R O C Z N I K I G L E B O Z N A W C Z E T. X X X I I , N R 2, W A R S Z A W A 1981
JERZY SO B IE SZ C Z A Ń SK I, A N N A RODZIEW ICZ, R EG IN A STEM PN IEW IC Z
W ZA JEM N E ODDZIAŁYW ANIE M IĘDZY HERBICYDAM I CARBAM INIANOW YM I A M IK RO FLO RĄ GLEBY
In sty tu t P r z e c h o w a ln ictw a i T ech n o lo g ii Ż y w n o ści A R w e W rocław iu
W aru n k i sp rzy jające rozw ojow i m ikroorganizm ów przysp ieszają zani kanie herbicydów w glebie [2]. Z b a k te rii Pseudomonas striata w yizolo w ano enzym , k tó ry hydrolizow ał CIPC do chloroaniliny i alkoholu izo propylow ego [6, 1 0]. Enzym ten był esterazą lub am idazą (dwie m ożliw e drogi ro zk ład u łańcucha bocznego), jego o ptim um pH w ynosiło 8,5, in- a k ty w o w ał się p rzy pH 4,5 oraz pod w pływ em n iek tó ry ch m ety lo k a rb a - m atów .
C hloroanilina pow stająca podczas ro zkładu CIPC ulega dalszem u roz kładow i. Różne m ogą być drogi ty ch przem ian: bezpośrednia h y d ro k sy - lacja, a potem rozerw anie pierścienia arom atycznego, albo oksydacja g ru p y NH2 lub acylacja, a potem h y d ro k sy lacja, albo k ondensacja i pow
stanie pochodnych azow ych {8]. Na p rzykładzie grzybów Fusarium o x y -
sporum badano p rzem ian y chloro aniliny [1 0] i w yizolow ano przy tej okazji p ro d u k ty ty ch przem ian, jak 4-chloronitrobenzen, 2-am ino-5-chlo- rofenol-2-acetam ido-5-chlorofenol i inne. W przem ian ach m ikrobiologicz nych pierścieniow e pochodne chloro an ilin y podlegają ro zerw an iu p ierś cienia arom atycznego, czem u to w arzyszy dehalogenizacja i po jaw iają się jony C1“ i[8, 1 2].
P rz y stosow aniu nad m iern y ch daw ek h erbicydów anilinow ych chlo ro anilina może w glebie kondensow ać ze swoim i pochodnym i tw orząc kom pleksy, takie jak TCAB (tetrachloroazobenzen), k tó re s tru k tu ra ln ie odpow iadają związkom karcinogennym . M etabolity chloro anilin y m ogą być też w iązane przez glebę, ale nie d ają się ekstrah ow ać rozpuszczalni kam i organicznym i [8].
M ając na uw adze przedstaw ione inform acje postanow iono zbadać roz kład ró żnych daw ek CIPC przez populację d ro bn ou strojó w b y tu ją c y ch w różnych ty p ac h gleb.
M A T E R IA Ł I M ETODY B A D A Ń
-38 .Т. S o bic szczański i in.
-3-ch lo ro fe n y lo k a rb rm inian) w glebie, a szczególnie jej końcow y etap zw iązany z dehalogenizacją chloroaniliny, badano przez oznaczanie ilości uw olnionych jonów C1“ stosując m etodę m erk u ro m e try c z n ą [5].
Do 5 m l badanego ro ztw o ru dodaw ano 0,5 m l ro d an k u rtę c i i 1 m l siarczanu żelazowoam onow ego. Pow stające zabarw ienie odczytyw ano na Specolu p rzy fali 460 nm.
Pozostałość CIPC w glebie badano m etodą chrom atografii cienkow ar stw ow ej na żelu skrobiow ym G-60. H erbicyd ekstrahow ano chloro fo r m em , a p ły tk i rozw ijano w układzie: benzen : eter n aftow y w stosu nk u 6 : 4. N astępnie p ły tk i chlorow ano w m ieszaninie K M n 04 i HCl, w yw o ływ ano roztw orem skrobi i K J w etanolu. P lam y identyfikow ano przez porów nanie ze sta n d a rd am i [14].
B adanym obiektem w dośw iadczeniach w azonow ych i polow ych b yły różne ty p y gleb: gliniasto-piaszczy-:ta, czarna ziem ia w rocław ska, piasz czysta i dla k o n tro li gliniasto-piaszczysta w yjałow iona w autoklaw ie. G leby te trak to w an o CIPC (40% s. a) w daw kach: 25, 50, 500, 1000 ppm . W dośw iadczeniach polow ych stosow ano 12 ppm CIPC.'
Jednogram ow e próbki gleby obiektów zawieszano w płynnej pożywce K earn eya (150 ml) w zbogaconej 100 ppm CIPC (jedyne źródło węgla i energii). P o pulację d ro bno u stro jó w inkubow ano w kolbäch na w y trzą - saczu w 25°C przy 180 obr/m in. W odstępach kilkud nio w ych pobierano z zachow aniem w arun k ów ste ry ln y c h prób k i tej hodow li do analiz.
Z dośw iadczenia wazonowego, w k tó ry m glebę gliniasto-piaszczystą traktow ano 1000 ppm CIPC i inkubow ano przez 65 dni w w aru n k ach lab o rato ry jn y ch okresow o naw ilżając, w yizolow ano jedenaście szczepów bak terii. Do izolacji b a k te rii użyto pożyw ek: dla Pseudomonas [15] syn tetycznej w edług K e a r n e y a [6], K a u f m a n a [9] oraz bulionu [3]. W yodrębnione szczepy b a k te rii przebadano, czy m ogą rozkładać CIPC jako jedyne źródło wTęgla w hodow li w głębnej na pożywce w edług K earneya. Inokulum stanow iła dobowa hodow la b a k te rii hodow ana na pożywc? w edług K earn ey a z glukozą. Pozostałość CIPC i obecność m e tabolitów utw orzonych w czasie jego przem ian y spraw dzono za pomocą testu roślinnego. Rośliną testow ą była gryka, k tó ra rea g u je w zrostem n a w et na .ślady CIPC w podłożu [16].
W Y N IK I I ICH OM ÓW IENIE
U zyskane w yniki badań p o tw ierd zają dane z lite ra tu ry o udziale m i kroorganizm ów w procesie d eg rad acji CIPC w glebie [1, 4, 6, 7, 8]. W y kazano ad ap tację niek tó ry ch gatu n k ów b a k te rii glebow ych do zm ienia nych w prow adzeniem h erb icyd u w arun k ó w środow iska.
Gleba gliniasto-piaszczysta (pil 5,7, w ilgotność 60%) pobrana bezpo
średnio z pola po upraw ie burakó w cukrow ych, (trak to w an a przed 4
H erb icy d y k a r b a m in ia n o w e a m ikroflora gle by 3Ê
Rys. l. R ozkład CIPC w rleb ie g lin ia sto -p ia szczy stej w yra żo n y u w a ln ia n iem jonów chloru
1 — gleba p r e i n k u b o w ana z CIPC, 2— gleba kontrolna
CIPC d ecom p osition in lo a m y -sa n d y soil ex p ressed by the relea se of the chlorine ions
1 — soil preincubated with CIPC, 2 — control soil
R ys. 2. R ozkład CIPC w g le b ie g lin ia sto -p ia szczy stej w y ra żo n y u w a ln ia n iem jo r ó w . chloru. G leba p rein k u b ow an a w w azon ie z daw k ą 1000 ppm CIPC
1 — gleba traktowana CIPC + pożywka z dawkq 100 ppm CIPC, 2 — gleba traktowana CIPC 4
+ pożyw1 a z dawkq 1% glukozy, 3 — gleba bez CIPC i pożywka z dawkq 100 ppm CIPC
( k o n t m l a )
CIPC cccom position. in J.oamy-sandy soil ex p ressed by the relea se of the chlorine ions. S o il p reincubated in pot w ith the dose of 100 ppm of CIPC
1 — soil treated with CIPC nutrient medium with the CIPC dose of 100 ppm, 2 — soil treated
with CIPC + nutrient medium with the CIPC dose of 1% glucose, 3 — soil w ithout CIPC +
40 J. Sob ieszczań sk i i in.
R ys. 3. R ozkład CIPC w g leb ie g lin ia sto -p ia szczy stej w yrażon y u w a ln ia n iem jo nów chloru. G leba p rein k u b ow an a z różn ym i d aw k am i CIPC
CIPC decom p osition in lo a m y -sa n d y so il ex p ressed by the rele a se of chlorine ions. S o il prein cu b ated w ith d ifferen t CIPC doses
25 ppm CIPC w w a ru n k ach la b o ra to ry jn y c h , n a ty c h m ia st ten herb icy d
utylizow ała, podczas gdy w glebie k o n tro ln ej herb icy d był de
g rado w any z opóźnieniem (rys. 1). Po 23 dniach w obu glebach nie stw ierdzano obecności nie rozłożonego herbicydu. Szybkość zanikania tego zw iązku z gleby (rys. 2 i 3) zależy jed n ak od wysokości zastosow a
nej daw ki CIPC. N iskie polowe daw ki (1 2, 25 ppm) u trz y m u ją się w
stanie nie rozłożonym przez k ilk a dni, podczas gdy daw ki rzędu 500 i 1 0 0 0 ppm — przez kilkad ziesiąt dni. Dla daw ek 50 i 500 ppm CIPC obserw ow ano in ten sy w ne uw aln ianie jonów Cl~ po 30 dniach inkubow a- nia gleby z herbicydem . N atom iast daw ka 1 0 0 0 ppm CIPC była d e g ra dow ana dopiero po 60 dniach (rys. 3). Można więc sądzić, że zw iększa nie daw ki h erb icy d u w ydłuża czas ad ap ta c ji m ikroorganizm ów do
obec-H erb icy d y k a r b a m i n ia n o w e a m ikroflora gleb> 41
ności tego zw iązku w glebie, po czym n astęp u je in ten sy w n y jego rozk ład na drodze enzym atycznej, co su g e ru ją inni au to rzy [6, 1 0, 1 1].
Okazało się, że różna jest intensyw ność ro zkładu CIPC w różnych ty p ac h gleb. W glebie ubogiej piaszczystej, tra k to w a n e j 500 ppm CIPC, herb icy d zalegał nie rozłożony, ta k że po 90 dniach jeszcze w y kryw ano
T a b e l a 1
Rozkład CIPC w różnych typach g le b wyrażony te s te m bi o l o g ic z n y m oraz metodą c h r o m a t o g r a f ii cienkowarstwowej
CIPC de c om po s iti on i n d i f f e r e n t s o i l ty p e s deter mined by means o f the b i o l o g i c a l t e s t and by the t h i n chromatography method
Rodzaj g le b y S o i l type P r e i n kubac ja g l e b y z CIPC dni P r e - i n c u b a t i o n o f s o i l whit CIPC,days
Drugi d z ie ń wgłę bne j hodowli p o p u l a c j i 2nd day o f submerged b a c t e r i a p o p u la ti o n c u l t u r e S z e ś ć d z i e s i ą t y d z i o ó wgłębnej hodowl i p o p u l a c j i 60th day o f submerged b a c t e r i a p o p u la ti o n c u l t u r e wz ro s t g r y k i buck-wheat growth p o z o s t a ł o ś ć CIPC - % CIPC r e s i d u e ,% w z ro s t g r y k i buck-wheat growth p o z o s t a ł o ś ć CIPC - % CIPC r e s i d u e 9% G l i n i a s t o -- p i a s z c z y e t a Loamy-sandy s o i l 4 0 70 + 0 89 / + - / 40 + 0 ko n tr o la c o n t r o l 0 80 / + - / 30 Czarna zie mi a wrocławska Wrocław bl a c k e a r t h 4 0 70 + 0 89 / + - / 25 + 0 k o n tr o la c o n t r o l 0 80 / + - / 20 P i a s z c z y s t a Sandy s o i l 4 0 100 0 95 89 0 100 0 95 k o n tr o la c o n t r o l 0 100 0 100 G l i n i a s t o - • p ia s z c z y s t a s t e r y l n a S t e r i l e loomy- - sandy s o i l 4 0 100 0 100 89 0 100 0 100 ko n tr o la c o n t r o l 0 100 0 100
całą jego ilość (rys. 4), (tabela 1). Podobnie w glebie gliniasto-piaszczy- stej w yjałow ionej nie stw ierdzono ro zk ład u CIPC, co w skazuje na m ik ro florę jako głów ny czynnik u su w ający ten h erb icyd z gleby [4]. W glebach gliniasto-piaszczystych i czarnej ziem i w rocław skiej obserw ow ano cał ko w ity rozkład CIPC po 60 dniach, co potw ierdzono chrom atograficznie i testem roślin ny m — w zrost siew ek g ry k i (tab. 1).
Nie bez znaczenia jest zdolność adsorbow ania herb icy d u przez cząstki gleby [12, 13]. M ożliwe, że jedn ą z przyczyn wolnego rozkładu chloropro- phan u w glebie piaszczystej był b rak su b stan cji organicznej oraz słaba zdolność sorp cyjn a tej gleby. A nalizy m ikrobiologiczne w ykazały, że w glebach tra k to w a n y ch CIPC selek cjon u ją się szczególnie b a k te rie z ro- dźajów Pseudomonas sp. i Achrom obacter sp. (tab. 2, rys. 5), ale z jede n a stu w yodrębnionych szczepów w ym ienionych b a k te rii tylko trz y sa m odzielnie rozk ładały CIPC w y k o rzy stu jąc go jako jedyne źródło w ęgla i energii (rys. 5). W krótszym czasie i in tensy w niej herb icy d ten był
42 J. S obie szczański i in.
Rys. 4. R ozkład CIPC w różnych typach gleb w y ra żo n y u w a ln ia n iem jon ów chloru. G leba in k u b ow an a z daw ką 500 ppm CIPC
1 — 26 dni inkubacji gleby z CIPC, 2 — 89 clni inkubacji gleby z CIPC, 3 — |*leba bez CIPC
(kontrola); a — gleba gliniasto-piaszczysta, b — gleba gliniasto-piaszczysta sterylna, с — czarna
ziemia zdegradowana, d-r- gleba piaszczysta
CIPC decom p osition in d ifferen t so il typ es, ex p ressed by the rele a se of chlorine ions. S o il incu b ated w ith the CIPC dose of 500 ppm
1 — 26 days of the soil incubation with CIPC, 2 — 98 days of the soil incubation with CIPC,
3 — soil without CIPC; a — loam y-sandy soil, b — sterile loamy-sandy soil, с — degraded black
cath. d — sandy soil
R ys. Г\ R ozkład CIPC przez szczepy bakterii g leb o w y ch w yra żo n y u w a ln ia n iem jon ów chloru
1 — l’ncmionioarts :;p. (nr 2). 2 — Achromobaclcr sp. (nr 1.1 J). 3 — 1'scudomonar, sp. (nr 1) CIPC с ею ш position by soil bacteria strains, caused by the relea se of chlorine ions
H erb icyd y k a rb n m in ia n o w e a mikroflora gle by 43
T a b e l a 2
Degradacja CIPC przez b a k t s r io rodzaju РееиЛсаопаз s p . i Achromobacter эр. CICP dec om po si tio n by b a c t e r i a of. Pseudcnonas s p . and Achromobacter ср .
Symbol Deno t a t i o n Rodzaj B a c t e r i a s p . P o z o s t a ł o ś ć CIPC metoda chromato g r a f i i /%/ CIPC r e s i d u e by the chromatographic method /%/ Syr.bol D e no ta ti on Rodzaj B a c t e r i a sp . P o z o s t a ł o ś ć CIPC metoda chromato g r a f i i /%/ CIPC r es id u e by the chromatographic method /%/ d z ie ń 0
О-day d z i e ń 51 51 s t day d z i e ń 0 0-d ay d z i e ń 51 5 1 s t day 6 J2 Pseudomonas sp. 100 100 6 70+ 2 1 / 2 Pseud en; en as Rp. 100 100 2 l / 2 Poeuiomonas sp . 100 100 D ^ 6 J Pseudomonas cp. 100 80 2 J1 Pseudoironr.s sp . 100 90 2 : 7 Рсеиаотопаз sp. 100 50 »1 Pseudomonas 100 80 2 JyłG R Pseudomonas sp .•:-.*.^):ro-?bacter
sp .
100 90
6 J Pseudomonas sp. 100 00 Г .-i l J Г f;n1
w Гг-'-udomonr. s r-p . AcnromoLiac ter
SP«
100 100
P 1 Pseudomonas sp . 100 eo 2 + 11 J, ■i AchromobacterPseudomonas sp. 100 40
2 Pseudomonas sp . 100 10 6 '2+ 2 l / 2+ -i i) K+2 Pseudomonas зр. +Achron]obacter cp« 100 90 7 Pseudomonas sp . 100 PO Г, + 6 J -+Р^+ I.lI 6 0 Pseudomonas sp. +Acnromobacter 100 90 11 J 1 Achromobacter , s p . 100 16 11 J 1 ! 2v7 Pseudomonas sp . +Achromobacter s p . 100 80 I I I 6 2 Achromobacter s p . 100 100' - ko n tr o lac o n t r o l 100 100 6 F. Achromobr-.cter sp . 100 100 - -
-rozk ład an y przez całą populację b a k te rii w prow adzoną do pożyw ki z próbką gleby.
Inni a u to rzy donoszą, że CIFC jest silnie toksyczny dla w ielu m ik ro organizm ów glebow ych i n iek tó re z nich nie rosn ą w obecności 1 0 0 ppm CIPC. M niejsze daw ki chlo ro p ro ph anu w yw ołują zm iany w m etabolizm ie kom órek, co przejaw iało się n aruszeniem zdolności w y tw arzan ia su b sta n cji anty bio ty cznych , w ydzielania am inokw asów do podłoża, c h a ra k te re m
procesów oddechow ych, różnicam i w cechach m orfologicznych {1, 2].
W N IO SK I
1. P opulacja drob n oustrojó w glebow ych może:
— adaptow ać się do zm ienionych w prow adzeniem h erbicydu w a ru n ków środow iska,
44 J. Sob ies zczań sk i i in.
— w ykorzystyw ać CIPC jako źródło w ęgla.
2. Niższe daw ki CIPC b y ły ro zk ład ane szybciej niż daw ki wyższe. 3. W glebie pozbaw ionej d ro b no u stro jó w nie obserw ow ano ro zk ład u CIPC.
4. N iektóre szczepy b a k te rii glebow ych z rodzajów Pseudomonas sp. i Achrom obacter sp. sam odzielnie u ty liz u ją CIPC, choć m niej in ten sy w nie niż to dzieje się w m ieszaninie całej pop ulacji glebow ej.
L IT E R A T U R A
[1] B a l i c k a N. , K a s z u b i a k H.: Sp osob y d zia ła n ia h erb icy d ó w na m ik ro organ izm y g leb ow e. P ost. M ikrob. 6, 1967, z. 1, 15-26.
[2] В a 1 i с к a N., G o ł ę b i o w s k a J.: D zia ła n ie h erb icy d ó w na drob n ou stroje g leb o w e w ś w ie tle badań p row ad zon ych w P olsce. P ost. M ikrob. 11, 1972, 1, 117-136.
[3] B u r b i a n k a М. , P l i s z k a A.: M ik rob iologia ży w n o ści. W arszaw a, 1977, PZW L, w y d . IV, 430.
[4] G e i s s b i i h l e r H. , M a r t i n H., V o s s G.: T he su b stitu ted ureas in h erb icid es. M arcel D ek k er INC, N ew Y ork 1978, 230.
[5] I w a s a k i L., U t s u m i S., O z a w a T.: B u ll Chem . Soc. Japan 25, 1952, 226.
[6] К a u f m a n D., K e a r n e y P.: M icrobiol d egrad ation of iz o p ro p y lo N 3 --c h lo ro p h en y lo ca rb a m a te and 2 -ch lo ro p h en y l-N -3 -ch lo ro p h en y lo ca rb a m a te. A ppl. M icrob. 13, 1965, 3, 433.
[7] К a u f m a n D.: M icrobiol m eta b o lites of a n ilin e-b a sed p esticid es. In te r n a tio n a l S ym p osiu m , W rocław 1973, 1.
[8] K a u f m a n D.: M icrobiol m eta b o lites of a n ilin e -b a se d h erb icid es. S o il Sei. A nn. 26, 1975, 2, 5-15.
[9] K a u f m a n D., K e a r n e y P., S h e e t s T.: M icrobiol d egrad ation of sim a zin e. A gr. and Food C hem . 13, 1965, 3, 238.
[10] K a u f m a n D., P l i m m e r J.: M icrobiol ox id a tio n of 4-ch lo ro a n ilin e. J. A gr. Food C hem . 21, 1973, 1, 127.
[11] K e a r n e y P., K a u f m a n D.: H y d ro litic d ecom p osition CIPC of e n z y m atic p a th w a y s. A gr. Food C hem . 13, 1965, 6, 561.
[12] K e a r n e y P., K a u f m a n D.: D egrad ation of h erb icid es. M arcel D ek k er INC, N e w Y ork 1969, 113-145.
[13] K e a r n e y P., K a u f m a n D.: H erb icid es ch em istry d egrad ation and m ode of action . M arcel D ek k er INC, N e w Y ork 1975, 209.
[14] P i s s J.: B ad an ie m etod ą fizy k o ch em ic zn ą szyb k ości d eza k ty w a cji 2 -ch lo ro - -4 -ety lo a m in o -6 -iz o p r o p y lo a m in o -3 -tr ó ja z y n y w gleb ie. P raca doktorska WSR, W rocław 1970.
[15] S a n d s D., R o v i r a A.: Iso la tio n of flu o r e sc e n t Ps e u d o m o n a d s w ith a s e le c tiv e m ed iu m . A ppl. M icrobiol. 20, 1970, 3, 513.
[16] S o b i e s z c z a ń s k i J.: W y k ry w a n ie h erb icy d ó w m etod am i b iologiczn ym i. P race N a u k o w e In st. T ech n o lo g ii O rganicznej i T w o rzy w S ztu czn y ch P o li te c h n ik i W rocław sk iej 8, 1972, 89.
H erb icy d y k a r b a m in ia n o w e a m ikroflora gle by 45 E. СОБЕЩ АНЬСКИ, А. РОДЗЕВИЧ, Р. СТЕМПНЕВИЧ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ КАРБАМИНОВОКИСЛЫМ ГЕРБИЦИДАМИ И ПОЧВЕННОЙ МИКРОФЛОРОЙ Институт складского дела и технологии продовольствия, Сельскохозяйственная академия, Вроцлав Р е з ю м е Испытывалось деградирование CJPC в почве, используя меркурометрический метод определения хлоридов, методом хроматографии в тонком слое, а также биологический тест. Исследования проводились па глинисто-песчаной почве обо гащенной различными дозами гербицида: 25, 50, 500, 1000 ppm. Сравнивалась также скорость разложения дозы 500 ppm CJPC в различных типах почв: супеси естественной, супеси стерилизованной, черной земле вроцлавской и пес чаной. Из исследованной почвы были обособлены бактериальные штаммы из видов Pseudomonas sp. и Achromobacter sp., отличающихся способностью само стоятельного разлигания CJPC. Полученные результаты подтвердили сведения из литературных источников о том, что разлажение CJPC протекает микро биологическим путем. Обнаружена адаптация почвенной популяции к при сутствию горбицида в почве. Скорость разложения CJPC в почве оказывала зависимость от величины примененной дозы и от типа почвы. Стерилизованная и песчаная почвы долго сохраняли гербицид без его разложения.
J» SO BIESZCZAŃSK I, A. RODZIEWICZ, R. STEMPNIEW ICZ
INTERACTION OF CARBAMINATE HERBICIDES AND SOIL MICROFLORA Department of Food Storage and Technology Agricultural
University of Wrocław S u m m a r y
The CIPC degradation in soil was investigated at use of the mercurometric method of determination of chlorides as well as the thin chromatography method and the biological test, The investigations comprised loamy-sandy soil enriched with various herbicide doses: 25, 50, 500 and 1000 ppm. Also the decomposition i ate of 500 ppm CIPC was compared for various soil types: natural loamy-sandy soil, sterilized loamy-sandy soil, Wrocław black earth and sandy soil. From the soil tested bacteria strains belonging to Pseudomonas sp. and Achromobacter sp. able to decompose independetly CIPC. The results obtained corroborate the litera ture data, according to which the CIPC decomposition would run on the micro biological way. An adaptation of the soil microflora to the presence of the herbicide in soil has been proved.
The CIPC decomposition rate in soil depended on the applied herbicide dose and the soil type. Sterile and sandy soil contained for a long time the non- -decomposed herbicide.
P ro /, d r J e r z y S o b i e s z c z a ń s k i I n s t y t u t P r z e c h o w a l n i c t w a i T e c h n o l o g i i Ż y w n o ś c i A R W r o c l a w , ul . N o r w i d a 25
