P
PRRZZEEGGLL¥¥DD MMEENNOOPPAAUUZZAALLNNYY 22//22000033 38
IIllo oœœcciio ow wa a o occeen na a
ssttrreeff o orrg ga an niizza atto orró ów w jj¹ ¹d deerrk ko ow wyycch h ((A Ag gN NO OR Rss)) w w ssu urro ow wiicczzyycch h
n
no ow wo ottw wo orra acch h n na ab b³³o on nk ko ow wyycch h jja ajjn niik ka a
T
Thhee aasssseessssm meenntt ooff tthhee aarrggyyrroopphhyylliicc nnuucclleeoollaarr oorrggaanniizzeerr rreeggiioonnss ((A AggN NO OR Rss)) ccoouunntt iinn sseerroouuss oovvaarriiaann nneeooppllaassm mss
L
Leesszzeekk GGoottttwwaalldd11,, MMaarriiaann DDaanniilleewwiicczz22,, JJaacceekk SSuuzziinn11,, AAnnddrrzzeejj BBiieeññkkiieewwiicczz11
Celem pracy by³o okreœlenie przydatnoœci analizy stref organizatorów j¹derkowych (AgNORs) w ocenie stopnia z³oœliwoœci surowiczych nowotworów nab³onkowych jajnika.
Badaniem objêto 110 kobiet leczonych operacyjnie w naszym oœrodku. Stwierdzono wzrost mAgNOR i pAgNOR, pocz¹wszy od surowiczych gruczolaków, przez guzy o z³oœliwoœci gra- nicznej do raków jajnika. Wraz ze zmniejszaniem siê zró¿nicowania histologicznego raków mAgNOR i pAgNOR zwiêksza³y siê. Wystêpowanie powy¿szych zale¿noœci w po³¹czeniu z prost¹ metodyk¹ i nisk¹ cen¹ badania czyni¹ z oceny AgNORs potencjalnie przydatn¹ me- todê dodatkow¹ w diagnostyce surowiczych nowotworów nab³onkowych jajnika.
S³owa kluczowe: strefy organizatorów j¹derkowych, surowicze nowotwory jajnika (Przegl¹d Menopauzalny 2003; 2:38–41)
Guzy pochodz¹ce z nab³onka pokrywaj¹cego pier- wotn¹ jamê cia³a stanowi¹ najliczniejsz¹ grupê nowo- tworów jajnika. Wœród nich znajduje siê 80–85% pier- wotnych guzów z³oœliwych tego narz¹du. Rak jajnika znajduje siê na 4. miejscu wœród przyczyn zgonów na nowotwory z³oœliwe u kobiet. Odsetek 5-letnich prze¿yæ dla wszystkich stopni klinicznych tego nowotworu wy-
nosi 30–40% i w ci¹gu ostatnich 30 lat nie uleg³ znacz¹- cej poprawie. Najczêœciej spotykanym typem histolo- gicznym raka jajnika jest gruczolakorak surowiczy [1].
W procesie nowotworzenia ulega za³amaniu równo- waga miêdzy czêstoœci¹ podzia³ów komórkowych, a œmierci¹ komórek na korzyœæ procesów proliferacyj- nych. Ukaza³y siê liczne prace, których autorzy umiesz-
1
1 II KKlliinniikkaa GGiinneekkoollooggiiii ii OOnnkkoollooggiiii GGiinneekkoollooggiicczznneejj,, IInnssttyyttuutt GGiinneekkoollooggiiii ii PPoo³³oo¿¿nniiccttwwaa UUMM ww ££ooddzzii;;
k
kiieerroowwnniikk KKlliinniikkii ii DDyyrreekkttoorr IInnssttyyttuuttuu:: pprrooff.. ddrr hhaabb.. mmeedd.. JJaacceekk SSuuzziinn
2
2 PPrraaccoowwnnaa MMoorrffoommeettrriiii KKaatteeddrryy ii ZZaakk³³aadduu PPaattoommoorrffoollooggiiii UUMM ww ££ooddzzii;;
k
kiieerroowwnniikk KKaatteeddrryy ii ZZaakk³³aadduu:: pprrooff.. ddrr hhaabb.. mmeedd.. WWiieelliiss³³aaww PPaappiieerrzz
P
PRRZZEEGGLL¥¥DD MMEENNOOPPAAUUZZAALLNNYY 22//22000033 39 czaj¹ ocenê proliferacji komórkowej guza wœród nieza-
le¿nych czynników rokowniczych w chorobie nowo- tworowej [2, 3, 4, 5]. Wskazuje siê m.in. na praktyczne znaczenie analizy iloœciowej i morfologicznej srebrzo- nych stref organizatorów j¹derkowych (AgNORs) oraz oceny ekspresji antygenów PCNA oraz Ki-67 w komór- kach nowotworu [2, 6, 7, 8]. Dotychczas potwierdzono du¿¹ wartoœæ tych oznaczeñ w odniesieniu do licznych nowotworów z³oœliwych (rak sutka, p³uca, przewodu pokarmowego, trzonu i szyjki macicy, gruczo³u kroko- wego, nowotwory oœrodkowego uk³adu nerwowego i in.) [3, 4, 7, 9, 10]. W piœmiennictwie brakuje podob- nych badañ prowadzonych na reprezentatywnych i hi- stologicznie jednorodnych grupach raków jajnika.
C
Ceell p prra accyy
Celem pracy by³o okreœlenie przydatnoœci analizy stref organizatorów j¹derkowych (AgNORs) w ocenie stopnia z³oœliwoœci surowiczych nowotworów nab³on- kowych jajnika.
M
Ma atteerriia a³³ ii m meetto od dyy b ba ad da añ ñ
Badaniem objêto 110 kobiet, operowanych w Insty- tucie Ginekologii i Po³o¿nictwa Uniwersytetu Medycz- nego w £odzi od 1.01.1998 r. do 1.10.2002 r. z powo- du surowiczych nowotworów nab³onkowych jajnika.
W grupie badanej by³o 29 chorych z gruczolakami, 12 kobiet z guzami granicznymi i 69 chorych na raka jaj- nika. Stwierdzono 17 surowiczych raków w stopniu G-1 (24,6%), 21 nowotworów G-2 (30,4%) i 31 raków jajnika G-3 (45,0%). Œredni wiek chorych z gruczola- kiem surowiczym wynosi³ 46,276±19,701 lat, kobiet z surowiczym guzem granicznym 56,583±10,317 lat, a chorych na raka jajnika: 51,880±16,511 lat.
Ka¿dorazowo wykonano i poddano ocenie histolo- gicznej 2 grupy preparatów tkankowych z guza uzy- skanego podczas operacji. Pierwsz¹ grupê skrawków po odparafinowaniu barwiono hematoksylin¹ i eozy- n¹ i badano histopatologicznie. Drug¹ grupê odpara- finowanych skrawków poddawano procedurze sre- brzenia, a nastêpnie badano w nich iloœæ ziarnistoœci AgNORs w komórkach nowotworu. W ka¿dym pre- paracie srebrzonym wg Howella i Plotona poddano analizie œredni¹ iloœæ stref organizatorów j¹derko- wych w komórkach nowotworu (mAgNOR) oraz od- setek komórek guza zawieraj¹cych 5 lub wiêcej NORs (pAgNOR) ze 100 kolejnych j¹der komórko- wych ogl¹danych w mikroskopie œwietlnym w po- wiêkszeniu 400 razy. Otrzymane wyniki opracowano statystycznie przy u¿yciu programu CSS Statistica (Statsoft Inc., Tulsa, OK., USA).
W Wyyn niik kii
Oceniono zale¿noœæ pomiêdzy typem histologicz- nym surowiczego guza jajnika, a œredni¹ iloœci¹ stref organizatorów j¹derkowych w komórkach nowotworu (mAgNOR) oraz odsetkiem komórek nowotworu za- wieraj¹cych 5 lub wiêcej NORs (pAgNOR). Wyniki zestawiono w tab. I. oraz II.
Stwierdzono, ¿e istniej¹ ró¿nice istotne statystycznie w œredniej iloœci AgNORs (mAgNOR) oraz w odsetkach komórek nowotworu zawieraj¹cych 5 lub wiêcej NORs (pAgNOR) pomiêdzy gruczolakami, guzami graniczny- mi i rakami jajnika, a wœród raków pomiêdzy guzami G1, G2 i G3 (w ka¿dym przypadku p<0,05) (tab. I., tab. II.).
Ustalono te¿, ¿e wystêpuje silna dodatnia korelacja miê- dzy wzrostem mAgNOR oraz pAgNOR, a zwiêkszaniem siê stopnia z³oœliwoœci surowiczych nowotworów jajnika od guzów ³¹godnych do raków jajnika. Uzyskane warto- œci wspó³czynników korelacji ρ-Spearmana wynosi³y odpowiednio: ρ= 0,850 (p<0,001) iρ= 0,831 (p<0,001).
Stwierdzono wystêpowanie silnej korelacji pomiê- dzy wartoœciami mAgNOR i pAgNOR w guzach ³agod- nych (ρ= 0,610; p<0,001) i w rakach jajnika (ρ= 0,899;
Tab. I. Œrednia iloœæ stref organizatorów j¹derkowych (mAgNOR) w komórkach surowiczych nowotworów nab³onkowych jajnika
Typ guza n MAgNOR SD
gruczolaki 29 1,925 0,361
guzy graniczne 12 2,908 0,258
raki G1 17 3,742 0,253
raki G2 21 4,127 0,556
raki G3 31 4,745 0,922
ogó³em raki 69 4,310 0,811
Tab. II. Procent komórek w poszczególnych typach surowiczych guzów jajnika zawieraj¹cych 5 lub wiêcej NORs (pAgNOR)
Typ guza n PAgNOR SD
gruczolaki 29 0,897 0,860
guzy graniczne 12 4,167 2,401
raki G1 17 22,118 10,030
raki G2 21 35,524 13,938
raki G3 31 52,258 20,651
ogó³em raki 69 39,739 20,580
P
PRRZZEEGGLL¥¥DD MMEENNOOPPAAUUZZAALLNNYY 22//22000033 40
p<0,001), natomiast nie uzyskano podobnej zale¿noœci w guzach o granicznej z³oœliwoœci (ρ= 0,442; ns).
D
Dyyssk ku ussjja a
Strefy organizatorów j¹derkowych to segmenty me- tafazowych chromosomów, wokó³ których podczas te- lofazy podzia³u komórkowego tworz¹ siê j¹derka.
NORs (nucleolar organizer regions) zlokalizowane s¹ w okolicach przewê¿eñ wtórnych chromosomów akro- centrycznych, czyli chromosomów 13., 14., 15., 21.
i 22. pary. W ich sk³ad wchodzi DNA koduj¹ce ryboso- malny RNA, zwi¹zane z niehistonowymi bia³kami, które odpowiadaj¹ liczbie i wielkoœci stref organizato- rów j¹derkowych i mog¹ byæ uwidocznione za pomoc¹ srebrzenia. W mikroskopie œwietlnym s¹ one wtedy wi- doczne jako czarne lub ciemnobr¹zowe ziarnistoœci w obrêbie j¹dra komórkowego. Uwa¿a siê, ¿e metafa- zowe ziarnistoœci AgNORs s¹ znacznikami aktywnych stref organizatorów j¹derkowych, a wiêc odpowiadaj¹ tym genom rybosomalnym, które ulegaj¹ ekspresji podczas interfazy. Iloœæ stref organizatorów j¹derko- wych jest wyraŸnie zwi¹zana z faz¹ cyklu komórkowe- go, a zwiêkszone ich iloœci wskazuj¹, ¿e wiêkszoœæ ko- mórek jest w fazie S-G2, a tylko niewielka ich czêœæ znajduje siê w fazie G1. Jest to cecha charakterystycz- na dla komórek szybko dziel¹cych siê. Do takich ko- mórek nale¿¹ komórki nowotworowe [11, 12, 13, 24].
Metoda AgNORs, czyli jednostopniowe srebrzenie ko- loidowe regionów organizatorów j¹derkowych jest jedn¹ z najczêœciej stosowanych metod w celu oceny prolifera- cji komórkowej. Pierwsze doniesienia dotycz¹ce jej za- stosowania w diagnostyce nowotworów pochodz¹ z lat 80. [11, 12]. Od tego czasu obserwuje siê sta³y wzrost za- interesowania t¹ tani¹ i prost¹, a jednoczeœnie bardzo u¿y- teczn¹ metod¹. W praktyce stosuje siê dwie metody oce- ny AgNORs. Pierwsza z nich polega na ocenie œredniej iloœci stref organizatorów j¹derkowych w komórkach no- wotworu (mAgNOR), w drugiej natomiast oblicza siê od- setek komórek nowotworu zawieraj¹cych 5 lub wiêcej NORs (pAgNOR). Uwa¿a siê, ¿e mAgNOR odpowiada ocenie ploidii nowotworu, natomiast pAgNOR odzwier- ciedla aktywnoœæ proliferacyjn¹ guza [6]. W przeprowa- dzonym badaniu zaobserwowano du¿e podobieñstwo po- miêdzy zachowaniem siê obu tych parametrów.
Metoda srebrzenia stref organizatorów j¹derko- wych znalaz³a ju¿ tak¿e zastosowanie w onkologii
ginekologicznej. Uwa¿a siê, ¿e wzbogacenie diagno- styki mikroskopowej zmian w szyjce macicy o sre- brzenie skrawków wg metody AgNOR mo¿e mieæ du¿¹ wartoœæ w ocenie transformacji nowotworowej zmian przedrakowych oraz w prognozowaniu kli- nicznego przebiegu choroby nowotworowej [14, 15].
Pojawi³y siê tak¿e doniesienia o istnieniu zale¿noœci pomiêdzy parametrami ziarnistoœci AgNORs, a od- powiedzi¹ raka szyjki macicy na radioterapiê. W od- niesieniu do raka trzonu macicy zaobserwowano, ¿e mo¿e to byæ czynnik pomocny w ustalaniu przyna- le¿noœci chorych na ten nowotwór do grup wysokie- go i niskiego ryzyka [7, 9, 1].
W piœmiennictwie pojawi³y siê równie¿ publikacje, mówi¹ce o zastosowaniu oceny stref organizatorów j¹- derkowych w diagnostyce i monitorowaniu leczenia no- wotworów jajnika [1, 6, 8, 10, 17, 18, 19]. Uwa¿a siê, ¿e zarówno iloœæ zgrupowañ ziarnistoœci, jak i pojedyn- czych AgNORs, wreszcie ³¹czna liczba tych ziarnistoœci wykazuj¹ istotny wzrost od zmian ³agodnych przez gu- zy graniczne do nowotworów z³oœliwych jajnika, co po- twierdzi³o przeprowadzone przez nas badanie. Stwier- dzenie, ¿e iloœæ ziarnistoœci AgNORs, podobnie jak dla raków o innym ni¿ jajnik umiejscowieniu, roœnie ze wzrostem stopnia zró¿nicowania komórkowego nowo- tworu równie¿ znalaz³o potwierdzenie w naszym mate- riale [6, 17]. Wg wiêkszoœci autorów najsilniej wyra¿o- ne s¹ powy¿sze zale¿noœci w³aœnie w surowiczych no- wotworach jajnika [8, 10, 17].
W Wn niio ossk kii
1. Stwierdza siê wzrost œredniej iloœci stref organiza- torów j¹derkowych w komórkach nowotworów (mAgNOR) i podobny wzrost odsetka komórek nowotworów zawieraj¹cych 5 lub wiêcej NORs (pAgNOR) pocz¹wszy od gruczolaków, przez gu- zy o z³oœliwoœci granicznej do raków jajnika.
2. Iloœæ stref organizatorów j¹derkowych jest jednym z czu³ych wyk³adników stopnia z³oœliwoœci suro- wiczych nowotworów nab³onkowych jajnika.
3. Wystêpowanie powy¿szych zale¿noœci w po³¹cze- niu z prost¹ metodyk¹ i nisk¹ cen¹ badania czyni¹ z oceny AgNORs potencjalnie przydatn¹ metodê dodatkow¹ w diagnostyce surowiczych nowotwo- rów nab³onkowych jajnika.
Summary
Aim of study: To evaluate the usefullnes of argyrophylic nucleolar organizer regions (AgNORs) analysis in the assessment of malignancy in the serous ovarian neoplasms.
Material and methods: 110 women who underwent a surgical procedure between 1998–2002 in our department due to serous ovarian neoplasms (29 adenomas, 12 borderli- ne and 69 carcinomas) were covered by the study. The specimens were prepared according
P
PRRZZEEGGLL¥¥DD MMEENNOOPPAAUUZZAALLNNYY 22//22000033 41 to the method described by Howell and Ploton. The mean number of AgNORs per nucleus
(mAgNOR) and the mean percentage of nuclei with five or more AgNORs per nucleus (pA- gNOR) were counted in the light microscope in 100 randomly chosen epithelial cell nuclei at 400 x oil immersion magnification.
Results: The mAgNOR and pAgNOR mean numbers were respectively: 1.925±0.361 and 0.897±0.860 in adenomas, 2.908±0.258 and 4.167±2.401 in borderline tumors, 4.310±0.811 and 39.739±20.580 in cancers. According to the grading of cancers it was as follows 3.742±0.253 and 22.118±10.030 in G1 tumors, 4.127±0.556 and 35.524±13.938 in G2 tumors, and 4.745±0.922 and 52.258±20.651 in G3 neoplasms. All the differences were statistically signifficant. The correlation between the tumor type and mAgNOR as well as pA- gNOR from adenomas to G3 cancers was found.
Conclusions: We found an increase in mAgNOR and pAgNOR from serous adenomas through borderline tumors to cancers. Together with the tumor grade increase, an increase in mAgNOR and pAgNOR was observed. These findings together with easy methods and low costs make the evaluation of AgNORs at potential helpful method in the assessment of serous ovarian neoplasms.
Key words: argyrophylic nucleolar organizer regions, serous ovarian neoplasms
P
Piiœœmmiieennnniiccttwwoo
1. Markowska J. Rak jajnika. Springer PWN, Warszawa 1997: 9-10.
2. Ceccarelli C, Trere D, Santini D, et al. AgNORs in breast tumours. Micron 2000; 31 (2): 143-9.
3. Chiusa L, Galliano D, Formiconi A, et al. High and low risk prostate carcinoma determined by histo- logic grade and proliferative activity. Cancer 1997; 79 (10): 1956-63.
4. Costa Ad, de Araujo NS, Pinto Dd, et al. PCNA/AgNOR and Ki-67/AgNOR double staining in oral squamous cell carcinoma. J Oral Parhol Med 1999; 28 (10): 438-41.
5. Miller B, Umpierre S, Tornos C, et al. Histologic characterization of uterine papillary serous adenocar- cinoma. Gynecol Oncol 1995; 56 (3): 425-9.
6. Ghazizadeh M, Sasaki Y, Araki T, et al. Prognostic value of proliferative activity of ovarian carcinoma as revealed by PCNA and AgNOR analyses. Am J Clin Pathol 1997; 107 (4): 451-8.
7. Howell WM, Black DA. Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective collo- idal developer: a 1-step method. Experimentia 1980; 36: 1014-5.
8. Terlikowski S, Lenczewski A, Sulkowska M, et al. Heterogennoœæ nowotworów nab³onkowych jajnika w analizie ekspresji bia³ek regionów organizatorów j¹derkowych. Gin Pol 2000; 71 (9): 1194-7.
9. Miller B, Flax S, Dockter M, et al. Nucleolar organizer regions in adenocarcinoma of the uterine cervix.
Cancer 1994. 15; 74 (12): 3142-5.
10. Sirri V, Roussel P, Hernandez-Verdun D. The AgNOR proteins: qualitative and quantitative changes during the cell cycle. Micron. 2000; 31 (2): 121-6.
11. Gryczyñski M, Niewiadomska H, Kobos J, et al. Ekspresja wybranych wskaŸników apoptozy, prolife- racji i przerzutowoœci w ocenie dynamiki rozrostu raka krtani. Otolaryngol Pol 2000; 54 (6): 615-9.
12. Nakae S, Nakamura T, Ikegawa R, et al. Evaluation of argyrophilic nucleolar organizer region and pro- liferating cell nuclear antigen in colorectal cancer. J Surg Oncol 1998; 69 (1): 28-35.
13. Ploton D, Menager M, Jeannesson P, et al. Improvement in the staining and in the visualization of the argyrophilic proteins of the Nucleolar Organizer Regions at the optical level. Histochem J 1986; 18:
5-14.
14. Wierzchniewska A. Przydatnoœæ iloœciowej oceny stref organizatorów j¹derkowych (AgNORs) oraz nie- których parametrów morfometrycznych j¹dra komórkowego w diagnostyce ró¿nicowej wybranych zmian pa- tologicznych szyjki macicy. Praca doktorska. AM £ódŸ 1997.
15. Mauri FA, Scampini S, Aldovini D, et al. AgNOR distribution in serous tumours of the ovary. Patho- logica 1990; 82 (1081): 487-92.
16. Miller B, Morris M, Silva E. Nucleolar organizer regions: a potential prognostic factor in adenocarcino- ma of the endometrium. Gynecol Oncol 1994; 54 (2): 137-41.
17. Criscuolo M, Martinelli AM, Migaldi M, et al. Prognostic significance of nucleolar organizer regions in ovarian epithelial tumors. Int J Gynecol Pathol 1993; 12 (3): 259-63.
18. Kêdzia W, Rutkowski R, Jankowska A, et al. Markery proliferacji oraz parametry morfoimmunolo- giczne w ocenie czynników rokowniczych w rakach b³ony œluzowej macicy. Gin Pol 1997; 68 (4): 199- 205.
19. Terlikowski S, Sulkowski S, Lenczewski A, et al. Study of borderline and invasive mucinous ovarian tu- mors using Ki-67 (MIB 1) antibodies and nucleolar organizer region (NOR) staining. Arch Gynecol Ob- stet 1999; 263 (1-2): 29-33.
A
Addrreess ddoo kkoorreessppoonnddeennccjjii
prof. dr hab. med. Jacek Suzin I Klinika Ginekologii i Onkologii Ginekologicznej
Instytutu Ginekologii i Po³o¿nictwa Uniwersytetu Medycznego w £odzi ul. Wileñska 37
94-029 £ódŸ
