Adres do korespondencji:
Justyna Sikora, Katedra i Zakład Immunologii i Serologii Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, ul. Raciborska 15, 40-074 Katowice, tel. +48 32 207 84 53, e-mail: sikoraj@poczta.onet.pl
Streszczenie
Wstęp: Hormony płciowe mogą wpływać na aktywność komórek układu odpornościowego, szczególnie na limfocyty i monocyty.
Cel pracy: Celem pracy było zbadanie w warunkach hodowli komórkowej aktywności jednojądrza- stych komórek krwi obwodowej (peripheral blood mononuclear cell – PBMC), po stymulacji progesteronem i 17β-estradiolem. Miarą aktywności PBMC było stężenie produkowanego przez te komórki transformującego czynnika wzrostu beta (transforming growth factor β – TGF-β), który stanowi ważny czynnik biorący udział w re- gulacji i przebiegu cyklu menstruacyjnego i implantacji.
Materiał i metody: Materiał do badań stanowiły PBMC izolowane z krwi 25 dawców. Uzyskane komórki hodowano przez 48 godz. w samym podłożu oraz w podłożu z dodatkiem różnych stężeń (1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml) progesteronu i 17β-estradiolu. Stężenie TGF-β w supernatancie z hodowli PBMC oznaczano metodą immunoenzymatyczną ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
Wyniki: Analiza otrzymanych wyników wykazała, że po stymulacji zarówno progesteronem, jak i 17β-estradiolem, aktywność sekrecyjna PBMC zmieniała się. Wraz ze zwiększeniem stężenia progestero- nu, stężenie TGF-β było istotnie statystycznie większe w porównaniu z hodowlą komórek niestymulowanych (p < 0,0001). Natomiast zwiększoną istotnie statystycznie sekrecję badanego parametru przez PBMC obserwo- wano dopiero po stymulacji komórek 17β-estradiolem o stężeniu 5 ng/ml (p < 0,0001).
Wnioski: Progesteron i 17β-estradiol wykazują wpływ na aktywność PBMC. Zwiększoną aktywność tych komórek obserwuje się po stymulacji większymi stężeniami hormonów, co znacznie wpływa na sekrecję TGF-β.
Słowa kluczowe: 17β-estradiol, progesteron, limfocyty, monocyty, TGF-β.
Summary
Objective: Sex hormones can affect the activity of immune cells, particularly lymphocytes and monocytes.
The aim of the study was to investigate the activity of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) after stimula- tion of progesterone and 17β-estradiol. The indicator of PBMC activity was the concentration of transforming growth factor-β (TGF-β) produced by those cells. It is an important factor involved in the regulation and course of the menstrual cycle and implantation
Materials and methods: Material for the study comprised peripheral blood mononuclear cells isolated from the blood of 10 donors. The resulting cells were cultured for 48 h in the medium and in medium supplemented with different concentrations (1 ng/ml and 5 ng/ml and 10 ng/ml), progesterone and 17β-estradiol. Concentra- tion of TGF-β in the supernatant of PBMC culture was determined by ELISA immunoassay.
Results: The analysis of results showed that after stimulation of both progesterone and 17β-estradiol, the secretory activity of PBMC was changed. With increasing concentrations of progesterone, the concentration of TGF-β2 was significantly higher as compared to unstimulated cultures (p < 0.0001). In contrast, significantly increased secretion of the parameter by PBMC was observed after stimulation of cells of 17β-estradiol at a con- centration of 5 ng/ml (p < 0.0001).
Conclusions: Progesterone and 17β-estradiol have effects on PBMC activity. Increased activity of these cells is observed after stimulation of higher levels of hormones, which greatly influences the secretion of TGF-β.
Key words: 17β-estradiol, progesterone, lymphocyte, monocytes, TGF-β.
Wp³yw progesteronu i 17β-estradiolu na aktywnoœæ jednoj¹drzastych komórek krwi obwodowej
The influence of progesterone and 17β-estradiol on the activity of peripheral blood mononuclear cells
Justyna Sikora, Aleksandra Mielczarek-Palacz, Zdzisława Kondera-Anasz, Justyna Kulińska
Katedra i Zakład Immunologii i Serologii Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach;
kierownik Katedry: prof. dr hab. n. med. Zdzisława Kondera-Anasz
Przegląd Menopauzalny 2011; 6: 443–447
Wstęp
W regulacji funkcji układu odpornościowego bierze udział wiele czynników, m.in. hormony płciowe, szcze- gólnie progesteron i 17β-estradiol. Warunkuje to różną reaktywność komórek biorących udział w odpowiedzi immunologicznej [1]. Limfocyty i monocyty, zaliczane do jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (peripheral blood mononuclear cell – PBMC), to jedne z najważniej- szych komórek biorących udział zarówno w odporno- ści nieswoistej, jak i swoistej. Dane z piśmiennictwa ostatnich lat potwierdzają obecność na powierzchni tych komórek receptorów zarówno dla estrogenów, jak i progesteronu, co wskazuje, że komórki te są wrażli- we na działanie hormonów płciowych [2]. Estrogeny stymulują różnicowanie limfocytów T w kierunku lim- focytów T pomocniczych typu 2 (Th2), wzmagają odpo- wiedź humoralną, a tym samym produkcję przeciwciał.
Z kolei progesteron wykazuje właściwości immunosu- presyjne, co ma na celu ułatwienie implantacji zarod- ka [3, 4]. Wpływ tych hormonów na aktywność PBMC ma ogromne znaczenie, szczególnie w sytuacji, gdy są one dostarczane do organizmu w postaci preparatów terapeutycznych stosowanych jako składniki środków antykoncepcyjnych, oraz w zaburzeniach hormonalnych w okresie menopauzy, pierwotnej niedoczynności jajni- ków, hormonalnej terapii zastępczej (HTZ) czy profilak- tyce osteoporozy.
Markerem aktywności PBMC jest m.in. produkowa- ny przez te komórki transformujący czynnik wzrostu (transforming growth factor β – TGF-β). Jest to wielo- funkcyjna cytokina, należąca do rodziny dimerycznych polipeptydowych czynników wzrostu [5]. Bierze udział w regulacji cyklu komórkowego oraz wpływa na wzrost i różnicowanie zarówno komórek układu odpornościo- wego, jak i komórek narządowo swoistych [6, 7].
Cel pracy
Celem pracy było zbadanie w warunkach hodowli komórkowej wpływu progesteronu i 17β-estradiolu na aktywność PBMC osoby zdrowej. Miarą aktywności było stężenie produkowanego przez te komórki TGF-β.
Materiał i metody
Materiał do badań stanowiły PBMC izolowane z krwi 25 dawców w wieku 25–37 lat (średnia wieku 32,04 ±5,81 roku). Mężczyźni oddawali krew w Regio- nalnym Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Katowicach. Wszyscy badani byli zdrowi i na podsta- wie badania ankietowego i lekarskiego oraz wyników badań laboratoryjnych zostali zakwalifikowani do odda- nia krwi. Od każdego dawcy pobrano 10 ml krwi żylnej na heparynę w systemie zamkniętym. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej izolowano poprzez wirowa- nie na gradiencie gęstości (LinfoSep, Biomedics, Spa- in), a następnie zawieszano w medium hodowlanym (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Bio Wittaker, Belgium), które zawierało mieszaninę antybiotyków (Penicillin-Streptomycin Solution, Sigma, USA) oraz 10-procentową płodową surowicę cielęcą (Fetal Bovi- ne Serum, BioWittaker, Belgium). Komórki hodowa- no przez 48 godz. w temperaturze 37°C i atmosferze 5-proc. CO2 w samym podłożu (hodowla podstawowa) oraz w podłożu z dodatkiem różnych stężeń (1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml) progesteronu i 17β-estradiolu (Sigma, USA). Po zakończonej inkubacji supernatant ze- brano i przechowywano w temperaturze –80°C. Stęże- nie TGF-β w supernatancie z hodowli PBMC oznaczano metodą immunoenzymatyczną ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (TGF-β ELISA, DRG Instruments GmbH, Germany). Czułość testu wynosiła 10 pg/ml.
Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Ka- towicach. Wszyscy badani zostali poinformowani o celu prowadzonych badań i wyrazili zgodę na pobranie krwi.
Wyniki opracowano statystycznie za pomocą pro- gramu Statistica v. 8. Do oceny rozkładu normalności wykorzystano test Shapiro-Wilka oraz jednoczynniko- wy test ANOVA w celu oceny istotności różnic. Za istot- ny statystycznie przyjmowano wartość p ≤ 0,05.
Wyniki
Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli I i na ryci- nie 1. Analiza otrzymanych danych wykazała, że po sty- Tab. I. Średnie stężenie TGF-β w supernatancie z hodowli jednojądrzastych komórek krwi obwodowej
Parametr
Hodowla jednojądrzastych komórek krwi obwodowej
hodowla podstawowa
hodowla stymulowana
progestero- nem 1 ng/ml
hodowla stymulowana
progestero- nem 5 ng/ml
hodowla stymulowana
progestero- nem 10 ng/ml
hodowla stymulowana 17β-estradiolem
1 ng/ml
hodowla stymulowana 17β-estradiolem
5 ng/ml
hodowla stymulowana 17β-estradiolem
10 ng/ml TGF-β
[pg/ml]
x ±SD 58,42 ±8,81 70,14 ±11,521 87,03 ±11,792 102,97 ±12,362 55,28 ±9,463 82,06 ±11,612 115,04 ±25,102 x – średnia; SD – odchylenie standardowe (standard deviation); 1p < 0,01 w porównaniu z hodowlą podstawową; 2p < 0,0001 w porównaniu z hodowlą podstawową; 3nieistotny statystycznie (NS) w porównaniu z hodowlą podstawową.
mulacji zarówno progesteronem, jak i 17β-estradiolem aktywność sekrecyjna PBMC zmieniała się. Wraz ze zwiększeniem stężenia progesteronu stężenie TGF-β było istotnie statystycznie większe w porównaniu z ho- dowlą komórek niestymulowanych (p < 0,0001). Nato- miast zwiększoną istotnie statystycznie sekrecję bada- nego parametru przez PBMC obserwowano dopiero po stymulacji komórek 17β-estradiolem o stężeniu 5 ng/ml (p < 0,0001).
Dyskusja
Prawidłowa odpowiedź immunologiczna uzależ- niona jest od aktywności komórek układu odporno- ściowego – zarówno od limfocytów, jak i monocytów.
Czynnikami, które mogą modulować aktywność tych komórek i wpływać na przebieg odpowiedzi immuno- logicznej, są hormony płciowe, takie jak progesteron i 17β-estradiol. Prowadzone badania miały na celu usta- lenie, jaki wpływ wywierają te hormony na aktywność PBMC u zdrowych ludzi. W tym celu komórki te izolo- wano od zdrowych mężczyzn, co pozwoliło na unik- nięcie endogennego wpływu hormonów na badane komórki, jaki niewątpliwie występowałby w przypadku komórek izolowanych z krwi kobiet. Aktywność PBMC oznaczano poprzez pomiar stężenia TGF-β produkowa- nego przez te komórki. Analiza otrzymanych wyników wykazała, że zarówno po stymulacji progesteronem, jak i 17β-estradiolem aktywność sekrecyjna PBMC zmienia- ła się. Wraz ze zwiększeniem stężenia progesteronu, którym stymulowano komórki, zwiększała się sekrecja TGF-β. Natomiast wzrost wydzielania badanego czynni- ka po stymulacji 17β-estradiolem obserwowano dopiero po zastosowaniu większych stężeń hormonu.
Transformujący czynnik wzrostu beta to ważna cyto- kina biorąca udział w regulacji procesów komórkowych, m.in. proliferacji, różnicowaniu i apoptozie. Ponadto od- grywa ważną rolę w mikrośrodowisku jamy macicy, bio- rąc udział w przebudowie i przygotowaniu endometrium do przyjęcia zapłodnionej komórki jajowej, co umożliwia prawidłowy przebieg ciąży [8, 9]. Produkcja i sekrecja TGF-β w endometrium jest ściśle związana z wydziela- niem hormonów płciowych i fazą cyklu menstruacyjnego.
Dowodzi to, że TGF-β zaangażowany jest w rozpoczęcie procesu menstruacji oraz bierze udział w wytworzeniu lokalnego stanu zapalnego, któremu towarzyszy napływ komórek układu odpornościowego [10]. Dostępne ba- dania dowodzą także, że nieprawidłowa sekrecja TGF-β może zwiększać ryzyko utraty ciąży, a także być związa- na z niepłodnością u kobiet [11]. Badania wskazują rów- nież, że źródłem TGF-β mogą być komórki endometrialne oraz doczesna, co potwierdza rolę tego czynnika w im- plantacji i tworzeniu łożyska [12]. Ponadto Omwandho i wsp. [13] zaobserwowali duże stężenie TGF-β u kobiet w okresie menopauzy, co może sugerować, że bierze on udział w pomenopauzalnej regeneracji endometrium.
Z dostępnych danych piśmiennictwa wynika, że do tej pory nie badano stężenia TGF-β jako markera ak- tywności PBMC stymulowanych hormonami płciowymi.
W piśmiennictwie dostępne są natomiast informacje, które potwierdzają zmiany aktywności tych komórek pod wpływem stymulacji progesteronem i 17β-estradiolem, jednak wyniki tych badań są niejednoznaczne.
Jain i wsp. [14] wykazali, że 17β-estradiol powoduje zahamowanie wydzielania interleukiny 6 (IL-6) przez monocyty i makrofagi, natomiast progesteron może po- wodować wzrost sekrecji czynnika martwicy nowotwo- ru (tumor necrosis factor – TNF). Zwiększenie stężenia prozapalnych cytokin we krwi może być związane ze zwiększeniem ryzyka chorób serca u kobiet po meno- pauzie. Asai i wsp. [15] stwierdzili, że 17β-estradiol nie wpływał na sekrecję IL-6 i TNF, natomiast hamował wy- dzielanie IL-10 przez PBMC. Z kolei badania prowadzone przez Boumana i wsp. [16] wykazały, że na aktywność monocytów i wydzielanie przez nie IL-1β i TNF nie ma istotnego wpływu zarówno stymulowanie progestero- nem, jak i 17β-estradiolem. Nie wykazali oni także żad- nej korelacji między sekrecją tych cytokin a stężeniem hormonów płciowych. Ich zdaniem, nadmierna aktywa- cja receptorów estrogenowych zlokalizowanych na ma- krofagach otrzewnowych może powodować zaburzenia w szlaku przekazywania sygnału zależnego od białek Smad, co z kolei może być związane z brakiem efektu biologicznego wywoływanego przez TGF-β [17, 18].
Hormony płciowe w zależności od dawki wyka- zują różne działanie modulujące aktywność PBMC.
Potwierdzają to również badania autorek artykułu, w których zarówno po stymulacji progesteronem, jak i 17β-estradiolem obserwowano tzw. efekt daw- ki. Podobne badania prowadzili Morishita i wsp. [19].
Stwierdzili oni jednak, że estradiol tylko w małych stę- żeniach zwiększa produkcję IL-1, jednak po stymula- cji większymi dawkami sekrecja tej cytokiny malała.
Ryc. 1. Średnie stężenie TGF-β w supernatancie z hodowli PBMC stymulowanej różnymi stężeniami progesteronu oraz 17β-estradiolu
stężenie TGF-β [pg/ml]
140 120 100 80 60 40 20
0 1 5 10 1 5 10
hodowla stymulowana
progesteronem [ng/ml] hodowla stymulowana 17β-estradiolem [ng/ml]
Również większe stężenia progesteronu wpływają ha- mująco na sekrecję IL-1.
Dane z piśmiennictwa pozwalają także na stwier- dzenie, że progesteron i 17β-estradiol wpływają na pro- cesy różnicowania limfocytów Th1 i Th2, co znajduje odbicie w ogólnoustrojowej zmianie odporności kobiet.
Hormony te powodują hamowanie odpowiedzi komór- kowej typu Th1, która wiąże się z wydzielaniem pro- zapalnych cytokin. Stymulują natomiast różnicowanie limfocytów w kierunku komórek Th2, które wytwarzają cytokiny przeciwzapalne, takie jak IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 oraz IL-13, warunkujące dojrzewanie pęcherzyka jajni- kowego, funkcjonowanie ciałka żółtego oraz implanta- cję, a w konsekwencji prawidłowy przebieg ciąży [20].
Wielu badaczy zajmuje się oceną aktywności komó- rek układu odpornościowego u kobiet po menopauzie stosujących HTZ. Stopińska-Głuszak i wsp. [21] oceniali, jak estrogen i medroksyprogesteron, stosowane w HTZ, wpływają na aktywność cytotoksyczną komórek NK (natural killer) oraz aktywność sekrecyjną PBMC. Z prze- prowadzonych badań wynika, że u kobiet, które stoso- wały te czynniki, obserwuje się spadek cytotoksycz- ności komórek NK oraz zmniejszone wydzielanie IL-2 i interferonu γ, a także zmiany sekrecji TNF. Niemniej jednak uzyskane wyniki wskazują, że estrogenowo-pro- gesteronowa terapia hormonalna może mieć wpływ na zmiany w funkcjonowaniu komórek układu odpor- nościowego i nadzór immunologiczny, przez co może sprzyjać rozwojowi chorób autoimmunologicznych i no- wotworowych [21]. Inni autorzy sugerują natomiast, że niedostateczna produkcja estrogenów u kobiet po me- nopauzie jest przyczyną wzrostu sekrecji cytokin proza- palnych oraz zmniejszenia liczby limfocytów Th CD4+
i limfocytów B. Ponadto, zwiększona sekrecja IL-6 jest przyczyną aktywacji osteoklastów i zwiększonej resorp- cji kości. Dlatego też suplementacja egzogennymi hor- monami płciowymi może zapobiec tym procesom [22, 23]. Niestety, konieczne są dodatkowe badania, które pozwolą na dokładne wyjaśnienie tego problemu.
Podsumowując, przedstawione dane wskazują, że zarówno progesteron, jak i 17β-estradiol wpływają mo- dulująco na komórki układu odpornościowego, szcze- gólnie na aktywność limfocytów i monocytów. Wyka- zano, że działanie tych hormonów uzależnione jest od ich stężenia. Poznanie zarówno czynników, jak i me- chanizmów, które mogą wpływać na aktywność tych komórek, pozwoli na wprowadzenie nowych środków terapeutycznych, które regulując aktywność komórek układu odpornościowego, będą bardziej skuteczne i bezpieczne w użyciu.
Wnioski
Progesteron i 17β-estradiol wykazują wpływ na ak- tywność PBMC, co manifestuje się zwiększoną sekrecją TGF-β przez te komórki.
Hormony płciowe w zależności od dawki wykazują różne działanie modulujące aktywność PBMC.
Zwiększoną aktywność tych komórek obserwuje się po stymulacji większymi stężeniami hormonów, co znacznie wpływa na sekrecję TGF-β.
Badania zostały sfinansowane ze środków Umowy Własnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowi- cach.
Piśmiennictwo
1. Bouman A, Heineman MJ, Faas MM. Sex hormones and the immune response in humans. Hum Reprod Update 2005; 11: 411-23.
2. Wira CR, Fahey JV, Ghosh M, et al. Sex hormone regulation of innate immunity in the female reproductive tract: the role of epithelial cells in balancing reproductive potential with protection against sexually trans- mitted pathogens. Am J Reprod Immunol 2010; 63: 544-65.
3. Cunningham M, Gilkeson G. Estrogen receptors in immunity and auto- immunity. Clin Rev Allergy Immunol 2011; 40: 66-73.
4. Szekeres-Bartho J, Halasz M, Palkovics T. Progesterone in pregnancy;
receptor-ligand interaction and signaling pathways. J Reprod Immunol 2009; 83: 60-4.
5. Tandon A, Tovey JC, Sharma A, et al. Role of transforming growth factor Beta in corneal function, biology and pathology. Curr Mol Med 2010;
10: 565-78.
6. Meulmeester E, Ten Dijke P. The dynamic roles of TGF-β in cancer. J Pa- thol 2011; 223: 205-18.
7. Gordon KJ, Blobe GC. Role of transforming growth factor-beta superfa- mily signaling pathways in human disease. Biochim Biophys Acta 2008;
1782: 197-228.
8. Jones RL, Stoikos C, Findlay JK, Salamonsen LA. TGF-beta superfamily expression and actions in the endometrium and placenta. Reproduction 2006; 132: 217-32.
9. Komiyama S, Aoki D, Komiyama M, Nozawa S. Local activation of TGF- -beta1 at endometriosis sites. J Reprod Med 2007; 52: 306-12.
10. Gaide Chevronnay HP, Cornet PB, Delvaux D, et al. Opposite regulation of transforming growth factors-beta2 and -beta3 expression in the hu- man endometrium. Endocrinology 2008; 149: 1015-25.
11. Skrzypczak J, Wirstlein P, Mikołajczyk M, et al. TGF superfamily and MMP2, MMP9, TIMP1 genes expression in the endometrium of women with impa- ired reproduction. Folia Histochem Cytobiol 2007; 45 (Suppl 1): S143-8.
12. McIntire RH, Ganacias KG, Hunt JS. Programming of human monocytes by the uteroplacental environment. Reprod Sci 2008; 15: 437-47.
13. Omwandho CO, Konrad L, Halis G, et al. Role of TGF-betas in normal human endometrium and endometriosis. Hum Reprod 2010; 25: 101-9.
14. Jain SK, Kannan K, Prouty L, Jain SK. Progesterone, but not 17beta-estra- diol, increases TNF-alpha secretion in U937 monocytes. Cytokine 2004;
26: 102-5.
15. Asai K, Hiki N, Mimura Y, et al. Gender differences in cytokine secre- tion by human peripheral blood mononuclear cells: role of estrogen in modulating LPS-induced cytokine secretion in an ex vivo septic model.
Shock 2001; 16: 340-3.
16. Bouman A, Schipper M, Heineman MJ, Faas M. 17beta-estradiol and progesterone do not influence the production of cytokines from lipo- polysaccharide-stimulated monocytes in humans. Fertil Steril 2004; 82 (Suppl 3): 1212-9.
17. Khan KN, Masuzaki H, Fujishita A, et al. Estrogen and progesterone re- ceptor expression in macrophages and regulation of hepatocyte growth factor by ovarian steroids in women with endometriosis. Hum Reprod 2005; 20: 2004-13.
18. Cherlet T, Murphy LC. Estrogen receptors inhibit Smad3 transcriptio- nal activity through Ap-1 transcription factors. Mol Cell Biochem 2007;
306: 33-42.
19. Morishita M, Miyagi M, Iwamoto Y. Effects of sex hormones on pro- duction of interleukin-1 by human peripheral monocytes. J Periodontol 1999; 70: 757-60.
20. Lea RG, Sandra O. Immunoendocrine aspects of endometrial function and implantation. Reproduction 2007; 134: 389-404.
21. Stopińska-Głuszak U, Waligóra J, Grzela T, et al. Effect of estrogen/
progesterone hormone replacement therapy on natural killer cell cy- totoxicity and immunoregulatory cytokine release by peripheral blood mononuclear cells of postmenopausal women. J Reprod Immunol 2006;
69: 65-75.
22. Gameiro C, Romao F. Changes in the immune system during menopause and aging. Front Biosci (Elite Ed) 2010; 2: 1299-303.
23. Bhavnani BR. Estrogens and menopause: pharmacology of conjugated equine estrogens and their potential role in the prevention of neuro- degenerative diseases such as Alzheimer’s. J Steroid Biochem Mol Biol 2003; 85: 473-82.
