OZNACZANIE STĘŻENIA BARWNIKÓW W WODZIE METODĄ UV-VIS

OZNACZANIE STĘŻENIA BARWNIKÓW W WODZIE METODĄ UV-VIS

I. SPEKTROFOTOMETRIA UV-Vis

Spektrofotometria w zakresie nadfioletu (ang. ultra-violet  UV) i promieniowania widzialnego (ang. visible- Vis), czyli spektrofotometria UV-Vis, jest techniką instrumentalną, w której do celów analitycznych wykorzystuje się przejścia energetyczne zachodzące w cząsteczkach, spowodowane absorpcją promieniowania elektromagnetycznego w zakresie nadfioletu (200-380 nm), widzialnym (380-780 nm) lub bliskiej podczerwieni. Technika ta polega na ilościowym pomiarze absorpcji, emisji lub odbicia światła.

Rys. 1. Widmo elektromagnetyczne.

Metodą spektrofotometrii UV-Vis można oznaczać substancje organiczne (np. wiele związków posiadających wiązanie π lub elektrony n, w tym węglowodory aromatyczne, aldehydy, ketony, kwasy i aminy) i nieorganiczne (np. pierwiastki ziem rzadkich, ozon, SO2) wykazujące absorpcję w nadfiolecie, związki absorbujące promieniowanie w zakresie widzialnym, w tym barwne związki organiczne (barwniki) i barwne sole metali (np. KMnO4, CuSC4) oraz substancje, których formy absorbujące promieniowanie uzyskuje się na drodze reakcji chemicznych. Do celów tych najczęściej wykorzystuje się reakcje kompleksowania.

Wzrastająca energia

Wzrastająca długość fali, λ

Promienie

Gamma Promienie X Nad- Podczerwień Fale radiowe

fiolet

Promieniowanie widzialne

λ

t p

r

I I

I

I

= + +

Głównymi zaletami tej metody są:

1. Duża czułość, której miarą jest molowy współczynnik absorpcji ε, odpowiadający λmax

badanego roztworu. Wartości ε dla czułych metod wynoszą powyżej 10000 dm³·mol^-1·cm^-1. Metody mało czułe charakteryzują się współczynnikami ε o wartościach poniżej 1000 dm³ · mol^-1·cm^-1.

2. Duża precyzja oznaczeń. Precyzja oznaczeń zależy od zakresu oznaczanych stężeń i od klasy stosowanych aparatów. W metodach spektrofotometrycznych można uzyskać wyniki, których błąd nie przekracza ±0,2 %.

3. Selektywność oznaczeń uwarunkowana z jednej strony selektywnością absorpcji, z drugiej zaś selektywnością odczynników wywołującą barwną reakcję z substancją oznaczoną.

II. ABSORPCJA

Wiązka promieniowania monochromatycznego przechodząca przez warstwę roztworu jest osłabiona w stosunku do padającego. Promieniowanie o natężeniu I⁰ ulega częściowo odbiciu lub rozproszeniu, częściowo pochłonięciu, a tylko częściowo przechodzi przez roztwór (Rys. 2.).

Rys. 2. Schemat ilustrujący zjawisko absorpcji promieniowania. Io- natężenie wiązki promienio- wania monochromatycznego, Ir– natężenie promieniowania rozproszonego i obitego, Ip– natężenie promieniowania pochłoniętego, It– natężenie promieniowania przechodzącego przez roztwór.

Prawa absorpcji

I prawo absorpcji (prawo Lamberta)

Wiązka promieniowania monochromatycznego po przejściu przez jednorodny ośrodek absorbujący o grubości b ulega osłabieniu zgodnie z równaniem:

e kb

I I = ₀ ⋅ ⁻ gdzie:

I0 - natężenie wiązki promieniowania monochromatycznego padającego na jednorodny ośrodek absorbujący,

I - natężenie promieniowania po przejściu przez ośrodek absorbujący, k - współczynnik absorpcji,

e - podstawę logarytmów naturalnych. Stąd:

A I kb

I⁰ = =

ln lub ab

I A=log I⁰ =

gdzie:

a = 0,4343 k,

A - zdolność pochłaniania promieniowania zwana absorbancją.

I prawo absorpcji można zatem sformułować w sposób następujący:

Absorbancja jest proporcjonalna do grubości warstwy absorbującej, jeśli wiązka promieniowania monochromatycznego przechodzi przez jednorodny ośrodek absorbujący.

Inną wielkością stosowaną do określania absorpcji promieniowania jest transmitancja (przepuszczalność) T określana jako:

I0

T = I

zatem:

A T1

=log

Transmitancję podajemy najczęściej w procentach, stąd:

I T

T 100 I 100

%

0

=

= lub

A T

% log100

=

II prawo absorpcji (prawo Lamberta-Beera)

Prawo to dotyczy absorpcji promieniowania przez roztwory. Jeśli współczynnik absorpcji rozpuszczalnika jest równy zeru, to wiązka promieniowania monochromatycznego po przejściu przez jednorodny roztwór substancji absorbującej o stężeniu c ulega osłabieniu zgodnie z równaniem:

e kbc

I I = ₀ ⋅ ⁻ Stąd, po przekształceniach jak wyżej, można zapisać:

I abc A=logI⁰ =

II prawo absorpcji można sformułować w sposób następujący:

Jeżeli współczynnik absorpcji rozpuszczalnika jest równy zeru, to absorbancja wiązki promieniowania monochromatycznego przechodzącej przez jednorodny roztwór jest wprost proporcjonalna do stężenia roztworu c i do grubości warstwy absorbującej b.

III prawo absorpcji (prawo addytywności absorpcji)

Absorbancja roztworu wieloskładnikowego równa się sumie absorbancji poszczególnych składników:

An

A A

A= ₁ + ₂ +...+ gdzie

A1,A2, ..., An - absorbancje poszczególnych składników.

W równaniu:

abc A=

wielkość a jest właściwym współczynnikiem absorpcji, gdy stężenie wyrażamy w [kg · dm^-3] lub [g · cm^-3]. Gdy stężenie c wyrazimy w [mol · dm^-3], równanie to przybiera postać:

bc A=ε

gdzie ε jest to molowy współczynnik absorpcji, a jego wymiar podawany jest dwojako:

[dm³ · mol^-1 · cm^-1] lub w jednostkach SI [m² · mol^-1].

Addytywność absorbancji jest spełniona, jeśli pomiędzy składnikami środowiska absorbującego nie ma żadnych oddziaływań chemicznych. Oznacza ona, że każde indywiduum absorbuje tak, jakby inne były nieobecne.

Jeżeli roztwór spełnia II prawo absorpcji, wykres funkcji A = f (c) jest linią prostą, (Rys. 3).

Współczynnik ε ma wartość stałą dla danego chromoforu, nie zależną od stężenia roztworu c.

Wykres funkcji ε = f (c) jest linią prostą równoległą do osi odciętych (Rys. 4).

A=f(c) A

c

ε=f(c) ε

c Rys. 3. Wykres zależności A=f(c). Rys. 4. Wykres zależności ε=f(c).

Ograniczenia w stosowaniu prawa Lamberta-Beera

W myśl II prawa absorpcji zależność absorbancji od stężenia powinna mieć charakter liniowy. W praktyce spotykamy się z odchyleniami od przebiegu prostoliniowego, zarówno z ujemnymi, jak i z dodatnimi (Rys. 5.) .

Rys. 5. Typowe odstępstwa od prawa Beera: I - prosta dla układu spełniającego prawa absorpcji, II - krzywe dla układów nie spełniających praw absorpcji. Główne przypadki odstępstw charakteryzują się zmianą współczynnika absorpcji (ε): a) zmniejszanie się ze wzrostem stężenia;

(b) wartości różne od rzeczywistej niezależnie od stężenia; (c) wzrost ze wzrostem stężenia.

Powyższe odchylenia mogą być wywołane przez:

podstawowe ograniczenia praw

¾ współczynnik absorpcji zależy od współczynnika załamania promieniowania w danym środowisku; dla roztworów rozcieńczonych (c<10^-2 mol·dm^-3) współczynnik załamania jest stały i identyczny ze współczynnikiem załamania czystego rozpuszczalnika. W roztworach o większych stężeniach, zmiany wartości współczynnika załamania mogą być przyczyną odstępstw od praw absorpcji,

¾ występowanie innego niż absorpcja oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego.

czynniki chemiczne powodujące odchylenia od prostoliniowego przebiegu absorbancji związane są z reakcjami chemicznymi zachodzącymi w analizowanym roztworze. Ponadto prawo Lamberta może być spełnione tylko dla przypadku istnienia w roztworze jednej formy cząsteczek. W wyniku zmiany pH czy stężenia roztworu część z nich może ulec zmianom lub deformacjom (dysocjacja, asocjacja, polimeryzacja, solwatacja, a także różne reakcje kompleksowania) co prowadzi do zmiany wartości molowych współczynników adsorpcji odpowiednich cząstek i zaburzenie prostoliniowego charakteru zależności A=f(c).

czynniki aparaturowe.

¾ brak ścisłej monochromatyzacji wiązki promienia,

¾ jeżeli w przyrządzie zachodzi rozpraszanie promieniowania; wywiera ono tym większy wpływ, im większe są wartości mierzonych absorpcji,

¾ zbyt duża szerokośćspektralna wiązki promieniowania przechodzącego przez próbkę.

III. APARATURA

Podstawowymi częściami składowymi spektrofotometrów UV-vis są:

1. Źródło promieniowania,

2. układ optyczny (monochromator), 3. pomieszczenie na komórkę pomiarową, 4. detektor mierzący natężenie promieniowania, 5. wskaźnik, rejestrator, komputer.

Rys. 6. Schemat blokowy spektrofotometru UV-Vis

Źródło promieniowania

Jako źródło promieniowania stosowane są:

a) lampy deuterowe  w zakresie od 180 nm do 380 nm,

b) lampy wolframowo-halogenowe  powyżej 380 nm przez zakres widzialny i bliską podczerwień,

c) wysokociśnieniowe łukowe lampy ksenonowe  są źródłem ciągłego promieniowania, pokrywającego cały zakres UV-Vis.

Monochromator ma za zadanie wybrać, z emitowanego przez źródło promieniowania ciągłego, wąskie pasmo o żądanej długości fali i przepuścić je przez komórkę z badaną substancją. Elementy wchodzące w skład układu optycznego przedstawiono na Rysunku 9.

Komórka pomiarowa. Do pomiarów absorpcji gazów i cieczy stosowane są kuwety. Do badań w nadfiolecie przy długościach fali 200- 380 nm stosuje się kuwety wykonane z kwarcu lub ze stopionej krzemionki, ponieważ materiały te nie pochłaniają promieniowania z tego zakresu. W zakresie widzialnym widma można stosować kuwety szklane.

W szczególnych przypadkach używa się kuwet wykonanych z tworzyw sztucznych.

źródło

promieniowa monochromator kuweta

pomiarowa detektor

wskaźnik i rejestrator

s.

s x

x c

A c = A

Standardowa grubość kuwet wynosi 10 mm, ale są również dostępne kuwety o grubości mniejszej (np.

1 mm) oraz większej (np. 100 mm). Kuweta pomiarowa powinna zapewniać dokładnie zdefiniowaną grubość warstwy absorbującej cieczy, wykazywać odporność na działanie analizowanych substancji chemicznych oraz zapewniać w maksymalnym stopniu transmitancję promieniowania.

*Do uzyskania optymalnych wyników analizy ważny jest odpowiedni dobór rozpuszczalnika. Rozpuszczalnik musi wykazywać niską absorpcję w tych zakresach widma, w których absorbuje badana próbka., nie może reagować z substancją rozpuszczoną, a także powinien wykazywać małą lotność.

Detektory fotoelektryczne stosowane w spektrofotometrach UV-Vis przetwarzają energię promieniowania elektromagnetycznego na energię elektryczną. Najczęściej stosowane są fotokomórki, fotopowielacze oraz fotodiody.

METODY OZNACZEŃ SPEKTROFOTOMETRYCZNYCH.

Ilościowe oznaczenia metodą spektrofotometrii UV-Vis należą do metod porównawczych.

Oznaczenie pojedynczego składnika przeprowadza się:

1) Metodą porównywania z pojedynczym wzorcem. Mierzymy absorbancję Ax roztworu badanego o stężeniu cx i absorbancję As roztworu wzorcowego o znanym stężeniu cs przy tej samej długości fali λ i w kuwetach o tej samej grubości b. Z porównania zmierzonych absorbancji na podstawie prawa Lamberta Beera, można obliczyć stężenie badanej próbki ze wzoru:

2) Metodą porównywania z kilkoma wzorcami, czyli metodą krzywej wzorcowej.

W metodzie tej wykorzystuje się serię roztworów wzorcowych o stężeniu analitu 0 (ślepa próba), 1, 2, 3, 4, 5 i dla każdego roztworu mierzy się absorbancję. Następnie wykreśla się krzywą kalibracyjną A=f(c). Dla badanej próbki mierzy się absorbancję i z krzywej kalibracyjnej odczytuje stężenie cx

3) Metodą dodatku wzorca. Procedura oznaczeń w tej metodzie sprowadza się do pomiaru absorbancji Ao próbki badanej o stężeniu cx i absorbancji Ai mieszaniny próbki badanej o

Grubość warstwy

Kuweta pomiarowa

Analit

Io IT

stężeniu cx z dodatkiem wzorca o znanym stężeniu cs. Metoda ta może być stosowana tylko w przypadku, gdy w badanym zakresie występuje prostoliniowa zależność A od c.

Metodą spektrofotometrii UV-Vis możliwe są także oznaczenia ilościowe mieszanin złożonych z dwu i z wielu absorbujących składników. Ze względu jednak na możliwość nakładania się na siebie krzywych adsorpcji, oznaczenia te wymagają zastosowania bardziej skomplikowanych procedur niż w przypadku oznaczeń pojedynczych składników.

Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis w analizie jakościowej.

Elektronowe widmo absorpcyjne jest cechą charakterystyczną związku chemicznego i określa jednoznacznie związek jednorodny. W przypadku związków organicznych widma w zakresie 180- 800 nm są stosowane do ustalenia pewnych zależności strukturalnych i identyfikacji grup funkcyjnych. Wynika to z obecności w cząsteczce chromoforów- ugrupowań odpowiedzialnych za absorpcję promieniowania w tym zakresie. Najczęściej są to pierścienie aromatyczne (aromatyczny sekstet elektronów), wiązania wielokrotne (ich część - wiązania typu π) zarówno między atomami węgla jak i inne, np. grupy karbonylowej C=O.

Tabela 1. Struktury oraz właściwości absorpcyjne wybranych chromoforów

C O C C

N N

N O C S

chromofor alkenowy chromofor benzenowy

chromofor azowy

chromofor karbonylowy

chromofor nitrozowy chromofor tiolowy

Obok pojęcia chromoforu w spektroskopii UV-Vis używa się pojęcia auksochromu.

Auksochromami są różne grupy funkcyjne w cząsteczce, które choć same nie pochłaniają energii z zakresu UV-Vis, swoją elektroujemnością wpływają na energię chromoforu, przesuwając absorpcję w kierunku fal dłuższych. Do najpopularniejszych auksochromów należy grupa aminowa i hydroksylowa. Grupy te nie są auksochromami z definicji. Pełnią rolę auksochromów, gdy są tak powiązane z chromoforem, że mogą wpływać na jego energię, np. grupa hydroksylowa w fenolu (bezpośrednie powiązanie z chromoforem i możliwość oddziaływania chromofor-auksochrom) pełni role auksochromu, natomiast grupa hydroksylowa w alkoholu benzylowym auksochromem nie jest (grupa CH2 między hydroksylem i pierścieniem skutecznie blokuje wpływ wolnych par tlenu na pierścień).

Auksochrom z jednej strony wpływa na wartość energii podstawowego poziomu energetycznego chromoforu, z drugiej strony może oddziaływać z otoczeniem cząsteczki (wartość pH roztworu, polarność rozpuszczalnika itp.), które z kolei modyfikuje jego siłę oddziaływania na chromofor. Tak więc poprzez auksochrom, otoczenie może modyfikować energię chromoforu zmieniając tym samym położenie, a czasem i kształt widma.

Rys. 8. Przykładowe widmo tej samej substancji zarejestrowane w roztworach o trzech różnych wartościach pH (pH=1, kwaśny; pH=7, obojętny i pH=10, zasadowy).

Taki wpływ otoczenia na kształt i położenie widma czasem utrudnia pomiary i każe pamiętać, że widmo UV-Vis jest charakterystyczne dla danej substancji w danych (określonych) warunkach, z drugiej strony jest przydatnym w badaniach struktury cząsteczki, pozwalając np. określić, czy grupa aminowa ma charakter aromatyczny (auksochrom, wyraźny wpływ pH na położenie maksimum pasma) czy też alifatyczny (połączona z pierścieniem poprzez łańcuch węglowy, widmo nie reaguje na zmiany pH).

CEL ĆWICZENIA

Celem niniejszego ćwiczenia jest zapoznanie się z zasadą działania i pracą Spektrofotometru UV-Vis A2800 firmy Hitachi. i oznaczenie stężeń roztworów barwników metodą krzywej wzorcowej. Analiza polega na pomiarze absorbancji analitu w całym zakresie UV-Vis i wyznaczeniu λmax (długość fali, odpowiadająca najbardziej intensywnemu pasmu absorpcji).

Następnie należy przeprowadzić pomiary absorbcji badanych próbek przy wyznaczonej długości fali i na podstawie sporządzonej krzywej kalibracji wyznaczyć ich stężenie oraz wartości ε.

Rys. 8. Schemat budowy i działania spektrofotometru UV-Vis

Na rysunku 8. przedstawiono schemat budowy dwuwiązkowego spektrofotometru UV-Vis.

Szerokopasmowa wiązka promieniowania emitowanego przez lampę deuterową lub jodowolframową kierowana jest przez zwierciadło skupiające (Lustro 1) na szczelinę wejściową (Szczelina 1) i dalej na monochromator. Toroidalna siatka dyfrakcyjna powoduje rozszczepienie wiązki promieniowania na poszczególne fale, tworząc uporządkowane według długości fal continuum. Z tego continuum szczelina wyjściowa (Szczelina 2) wycina promień światła monochromatycznego (zawierający tylko 1 długość fali), który następnie przechodzi przez filtr i pada na zwierciadło toroidalne (Lustro 2). Promień odbity od tego zwierciadła dzieli się

Siatka dyfrakcyjna

Szczelina 1 Szczelina 2

Kuweta referencyjna

Kuweta próbki

Soczewka 2 Soczewka 1

Detektor 2

Detektor 1 Lustro 1

Lustro 2

Lustro 3 Lustro 4

Lustro

półprzepuszczalne

Wiązka referencyjna

Wiązka pomiarowa Filtr

D2 Lampa UV

WI lampa Vis

Monochromator Komora

pomiarowa

następnie, przy pomocy pół-zwierciadła, na promień próbki i promień referencyjny (porównawczy). Oba te promienie przechodzą następnie, odpowiednio, przez kuwetę próbki badanej i kuwetę próbki odniesienia w komorze próbek. Po przejściu przez kuwety, oba promienie ulegają skupieniu za pomocą soczewek skupiających (Soczewka 1 i Soczewka 2).

Skupione promienie ulegają zogniskowaniu na fotodiodach krzemowych Detektor 1 i Detektor 2, gdzie zostają przekształcone na sygnały elektryczne.

Rejestrując wartości absorbancji w funkcji zmieniającej się długości fali przechodzącej przez roztwór otrzymujemy widmo. Zmiany długości fali najczęściej uzyskuje się zmieniając w sposób ciągły i automatyczny kąt monochromatora w stosunku do padającej nań wiązki ze źródła promieniowania.

Rys. 10. Przykład widma absorpcyjnego.

WYKONANIE DOŚWIADCZENIA

Przygotowanie roztworów wzorcowych analitu

1) Przygotować roztwór podstawowy barwnika rozpuszczając 25 mg w 500 ml wody destylowanej.

2) Do 8 probówek o pojemności 25 ml odmierzyć pipetą automatyczną: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8;

1,0; 1,2; 1,4; 1,6 ml roztworu podstawowego, uzupełnić wodą do 10 ml, zamknąć probówki parafilmem i dokładnie wymieszać.

3) Obliczyć stężenia przygotowanych roztworów.

Przygotowanie badanej próbki

Dokłady opis kolejnych czynności przygotowania badanej próbki do analizy w poszczególnych doświadczeniach będzie dostępny na zajęciach.

Wykonanie oznaczeń spektrofotometrycznych

1) Zarejestrować widmo roztworu podstawowego barwnika w całym zakresie UV-Vis stosując wodę jako odnośnik w celu wyznaczenia analitycznej długości fali (λmax, nm), dla maksimum pasma absorpcyjnego barwnika.

2) Przy wyznaczonej λmax zmierzyć absorbancję A roztworów wzorcowych analitu.

3) Przy wyznaczonej analitycznej długości fali zmierzyć absorbancję badanej próbki . Opracowanie wyników i dyskusja:

1. Wyniki pomiarów zestawić w tabelach.

2. Przedstawić graficznie zależność A=f(c) otrzymaną na podstawie pomiarów absorbancji roztworów wzorcowych (krzywa kalibracji).

3. Z parametrów otrzymanej prostej regresji oraz wyznaczonych eksperymentalnie wartości absorbancji badanej próbki obliczyć stężenie barwnika w próbce.

4. Sformułować wnioski

Literatura

[1] Cygański, Metody spektroskopowe w chemii analitycznej, WN-T, Warszawa 1997.

[2] Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej. W-wa, PWN, 2002.

[3] Ewing G. W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej. W-wa, PWN, 1980.

Przygotowała: Anna Kołodziej