeny w po³¹czeniu z monoklonalnymi surowica- mi wzorcowymi.
Te specjalne procedury s¹ zwykle stosowane w za- k³adach badawczych, dysponuj¹cych du¿ym doœwiad- czeniem w serodiagnostyce autoprzeciwcia³ i zapleczem aparaturowym umo¿liwiaj¹cym otrzymywanie i oczysz- czanie autoantygenów metodami chromatograficznymi.
Z w³asnego doœwiadczenia autor stwierdza, ¿e warto to robiæ, gdy¿ mo¿e to mieæ (okreœlone miejsce serodiagno- styki) znaczenie w diagnostyce ró¿nicowej chorób reu- matycznych, zw³aszcza w trudnych diagnostycznie przy- padkach, i warto, by istnia³y zak³ady, w których prowa- dzi siê tak¹ specjalistyczn¹ diagnostykê [29–31].
Nale¿y tylko wyraziæ ubolewanie, ¿e na ogó³ œrodki przeznaczone przez instytucje do tego powo³ane nie za-
E
Ettaapp CCeellee pprroocceedduurryy PPrrzzyykk³³aadd SSttoossoowwaannaa mmeettooddaa
Etap I wykazanie obecnoœci (miano, a miano ANA 1/640 IIF – Hep-2
tak¿e typ œwiecenia) przeciwcia³ typ homogenno-plamisty Colorzyme – Hep-2
ANA ELISA-skrining
Etap II jeœli ANA s¹ dodatnie – ustala siê obecne przeciwcia³a anty-Ro, ELISA
swoistoœæ (swoistoœci) przeciwcia³ anty-La Western-blott
ANA brak anty-dsDNA, anty-Sm
Etap III ustala siê swoistoœci dla podtypów przeciwcia³a dla antygenu Ro Western-blott antygenów ANA (jeœli istnieje – 52 kD
uzasadnienie kliniczne)
Etap IV jeœli ANA ca³kowicie ujemne lub obecne przeciwcia³a dla metody kombinowane przy ANA-dodatnich nie udaje siê nukleohistonu (do 60% w SLE) (immunochemiczne
ustaliæ swoistoœci przeciwcia³a i Western-blott)
RRyycc.. 11.. Kaskadowa metoda oznaczania swoistoœci przeciwcia³ ANA.
FFiigg.. 11.. ”Cascade” method of the ANA specificity assessment.
pewniaj¹ mo¿liwoœci utrzymania takich specjalistycznych zak³adów diagnostycznych, prowadz¹cych nierutynow¹ identyfikacjê autoprzeciwcia³.
Przestrzeganie wy¿ej opisanych procedur w wiêk- szoœci przypadków badanych surowic daje mo¿liwoœæ ustalenia swoistoœci ANA i powtarzalnoœci wyników, unikniêcia b³êdów diagnostycznych i – co nie mniej wa¿ne – uzyskania rozs¹dnych kosztów prowadzonej diagnostyki. Coraz wiêksza liczba nowo odkrytych au- toprzeciwcia³ i metod diagnostycznych zmusza do wprowadzenia procedur standaryzacji zarówno metod, jak i testów, na których s¹ oznaczane autoprzeciwcia³a.
Podsumowuj¹c, nale¿y stwierdziæ, ¿e oznaczanie przeciwcia³ przeciwj¹drowych jest metod¹ czu³¹, lecz nieswoist¹. Tylko u chorych z objawami podmiotowy- mi czy przedmiotowymi chorób tkanki ³¹cznej wykry- cie ANA w mianach wy¿szych/równych ni¿ 320 (a u dzieci od 1/100) mo¿e byæ pomocne w potwierdze- niu rozpoznania. Nale¿y podkreœliæ, ¿e przeciwcia³a mog¹ wystêpowaæ w ró¿nych chorobach poza uk³ado- wymi chorobami tkanki ³¹cznej, np. w chorobach w¹- troby i p³uc, we wszelkiego typu zaka¿eniach, w choro- bach nowotworowych, skórnych i endokrynologicz- nych, a ponadto odsetek dodatnich ANA zwiêksza siê u kobiet w ci¹¿y, u osób powy¿ej 60. roku ¿ycia, w ze- spo³ach polekowych oraz w stanach po przeszczepach (np. serca i nerek) [32]. U osób zdrowych (zw³aszcza powy¿ej 50.–60. roku ¿ycia) wyniki testu te¿ bywaj¹ dodatnie. Badanie to nie powinno byæ zlecane pacjen- tom z niejasnymi dolegliwoœciami czy objawami, po- niewa¿ z wy¿ej opisanych powodów wartoœæ diagno- styczna tego oznaczenia jest znikoma. Wskazane jest natomiast u chorych z objawami uk³adowej choroby tkanki ³¹cznej, poniewa¿ tylko ustalenie obecnoœci przeciwcia³a markerowego, tj. przeciwcia³a o wysokiej swoistoœci dla danej jednostki chorobowej, ma znacze- nie pomocnicze dla diagnostyki ró¿nicowej chorób reu- matycznych, gdy¿ autoprzeciwcia³a markerowe s¹ w kryteriach diagnostycznych wiêkszoœci chorób reu- matycznych. Otrzymane t¹ drog¹ wyniki uzasadniaj¹ wówczas podjêcie dalszych badañ maj¹cych na celu potwierdzenie rozpoznania [33].
P
Piiœœmmiieennnniiccttwwoo
1. Systemic Autoimmunity. Bigazzi PE, Reichlin M (eds.). Mariel Dekller Inc., New York, Basel, Honkong 1991.
2. Organ-specific Autoimmunity. Bigazzi PE, Wick G, Wicher K (eds). Mariel Dekller Inc., New York, Basel, Honkong, 1991.
3. Barnett LA, Fujinami RS. Molecular mimicry: a mechanism for autoimmune injury. FASEB J 1992; 6: 840-51.
4. Baum H, Butler P, Davies H, et al. Autoimmune disease and molecular mimicry: an hypothesis. Trends Biochem Sci 1993;
18: 140-5.
5. Horsfall AC. Molecular mimicry and autoantigens in conective tissue diseases. Mol Biol Rep 1992; 16: 139-43.
6. Z¹bek J. Rola antygenów bakteryjnych w indukcji procesów autoimmunizacyjnych zwi¹zanych z patogenez¹ reaktywnego zapalenia stawów. Alergia Astma Immunologia 1999; 4: 41-4.
7. Kontny E, Jesieñ-Dudziñska E, Romicka AM, et al. Immunologia chorób stawów. W: Immunologia kliniczna. Kowalski ML (red.).
Mediton Oficyna Wydawnicza, £ódŸ 2000, 357-84.
8. Fritzler MJ. Immunofluorescent antinuclear antibody tests.
Autoimmune Disease. In: Manual of Clinical Laboratory Immunology. Rose NR, Friedman H, Fahey JL (eds). American Society for Microbiology, Washinghton DC 1986: 733-9.
9. von Mühlen CA, Tan EM. Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum 1995;
24: 323-58.
10. Puszczewicz MJ. Przeciwcia³a przeciwj¹drowe w diagnostyce ró¿nicowej chorób uk³adowych. Reumatologia 1998; 36: 30-41.
11. Manual of Biological Markers of Disease. van Venrooij WJ, Maini RN (eds). Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Boston, London 1994.
12. Reichlin M. Systemic Lupus Erythematosus. In: Systemic Autoimmunity. Bigazzi PE, Reichlin M (eds). Mariel Dekller Inc., New York, Basel, Honkong, 1991: 163-99.
13. Vincent C, Serre G, Lapeyre F, et al. High diagnostic value in rheumatoid arthritis of antibodies to the stratum corneum of rat oesophagus epithelium, so-called “antikeratin-antibodies”.
Ann Rheum Dis 1989; 48: 712-22.
14. B¹kowska A. Antikeratin antibodies in serum and in synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis. Central European J Immunol 1999; 24: 25-9.
15. Metody diagnostyki serologicznej w reumatologii. Luft S (red.).
PWN, Warszawa, 1996.
16. Z¹bek J. Metody wykrywania autoprzeciwcia³ „markerowych”
w chorobach z autoimmunizacj¹. W: Immunologia kliniczna.
Kowalski ML (red.). Mediton Oficyna Wydawnicza, £ódŸ 2000:
787-806.
17. Iwaszkiewicz J, Szkudliñska B. Metody oceny humoralnych sk³adników odpowiedzi immunologicznej. W: Immunologia kliniczna. Kowalski ML (red.). Mediton Oficyna Wydawnicza,
£ódŸ 2000: 749-64.
18. Reis J. Wspó³czesne metody szybkiej indykacji i immunodia- gnostyki rozpuszczalnych antygenów bakteryjnych. Post Mikrobiol 1989; 28: 17-34.
19. Manual of Clinical Laboratory Immunology. Rose NR, Friedman H, Fahey JL (eds). American Society for Microbiology.
Washinghton DC 1986.
20. Manual of Biological Markers of Disease. van Venrooji WJ, Maini RN (eds). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, 1994.
21. Engvall E, Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay of immunoglobulin G.
Immunochemistry 1971; 9: 871-6.
22. Gershoni JM, Poladi GE. Protein blotting: principles and applications. Anal Biochem 1983; 131: 1-34.
23. Grzybowski J, Trafny EA. Immunoenzyme test ELISA: classification and nomenclature. Post Hig Med Doœw 1985; 39: 440-9.
24. Z¹bek J. Wykrywanie autoprzeciwcia³ wystêpuj¹cych w surowi- cach chorych na uk³adowe choroby tkanki ³¹cznej z zastosowa-
niem techniki „immunoblotting”, czyli elektroforezy bia³ek w ¿elu poliakrylamidowym po³¹czonej z immunodetekcj¹. W: Metody diagnostyki serologicznej w reumatologii. Luft S (red.). PWN War- szawa, 1996: 101-12.
25. Cleymaet JE, Nakamura RM. Indirect immunofluorescent antinuclear antibody tests: comparison of sensitivity and specificity of different substrates. Am J Clin Pathol 1972; 58:
388-93.
26. Z¹bek J. Nowoczesne metody wykrywania autoprzeciwcia³ markerowych oraz autoantygenów w chorobach reumatycz- nych. Reumatologia 1997; 35: 476-7.
27. van Venrooij WJ, Charles P, Maini RN. The consensus workshop for the detection of antibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases. J Immunol Methods 1991; 140: 181-9.
28. Z¹bek J. Consensus Workshop for Standardization of Autoantibodies to Intracellular Antigens. Second Meeting.
Warszawa 29-30.04.1995. Reumatologia 1995; 33: 461-2.
29. Z¹bek J. Nowoczesne metody wykrywania autoprzeciwcia³ w chorobach z autoagresj¹. Przegl Epidemiol 2002; 56: 59-65.
30. Z¹bek J. Przyczyny niepowodzeñ w identyfikacji swoistoœci autoprzeciwcia³ ANA w surowicach pobranych od pacjentów z uk³adowymi chorobami tkanki ³¹cznej. Reumatologia 2004;
42: 416-26.
31. Z¹bek J, Palacz A, Musiej-Nowakowska E i wsp. Porównanie wartoœci diagnostycznej przeciwcia³ dla nukleosomów z innymi markerami serologicznymi wystêpuj¹cymi w toczniu rumieniowatym uk³adowym. Reumatologia 2004; 42: 507-14.
32. Thomas C, Robinson JA. Oznaczanie przeciwcia³ przeciwj¹drowych. Medycyna po Dyplomie 1994; 3: 114-8.
33. Hebanowski M, B¹kowska A. Komentarz. Medycyna po Dyplomie 1994; 3: 118-9.
