1 Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach 2010–2013 jako projekt badawczy.
DOSKONALENIE WARUNKÓW HYDROLIZY ENZYMATYCZNEJ POLISACHARYDÓW ZAWARTYCH
W SŁOMIE RZEPAKOWEJ
1Karolina Świątek, Małgorzata Lewandowska, Magdalena Świątek, Włodzimierz Bednarski
Katedra Biotechnologii Żywności
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie
Wstęp
Jednym z głównych problemów technologicznych podczas fermentacji surow- ców lignocelulozowych jest złożoność ich budowy, co powoduje, że niezbędne jest ich przygotowanie, które decyduje o efektywności procesu. Destabilizacja struk- tury surowca powinna zapewnić wysoki poziom dostępu do celulozy i hemicelu- lozy, jak również brak lub minimalne pozostałości ligniny oraz inhibitorów, któ- re zakłócają proces hydrolizy polisacharydów. Wyróżnia się cztery główne grupy metod wstępnej obróbki surowców lignocelulozowych: fizyczne, fizykochemiczne, chemiczne i biologiczne. W zależności od zastosowanej metody zachodzą różne przemiany w obrębie kompleksu lignocelulozowego. Z uwagi na dużą różnorod- ność surowców lignocelulozowych oraz różnice w ich właściwościach fizycznych i chemicznych niezbędne jest opracowanie takich sposobów postępowania, które gwarantowałyby uzyskanie pożądanych rezultatów przy minimalnych nakładach finansowych [DA COSTA SOUSA i in. 2009; KRISTENSEN 2009].
Ostatnio przeprowadzono wiele badań dotyczących oceny możliwości stoso- wania enzymów w procesach biokonwersji lignocelulozy. Enzymatyczna hydroliza wstępnie przygotowanych materiałów lignocelulozowych obejmuje reakcje mające na celu przekształcenie celulozy do glukozy oraz hemicelulozy do pentoz (ksylozy i arabinozy) i heksoz (glukozy, galaktozy i mannozy). Konwersja celulozy i hemi- celulozy katalizowana jest odpowiednio przez celulazy i hemicelulazy. Celulazy odgrywają tu znaczącą rolę, ponieważ katalizują proces rozkładu celulozy do cu- krów fermentujących. Enzymami biorącymi udział w hydrolizie celulozy są: endo- glukanazy, egzoglukanazy oraz β-glukozydazy. Endoglukanazy katalizują losowo rozkład wewnętrznych wiązań łańcucha celulozy, natomiast egzoglukanazy atakują końce łańcucha, uwalniając cząsteczki celobiozy [KUMAR i in. 2008]. Degradacja
celulozy jest utrudniona ze względu na występowanie wewnętrznych i zewnętrz- nych wiązań wodorowych, które stabilizują włókna celulozy [MALHERBEI CLOETE 2002]. Proces hydrolizy celulozy składa się z następujących etapów: adsorpcji ce- lulazy na powierzchni celulozy, degradacji celulozy do cukrów prostych oraz de- sorpcji celulazy z powierzchni materiału poddawanego hydrolizie [KULIKOWSKA i KLIMKOWSKI 2008].
Hemiceluloza może być rozkładana przez różne enzymy. Ksylan ulega hy- drolizie pod wpływem enzymów, takich jak endoksylanaza i β-ksylozydaza, któ- re powodują jego degradację do ksylooligosacharydów. Z kolei α-glukuronida- za, α-arabinofuranozydaza i esteraza acetyloksylanu odszczepiają boczne grupy i łańcuchy heteroksylanu, natomiast za hydrolizę glukomannanu odpowiadają β-mannanaza i β-mannozydaza. Efektywność hydrolizy polisacharydów substra- tów lignocelulozowych uwarunkowana jest ich skutecznym przygotowaniem oraz precyzyjnym doborem kompleksu enzymów [KUMAR i in. 2009].
Głównym źródłem handlowych preparatów celulaz są grzyby strzępkowe, w szczególności celulolityczne szczepy należące do rodzaju Trichoderma. Najbar- dziej reprezentatywnymi przedstawicielami są T. viride, T. longibrachiatum, T. re- esei. Produkowane obecnie na skalę przemysłową preparaty celulaz bazują głównie na genetycznie zmodyfikowanych mutantach T. reesei. Grzyby z rodzaju Aspergil- lus, najczęściej wykorzystywane w produkcji przemysłowej, mogą być przydat- ne jako źródło pozyskiwania β-glukozydazy, ksylanazy i ksyloglukanazy. Również grzyby z rodzaju Penicillium mogą być alternatywnym producentem enzymów z grupy celulaz. Enzymy tych grzybów są mniej podatne na hamujący wpływ in- hibitorów, charakteryzują się także mniejszym powinowactwem do ligniny [GU-
SAKOV 2011]. Innym ważnym źródłem enzymów celulolitycznych są bakterie, za- równo tlenowe, jak i beztlenowe. Bakterie razem z grzybami zajmują w przyrodzie centralne miejsce w biodegradacji biomasy roślinnej, z uwagi na ich zdolność do tworzenia odpowiednich nanokompleksów układów enzymatycznych. Przykładem takich tlenowych promieniowców mogą być Cellulomonas i Thermobifida. Nato- miast beztlenowce, takie jak Clostridium i Ruminococcus, mogą produkować spe- cjalne kompleksy celulaz, zwane cellulosomami. Pomimo istotnych zalet, jak prze- żywalność w wyższej temperaturze i lepsze przystosowanie do trudnych warunków, bakterie nie mogą konkurować z mutantami grzybów, gdyż poziom ekspresji białka tych mikroorganizmów jest za niski [WILSON 2009; GUSAKOV 2011].
Celem przeprowadzonych badań było określenie przydatności celulolitycz- nych preparatów enzymatycznych, skomponowanych w różnych zestawieniach, do wydajnej hydrolizy polisacharydów słomy rzepakowej. Efekty hydrolizy oceniano na podstawie stężenia wydzielonych cukrów, możliwych do wykorzystania przez drożdże w procesie fermentacji alkoholowej.
Materiał i metody
Materiałem doświadczalnym była słoma rzepakowa (Brassica napus L. var. na- pus), pochodząca z Gospodarstwa Rolnego w Pacółtowie AUREPIO AGRA Sp. z o.o., w postaci wysuszonej, o zawartości 95,1% suchej masy. Surowiec poddano proce- sowi kilkustopniowego mielenia (młyn tnący Retsch SM100, 2007 r., Niemcy), do poziomu rozdrobnienia 1–2 mm. Określono udział poszczególnych frakcji włókna
w słomie rzepakowej, stosując urządzenie FibertecTM 1020 (FOSS, 2011 r., Chiny);
oznaczono: zawartość włókna neutralno-detergentowego (NDF) według Van Soest’a [VAN SOEST i in. 1991], zawartość włókna kwaśno-detergentowego (ADF) oraz za- wartość ligniny kwaśno-detergentowej (ADL) [PN-EN ISO 13906]. Zawartość celu- lozy wyznaczono z różnicy pomiędzy udziałem frakcji ADF i ADL, natomiast zawar- tość hemicelulozy – z różnicy pomiędzy udziałem frakcji NDF i ADF.
Słomę rzepakową poddano chemicznej obróbce w warunkach: temperatura 121°C, czas 1 h, dodatek NaOH 0,1g·g–1 s.s. substratu (parametry te wyznaczono na podstawie wcześniejszych badań przeprowadzonych w Katedrze Biotechnologii Żywności). Materiał po obróbce i korekcie kwasowości środowiska do pH 5,0 (za pomocą 99-procentowego kwasu octowego) poddano hydrolizie enzymatycznej.
Stężenie substratu lignocelulozowego w zawiesinie ustalono na poziomie 10% s.s.
(w/w), co zapewniło możliwość mieszania medium w czasie reakcji. Reakcję pro- wadzono w czasie 72 h, w temperaturze 50°C, w kolbach stożkowych o pojemności 500 cm3, zawierających 100 g medium reakcyjnego, z zastosowaniem wytrząsania (250 obr·min–1; inkubator Innova 40, New Brunswick, 2010 r., USA), przy użyciu 6 ustalonych kompozycji preparatów enzymatycznych (według tab. 1). Oceniano dwa rodzaje celulaz: Celluclast 1.5L (Novozymes, nr kat. SIGMA C2730) i celula- zę z Trichoderma longibrachiatum (nr kat. SIGMA C9748) oraz dwa preparaty ksy- lanaz: Pentopan Mono BG – ksylanaza z Thermomyces lanuginosus (Novozymes, nr kat. SIGMA X2753) i ksylanazę z Trichoderma longibrachiatum (nr kat. SIG- MA X2629). We wszystkich wariantach procesu hydrolizy zastosowano dodatek celobiazy (Novozyme 188, Novozymes, nr kat. SIGMA C6105) w celu rozkładu powstającej celobiozy (hamującej aktywność celulaz) do glukozy.
Tabela 1; Table 1 Kompozycje stosowanych preparatów enzymatycznych
The compositions of the enzyme preparations used Nr; No Kompozycje preparatów enzymatycznych
The compositions of the enzyme preparations
1 Celluclast 1.5L + celobioza
2 Celluclast 1.5L + Pentopan Mono BG + celobiaza 3 Celluclast 1.5L + ksylanaza z T. longibrachiatum + celobiaza 4 celulaza z T. longibrachiatum + celobiaza
5 celulaza z T. longibrachiatum + Pentopan Mono BG + celobiaza 6 celulaza z T. longibrachiatum + ksylanaza z T. longibrachiatum + celobiaza
Preparaty enzymatyczne stosowano w następujących dawkach: Celluclast 1.5L – 15 FPU·g–1 s.s. słomy, celulaza z Trichoderma longibrachiatum – 15 U·g–1 s.s. słomy, Pentopan Mono BG – 15 FXU·g–1 s.s. słomy, ksylanaza z T. longibra- chiatum – 15 FXU·g–1 s.s. słomy, celobiaza (Novozyme 188) – 30 CBU·g–1 s.s. sło- my. Aktywność enzymów była wyrażana następująco: 1 FPU – ilość enzymu uwal- niająca 1 μmol glukozy z bibuły Whatman no. 1, w czasie 1 minuty, 1 U – ilość enzymu uwalniająca 1 μmol glukozy z celulozy w czasie 1 h (warunki reakcji:
pH 5,0; temperatura 37°C, czas inkubacji 2 h), 1 FXU – ilość enzymu uwalniająca 1 μmol ksylozy z ksylanu w czasie 1 minuty (warunki reakcji: pH 4,5; tempera-
tura 30°C), 1 CBU – ilość enzymu przekształcająca 1 μmol celobiozy do 2 μmoli glukozy w ciągu 1 minuty (warunki reakcji: pH 4,8; temperatura 50°C). Podczas hydrolizy zastosowano dodatek azydku sodu (0,1%) celem wyeliminowania poten- cjalnych zakażeń mikrobiologicznych. W czasie reakcji okresowo pobierano próbki do analizy. Efekty hydrolizy określano na podstawie stężenia uwolnionych cukrów redukujących, oznaczonych przy użyciu metody z kwasem 3,5-dinitrosalicylowym [MILLER 1959]. Porównawczo przeprowadzono hydrolizę materiału natywnego.
Wyniki i dyskusja
Efektywność hydrolizy enzymatycznej surowców lignocelulozowych uza- leżniona jest od ich rodzaju, stopnia dojrzałości, składu chemicznego oraz sposo- bu wstępnej obróbki. Rozdrabnianie prowadzi do zmniejszenia wielkości cząstek i częściowego zniszczenia krystalicznej struktury celulozy, co ułatwia dostęp en- zymów do kompleksu polisacharydów, a także powoduje zwiększenie wrażliwości substratu na działanie czynników chemicznych. Redukcja wielkości cząstek słomy pszennej do wartości 53–149 μm pozwala na zwiększenie wydajności uwalniania glukozy i ksylozy po 24-godzinnej hydrolizie enzymatycznej odpowiednio o 39%
i 20% w porównaniu z próbami odniesienia (cząstki o długości 2–4 cm) [PEDER-
SEN i MEYER 2009; DA COSTA SOUSA i in. 2009]. Wstępne traktowanie lignocelulo- zy alkaliami, takimi jak: wodorotlenek wapnia, amoniak czy wodorotlenek sodu, powoduje degradację wiązań łączących ligninę z pozostałymi polimerami, co jest przyczyną częściowego upłynnienia kompleksu, a także usunięcia części ligniny.
Wymienionym zmianom towarzyszy również zwiększenie dostępności celulozy dla enzymów hydrolitycznych [ALVIRA i in. 2010]. We wcześniej prowadzonych bada- niach własnych ustalono warunki wstępnej obróbki badanego substratu oraz para- metry prowadzenia hydrolizy enzymatycznej.
Doświadczenia opisane w niniejszej pracy dotyczyły doboru najefektywniej współdziałającej kombinacji preparatów enzymatycznych, charakteryzującej się wydajnym uwalnianiem cukrów fermentujących ze słomy rzepakowej. Udział pod- stawowych frakcji (celulozy, hemicelulozy i ligniny) w suchej masie słomy rzepa- kowej wynosił odpowiednio: 49,2; 12,2 i 14,9%, przy czym łączna zawartość ce- lulozy i hemicelulozy – polisacharydów stanowiących potencjalne źródło cukrów fermentujących – kształtowała się na poziomie 61,4%.
Przeprowadzenie 72-godzinnej hydrolizy substratu natywnego (próba kontro- lna) pozwoliło na uzyskanie stężenia uwolnionych cukrów redukujących na po- ziomie 10,68–16,39 g·dm–3 hydrolizatu, a największe ich stężenie osiągnięto przy zastosowaniu kompozycji, w której składzie znalazła się ksylanaza z T. longibra- chiatum – zarówno w skojarzeniu z celulazą Celluclast 1.5L (rys. 1), jak i z celulazą z T. longibrachiatum (rys. 2). Zastosowanie wymienionych kombinacji pozwoliło na uzyskanie wydajności hydrolizy polisacharydów w odniesieniu do wartości teo- retycznej, wyznaczonej na podstawie stężenia celulozy i hemicelulozy w materiale natywnym, na poziomie odpowiednio 22,0 i 24,0%. Najmniej korzystne okazało się zastosowanie kompozycji Celluclast 1.5L i celobiaza: po 72 h procesu ich stężenie w hydrolizacie wynosiło 10,68 g cukrów·dm–3, co dowodzi istotnej roli enzymów degradujących hemicelulozę podczas biokonwersji kompleksu lignocelulozowego (rys. 1).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78
Stężenie uwolnionych cukrów redukujących (g·dm–3 ) The concentration of released reducing sugars (g·dm–3 )
Czas; Time [h]
1 2 3 1 2 3
Rys. 1. Postęp hydrolizy enzymatycznej słomy rzepakowej natywnej (symbole puste) oraz po obróbce wstępnej (NaOH – 0,1 g·g s.s. materiału, temperatura – 121°C, czas – 1 h) (symbole pełne), z zastosowaniem trzech kombinacji preparatów enzymatycznych (nr 1, 2 i 3 według tabeli 1), w czasie 72 h eksperymentu, wy- rażony stężeniem cukrów redukujących w hydrolizacie
Fig. 1. Enzymatic hydrolysis rate of untreated (empty symbols) and pretreated rape straw (addition of NaOH 0,1 g·g–1 d.m. of substrate, temperature 121°C, time 1 h) (filled symbols), with the use of three combinations of enzyme prepara- tions (no. 1, 2, 3 according to table 1), during 72-hour experiment, expressed as reducing sugars concentration in hydrolysate
Hydroliza enzymatyczna wstępnie przygotowanej słomy rzepakowej, prowa- dzona z udziałem każdej z proponowanych kompozycji preparatów enzymatycz- nych, pozwoliła uzyskać trzykrotnie większą zawartość cukrów redukujących po 72 h procesu niż hydroliza substratu natywnego. Już w początkowym etapie pro- cesu zauważono wysoką skuteczność stosowania kompozycji preparatów enzyma- tycznych – celulazy z Trichoderma longibrachiatum, ksylanazy z T. longibrachia- tum i celobiazy (rys. 2). Zastosowanie tej kombinacji spowodowało uwolnienie 32,27 g cukrów·dm–3 hydrolizatu juý po 12 h procesu, by w końcowym etapie osią- gnąć największą z odnotowanych we wszystkich doświadczeniach wartość: 48,82 g cukrów redukujących·dm–3.
Najniższe stężenie cukrów fermentujących w hydrolizacie (33,42 g·dm–3) uzy- skano w doúwiadczeniu z udziaůem kompleksu preparatów Celluclast 1.5L i celo- biaza (rys. 1). W eksperymencie z udziałem kompozycji preparatów celulazy i ksy- lanazy z Trichoderma longibrachiatum z celobiazą uzyskano wydajność hydrolizy polisacharydów słomy rzepakowej na poziomie 71,6% (rys. 3), co oznacza zwięk- szenie jej efektywności średnio o 45% w porównaniu z rezultatami doświadczenia z zastosowaniem preparatów Celluclast 1.5L i celobiaza. Można więc stwierdzić, że najskuteczniej działającym kompleksem enzymów okazał się zestaw celulaz i hemicelulaz z T. longibrachiatum i celobiazy, co świadczy o ich synergistycznym działaniu.
Na rysunku 3 przedstawiono wyniki ilustrujące efektywność 72-godzinnej hy- drolizy enzymatycznej słomy rzepakowej. Jak wspomniano wcześniej, najkorzyst- niejszą z przebadanych kompozycji enzymów okazała się kombinacja preparatów, które pochodziły z grzybów T. longibrachiatum. Szczególnie istotną rolę można przypisać preparatowi ksylanaz, którego zestawienie z celulazami preparatu Cel- luclast 1.5L (kompozycja 3) skutkowało korzystnym stopniem hydrolizy polisa- charydów, tj. 67,1%.
Prawdopodobnie w preparacie ksylanazy z T. longibrachiatum aktywne są również inne hemicelulazy, które sprzyjają kompleksowej hydrolizie badanego surowca lignocelulozowego. Dodatkowo należy zaznaczyć, że wstępna obróbka alkaliami sprzyja poprawie podatności na hydrolizę kompleksu polisacharydów za- wartych w substracie.
MCINTOSHI VANCOV [2010] badali wpływ wstępnego traktowania alkaliami słomy sorgo (Sorghum bicolor) na efektywność hydrolizy enzymatycznej tak prze- tworzonego materiału. Doświadczenia hydrolizy poprzedzono obróbką substratu, stosując zmienne parametry w zakresie: stężenia NaOH (od 0 do 2,0% (w/v)), tem- peratury (60 i 121°C) oraz czasu jej trwania (30, 60 i 90 min). Reakcję hydrolizy enzymatycznej polisacharydów prowadzono przez 48 h w warunkach: temperatu- ra 50°C, pH 5,0, wytrząsanie (150 rpm), z zastosowaniem kombinacji preparatów oferowanych przez firmę Novozymes: celulazy (NS50013), ksylanazy (NS50030) i β-glukozydazy (NS50010). Stężenie rozdrobnionej słomy w zawiesinie ustalono Rys. 2. Postęp hydrolizy enzymatycznej słomy rzepakowej natywnej (symbole puste) oraz po obróbce wstępnej (NaOH – 0,1 g·g–1 s.s. materiału, temperatura – 121°C, czas – 1 h) (symbole pełne), z zastosowaniem trzech kombinacji preparatów en- zymatycznych (nr 4, 5 i 6 wg tabeli 1), w czasie 72 h eksperymentu, wyrażony stężeniem cukrów redukujących w hydrolizacie
Fig. 2. Enzymatic hydrolysis rate of untreated (empty symbols) and pretreated rape straw (addition of NaOH 0,1 g·g–1 d.m. of substrate, temperature 121°C, time 1 h) (filled symbols), with the use of three combinations of enzyme prepara- tions (no. 4, 5, 6 according to table 1), during 72-hour experiment, expressed as reducing sugars concentration in hydrolysate
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78
Stężenie uwolnionych cukrów redukujących (g·dm–3 ) The concentration of released reducing sugars (g·dm–3 )
Czas; Time [h]
4 5 6 4 5 6
na poziomie 5% s.s. Zaobserwowano, że zastosowanie, oprócz celulazy, prepara- tów ksylanazy i β-glukozydazy pozwoliło na zwiększenie skuteczności hydrolizy polisacharydów słomy sorgo, przy jednoczesnym 4-krotnym zmniejszeniu dawki celulazy. Maksymalną wydajność hydrolizy celulozy i hemicelulozy (95%) uzyska- no przy zastosowaniu enzymów w następujących dawkach: celulaza – 5,0 FPU·g–1 substratu, β-glukozydaza – 7,5 CBU·g–1 substratu, ksylanaza – 1,5 FXU·g–1 sub- stratu.
LU i in. [2010] przeprowadzili badania z wykorzystaniem słomy kukurydzia- nej, którą poddano wstępnej obróbce metodą eksplozji pary, a w dalszej kolejno- ści neutralizowano lub przepłukiwano wodą. Cytowani autorzy oceniali również wpływ stężenia substratu w środowisku reakcyjnym na wydajność uwalniania cu- krów fermentujących. Hydrolizę prowadzono przez 96 h, w temperaturze 50°C, pH 4,8, z zastosowaniem wytrząsania, stosując mieszankę kwaśnych celulaz (Glo- bal Green Tech, Chiny). Stężenie substratu lignocelulozowego w zawiesinie ustalo- no w zakresie 10–30% s.s. (w/w). Zaobserwowano, że koncentracja substratu w me- dium reakcyjnym ma niewielki wpływ na efektywność konwersji polisacharydów słomy. Najkorzystniejsze rezultaty uzyskano przy zastosowaniu stężenia substratu na poziomie 30%, co pozwoliło na otrzymanie 103,3 g glukozy·dm–3 hydrolizatu (stopień konwersji celulozy do glukozy wyniósł 72,5%) [LU i in. 2010].
SAHA i in. [2005] przeprowadzili hydrolizę enzymatyczną słomy pszennej uprzednio traktowanej 0,75% roztworem kwasu siarkowego. Zastosowano kom- pleks enzymów: celulazę z Triochoderma reesei, β-glukozydazę z Aspergillus niger i ksylanazę z Trichoderma longibrachiatum. Proces hydrolizy prowadzono w tem-
15,7 17,6 22,0 19,0 20,6 24,0
49,0
55,2
67,1
49,3 50,6
71,6
0 10 20 30 40 50 60 70 80
1 2 3 4 5 6
Wydajność; Yield (%)
Nr kompozycji; No of composition
hydroliza natywnego surowca; hydrolysis of untreated substrate obróbka z udziałem NaOH; pretreatment with NaOH
Rys. 3. Porównanie wydajności 72-godzinnej hydrolizy enzymatycznej słomy rzepa- kowej natywnej i po obróbce z udziałem NaOH, przeprowadzonej z zastosowa- niem sześciu kompozycji preparatów enzymatycznych. Wydajność hydrolizy celulozy i hemicelulozy obliczono w odniesieniu do wartości teoretycznej wy- znaczonej na podstawie zawartości celulozy i hemicelulozy w materiale natyw- nym (61,4%)
Fig. 3. The comparison of the efficiency of 72-hour enzymatic hydrolysis of untreated and pretreated (NaOH) rape straw, conducted with the use of six compositions of enzyme preparations. The efficiency of cellulose and hemicellulose hydroly- sis was calculated in relation to the theoretical value determined based on the content of cellulose and hemicellulose in the native substrate (61,4%)
peraturze 45°C, przy pH 5,0, w czasie 72 h. Wymieniony zestaw enzymów okazał się najkorzystniejszy ze wszystkich zastosowanych w doświadczeniu, czego do- wodzi uzyskany stopień konwersji celulozy do glukozy na poziomie 81% (565 mg cukrów redukujących·g–1 surowca).
Porównując badania przeprowadzone w ramach niniejszej pracy, można stwierdzić, że zastosowanie najkorzystniejszej kompozycji enzymów pozwoliło na uzyskanie koncentracji monosacharydów w hydrolizacie w ilości 488 mg·g–1 su- rowca.
Wnioski
Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, iż preparaty celulaz: Celluclast 1.5L i celulaza z Trichoderma longibrachiatum są przydatne w procesie hydrolizy enzymatycznej surowców lignocelulozowych. Większą skutecznością charaktery- zuje się preparat otrzymany z gatunku T. longibrachiatum.
Istotny wpływ na przebieg hydrolizy ma zastosowanie preparatów ksylanaz.
W badaniach zastosowano preparaty ksylanaz: Pentopan Mono BG i ksylanazę z T. longibrachiatum, z których ta ostatnia odegrała kluczową rolę w uzyskaniu wysokiego poziomu wydajności hydrolizy polisacharydów. Jej wysoką skutecz- ność potwierdza korzystne stężenie monosacharydów w mediach poreakcyjnych (45,7–48,8 g·dm–3), a także różnica pomiędzy efektami działania kompozycji en- zymatycznych bez udziału ksylanaz oraz kompozycji enzymatycznych z ich udzia- łem. Za najkorzystniejszą kompozycję enzymów uznano: celulazę z Trichoderma longibrachiatum, ksylanazę z T. longibrachiatum i celobiazę, co dowodzi ich sku- tecznego synergistycznego działania.
Preparaty enzymatyczne pozyskiwane z T. longibrachiatum pozwalają na uzyskanie wysokiego stopnia konwersji polisacharydów surowca lignocelulozowe- go do cukrów fermentujących. Przedstawione rezultaty badań potwierdziły rów- nież konieczność stosowania obróbki wstępnej w biotechnologicznym przetwarza- niu słomy rzepakowej.
Literatura
ALVIRA P., TOMÁS-PEJÓ E., BALLESTEROS M., NEGRO M.J. 2010. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hy- drolysis: A review. Bioresource Technology 101: 4851–4861.
DA COSTA SOUSA L., CHUNDAWAT S.P.S., BALAN V., DALE B.E. 2009. ‘Cradle- -to-grave’ assessment of existing lignocellulose pretreatment technologies. Curr.
Opin. Biotechnol. 20: 339–347.
GUSAKOV A.V. 2011. Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production. Trends in Biotechnology 29 (9): 419–425.
KRISTENSEN J. B. 2009. Enzymatic hydrolysis of lignocelluloses. Substrate interac- tions and high solids loadings. Forest & Landscape Research 42: 7.
KULIKOWSKA D., KLIMOWSKI K. 2008. Produkcja bioetanolu z odpadów lignoce- lulozowych – możliwości i ograniczenia. Cz. II. Hydroliza i fermentacja. Gaz, Woda i Technika Sanitarna 2: 24–28.
KUMAR R., SINGH S., SINGH O.V. 2008. Bioconversion of lignocellulosic biomass:
biochemical and molecular perspectives. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 35: 377–
–391.
KUMAR R., MAGO G., BALAN V., WYMAN C.E. 2009. Physical and chemical char- acterizations of corn stover and poplar solids resulting from leading pretreatment technologies. Bioresour. Technol. 100: 3948–3962.
LU Y., WANG Y., XU G., CHU J., ZHUANG Y., ZHANG S. 2010. Influence of High Solid Concetration on Enzymatic Hydrolysis and Fermantation of Steam-Exploded Corn Stover Biomass. Appl. Biochem. Biotechnol. 160: 360–369.
MALHERBE S., CLOETE T.E. 2002. Lignocellulose biodegradation: Fundamentals and applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 1: 105–
–114.
MCINTOSH S., VANCOV T. 2010. Enhanced enzyme saccharification of Sorghum bi- color straw using dilute alkali pretreatment. Bioresour. Technol. 101: 6718–6727.
MILLER G.L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reduc- ing sugar. Anal. Chem.31 (3): 426–428.
PEDERSEN M., MEYER A.S. 2009. Influence of substrate particle size and wet oxida- tion on physical surface structures and enzymatic hydrolysis of wheat straw. Biotech- nol. Prog. 25: 399–408.
SAHA B.C., ITEN L.B., COTTA M.A., WU Y.V. 2005. Dilute acid pretreatment, enzy- matic saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol. Proc. Biochem.
40: 3693–3700.
VAN SOEST P.J., ROBERTSON J.B., LEWIS B.A. 1991. Methods for dietary fiber, neu- tral detergent fiber and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition.
Journal of Dairy Science 74: 3583–3597.
WILSON D.B. 2009. Cellulases and biofuels. Curr. Opin. Biotechnol. 20: 295–299.
Słowa kluczowe: lignoceluloza, słoma rzepakowa, hydroliza enzymatyczna, ksylanaza
Streszczenie
Przeprowadzono badania, których celem było określenie wpływu różnych kompozycji preparatów celulolitycznych na efektywność procesu hydrolizy en- zymatycznej polisacharydów słomy rzepakowej po wstępnej obróbce alkalicznej.
Skuteczność ich działania oceniono na podstawie stężenia cukrów prostych uwol- nionych w trakcie reakcji enzymatycznej oraz wydajności obliczonej w odniesieniu do sumy polisacharydów zawartych w surowcu natywnym. Najkorzystniejszym ze-
stawem okazała się kombinacja preparatów pochodzących z grzybów Trichoderma longibrachiatum. Wykazano istotne znaczenie ksylanaz z T. longibrachiatum, któ- rych obecność sprzyjała poprawie efektywności hydrolizy polisacharydów o 37–
45% w porównaniu z doświadczeniami bez ich udziału. Wyniki przeprowadzonych badań potwierdziły również konieczność stosowania obróbki wstępnej podczas przetwarzania substratów lignocelulozowych.
THE IMPROVEMENT OF THE CONDITIONS OF ENZYMATIC HYDROLYSIS OF LIGNOCELLULOSIC
SUBSTRATE POLYSACCHARIDES
Karolina Świątek, Małgorzata Lewandowska, Magdalena Świątek, Włodzimierz Bednarski
Chair of Food Biotechnology University of Warmia and Mazury, Olsztyn
Key words: lignocellulose, rape straw, enzymatic hydrolysis, xylanase Summary
Research evaluating the impact of different compositions of cellulolytic prep- arations on the efficiency of enzymatic hydrolysis of polysaccharides of alkali pre- treated rape straw was carried out. The effectiveness of the used compositions was assessed based on the amount of reducing sugars released during the enzymatic re- action and the yield calculated in relation to the sum of polysaccharides contained in the native substrate. The combination of the preparations derived from the fungus Trichoderma longibrachiatum was the most favorable. It was stated that xylanases from T. longibrachiatum were essential, allowing to improve the efficiency of hy- drolysis of polysaccharides by 37–45% compared to experiments without their par- ticipation. The results of the conducted research also confirmed the necessity of the pretreatment step in the processing of lignocellulosic substrates.
Mgr inż. Karolina Świątek Katedra Biotechnologii Żywności Uniwersytet Warmińsko-Mazurski ul. Heweliusza 1
10-718 OLSZTYN
e-mail: karolina.swiatek@uwm.edu.p
