Application of capillary electrophoresis to analysis of tricyclic psychotropic drugs

APPLICATION OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS TO ANALYSIS OF TRICYCLIC PSYCHOTROPIC DRUGS

K

M

M

W

Faculty o f Chemistry, Jagiellonian University, Cracow

ABSTRACT: Two separation modes of capillary electrophoresis (CE): capillary zone electrophoresis (CZE) and m icellar electrokinetic capillary chrom atography (MECC) were used for toxicological analysis of blood sam ples and p h arm aceutical p re p a ra ­ tions. These two techniques were te sted on commonly used phenothiazines (PHE) and tricyclic a n tid ep ressan ts (TCA), which are drugs of forensic in terest. The a n a ly t­

ical potential of CZE and MECC w as exemplified by the separation of four-drug m ix­

tu re s added to blood and single-drug analyses of pharm aceuticals. The detection lim it for prom azine in blood and rep eatab ility of identification p a ram eters (stan d ard deviations of relative m igration tim es) for desipram ine in a pharm aceutical p re p a ra ­ tion an d prom azine in blood sam ples were determ ined.

KEY WORDS: C apillary zone electrophoresis; M icellar electrokinetic capillary chro­

m atography; Phenothiazines; Tricyclic an tid ep ressan ts; Blood sam ples; P h a rm a ­ ceuticals.

Problems o f Forensic Sciences, vol. LII, 2002, 52-63 Received 5 November 2002; accepted 2 December 2002

INTRODUCTION

The first applications of capillary electrophoresis (CE) to drug analysis took place in th e late seventies and early eighties [3]. Plastic capillaries were used a t th a t tim e. In 1988 fused silica capillaries were introduced, w hich in i­

tia te d th e dynam ic developm ent of electrophoretic m ethods for drugs an a ly ­ sis. At presen t in th is area, th re e CE sep aration modes are m ostly used: cap­

illary zone electrophoresis (CZE), m icellar electrokinetic capillary chrom a­

tography (MECC) and chiral separations. At the beginning of th e nineties, th e first papers concerning CE applications to toxicological analysis a p ­ peared. For instance, th is technique was applied to analysis of: b a rb itu ra te s in serum an d u re a [4], benzodiazepines in u re a [6] and serum [5], anti- arrh ythm ic drugs, tricyclic neuroleptics and tricyclic an tid e p re ssan ts in u re a [1] an d phenothiazines in pharm aceutical prep aratio n s [2].

The aim of th is work was to stud y th e possibility of application of CZE

and MECC to th e analysis of psychotropic drugs in the phenothiazine (PHE)

dazine;

— TCAD: am itriptyline, im ipram ine, clom ipram ine, desipram ine, dox­

epin, nortriptyline, noxiptyline.

The drug sta n d a rd s were p u rchased from Sigma-Aldrich (Germany). The following electrolytes were used as sep aratio n buffers:

- CZE: 50 mM CAPSO (3-[cyclohexylamino]-2-hydroxy-1-propanesulfo- nic acid (Sigma, G erm any) + m ethanol (HPLC grade - Merck, G er­

m any) (70:30, v/v), pH = 9.5;

- MECC: 40 mM sodium te tra b o ra te (POCH, Gliwice), pH = 9.5 w ith a d ­ dition of 10 mM STDC (sodium salt of taurodeoxycholic acid) (Sigma, Germany).

Blood th a t had passed its expiration d ate w as ta k e n from th e local blood b a n k (“b lan k sam ples”) in Cracow, Poland. Pharm aceutical preparations:

Petylyl (A rzneim ittelw erk, D resden, Germ any) and A nafranil SR (Novartis P h a rm a AG Basle, Sw itzerland) were bought in a Polish pharm acy.

Preparation o f sam ples for an alysis

The drugs were analysed as single drugs or drug m ixtures a fte r ap p ropri­

ate dilution of th e ir m ethanolic sta n d a rd solutions w ith w ater.

One tab le t of each pharm aceutical p rep aratio n w as pulverised in an ag­

ate m o rtar (after w ashing off th e ex tern al layer from th e tablet), dissolved in a suitable am ount of m ethanol, subjected to u ltra so u n d an d filtered. Before analysis, m ethanolic solutions were appropriately diluted w ith w ater.

1 ml of “b lank” blood was spiked w ith drug sta n d a rd m ixtures, in am ounts of 5 Rg each. In order to estim ate th e detection lim it of prom azine, th is drug w as added to “blan k ” blood in th e following concentrations: 5; 2.5;

1.25; 0.63 and 0.31 |Jg/ml. N ext th e blood sam ples were extracted by th e liq­

uid-liquid technique, according to th e following procedure. 1 ml of th e sam ­

ple was alkalised w ith 3ml 0.6 M NaO H to pH = 12 an d extracted using 5 ml

of hexane w ith isoam yl alcohol (99:1, v/v). The whole w as gently sh aken for

10 m in and th e n centrifuged (3000 rpm ) for 10 min. The organic layer was

54 K. M a d ej, M . W o zn ia k ie w ic z

gradually transferred into 1.5 ml Eppendorf probes and evaporated to ca 0.5 ml u n d e r nitrogen. U sing CZE th e exam ined drugs were re-extracted into 0.01% phosphoric acid, and, in th e case of MECC, into 0.01% phosphoric acid in 0.01 M aqueous solution of STDC. To th is end, the organic layer was shaken w ith 50 |jl of appropriate m edium for 3 m in and centrifuged (5000 rpm) for 4 min. The sep arated aqueous layer w as injected into th e capillary.

A pparatus

A Prince 550 a ir th erm o sta te d capillary electrophoresis system (Prince Technologies, Em m en, Holland) w ith Lam bda 1010 spectrophotom eter (Bis- choff, Leonberg, Germany) w as used.

The sep aratio n s of compounds were carried out in a bare fused silica cap­

illary of 50 Rm ID and 100 cm/66 cm length, a t 30 kV. Sam ples were injected into the capillary by th e hydrodynam ic technique using a pressu re of 100 m bar for 6 sec. D etection of th e an aly tes was carried out in light of w ave­

len gth 210 an d 254 nm.

RESULTS AND DISCUSSION

The following 12 commonly used psychotropic drugs in the phenothiazine derivatives and tricyclic an tid e p re ssan ts groups (chlorprom azine, levom e­

prom azine, perazine, prom azine, thioridazine, am itriptyline, im ipram ine, clom ipram ine, desipram ine, doxepin, n o rtrip tylin e and noxiptyline) were included in th e study. Two sep aratio n modes of capillary electrophoresis:

CZE and MECC were used. F irst, these techniques were tested on sta n d a rd single drug solutions. The obtained resu lts indicated th a t all teste d drugs can be determ ined in pharm aceutical preparations.

In order to exam ine th e sep aratio n possibilities of CZE and MECC m eth ­ ods in relatio n to th e tested groups ofcom pounds, these drugs were analysed as sta n d a rd m ixtures. Good sep aration s were obtained for a m axim um of four (Figure 1 an d 2) and five (Figure 3) drugs. In th e case of four-component m ixtures, two PH Es (prom azine an d chlorprom azine) and two TCADs (desipram ine and nortriptyline) were separated, and also four TCADs (doxepin, im ipram ine, am itrip ty line and clom ipramine). In th e five-compo­

n e n t m ixture, five TCADs (desipram ine, n ortriptyline, im ipram ine, doxepin an d am itriptyline) were separated.

Next, analyses of blood sam ples spiked w ith sta n d a rd m ixtures were c a r­

ried out, and identification of th e active sub stances in pharm aceu ticals w as

perform ed as well. In th e case of pharm aceu ticals analysis, th e m atrix effect

w as not significant an d both CE modes could be used interchangeably. For

a h igher rep eatab ility of th e identification param eter, a second sta n d a rd

Fig. 1. S eparation of a sta n d a rd m ixture of two PH Es: chlorprom azine (Chl), prom azine (Pro) and two TCADs: desipram ine (Des), nortriptyline (Nor) by CE-CZE.

Separation buffer: 50 mM CAPSO + m ethanol (70: 30, v/v), pH = 9.5; E O F -electro o s- motic flow.

t [min]

Fig. 2. S eparation of a sta n d a rd m ixture of four TCADs: doxepin (Dox), im ipram ine (Imi), am itriptyline (Ami) and clom ipram ine (Clo) by CE-MECC. S eparation buffer:

40 mM sodium tetrab o ran e, pH = 9.5 w ith addition of 10 mM STDC; EOF - electroosmotic flow.

drug w as added as an in te rn a l sta n d a rd to p rep aratio n sam ples. The electrophoregram s gained for th e analysed p rep aratio n s are shown in Fig­

u res 4 and 5.

A pplication of CZE an d MECC to th e analysis of blood sam ples for

tricyclic psychotropic drugs did not yield equally effective sep aratio n resu lts

(Figure 6 and 7). The influence of th e biological m atrix on th e determ inatio n

56 K. M a d ej, M . W o źn ia k ie w ic z

Fig. 3. S eparation of a sta n d a rd m ixture of five TCADs: desipram ine (Des), n o r­

trip ty lin e (Nor), im ipram ine (Imi), doxepin (Dox) and am itrip ty lin e (Ami) by CE-CZE. The rem aining d a ta are the sam e as in Fig. 1.

Fig. 4. A nalysis of Petylyl (desipram ine) w ith addition of im ipram ine (Imi) as an in ­ te rn a l sta n d a rd (IS) by CE-CZE. The rem aining d a ta are th e sam e as in Fig. 1.

of desipram ine, n ortriptyline, prom azine and chlorprom azine in blood by CZE w as sufficiently significant to ren d e r impossible sep aratio n and id en ti­

fication of two out of th e four drugs in th e m ixture (Figure 6). In th is case, good sep aratio n of desipram ine an d n o rtrip tylin e w as obtained, b u t prom a­

zine was poorly se p arated from th e blood m atrix, and chlorprom azine w as

completely m asked by th e “biological background”. However, th e presence of

endogenous compounds in th e blood extract did not significantly influence the

course of analysis by MECC of th is m aterial containing four drugs (Figure 7).

0 5 10 1 5 20 2 5 t [min]

Fig. 5. A nalysis of A nafranil (clomipramine) w ith addition of doxepin as an in te rn al sta n d a rd (IS) by CE-MECC. The rem aining d a ta are the sam e as in Fig. 2.

Fig. 6. A nalysis of: (a) blood w ith addition of a sta n d a rd m ixture of two PHEs:

chlorprom azine (Chl), prom azine (Pro) and two TCADs: desipram ine (Des), n o r­

trip ty lin e (Nor) and (b) “b lan k ” blood by CE-CZE. The rem aining d a ta are th e same as in Fig. 1.

Good sep aratio n of all four com ponents (doxepin, im ipram ine, am itriptyline an d clom ipram ine) in th e m ixture w as achieved, b u t th e peaks correspond­

ing to th e teste d drugs were relatively broad, an d th e sep aratio n tim e w as ra th e r long (over 40 min).

The relative m igration tim es (identification param eters) and th e ir corre­

sponding sta n d a rd deviations for analyses of: prom azine in blood by MECC

58 K. M a d ej, M . W o zn ia k ie w ic z

Fig. 7. A nalysis of: (a) blood w ith addition of a sta n d a rd m ixture of four TCADs:

doxepin (Dox), im ipram ine (Imi), am itriptyline (Ami) and clom ipram ine (Clo);

(b) “b lan k ” blood, by CE-MECC. The rem aining d a ta are the sam e as in Fig. 2.

an d desipram ine in a pharm aceu tical p rep aratio n by CZE are given in T a ­ ble I. The detection lim it of prom azine in blood was also estim ated.

TABLE I . ANALYSIS OF PROMAZINE IN BLOOD BY MECC AND DESIPRAM INE IN A PHARMACEUTICAL PREPARATION (PETYLYL) BY CZE

S a m p le S e p a ra tio n

m ode D ru g I n te r n a l

s ta n d a rd

R e la tiv e m ig ra tio n

tim e

S ta n d a rd d ev ia tio n

LOD [p. g/ml]

N u m b e r of re p e a te d m e a s u re m e n ts

Blood M EC C P ro m a z in e Im ip ra m in e 1.08 0.05 0.65 5

T a b le t CZE D e sip r a m in e Im ip ra m in e 0.86 0.01 - 3

CONCLUSIONS

1. The peaks on electrophoregram s corresponding to tested drugs ob­

tain e d by th e CZE m ethod were n arrow er an d th e ir m igration tim es were sh o rter and more rep eatab le as com pared w ith th e appropriate peaks in th e case of application of th e MECC method.

2. Both sep aratio n modes: CZE an d MECC m ay be equally effectively used for identification of th e tested psychotropic drugs in p h arm aceu ­ tical preparations.

3. MECC is preferable (to CZE) for blood analysis, because it possesses

g rea ter sep aratio n possibilities an d significantly reduces th e influence

of th e biological m atrix on th e sep aration results. In th e case of app li­

tion into the capillary — a few nl) will m ost probably allow a lowering of th e detection lim it to th erap eu tic concentration levels.

References:

1. A u m a t e l l A. , W e l l s R. J ., D eterm ination of a cardiac an tiarrhythm ic, tricyclic antipsychotics and a n tid ep ressan ts in h u m an and anim al u rine by m icellar electrokinetic capillary chrom atography using a bile salt, Jou rn a l of Chromatography B 1995, vol. 669, pp. 331-344.

2. M u i j s e l a a r P. G. H. M. , C l a e s s e n s H. A. , C r a m e r s C. A. , D eterm i­

natio n of stru ctu ra lly related phenothiazines by capillary zone electrophoresis and micellar electrokinetic chromatography, Journal o f Chromatography A 1996, vol. 735, pp. 395-402.

3. T h o r m a n n W. , C a s l a v s k a J . , C apillary electrophoresis in drug analysis, Electrophoresis 1998, vol. 19, pp. 2691-2694.

4. T h o r m a n n W. , M e i e r P . , M a r c o l l i C. [etal.], A nalysis of b a rb itu ra te s in h u m a n seru m a n d u rin e by high-perform ance capillary electrophoresis- m icellar electrokinetic capillary chrom atography w ith on-column m ulti-w ave­

len g th detection, J o u rn a l o f Chromatography 1991, vol. 545, pp. 445-460.

5. T o m i t a M. , O k u y a m a T., A pplication of capillary electrophoresis to the si­

m ultaneous screening and q u an tita tio n of benzodiazepines, Jo u rn a l of Chro­

m atography B 1996, vol. 678, pp. 331-337.

6. T o m i t a M. , O k u y a m a T. , S a t o S [et al], Sim ultaneous d eterm ination of n itrazep am an d its m etabolites in u rine by m icellar electrokinetic capillary chrom atography, J o u rn a l o f Chromatography (Biomedical A pplications) 1993, vol. 621, pp. 249-255.

ZASTOSOWANIE ELEKTROFOREZY KAPILARNEJ W ANALIZIE TRÓJPIERŚCIENIOWYCH LEKÓW PSYCHOTROPOWYCH

K

M

M

W

WSTĘP

Pierw sze zastosow ania elektroforezy kapilarnej (CE) do analizy leków przy p a­

d a ją n a przełom la t siedem dziesiątych i osiem dziesiątych dwudziestego w ieku [3].

Stosowano wówczas k apilary plastikow e. W roku 1988 wprowadzono k ap ilary k w a r­

cowe, które zapoczątkowały dynam iczny rozwój elektroforetycznych metod analizy leków. A ktualnie w tej dziedzinie najczęściej wykorzystuje się trzy w arian ty elektro­

forezy kapilarnej: k a p ila rn ą elektroforezę strefow ą (CZE), m icelarn ą elektrokine- ty czn ą chrom atografię k a p ila rn ą (MECC) oraz rozdziały chiralne. Od początku lat dziewięćdziesiątych pojaw iająsię również prace dotyczące zastosow ań CE w analizie toksykologicznej. Technikę tę zastosowano m.in. do analizy barb itu ran ó w w su ro ­ wicy i moczu [4], benzodiazepin w moczu [6] i surowicy [5], leków antyarytm icznych oraz trójpierścieniow ych leków neuroleptycznych i przeciw depresyjnych w moczu [1], a także fenotiazyn w p re p a ra tac h farm aceutycznych [2].

Celem niniejszej pracy było zbadanie możliwości zastosow ania CZE i MECC do analizy leków psychotropowych z grupy fenotiazyn (PHE) i trójpierścieniowych leków przeciw depresyjnych (TCAD) w pełnej krw i oraz w p re p a ra tac h farm aceutycz­

nych.

MATERIAŁY I METODY

M a te r ia ły

W badan iach uwzględniono następujące leki z grup PH E i TCAD:

— PHE: chlorprom azyna, lewom eprom azyna, perazyna, prom azyna, tiorydazy- na;

— TCAD: am itryptylina, im ipram ina, klom ipram ina, dezypram ina, doksepin, n o rtry p ty lin a i noksyptylina.

S ta n d ard y badanych leków były zakupione w firm ie Sigma-Aldrich (Niemcy).

Zastosowano następujące elektrolity jako bufory separacyjne:

- CZE: CAPSO kw as 3-[cyclohexylamino]-2-hydroksy-1 propanesulfonow y (Sig­

ma, G erm any) + m etanol (HPLC grade - Merck, Niemcy) (70:30, v/v), pH = 9,5;

- MECC: 40 mM te tra b o ra n sodu (POCH, Gliwice); pH = 9,5 z 10 mM STDC (so­

dowa sól kw asu taurodeoksycholinowego) (Sigma, Niemcy).

P rzeterm in o w an ąk rew od dawców (“ślepa krew ”) otrzym ano w stacji krw iodaw ­ stw a w Krakowie. P re p a ra ty farm aceutyczne: Petylyl (A rzneim ittelw erk, Drezno, Niemcy) oraz A nafranil SR (N ovartis P h a rm a AG Bazylea, Szwajcaria) zakupiono w aptece.

lizowano 3 ml 0,6 M NaOH do pH = 12 i ekstrahow ano 5 ml h ek san u z alkoholem izo- amylowym (99:1, v/v). Całość delikatnie w ytrząsano przez 10 min, a następ n ie w iro­

wano (3000 x rpm) przez 10 min. W arstw ę organiczną przenoszono sukcesywnie do 1,5 ml plastikow ych probówek Eppendorfa i odparowywano w atm osferze azotu do ok. 0,5 ml. Stosując w a ria n t CZE leki reekstrahow ano do 0,01% kw asu fosforowego, n a to m ia st w p rzy p ad k u zastosow ania MECC - do 0,01% k w asu fosforowego w 0,01 M wodnym roztworze STDC. W tym celu w arstw ę organiczną w ytrząsano z 50 ml odpowiedniego m edium przez 3 m in i odwirowywano przez 4 m in (5000 x rpm).

O ddzieloną w odną w arstw ę w strzykiw ano do kapilary.

A p a r a tu r a

W badan iach zastosowano term ostatow any pow ietrzem system do elektroforezy kapilarnej Prince 550 (Prince Technologies, Em m en, H olandia) połączony ze spek­

trofotom etrem (Bischoff, Leonberg, Niemcy).

Rozdziały związków przeprow adzane były w pustej kapilarze kwarcowej o śre d ­ nicy 50 ąm i długości 100 cm/66 cm pod napięciem 30 kV. Próbki w strzykiw ano do k ap ilary te c h n ik ą hydrodynam iczną przy użyciu ciśnienia 100 m bar przez 6 s.

Detekcję analitów prowadzono przy długościach fal św iatła 210 i 254 nm.

WYNIKI BADAŃ I ICH OMÓWIENIE

W badaniach uwzględniono 12 powszechnie stosowanych leków psychotropo­

wych z grupy pochodnych fenotiazyn i trójpierścieniow ych leków przeciwdepresyj- nych (chlorprom azynę, lewom eprom azynę, perazynę, prom azynę, tiorydazynę, ami- tryptylinę, im ipram inę, klom ipram inę, dezypram inę, doksepin, nortryptylinę i nok- syptylinę). Zastosowano dwa w arian ty separacyjne elektroforezy kapilarnej, tj. CZE i MECC. W pierwszej kolejności w spom niane techniki testow ano n a wzorcowych roztw orach pojedynczych leków. W w yniku przeprow adzonych eksperym entów stwierdzono, że w szystkie testow ane leki m ogą być oznaczane w p rep aratach fa rm a ­ ceutycznych.

W celu zbadania możliwości separacyjnych zastosowanych metod: CZE i MECC w odniesieniu do testow anej grupy związków, leki te analizow ano w ich wzorcowych m ieszaninach. Dobre rozdziały uzyskano m aksym alnie dla czterech (rycina 1 i 2) i pięciu (rycina 3) leków. W przypadku m ieszanin czteroskładnikow ych były to: dwie pochodne fenotiazyny (prom azyna i chlorprom azyna) i dwa trójpierścieniow e leki

B2 K. M a d ej, M . W o źn ia k ie w ic z

przeciwdepresyjne (dezypram ina i nortryptylina) oraz cztery trójpierścieniowe leki przeciwdepresyjne (doksepin, im ipram ina, am itryptylina i klom ipram ina), natom iast m ieszaninę pięcioskładnikową stanowiło pięć trójpierścieniowych leków przeciwde- presyjnych (dezypram ina, nortryptylina, im ipram ina, doksepin i am itryptylina).

W następnej kolejności wykonano analizy próbek krw i z dodatkiem wzorcowych m ieszanin leków, a także przeprowadzono identyfikację substancji czynnych w p re ­ p a ra ta c h farm aceutycznych. W przypadku analizy środków farm aceutycznych efekt matrycowy nie odgrywał znaczącej roli i oba w arianty CE mogły być stosowane za­

miennie. W celu uzyskania większej powtarzalności p aram etru identyfikacyjnego do próbek preparatów dodawano drugi lek wzorcowy jako stan d ard wewnętrzny. U zyska­

ne elektroforegram y dla analizowanych preparatów pokazano n a rycinach 4 i S.

Zastosowanie CZE i MECC do analizy próbek krw i n a zaw artość trójpierścienio- wych leków psychotropowych nie dało jednakowo efektywnych wyników rozdziału (ryciny B i 7). W przypadku analizy krw i n a zaw artość dezypram iny, nortryptyliny, prom azyny i chlorprom azyny m etodą CZE wpływ m atrycy biologicznej okazał się na tyle istotny, że uniem ożliwił on rozdział oraz identyfikację dwóch spośród czterech leków w m ieszaninie (rycina B). W tym przypadku uzyskano dobry rozdział dla dezypram iny i nortryptyliny, n ato m ia st prom azyna została słabo oddzielona od m atrycy krwi, a chlorprom azyna została całkowicie zam askow ana przez „tło” biolo­

giczne. N atom iast obecność związków endogennych w ekstrakcie krw i nie m iała większego znaczenia dla przebiegu analizy m etodą MECC tego m ateriału zaw ie­

rającego cztery leki (rycina 7). U zyskano dobry rozdział w szystkich czterech sk ład n i­

ków w m ieszaninie (doksepin, im ipram ina, am itryptylina i klom ipram ina), jakkol­

wiek piki odpowiadające testow anym lekom były stosunkowo szerokie, a czas sep a­

racji długi (ponad 4O min).

W tabeli I podano względne czasy m igracji (param etry identyfikacyjne) i odpo­

wiadające im odchylenia standardow e w dwóch przypadkach analiz: dla prom azyny we krw i m etodąM E C C i dezypram iny w preparacie farm aceutycznym m etodą CZE.

Dla prom azyny oszacowano również granicę detekcji we krwi.

WNIOSKI

1. Piki leków n a elektroforegram ach uzyskiw ane m etodą CZE sąw ęższe, a czasy m igracji krótsze i bardziej pow tarzalne w porów naniu z odpowiednimi czasa­

mi migracji w przypadku zastosow ania metody MECC.

2. Oba w arian ty separacyjne CZE i MECC m ogą być równoważnie stosowane do identyfikacji testow anych leków psychotropowych w p rep aratach farm aceu ­ tycznych.

3. W odniesieniu do analizy krwi, w a ria n t MECC je st bardziej preferow any niż w a ria n t CZE, gdyż posiada on większe możliwości separacyjne i w znacznym stopniu redukuje wpływ m atrycy biologicznej na wynik rozdziału. W p rzypad­

ku stosow ania CZE do analizy próbek krw i wym agane s ą czystsze ek strak ty , np. przez zastosow anie techniki SPE. A ltern aty w n ą drogą elim inacji efektu matrycowego może być zastosow anie kom binacji dwóch w ariantów CE, n a przykład CZE z odpowiednim dodatkiem su rfak tan ta.