ZNACZENIE POLIAMIN W PRODUKCJI ZARODKÓW SOMATYCZNYCH
POLYAMINES IN SOMATIC EMBRYO PRODUCTION JanKĘPCZYŃSKI1, Izabela RUDUŚ1, Marta E. BRYŚKIEWICZ2
1Katedra Fizjologii i Inżynierii Genetycznej Roślin, Uniwersytet Szczeciński
2Pomorski Uniwersytet Medyczny, Szczecin
Streszczenie: Podczas somatycznej embriogenezy (SE) w warunkach in vitro, w wyniku wyzwole- nia potencjału embriogenicznego komórek eksplantatu, następuje rozwój somatycznych zarodków.
Liczne dane wskazują, że wielokationowe aminy biogenne – poliaminy (PA) można zaliczyć do grupy endogennych czynników warunkujących embriogeniczność tkanek roślinnych. Chociaż mechanizm działania poliamin nie jest w pełni poznany, niejednokrotnie wykazano ich udział w regulacji poszcze- gólnych etapów SE prowadzących do uformowania struktur zarodkowych. Sugeruje się, że poszcze- gólne PA mogą pełnić odmienne funkcje – putrescyna podtrzymuje proliferację komórek, a różnicow- anie – raczej spermidyna i spermina.
Słowa kluczowe: androgeneza, gynogeneza, kultury in vitro, poliaminy, somatyczna embriogeneza Summary: Somatic embryogenesis in vitro is a process in which somatic embryos are formed as a re- sult of the expression of plant tissue embryogenic potential. There is substantial evidence that poly- amines (PA), which are ubiquitous polycationic biogenic amines, can be considered as endogenous factors determining embryogenicity. Though, the mechanism of PA action has not been elucidated yet, there are many instances of their regulatory function in different phases of SE leading to somatic em- bryo development. A diverse role in SE of distinct polyamines is suggested with putrescine responsible for cell proliferation whereas spermidine and spermine for cell differentiation.
Key words: androgenesis, gynogenesis, in vitro cultures, polyamines, somatic embryogenesis Wykaz stosowanych skrótów: ABA – kwas abscysynowy; ADC – dekarboksylaza argininy; BA – N-6-ben- zyloadenina; Cad – kadaweryna; CHA – cykloheksyloamina; 2,4-D – kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy;
DCHA – dicykloheksyloamina; IAA – kwas indolilo-3-octowy; DFMA – α-difluorometyloarginina;
DFMO – α-diflurometyloornityna; NAA – kwas naftylo-1-octowy; ODC – dekarboksylaza ornityny;
PA – poliaminy; Put – putrescyna; SAM – S-adenozylometionina; SE – somatyczna embriogeneza; Spd – spermidyna; SPDS – syntaza spermidyny; Spm – spermina; SPMS – syntaza sperminy
Abbreviations: ABA – abscisic acid; ADC – arginine decarboxylase; BA – N-6-benzyladenine; Cad – cadaverine; CHA – cyclohexylamine; 2,4-D – 2,4-dichlorophenoxyacetic acid; DCHA – dicyclo- hexylamine; IAA – indole-3-acetic acid; DFMA – α-difluoromethylarginine; DFMO – α-diflurometh - ylornithine; NAA – naphthalene-1-acetic acid; ODC – ornithine decarboxylase; PA – polyamines; Put – putrescine; SAM – S-adenozylmethionine; SE – somatic embryogenesis; Spd – spermidine; SPDS – spermidine synthase; Spm – spermine; SPMS – spermine synthase
WSTĘP
Somatyczna embriogeneza (SE) jest to kilkuetapowy proces morfogenetyczny prowadzący do wytworzenia z komórek roślinnych innych niż zygota, dwubieguno- wych struktur, zwanych zarodkami somatycznymi [93]. Ze względu na niezwykle wysoki współczynnik rozmnażania klonalnego, SE jest często uznawana za szybką i wydajną alternatywę dla tradycyjnych metod produkcji roślinnej, która może zna- leźć szerokie zastosowanie w nasiennictwie. Opłacalność masowej produkcji wy- maga, aby cały proces przebiegał w sposób zsynchronizowany i dostarczał dużej liczby wysokiej jakości zarodków, które mogą być przechowywane bez utraty zdol- ności do kiełkowania i konwersji w prawidłowo wykształcone rośliny [37]. Badania dotyczące czynników i mechanizmów regulujących poszczególne etapy SE, powin- ny doprowadzić do pełnej optymalizacji warunków ich przebiegu. Stwierdzono, że decydujące znaczenie podczas SE mają regulatory wzrostu, do których zaliczane są również wielokationowe aminy biogenne, poliaminy (PA), wśród których, naj- bardziej rozpowszechnionymi w komórkach roślinnych są: dwuamina putrescyna (Put), triamina spermidyna (Spd) oraz tetraamina spermina (Spm).
Już w 1978 roku Montague i wsp. [55] zaobserwowali pozytywną korelację pomiędzy indukcją SE a zwiększeniem zawartości PA w kulturach komórkowych Daucus carota. Zahamowanie biosyntezy PA w tych kulturach całkowicie zabloko- wało tworzenie somatycznych zarodków. Istotna rola PA w SE może być związana z ich wpływem na wiele podstawowych funkcji komórkowych, takich jak synteza kwasów nukleinowych i białek, cykl komórkowy oraz różnicowanie [3, 38]. Jednak mechanizmy działania tych związków w regulacji procesów morfogenetycznych roślin nie są jeszcze w pełni wyjaśnione.
Celem niniejszego opracowania jest przedstawienie informacji na temat udziału poliamin w poszczególnych etapach somatycznej embriogenezy.
CHARAKTERYSTYKA SOMATYCZNEJ EMBRIOGENEZY W trakcie SE, powstają zarodki somatyczne, czyli dwubiegunowe struktury o mor- fologii zbliżonej lub identycznej z morfologią zarodka zygotycznego (ryc. 1). Proces SE można rozdzielić na dwie fazy, które zasadniczo są od siebie niezależne i podlega-
ją regulacji przez zespoły odmiennych czynników [30, 37]. W fazie pierwszej, okre- ślanej zwykle mianem indukcji, niektóre komórki eksplantatu nabywają kompetencji do embriogenezy [43, 61]. Początkowo, zróżnicowane komórki eksplantatu podlegają odróżnicowaniu (dedyferencjacja) stając się ponownie komórkami o właściwościach merystematycznych. Dalej następuje ich redyferencjacja i przekształcenie w komór- ki embriogeniczne zdolne do realizacji programu rozwoju zarodkowego. Zdarza się również, że komórki wykazują naturalną kompetencję embriogeniczną.
Ujawnienie kompetencji embriogenicznej komórek, czyli wyzwolenie embrio- genicznego potencjału eksplantatu i formowanie somatycznych zarodków, obser- wujemy w fazie ekspresji SE, zwanej zwykle fazą różnicowania. W fazie tej, za- rodki somatyczne rozwijają się z komórek eksplantatu wykazujących kompetencję embriogeniczną naturalną, bądź nabytą pod wpływem zastosowanych czynników indukujących [30, 37, 43]. Realizacja programu rozwoju zarodkowego przez ko-
RYCINA 1. Schemat przebiegu bezpośredniej (BSE) i pośredniej (PSE) somatycznej embriogenezy w warunkach in vitro [19, 37, 88]
FIGURE 1. Direct (BSE) and indirect (PSE) somatic embryogenesis in in vitro cultures [19, 37, 88]
mórki embriogeniczne nie wymaga już działania żadnego sygnału zewnętrznego;
w praktyce embriogenicznie zaindukowane tkanki przenoszone są więc na pożywkę pozbawioną regulatorów wzrostu [61, 89].
Somatyczne zarodki mogą powstawać bezpośrednio z komórek eksplantatu pierwotnego, czyli na drodze bezpośredniej SE lub pośrednio z embriogenicznego kalusa, który jest tkanką heterogenną, złożoną z agregatów proembriogenicznych oraz komórek merystematycznych niezdolnych do rozwoju zarodkowego [88].
Podczas pośredniej SE, faza indukcji obejmuje więc nie tylko przeprogramowanie komórek somatycznych w embriogeniczne, ale też zainicjowanie nieuorganizowa- nego wzrostu tkanki kalusowej (ryc. 1). W celu zwiększenia wydajności SE można wprowadzić dodatkowy etap poprzedzający fazę różnicowania, w którym następu- je namnażanie embriogenicznego kalusa na stałym podłożu bądź wyprowadzonej z niego zawiesiny w płynnej pożywce [89].
ENDOGENNE POLIAMINY JAKO MARKER EMBRIOGENICZNOŚCI
Potencjał embriogeniczny danej kultury, zdeterminowany genetycznie, warunku- je wydajność procesu SE, której ostateczną miarą może być liczba uformowanych somatycznych zarodków [19, 30]. Teoretycznie, ze względu na totipotencję komórek roślinnych, w każdej z nich, w określonych warunkach, można zainicjować program rozwoju zarodkowego, chociaż w praktyce tylko niektóre komórki ekplantatu wyka- zują embriogeniczność. Odnotowuje się ogromne zróżnicowanie odpowiedzi embrio- genicznej eksplantatów, dlatego poszukiwane są wiarygodne markery, które umożli- wiłyby wyselekcjonowanie tkanek o dużym potencjale.
Zaangażowanie PA w nabywanie przez eksplantaty kompetencji do embriogene- zy stwierdzono na przykład u Solanum melongena [96], Medicago sativa [29], Panax ginseng [56] czy Dactylis glomerata [45]. Kalus embriogeniczny charakteryzuje się zwykle wyższą zawartością endogennych PA niż kalus nieembriogeniczny [41, 47, 63, 87]. Fraga i wsp. [21] wykazali, że eksplantaty Pinus radiata o wysokim potencja- le embriogenicznym charakteryzują się dużą zawartością wolnych PA i jednocześnie niskim stopniem metylacji DNA. Zależność ta wynika prawdopodobnie z faktu, że S-adenozylometionina (SAM) jest nie tylko prekursorem biosyntezy PA, ale również dostarcza grupy metylowe do metylacji DNA.
Zatem nabywanie kompetencji może być skorelowane z podwyższoną całko- witą zawartością PA [21, 76, 95], chociaż w kulturach Papaver somniferum i Pinus nigra zaobserwowano zależność odwrotną [58, 66]. Podobnie u Lasiurus scindicus, Sorghum halepense, Urochloa panicoides kultury nie-embriogenne charakteryzowały się wyższą zawartością wolnych PA, szczególnie Put, niż kultury embriogenne [33].
Analiza zawartości poszczególnych PA wskazuje, że bardziej adekwatnym wskaźnikiem obrazującym poziom kompetencji jest stosunek stężenia Put/Spd lub Put/Spd+Spm. Kalus embriogeniczny Coffea canephora zawierał kilkakrotnie wię- cej Spd i Spm niż kalus nieembriogeniczny, podczas gdy zawartość Put była w obu tkankach podobna [41]. Akumulacja Spd może być traktowana jako marker embrio- geniczności wielu gatunków roślin okrytozalążkowych m.in. Solanum melongena [95], Oryza sativa [77], Medicago sativa [29] czy Panax ginseng [56], jak również u roślin nagozalążkowych [31, 53, 79].
Zawartość PA w komórkach roślinnych jest w dużej mierze uzależniona od aktywności enzymów szlaku ich biosyntezy. Dekarboksylaza argininy (ADC, EC 4.1.1.19) i dekarboksylaza ornityny (ODC, EC 4.1.1.17) katalizują kluczowe reakcje prowadzące do wytworzenia Put, a w konsekwencji także jej pochodnych, Spd i Spm [3, 38, 40]. Stwierdzono, że wyższa aktywność tych enzymów jest pozytywnie sko- relowana ze zdolnościami embriogenicznymi komórek w kulturach Daucus carota [48]. Natomiast obniżenie stężenia endogennych wolnych PA poprzez zastosowanie inhibitorów ich biosyntezy uniemożliwia wyzwolenie potencjału embriogeniczne- go. Zastosowanie cykloheksyloaminy (CHA) bądź dicykloheksyloaminy (DCHA), inhibitorów syntazy Spd (SPDS, EC 2.5.1.16) i syntazy Spm (SPMS, EC 2.5.1.22), spowodowało obniżenie zawartości Spd i Spm z równoczesnym podwyższeniem stę- żenia Put. Konsekwencją zmiany relacji Put/Spd było zahamowanie SE [36, 46].
POLIAMINY W INDUKCJI SOMATYCZNEJ EMBRIOGENEZY Przyjmuje się, że kluczowe znaczenie w indukcji SE pełnią auksyny. Są one sto- sowane niezależnie lub w kombinacji z innymi regulatorami wzrostu, najczęściej cytokininami, a także giberelinami [30, 43, 61]. Badania na poziomie molekular- nym potwierdzają, że proces przemodelowania chromatyny oraz zmiany we wzorze metylacji DNA, prowadzące w konsekwencji do zmiany programu ekspresji genów podczas indukcji SE, jest kontrolowany przez regulatory wzrostu [13, 19]. Według nowszej koncepcji, przeprogramowanie genetyczne w kierunku SE stanowi od- powiedź tkanki roślinnej na stres związany z jej umieszczeniem w warunkach in vitro [18, 34, 97]. Zidentyfikowano różne czynniki stresowe zdolne do zainduko- wania embriogeniczności, jak na przykład jony metali ciężkich, wysoki potencjał osmotyczny, zranienie czy podwyższona temperatura. Sugeruje się też, że uzyska- nie kompetencji embriogenicznej pod wpływem syntetycznej auksyny 2,4-D (kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy), najczęściej stosowanej do indukcji SE, może być roz- patrywane jako odpowiedź tkanki eksplantatu na czynnik stresowy. Ponadto, kwas abscysynowy (ABA), inhibitor wzrostu i rozwoju roślin, uznawany powszechnie za
„hormon stresu”, również może indukować SE in vitro [97].
Dotychczas nie odnotowano przypadku skutecznego użycia PA jako samodziel- nego czynnika indukującego proces SE. Natomiast liczne prace wskazują, że za- aplikowanie egzogennych PA w fazie indukcji zdecydowanie zwiększa wydajność SE. Egzogenna Put (0,5 mM), wprowadzona do pożywki indukującej zawierającej NAA, zwiększyła blisko 6-krotnie liczbę otrzymanych somatycznych zarodków Solanum melongena [95]. Również Sakhanokho i wsp. [72] zwiększyli wydajność indukcji SE wywołaną przez 2,4-D u Gossypium hirsutum poprzez aplikację Put.
Spd (0,1 mM) natomiast, podwyższyła skuteczność indukcji wywołanej przez jed- noczesne zastosowanie 2,4-D, NAA i kinetyny w kulturach Panax vietnamensis;
uzyskano więcej zaindukowanych embriogenicznie eksplantatów i blisko 3-krot- nie zwiększono produkcję zarodków [62]. Rajesh i wsp. [69] wykazali dodatni wpływ egzogennej Put (1 mM) i w mniejszym stopniu Spm (0,1 mM) na indukcję SE oraz stymulację wtórnej SE w kulturach Elaeis guinensis, w których wykorzy- stano 2,4-D jako czynnik indukujący. Podobnie, stwierdzono, że powstawanie wtór- nych zarodków somatycznych w kulturach Coffea canefora, zaindukowane przez IAA w kombinacji z BA, jest stymulowane egzogenną Put (50 mM) [41]. Nato- miast u Theobroma cacao, najbardziej efektywna w promowaniu indukcji wtórnej SE przez 2,4-D z udziałem BA, okazała się Spm [78].
Zastosowanie poliamin w fazie indukcji jako czynnika zwiększającego wy- dajność SE wymaga optymalizacji zarówno rodzaju jak i stężenia określonej PA.
Przykładowo, w kulturach Zea mays zarówno Put jak i Spm w podobnym stop- niu promują indukcję SE w obecności gibereliny, jednak w różnym stężeniu – Put w wyższym (150 μM), a Spm w niższym (50 μM) [32]. Zdarza się również, że apli- kacja PA nie przynosi spodziewanego skutku – egzogenne PA okazały się inhibito- rami bezpośredniej SE z eksplantatów liściowych Phalenopsis [27].
Egzogenne PA są łatwo absorbowane i akumulowane przez komórki roślinne – po zaaplikowaniu Put, Spd czy Spm w tkankach zwiększa się zawartość każdej z nich [16, 74, 77, 80, 82, 95]. W pewnych przypadkach pozostaje to bez wpływu na pozostałe PA, chociaż częściej stężenie innych PA też ulega zmianie. Na przykład, w obecności egzogennej Put lub Spd zwiększała się zawartość wszystkich PA w embriogenicznym kalusie Picea glauca [16]. Z kolei egzogenna Put wywołała obniżenie zawartości Spd i Spm w zawiesinie komórkowej Araucaria angustifolia [82] oraz w somatycznych zarodkach Ocotea catharinensis [74], natomiast zarówno egzogenna Spd jak i Spm spowodowały zwiększenie stężenia endogennej Put [74, 80].
Pozytywny wpływ egzogennych PA na indukcję SE nie zawsze związany jest ze zwiększeniem ich zawartości w tkankach eksplantatu lub kalusie. Przykładowo, PA zastosowane w stosunkowo niskich stężeniach (0,1, 0,5 i 1 μM) w fazie indukcji stymulowały wzrost kalusa embriogenicznego i wytwarzanie somatycznych zarod- ków u Momordica dioica, ale zawartość wolnych endogennych PA była zdecydowa- nie niższa [85]. Również stymulacja indukcji SE przez egzogenne PA u Momordica charantia była skorelowana z obniżeniem zawartości endogennych poliamin [67].
Często, podwyższenie stężenia PA w indukowanych embriogenicznie tkankach okazuje się czynnikiem stymulującym SE. Na przykład zaaplikowanie prekursora biosyntezy PA, argininy, w fazie indukcji SE w kulturach Saccharum sp. umożliwiło wytworzenie większej liczby somatycznych zarodków, przy czym wykryto znacznie wyższe stężenia endogennych PA w różnicującej się tkance embriogennej [65]. Nato- miast w kulturach Coffea canefora, w których indukcja SE następuje pod wpływem cytokinin i jest dodatkowo stymulowana światłem, stwierdzono, że w kulturach inku- bowanych na świetle, zawartość endogennych PA, zarówno form wolnych jak i zwią- zanych, jest znacznie wyższa niż wówczas, gdy hodowle prowadzono w ciemności [10]. Zastosowanie glicerolu w celu zaindukowania SE u Citrus sinensis również modyfikuje zawartość endogennych PA, co jest skorelowane z poziomem ekspresji genów kodujących kluczowe enzymy szlaku ich biosyntezy [94].
NAMNAŻANIE TKANKI EMBRIOGENICZNEJ
Proces SE jest uznawany za jedną z potencjalnie wydajniejszych metod maso- wego namnażania roślin o wyselekcjonowanym genotypie i stanowi punkt wyjścia dla biotechnologicznych metod ulepszania materiału roślinnego. Dla niektórych ga- tunków roślin, m.in. drzew iglastych, prace nad zwiększaniem skali produkcji soma- tycznych zarodków i jej komercjalizacją są już bardzo zaawansowane [39]. Zatem, niezwykle istotne staje się opracowanie optymalnych warunków namnażania tkanki embriogenicznej, uzyskanej w fazie indukcji. W tym celu można namnażać kalus em- briogeniczny na stałych podłożach, bądź wyprowadzić z niego przejściową lub usta- bilizowaną zawiesinę embriogeniczną.
Od dość dawna wiadomo, że poliaminy współuczestniczą w regulacji aktyw- ności mitotycznej komórek, zatem mogą również odgrywać istotną rolę w namna- żaniu tkanek embriogenicznych [3, 38, 44]. Wzrost poziomu endogennych PA towarzyszy indukcji podziałów komórkowych [5]. Zastosowanie egzogennych PA powoduje stymulację wzrostu tkanki embriogenicznej Araucaria angustifolia namnażanej zarówno na podłożu płynnym jak i stałym [80, 82]. Egzogenna Put stymulowała wzrost embriogenicznego kalusa Coffea canefora, Momordica cha- rantia i Momordica dioica [41, 67, 85].
Kultury zawiesin stanowią alternatywną drogę pozwalającą na szybszy przyrost świeżej masy kultur embriogenicznych w porównaniu z kulturami kalusa prowadzo- nymi na pożywkach stałych [80]. Dodatkowo umożliwiają poprawienie synchroniza- cji rozwoju mas proembriogenicznych. Tempo wzrostu zawiesiny embriogenicznej ilustruje krzywa sinusoidalna, w której wyróżnia się fazy: spoczynkową, wzrostu wy- kładniczego, wzrostu liniowego i fazę stacjonarną [2]. Podczas proliferacji agregatów proembriogenicznych w zawiesinie następuje zmiana zawartości PA. Przykładowo u Araucaria angustifolia, następuje podwyższenie stężenia endogennej Put w fazach
wykładniczej i wzrostu liniowego, podczas gdy zawartość Spd i Spm ulega stopnio- wemu obniżeniu [80]. Również w zawiesinie embriogennej Pinus sylvestris, przejście z fazy spoczynkowej do fazy wzrostu wykładniczego jest skorelowane ze zwiększe- niem zawartości Put i obniżeniem stężenia zarówno wolnej jak i związanych form Spd [91], przy czym akumulacja Put była właśnie wynikiem zahamowania biosyntezy pochodnych PA – Spd i Spm. Pozytywną korelację między fazą intensywnego wzro- stu a stężeniem wolnej Put, wykryto również w kulturach zawiesinowych Catharan- thus roseus i Picea rubens, co może dodatkowo świadczyć o szczególnej roli tej PA we wzroście i podziałach komórkowych [50, 54].
Zaaplikowanie egzogennej Put spowodowało zwiększenie świeżej masy zawie- siny komórkowej Capsicum frutescens [83]. Podobnie u Ocotea catharinensis, eg- zogenna Put stymulowała namnażanie zawiesiny embriogenicznej, natomiast egzo- genna Spd miała działanie hamujące [74]. Negatywny wpływ Spd, a także Spm na namnażanie zawiesiny embriogenicznej stwierdzono również w kulturach Pinus sy- lvestris [64] oraz Araucaria angustifolia [14, 80].
Morfologiczne zmiany w agregatach proembriogenicznych, które ulegają namno- żeniu w kulturach zawiesinowych, są bardzo ważne dla procesu późniejszego formo- wania się zarodków somatycznych u roślin iglastych [14, 59, 60, 80]. Wyróżnia się trzy typy agregatów proembriogenicznych, z których tylko jeden ulega bezpośrednio różnicowaniu i przekształceniu w strukturę zarodka [20]. Zarówno w kulturach Ara- ucaria angustifolia, Cryptomeria japonica jak i Picea glehnii, egzogenna Spd i Spm sprzyjają formowaniu się właśnie tych agregatów, z których rozwijają się zarodki so- matyczne, podczas gdy Put zwiększa procentowy udział pozostałych agregatów [80, 59, 60]. Jest to zgodne z poglądem Galstona i Kaur-Sawhneya [22], że rolą Put jest podtrzymywanie proliferacji komórek, natomiast za indukcję ich różnicowania odpo- wiedzialne są Spd i Spm.
FORMOWANIE SOMATYCZNYCH ZARODKÓW
Celem procesu SE jest uzyskanie zarodków somatycznych, które pod względem morfologicznym i fizjologicznym są identyczne z zarodkami zygotycznymi. Mimo dużego podobieństwa często obserwuje się różnice między zarodkami zygotycznymi a ich somatycznymi odpowiednikami. Na podstawie analizy zawartości PA w zarod- kach zygotycznych stwierdzono, że stosunek ilościowy Put/Spd+Spm może służyć jako marker rozwoju embrionalnego [6, 73, 79]. Zaobserwowano mianowicie, że proporcja Put/Spd+Spm zwiększa się we wczesniejszych stadiach rozwoju (zarodki globularne, sercowate, torpedy), a obniża w dalszych etapach i podczas dojrzewania.
Podczas rozwoju zarodków Pinus radiata stwierdzono podwyższanie się stężenia endogennej Spd oraz niewielkie obniżenie lub brak istotnych zmian w zawartości Put, co prowadzi do zmiany stosunku ilościowego Put/Spd w podobnym stopniu dla obu rodzaju zarodków [53]. Również w trakcie rozwoju zarodków somatycznych Pi-
cea abies, aż do osiągnięcia dojrzałości, obniża się stosunek ilościowy Put do Spd i zwiększa aktywność dekarboksylazy SAM [24]. W dojrzałych zarodkach somatycz- nych zawartość Spd przewyższa blisko dziesięciokrotnie zawartość Put, natomiast w zarodkach zygotycznych ta różnica jest znacznie mniejsza – około dwukrotna. Po- nadto ulegające desykacji zarodki somatyczne Picea abies akumulują Spm w znacz- nie większym stopniu niż zarodki zygotyczne. Także w zarodkach somatycznych Vi- tis vinifera wykryto wyższe stężenia wolnych PA oraz zwiększoną aktywność ADC i ODC niż w zarodkach zygotycznych [17], przy czym stężenie wolnej Put było wyż- sze w stosunku do Spd w późnym stadium torpedy w zarodkach somatycznych, co prawdopodobnie spowodowało zaburzenia ich zdolności regeneracyjnych.
Analiza endogennych PA w różnych stadiach rozwoju zarodków somatycznych wykazała, że kalus i zawiesina embriogeniczna oraz zarodki we wczesnych stadiach rozwojowych (globularne, sercowate) zawierają zwykle znacznie wyższe stężenie PA niż zarodki zróżnicowane (stadium torpedy i liścieniowe) [16, 52, 63, 74, 85].
W przypadku niektórych gatunków takich jak Picea glauca, Momordica charantia, Theobroma cacao, we wczesnych fazach embriogenezy dominuje Put, a w później- szych Spd [16, 63, 85]. U innych gatunków, na przykład Picea abies, Quercus ilex wykazano, że nawet w zarodkach globularnych Spd przeważa nad pozostałymi PA [24, 49, 52]. Najprawdopodobniej wiąże się to ze zróżnicowaną funkcją PA podczas SE, w których Put odpowiada za podziały komórkowe, podczas gdy Spd ma więk- sze znaczenie w różnicowaniu. Santa-Catarina i wsp. [74] stwierdzili, że zaapliko- wanie egzogennej Put stymuluje proliferację zarodków globularnych, podczas gdy w obecności egzogennej Spd lub Spm więcej zarodków osiąga stadium liścieniowe.
Dlatego też, najczęściej do poprawienia etapu różnicowania zarodków somatycznych stosowane są Spd i Spm [12, 14, 16, 17, 35, 53, 80, 81, 84]. Stymulujące działanie Spd i Spm na rozwój somatycznych zarodków może być związane z ich wpływem na uwalnianie w tkankach roślinnych tlenku azotu. Egzogenna Spd i Spm w wyższym stopniu niż Put indukowały produkcję tlenku azotu w rozwijających się zarodkach somatycznych Ocotea catharinensis, co było skorelowane z osiągnieciem stadium li- ścieniowego [74]. Pozytywny wpływ Spm na formowanie zarodków somatycznych może być także związany ze zwiększoną syntezą DNA oraz zahamowaniem pozako- mórkowej sekrecji białek [84].
WPŁYW POLIAMIN NA PRODUKCJĘ ZARODKÓW HAPLOIDALNYCH
Rośliny w warunkach in vitro mogą być również regenerowane na drodze an- drogenezy i gynogenezy, co prowadzi do uzyskania roślin haploidalnych [26, 57].
W przypadku androgenezy wykorzystuje się kultury pylników lub kultury izolowa- nych mikrospor, przy czym indukcja androgenezy wymaga uprzedniego zastoso- wania czynników stresowych, przykładowo stresu termicznego, stresu głodu bądź
czynnika chemicznego. Natomiast podczas gynogenezy haploidalne zarodki powsta- ją z gametofitu żeńskiego w kulturach zalążków lub zalążni. Zarówno w trakcie an- drogenezy jak i gynogenezy może pojawić się tkanka kalusowa.
Już w roku 1985, Villanueva i wsp. [90] wykryli, że podczas androgenezy w kul- turach Nicotiana tabacum i Datura inoxia, zwiększa się zawartość Put i Spd. Wyko- rzystanie inhibitorów biosyntezy PA, DFMO i DFMA potwierdziło niezbędność PA podczas formowania androgenicznych zarodków, ale nie do indukcji embriogenezy w kulturach pylników [23]. Jednojądrowe mikrospory kukurydzy poddane działaniu niskiej temperatury w celu zaindukowania embriogenezy, zawierają niższe stężenia PA w porównaniu do mikrospor in vivo [75]. Zatem indukcja androgenezy związa- na jest z modyfikacją metabolizmu PA. Stwierdzono również, że w mikrosporach aktywnych mitotycznie (tworzenie kalusa in vitro) dominuje wolna Spd. Ponadto formowanie się androgennych zarodków jest pozytywnie skorelowane z podwyższe- niem zawartości Spd i Spm.
Egzogenne PA stymulują produkcję zarodków mikrosporowych u różnych ga- tunków roślin, na przykład Solanum tuberosum [86], Cucumis sativus [1], Citrus cle- mentina [9], Guizotia abyssinica [28] oraz niektórych gatunków zbóż [7, 11, 70, 71].
Zwiększenie wydajności procesu androgenezy w kulturach pylników, osiąga się najczęściej poprzez zaaplikowanie Put lub Spd w fazie indukcji. Zależnie od gatun- ku, a nawet odmiany, podwyższenie częstości wytworzenia androgenicznych kalu- sów oraz liczby wykształconych haploidalnych zarodków, wynika z zastosowania Put [11, 28] albo Spd [1, 9]. Egzogenne PA poprawiają zdolność zarodków androge- nicznych do konwersji w normalne, zazielenione rośliny, zatem ich użycie pozwa- la na rozwiązanie częstego problemu albinizmu regenerantów [1, 7, 28]. Ponadto, Dewi i Purwoko [11] wykazali, że egzogenna Put (1 mM) stymuluje androgenezę ryżu indyjskiego nie tylko poprzez pobudzenie formowania się kalusa i zarodków, ale także przez zahamowanie przedwczesnego starzenia się kultur i związanej z tym nadmiernej produkcji etylenu.
Poprawienie efektywności indukcji androgenezy oraz zdolności regeneracyj- nych wytworzonych zarodków można uzyskać także poprzez wstępne traktowanie pylników roztworem odpowiedniej PA [71]. Jednak ostateczny skutek takiego za- biegu zależy z jednej strony od czasu jego trwania, a z drugiej od genotypu rośliny.
Proces gynogenezy jest wykorzystywany do uzyskiwania haploidów już od 1976 roku, a systemy regeneracyjne obejmują wiele gatunków roślin głównie uprawnych, jak na przykład cebula, słodki ziemniak, ogórek, burak cukrowy, ku- kurydza, pszenica czy tulipan [8]. Jednak jak na razie możliwości wykorzystania PA do optymalizacji procesu indukcji gynogenezy w kulturach in vitro oraz popra- wienia zdolności regeneracyjnych uzyskanych tą drogą haploidalnych zarodków sprawdzono jedynie w kulturach Allium cepa [15, 25, 51 68]. Okazuje się, że pozy- tywny wpływ wywiera Spd, a nie Put. Obniżenie stężenia endogennej Spd w wy- niku zastosowania CHA, inhibitora syntazy Spd, doprowadziło do zahamowania
procesu gynogenezy, prawdopodobnie na skutek nagromadzenia endogennej Put oraz stymulacji produkcji etylenu [25].
Wydaje się, że Spd odgrywa szczególnie istotną rolę w przebiegu procesu gyno- genezy. Świadczą o tym, nie tylko wyniki badań nad wpływem egzogennej Spd lub inhibitora jej biosyntezy, ale również przeprowadzona przez Wei i wsp. [92] analiza zawartości endogennej Spd w kulturze niezapłodnionych zalążni Cucumis sativus.
Genotypy o wyższych zdolnościach do gynogenezy charakteryzowały się większą pulą endogennych PA, a zwłaszcza większą zawartością wolnych i skoniugowanych Spd i Spm oraz niższym stosunkiem Put/PA w porównaniu z genotypami o mniej- szym potencjale. Niezapłodnione zalążnie, przed wyłożeniem na pożywkę indukują- cą gynogenezę zawierały najwięcej Spd. Zawartość Spd i Spm obniżała się gwałtow- nie w pierwszych dniach od zainicjowania kultury, zwiększało się natomiast stężenie Put i Cad. W końcowym etapie gynogenezy Put dominowała nad pozostałymi PA.
PODSUMOWANIE
Poliaminy są zaangażowane w regulację licznych procesów fizjologicznych oraz morfogenetycznych przebiegajacych w roślinie zarówno w warunkach in vivo jak i in vitro. Liczne badania wykazują, że poliaminy pełnią istotną rolę w procesie embriogenezy somatycznej. Obniżenie zawartości endogennych PA poprzez zasto- sowanie inhibitorów ich biosyntezy prowadzi najczęściej do zahamowania SE we wszystkich jej fazach: indukcji embriogeniczności, formowania embriogenicznego kalusa, namnażania embriogenicznej zawiesiny, formowania somatycznych zarod- ków i ich dojrzewania. Większość danych sugeruje, iż Put odgrywa istotną rolę pod- czas indukcji i namnażania, natomiast Spd i Spm mają znaczenie głównie w różni- cowaniu i dojrzewaniu zarodków.
Wyniki badań nad udziałem PA w poszczególnych etapach SE dostarczają cennych wskazówek do optymalizacji procesu produkcji somatycznych zarodków w różnych systemach regeneracyjnych. Podniesienie wydajności procesu SE w wa- runkach in vitro możliwe jest poprzez umiejętne wykorzystanie egzogennych PA w odpowiednio dobranych stężeniach. Alternatywą stosowania egzogennych PA lub prekursorów, może być modyfikacja szlaku ich biosyntezy metodami inżynie- rii genetycznej. Na przykład, podwyższenie zawartości endogennej Put, poprzez wprowadzenie genu dekarboksylazy ornityny (ODC) pod kontrolą konstytutyw- nego promotora CaMV35S, wywołało stymulację SE w kulturach marchwi [4]
i zwiększyło zdolności regeneracyjne embriogenicznego kalusa ryżu [42]. Identy- fikacja i izolacja promotorów indukowalnych oraz swoistych tkankowo, a dalej ich wykorzystanie do kontroli ekspresji transgenów w roślinach, stwarza możliwości skutecznej i precyzyjnej manipulacji zawartością poliamin w tkankach roślinnych, w celu optymalizacji poszczególnych etapów SE.
LITERATURA
[1] Ashok kumAr hG, rAvishAnkAr Bv, murthy hn. The influence of polyamines on androgenesis of Cucumis sativus L. Euro J Hort Sci 2004; 69: 201-205.
[2] BAch A, Pawłowska B. Procesy rozwojowe w kulturze in vitro i typy kultury. W: Malepszy S. [red.]
Biotechnologia roślin. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa. 2012; 21-40.
[3] BAron k, stAsollA c. The role of polyamines during in vivo and in vitro development. In Vitro Cell Dev Biol-Plant 2008; 44: 384-395.
[4] BAstolA Dr, minochA sc. Increased putrescine biosynthesis through transfer of mouse ornithine de- carboxylase cDNA in carrot promotes somatic embryogenesis. Plant Physiol 1995; 109: 63-71.
[5] BezolD tn, loy JB, minochA sc. Changes in the cellular content of polyamines in different tissues of seed and fruit of normal and a hull-less seed variety of pumpkin during development. Plant Sci 2003;
164: 743-752.
[6] cAnGAhuAlA-inocente Gc, silveirA v, cAPrestAno cA, Ducroquet JPhJ, Floh eis, GuerrA mP.
Dynamics of biochemical and morphophysiological changes during zygotic embryogenesis in Acca sellowiana (Berg.) Burr. Plant Growth Regul 2009; 59: 103-115.
[7] chA-um s, sriAnAn B, PichAkum A, kirDmAnee c. An efficient procedure for embryogenic callus in- duction and double haploid plant regeneration through anther culture of Thai aromatic rice (Oryza sativa L. subsp. indica). In Vitro Cell Dev Biol-Plant 2009; 45: 171-179.
[8] chen JF, cui l, mAlik AA, mBirA kG. In vitro haploid and dihaploid production via unfertilized ovule culture. Plant Cell Tiss Organ Cult 2011; 104: 311-319.
[9] chiAncone B, tAssoni A, BAGni n, GermAniá mA. Effect of polyamines on in vitro anther culture of Citrus clementina Hort. ex Tan. Plant Cell Tiss Organ Cult 2006; 87: 145-153.
[10] De-lA-PeñA c, GAlAz-ávAlos rm, loyolA-vArGAs vm. Possible role of light and polyamines in the onset of somatic embryogenesis of Coffea canephora. Mol Biotechnol 2008; 39: 215-224.
[11] Dewi is, Purwoko Bs. Role of polyamines in inhibition of ethylene biosynthesis and their effects on rice anther culture development. Indonesian J Agricult Sci 2008; 9: 60-67.
[12] Dos sAntos Alw, silveirA v, steiner n, mArAschin m GuerrA mP. Biochemical and morphol ogical changes during the growth kinetics of Araucaria angustifolia suspension cultures. Braz Arch Biol Technol 2010; 53: 497-504.
[13] DuDits D, GyörGyey J, BöGre l & BAkó l. Molecular biology of somatic embryogenesis. W: Thorpe TA [red.] In vitro embryogenesis in plants. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht. 1995; 267-308.
[14] DutrA nt, silveirA v, De AzeveDo iG, Gomes-neto lr, FAçAnhA Ar, steiner n, GuerrA mP, Floh
ies, sAntA-cAtArinA c. Polyamines affect the cellular growth and structure of pro-embryogenic masses in Araucaria angustifolia embryogenic cultures through the modulation of proton pump activities and endogenous levels of polyamines. Physiol Plant 2012; 148: 121-132.
[15] eBrAhimi r, zAmAni z. Effect of polyamines on in vitro gynogenesis of onion (Allium cepa L.). Am Eurasian J Sustain Agricult 2009; 3: 71-74.
[16] el meskAoui A, tremBAly Fm. Effects of exogenous polyamines and inhibitors of polyamine biosyn- thesis on endogenous free polyamine contents and the maturation of white spruce somatic embryos.
African J Biotechnol 2009; 8: 6807-6816.
[17] FAure o, menGoli m, nouGAreDe A, BAGni n. Polyamine pattern and biosynthesis in zygotic and so- matic embryo stages of Vitis vinifera. J Plant Physiol 1991; 138: 545-549.
[18] Fehér A. The initiation phase of somatic embryogenesis: what we know and what we don`t. Acta Biol Szeged 2008; 52: 53-56.
[19] Fehér A, PAsternAk tP, DuDits D. Transition of somatic plant cells to an embryogenic state. Plant Cell Tiss Organ Cult 2003; 74: 201-228.
[20] FilonovA lh, Bozhkov Pv, von ArnolD s. Developmental pathway of somatic embryogenesis in Picea abies as revealed by time-lapse tracking. J Exp Bot 2000; 51: 249-264.
[21] FrAGA mF, cAnAl mJ, roDriGuez r. In vitro morphogenic potential of differently aged Pinus radiata trees correlates with polyamines and DNA methylation levels. Plant Cell Tiss Organ Cult 2002; 70:
139-145.
[22] GAlston Aw, kAur-sAwhney r. Polyamines as endogenous growth regulators. W: Davies PJ [red.]
Plant hormones: physiology, biochemistry and molecular biology. Kluver Academic Publishers, Dor- drecht. 1990; 158-178.
[23] GArriDo e, chiBi F, mAtillA A. Polyamines in the induction of Nicotiana tabacum pollen embryoge- nesis by starvation. J Plant Physiol 1995; 145: 731-735.
[24] GemPerlová l, novákovA m, vaňková r, eDer J, cvikrová m. Diurnal changes in polyamine content, arginine and ornithine decarboxylase, and diamine oxidase in tobacco leaves. J Exp Bot 2009; 57:
1413-1421.
[25] GeoFFriAu e, kAhAne r, mArtin-tAnGuy J. Polyamines are involved in the gynogenesis process in onion. Physiol Plant 2006; 127: 119-129.
[26] GermAná mA. Anther culture for haploid and doubled haploid production. Plant Cell Tiss Organ Cult 2011; 104: 283-300.
[27] Gow wP, chen Jt, chAnG wc. Influence of growth regulators on direct embryo formation from leaf explants of Phalaenopsis orchids. Acta Physiol Plant 2008; 30: 507-512.
[28] hemA BP, murthy hn. Improvement of in vitro androgenesis in niger using amino acids and polyam- ines. Biol Plant 2008; 52: 121-125.
[29] huAnG Xl, li XJ, li y, huAnG lz. The effect of AOA on ethylene and polyamine metabolism during early phases of somatic embryogenesis in Medicago sativa. Physiol Plant 2001; 113: 424-429.
[30] Jiménez vm. Involvement of plant hormones and plant growth regulators on in vitro somatic embryo- genesis. Plant Growth Regul 2005; 47: 91-110.
[31] Jo l, Dos sAntos Alw, schlöGl Ps, GuerrA mP, rossi mm, Floh eis. Establishiment of molecular markers for early selection of embryogenic cultures with high embryogenic potential in brazilian pine (Araucaria angustifolia (BERT) O. KTZE). BMC Proceedings 2011; 5(Suppl 7): P138. http://www.
biomedcentral.com/1753-6561/5/S7/P138
[32] Joshi r, shuklA A, kumAr P. Interactive effect of GA3 and polyamines on in vitro somatic embryogen- esis from immature embryos in maize (Zea mays L.). Maydica 2010; 55: 111-119.
[33] kAckAr A, shekhAwAt ns. Plant regeneration through somatic embryogenesis and polyamine levels in cultures of grasses of Thar Desert. J Cell Mol Biol 2007; 6: 121-127.
[34] kArAmi o, sAiDi A. The molecular basis for stress-induced acquisition of somatic embryogenesis. Mol Biol Rep 2010; 37: 2493-2507.
[35] kevers c, GAsPAr t, Dommes J. The beneficial role of different auxins and polyamines at successive stages of somatic embryo formation and development of Panax ginseng in vitro. Plant Cell Tiss Organ Cult 2002; 70: 181-188.
[36] kevers c, le GAl n, monteiro m, Dommes J, GAsPAr t. Somatic embryogenesis of Panax ginseng in liquid cultures: a role for polyamines and their metabolic pathways. Plant Growth Regul 2000; 31:
209-214.
[37] kępczyńska e. Kiełkowanie i konwersja somatycznych zarodków in vitro. Biotechnol 2006; 4: 78-94.
[38] kępczyński J, ruduś i, Bryśkiewicz m. Znaczenie poliamin w organogenezie in vitro. Post Biol Kom 2013; 40: 189-200.
[39] klimAszewskA k, noceDA c, Pelletier G, lABel P, roDriGuez r, lelu-wAlter mA. Biological char- acterization of young and aged embryogenic cultures of Pinus pinaster (Ait.). In Vitro Cell Dev Bil- ol-Plant 2009; 45: 20-33.
[40] krAsuskA u, BuDnickA k, BoGAtek r, GniAzDowskA A. Poliaminy w regulacji spoczynku i kiełkowa- nia nasion. Post Biol Kom 2012; 39: 395-414.
[41] kumAr Jv, rAnJithA kumAri BD, cAstAño e. Cyclic somatic embryogenesis and efficient plant regen- eration from callus of safflower. Biol Plant 2008; 52: 429-436.
[42] kumriA r, rAJAm mv. Alteration in polyamine titres during Agrobacterium-mediated transformation of indica rice with ornithine decarboxylase gene affects plant regeneration potential. Plant Sci 2002;
162: 769-777.
[43] kurczyńska eu, PotockA i, DoBrowolskA i, kulinskA-łukAszek k, sAlA k, wróBel J. Cellular markers for somatic embryogenesis. W: Sato K-I [red.] Embryogenesis. InTech 2012;
[44] http://www.intechopen.com/books/embryogenesis/cellularmarkers-for-somatic-embryogenesis.
[45] kusAno t, BerBerich t, tAteDA c, tAkAhAshi y. Polyamines: essential factors for growth and survival.
Planta 2008; 228: 367-381.
[46] li z, Burritt DJ. Changes in endogenous polyamines during the formation of somatic embryos from isogenic lines of Dactylis glomerata L. with different regenerative capacities. Plant Growth Regul 2003; 40: 65-74.
[47] litz re, yurGAlevitch c. Effect of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, aminoethoxyvinylglyci- ne, methylglyoxal bis-(guanylhydrazone) and dicyclohexylammonium sulfate on induction of embry- ogenic competence of mango nucellar explants. Plant Cell Tiss Organ Cult 1997; 51: 171-176.
[48] liu hy, XiAo lt, lu XD, hu JJ, wu s, he cz, DenG XX. Changes in polyamine l evel s in Citrus si- nensis Osb. cv. Valencia callus during somatic embryogenesis. Zhi Wu Sheng Li Yu Fen Zi Sheng Wu Xue Xue Bao 2005; 31: 275-80.
[49] loukAninA n, thorPe tA. Arginine and ornithine decarboxylases in embryogenic and non-embryoge- nic carrot cell suspensions. In Vitro Cell Dev Biol-Plant 2008; 44: 59-64.
[50] mAlá J, cvikrová m, máchová P, mArtincová o. Polyamines during somatic embryo development in Norway spruce (Picea abies [L.]). J Forest Sci 2009; 55: 75-80.
[51] mAki h, AnDo s, koDAmA h, komAmine A. Polyamines and the cell cycle of Catharanthus roseus cells in culture. Plant Physiol 1991; 96: 1008-1013.
[52] mArtinez el, AGuero cB, loPez me, GAlmArini cr. Improvement of in vitro gynogenesis induction in onion (Allium cepa L.) using polyamines. Plant Sci 2000; 156: 221-226.
[53] mAuri Pv, mAnzAnerA JA. Somatic embryogenesis of holm oak (Quercus ilex L.): ethylene production and polyamine content. Acta Physiol Plant 2011; 33: 717-723.
[54] minochA r, smith Dr, reeves cr, steele k, minochA s. Polyamines levels during the development of zygotic and somatic embryos of Pinus radiata. Physiol Plant 1999; 105: 155-164.
[55] minochA r, minochA sc, lonG s. Polyamines and their biosynthetic enzymes during somatic embryo development in red spruce (Picea rubens Sarg.). In Vitro Cell Dev Biol-Plant 2004; 40: 572-580.
[56] montAGue mJ, koPPenBrink Jw, JAworski eG. Polyamine metabolism in embryogenic cells of Daucus carota. I. Changes in intracellular content and rates of synthesis. Plant Physiol 1978; 62: 430-433.
[57] monteiro m, kevers c, Dommes J, GAsPAr t. A specific role for spermidine in the initation phase of somatic embryogenesis in Panax ginseng CA Meyer. Plant Cell Tiss Organ Cult 2002; 68: 225-232.
[58] murovec J, BohAnec B. Haploids and doubled haploids in plant breeding. W: Sato K-I [red.] Embryogenesis. InTech 2012; http://www.intechopen.com/books/embryogenesis/
cellularmarkers-for-somatic-embryogenesis.
[59] nABhA s, lAmBlin F, Gillet F, lAurAin D, FliniAuX m, DAviD A, JAcquin A. Polyamine content and somatic embryogenesis in Papaver somniferum cells transformed with sam-1 gene. J Plant Physiol 1999; 154: 729-734.
[60] nAkAGAwA r, oGitA s, kuBo t, FunADA r. Effect of polyamines and L-ornithine on the development of proembryogenic masses of Cryptomeria japonica. Plant Cell Tiss Organ Cult 2006; 85: 229-234.
[61] nAkAGAwA r, kurushimA m, mAtsui m, nAkAmurA r, kuBo t, FunADA r. Polyamines promote the development of embryonal-suspensor masses and the formation of somatic embryos in Picea glehnii.
In Vitro Cell Dev Biol-Plant 2011; 47: 480-487.
[62] nAmAsivAyAm P. Acquisition of embryogenic competence during somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss Organ Cult 2007; 90: 1-8.
[63] nhut Dt, vinh Bvt, hien tt, huy nP, nAm nB, chien hX. Effects of spermidine, proline and car- bohydrate sources on somatic embryogenesis from main root transverse thin cell layers of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et. Grushv.). African J Biotechnol 2012; 11: 1084-1091.
[64] niemenAk n, AwAh tm, lieBerei r. Establishment of suspension culture in Theobroma cacao and poly- amines associated with cacao embryogenesis. Plant Growth Regul 2012; 67:1-8.
[65] niemi k, sArJAlA t, chen X, häGGmAn h. Spermidine and methylglyoxal bis(guanylhydrazone) affect maturation and endogenous polyamine content of Scots pine embryogenic cultures. J Plant Physiol 2002; 159: 1155-1158.
[66] nieves n, sAGArrA F, González r, lezcAno y, ciD m, BlAnco mA, cAstillo r. Effect of exogenous arginine on sugarcane (Saccharum sp.) somatic embryogenesis, free polyamines and the contents of the soluble proteins and proline. Plant Cell Tiss Organ Cult 2008; 95: 313-320.
[67] noceDA c, sAlAJ t, Pérez m, vieJo m, cAñAl mJ, sAlAJ J, roDriGuez r. DNA demethylation and decrease on free polyamines is associated with the embryogenic capacity of Pinus nigra Arn. cell culture. Trees 2009; 23: 1285-1293.
[68] PAul A, mitter k, rAychAuDhuri ss. Effect of polyamines on in vitro somatic embryogenesis in Momordica charantia L. Plant Cell Tiss Organ Cult 2009; 97: 303-311.
[69] Ponce m, mArtínez l, GAlmArini c. Influence of CCC, putrescine and gellan gum concentration on gynogenic embryo induction in Allium cepa. Biol Plant 2006; 50: 425-428.
[70] rAJesh mk, rADhA e, kArun A, PArtAsArAthy vA. Plant regeneration from embryo-derived callus of oil palm – the effect of exogenous polyamines. Plant Cell Tiss Organ Cult 2003; 75:41-47.
[71] rAJyAlAkshmi k, chowDhry cn, mAheshwAri n, mAheshwAri sc. Anther culture response in some Indian wheat cultivars and the role of polyamines in induction of haploids. Phytomorphol 1995; 45:
139-145.
[72] reDhA A, sulemAn P. Effects of exogenous application of polyamines on wheat anther cultures. Plant Cell Tiss Organ Cult 2011; 105: 345-353.
[73] sAkhAnokho hF, oziAs-Akins P, mAy ol, chee Pw. Putrescine enhances somatic embryogenesis and plant regeneration in upland cotton. Plant Cell Tiss Organ Cult 2005; 81: 91-95.
[74] sAntA-cAtArinA c, silveirA v, BAlBuenA ts, viAnA Am, estelitA mem, hAnDro w, Floh eis. IAA, ABA, polyamines and free amino acids associated with zygotic embryo development of Ocotea ca- tharinensis. Plant Growth Regul 2006; 49: 237-247.
[75] sAntA-cAtArinA c, silveirA v, scherer GFe, Floh eis. Polyamine and nitric oxide levels relate with morphogenetic evolution in somatic embryogenesis of Ocotea catharinensis. Plant Cell Tiss Organ Cult 2007; 90: 93-101.
[76] sAntos m, BoGet n, torne Jm. Endogenous polyamine cont ent dur ing in vivo maturation and in vitro culture of maize pollen. Plant Growth Regul 1995; 16: 19-26.
[77] shArmA P, rAJAm mv. Spatial and temporal changes in endogenous polyamine levels associated with somatic embryogenesis from different hypocotyl segments of eggplant (Solanum melongena L.). J Plant Physiol 1995; 146: 658-664.
[78] shoeB F, yADAv Js, BAJAJ s, rAJAm mv. Polyamines as biomarkers for plant regeneration capacity: im- provement of regeneration by modulation of polyamine metabolism in different genotypes of indica rice. Plant Sci 2001; 160: 1229-1235.
[79] silvA ter, ciDADe lc, Alvim Fc, cAscArDo Jcm, costA mGc. Studies on genetic transformation of Theobroma cacao L.: evaluation of different polyamines and antibiotics on somatic embryogenesis and the efficiency of uidA gene transfer by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Tiss Organ Cult 2009; 99: 287-298.
[80] silveirA v, Floh eis., hAnDro w, GuerrA mP. Effect plant growth regulators on the cellular growth and levels of intracellular protein, starch and polyamines in embryogenic suspension cultures of Pinus taeda. Plant Cell Tiss Organ Cult 2004; 76: 53-60.
[81] silveirA v, sAntA-cAtArinA c, tun nn, scherer GFe, hAnDro w, GuerrA mP, Floh eis. Polyamine effects on the endogenous polyamine contents, nitric oxide release, growth and differentiation of em- bryogenic suspension cultures of Araucaria angustifolia (Bert.) O. Ktze. Plant Sci 2006; 171: 91-98.
[82] steiner n, sAntA-cAtArinA c, AnDrADe JBr, BAlBuenA ts, GuerrA mP, hAnDro w, Floh eis, sil-
veirA v. Araucaria angustifolia biotechnology – review. Func Plant Sci Biotechnol 2008; 2: 20-28.
[83] steiner n, sAntA-cAtArinA c, silveirA v, Floh eis., GuerrA mP. Polyamine effects on growth and endogenous hormones levels in Araucaria angustifolia embryogenic cultures. Plant Cell Tiss Organ Cult 2007; 89: 55-62.
[84] suDhA G, rAvishAnkAr GA. Putrescine facilitated enhancement of capsaicin production in cell suspen- sion cultures of Capsicum frutescens. J Plant Physiol 2003; 160: 339-346.
[85] tAkeDA t, hAyAkAwA F, oe k, mAtsuokA h. Effects of exogenous polyamines on embryogenic carrot cells. Biochem Engineer J 2002; 12: 21-28.
[86] thiruvenGADAm m, rekhA kt, kim eh, PrAveen n, chunG im. Effect of exogenous polyamines enhances somatic embryogenesis via suspension cultures of spine gourd (Momordica dioica Roxb. ex.
Willd.). Australian J Crop Sci 2013; 7: 446-453.
[87] tiAinen t. The role of ethylene and reducing agents on anther culture response of tetraploid potato (So- lanum tuberosum L.). Plant Cell Rep 1992; 10: 604-607.
[88] venkAtAchAlAm l, BhAGyAlAkshmi n. Spermine-induced morphogenesis and effect of partial immer- sion system on the shoot cultures of banana. Appl Biochem Biotechnol 2008; 151: 502-511.
[89] von ArnolD s. Somat ic embryogenesis. W: Geor ge EF, Hal l MA, De Klerk G-J [red.] Plant Propaga- tion by Tissue Culture. Springer 2008; 335-354.
[90] von ArnolD s, sABAlA i, Bozhkov P, DyAchok J, FilonovA l. Developmental pathways of somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss Org Cult 2002; 69: 233-249.
[91] villAnuevA vr, mAthivet v, sAnGwAn rs. RNA, proteins and polyamines during gametophytic and androgenetic development of pollen in Nicotiana tabacum and Datura innoxia. Plant Growth Regul 1985; 3: 293-307.
[92] vuosku J, suorsA m, ruottinen m, sutelA s, muilu-mäkelä r, Julkunen-tiitto r, sArJAlA t, neuBAuer P, häGGmAn h. Polyamine metabolism during exponential growth transition in Scots pine embryogenic cell culture. Tree Physiol 2012; 32: 1274-87.
[93] wei A, Du s, hAn y, liu n, zhAnG G. A study on the relationship between cucumber gynogenesis and content of ovary hormones and polyamines. IV International Symposium on Cucurbits. ISHS Acta Horticult 2010; 871.
[94] williAms eG, mAheswArAn G. Somatic embryogenesis: factors influencing coordinated behaviour of cells as an embryogenic group. Ann Bot 1986; 57: 443-462.
[95] wu XB, wAnG J, liu Jh, DenG XX. Involvement of polyamine biosynthesis in somatic embryogenesis of Valencia sweet orange (Citrus sinensis) induced by glycerol. J Plant Physiol 2009; 166: 52-62.
[96] yADAv Js, rAJAm mv. Spatial distribution of free and conjugated polyamines in leaves of Solanum me- longena L. associated with differential morphogenetic capacity: efficient somatic embryogenesis with putrescine. J Exp Bot 1997; 48: 1537-1545.
[97] yADAv Js, rAJAm mv. Temporal regulation of somatic embryogenesis by adjusting cellular polyamine content in eggplant. Plant Physiol 1998; 116: 617-625.
[98] Zavattieri MA, Frederico AM, Lima M, Sabino R, Arnholdt-Schmitt B. Induction of somatic embry- ogenesis as an example of stress-related plant reactions. Electronic J Biotech 2010; 13: 1-9. http://
www.ejbiotechnology.info/content/vol13/issue1/full/4/
Redaktor prowadzący – Janusz Maszewski Otrzymano: 29.08.2013
Przyjęto: 15.09.2013 Jan Kępczyński
Katedra Fizjologii i Inżynierii Genetycznej Roślin Uniwersytet Szczeciński
ul. Wąska 13 71-415 Szczecin tel.: 0-91 444 15 44 fax: 0-91 444 15 89 e-mail: jankepcz@wp.pl
