BADANIE AKTYWNOŚCI AMYLOLITYCZNEJ I CELULOLITYCZNEJ SZCZEPÓW TERMOFILNEGO GRZYBA Thermomyces lanuginosus (syn. Humicola lanuginosa)

BADANIE AKTYWNOŚCI AMYLOLITYCZNEJ

I CELULOLITYCZNEJ SZCZEPÓW TERMOFILNEGO GRZYBA

Katarzyna Janda, Joachim Falkowski

Katedra Technologii Rolnej i Przechowalnictwa, Akademia Rolnicza w Szczecinie

Wstęp

W ostatnich latach zwrócono większą uwagę na enzymy termostabilne ze względu na szerokie możliwości zastosowania w przemyśle [WASSERMAN 1984;

KRISTJANSSON 1989]. Źródłem ich pozyskiwania mogą być również grzyby termofil- ne [MAHESHWARI i in. 2000]. Jednym z najpowszechniejszych grzybów termofilnych jest gatunek Thermomyces lanuginosus (syn. Humicola lanuginosa). Celem niniej- szego opracowania było badanie aktywności amylolitycznej i celulolitycznej szcze- pów termofilnego grzyba Thermomyces lanuginosus.

Materiał i metody

Materiał badawczy stanowiło 148 szczepów termofilnego grzyba Thermomy- ces lanuginosus, które wyodrębniono z prób kompostu ogrodowego, kompostu liściowego, biohumusu, podłoża pieczarkowego, surowego ziarna kawy oraz łuska- nych orzechów laskowych. Doświadczenia prowadzono przez 6 dób w temperatu- rze 55?C w trzech powtórzeniach. Do badania aktywności amylolitycznej zastoso- wano podłoże stałe z dodatkiem 2% skrobi [HARRIGAN, MC CANCE 1976]. Ocenę aktywności amylolitycznej szczepów przeprowadzano co 24 godziny, załewając płytki płynem Lugola. W miejscu hydrolizy skrobi pojawiała się wokół kolonii strefa przezroczysta, w przeciwnym przypadku podłoże zabarwiało się na kolor niebieskofioletowy. Jako indeks aktywności amylolitycznej przyjęto stosunek średnicy strefy hydrolizy skrobi do średnicy kolonii badanego szczepu [Но,

FOSTER 1972; HANKIN, ANAGNOSTAKIS 1975; ILNICKA-OLEJNICZAK i in. 1983].

Uzyskane wyniki analizowano statystycznie za pomocą analizy wariancji.

Statystyczne istotności różnic określano używając najmniejszej istotnej różnicy, przy P = 0,05, wyliczonej testem Tukeya. Znajomość najmniejszej istotnej różnicy pozwoliła na tworzenie grup jednorodnych, w obrębie których znalazły się wartoś- ci nieróżniące się między sobą istotnie.

Do oznaczania aktywności celulolitycznej zastosowano podłoże stałe z do- datkiem sproszkowanej celulozy w ilości 5% [TANSEY 1971]. Średnice kolonii ba- danych szczepów mierzono co 24 godziny. Poddawano je także obserwacji mikro-

skopowej w celu ustalenia, czy wyrosłe kolonie zdolne były do wytwarzania zarod- ników. Uzyskane wyniki średnic kolonii zostały uśrednione i są reprezentatywne dła gatunku Thermomyces lanuginosus.

Wyniki i dyskusja Aktywność amylolityczna

Średnie wartości indeksu aktywności amylolitycznej, charakteryzujące szcze- py wyodrębnione z różnych substratów, przedstawia tabela 1.

Tabela 1; Table 1 Średnie wartości indeksu aktywności amylolitycznej osiągniętej przez szczepy

podczas sześciodobowej hodowli na podłożu z dodatkiem skrobi

Average indices of amylolytic activity obtained by strains in a period of 6 day incubation on the medium with starch

_, = : Wartość indeksu aktyw-

"Toa gó e ala, Index of amylolytie | NTRaci LSD = 0,09

activity

Orzechy laskowe; Hazelnuts strains 1,24 a

Biohumus; Biohumus 1,10 b

Kompost liściowy; Leaf's compost 1,05 b

Ziarno kawy; Coffee beans 1,05 b

Kompost ogrodowy; Garden *s compost 1,04 b

Podłoże pieczarkowe; Mushroom compost 1,02 b

lolitycznej równą 1,24 osiągnęły szczepy wyodrębnione z orzechów laskowych.

Najmniejszą wartością równą 1,02 charakteryzowały się szczepy pochodzące z podłoża pieczarkowego. Wartość najwyższa, uzyskana przez szczepy wyizolowane z orzechów laskowych, różniła się istotnie od wielkości charakteryzujących pozos- tałe szczepy, które stanowiły grupę jednorodną.

Zmiany wartości indeksu aktywności amylolitycznej wyodrębnionych szcze- pów w czasie sześciodobowej hodowli na podłożu z dodatkiem skrobi przedstawia rys. 1. Ponieważ niezależnie od źródła wyodrębnienia szczepów, dynamika zmian ich aktywności amylolitycznej była zbliżona, dlatego otrzymane wartości zostały uśrednione i przedstawione w postaci jednej krzywej. Wartości te są reprezenta- tywne dla badanej populacji Thermomyces lanuginosus.

Z danych umieszczonych na wykresie wynika, że jest to krzywa rosnąca, w której wartości najniższe charakterystyczne były dla pierwszych dni hodowli, zaś najwyższe — dla doby ostatniej. Przebieg krzywej wskazuje na etapową hydrolizę skrobi, która zależna była od zapotrzebowania mikroorganizmów na produkty hydrolizy tego substratu.

_ 1,14

3 s 1,12 |

ЕЕ 110

С PE 1,06 |

5 = -

нее № 1,02

NA Вх 1,004 R ,

= gOS E 0,98 4

E o 0,96 т т т т т

1 2 3 4 5 6

Czas hodowli (doby); Time incubation (days)

Rys. 1. Zmiany wartości indeksu aktywności amylolitycznej szczepów Thermomyces lanuginosus w czasie sześciodobowej hodowli na podłożu z dodatkiem skrobi Fig. 1. The changes in amylolytic activity index of the Thermomyces lanuginosus

strains during 6 day incubation on the medium with starch addition

Autorzy zajmujący się zagadnieniem aktywności amylolitycznej grzybów termofilnych są zgodni, że badane przez nich szczepy Thermomyces lanuginosus (syn. Humicola lanuginosa) zdolne były do syntezy enzymów amylolitycznych [FERGUS 1969a; BARNET, FERGUS 1971; BIŁAJ 1979; HAASUM i in. 1991; JENSEN, OLSEN 1992; ADAMS 1994; ARNESEN i in. 1998; LI-DUOCHUAN i in. 1998; MAHESHWARI i in.

2000]. Dobre wyniki biosyntezy tego enzymu osiągano stosując podłoże ze skrobią z dodatkiem ekstraktu drożdżowego [FERGus 1969a; BARNET, FERGUS 1971;

HAASUM i in. 1991; JENSEN i in. 1993; ADAMS 1994; ARNESEN i in. 1998]. ARNESEN i in.

[1998] zalecają dodatek do podłoża hodowlanego substratu Tween-80, który ich zdaniem stymuluje syntezę alfa-amylazy i innych białek. BiLAJ [1979] twierdzi, że Thermomyces lanuginosus posiada najwyższą wśród badanych grzybów termofil- nych aktywność amylolityczną oraz że szczepy tego gatunku zdolne są do aktyw- nej hydrolizy skrobi w procesach samozagrzewania ziarna i innych substratów roślinnych.

Aktywność celulolityczna

Ponieważ nie stwierdzono występowania stref przejaśnienia, które świadczą o hydrolizie celulozy, w związku z tym niemożliwe było porównanie aktywności celulolitycznej poszczególnych szczepów, gdyż wielkość średnicy kolonii nie zaw- sze jest proporcjonalna do poziomu aktywności enzymatycznej. Niemniej badane szczepy rosły, więc na podstawie otrzymanych wyników sporządzono krzywą wzrostu szczepów hodowanych na podłożu z celulozą, którą zestawiono z krzywą obrazującą wzrost kolonii szczepów hodowanych na podłożu optymalnym dla tego gatunku, jakim jest PDA (Potato Dextrose Agar) z dodatkiem ekstraktu drożdżowego. Przedstawione wyniki zostały uśrednione dla wszystkich badanych szczepów i są reprezentatywne dla badanej populacji. Porównano w ten sposób wielkości kolonii tworzonych przez szczepy w obecności dwóch różnych Źródeł węgla w podłożu. Obie krzywe wzrostu przedstawiono na rys. 2.

80,0

—— podłoże PDA; medium PDA 73,5

~ 70,0 | —a- podłoże z celulozą; medium with cellulose

GE 600 4

E a

a g 50,0 | 49,0

& 2

3 8 40,0 4 Ś m

8 2 30,0 -

eg

a Е 20,0 -

7 10,0 4

0,0 T T т T

1 2 3 4 5 6

Czas hodowli (doby); Time incubation (days)

Rys. 2. Średnie dobowe przyrosty średnic kolonii szczepów Thermomyces lanuginosus podczas sześciodobowej hodowli na podłożu PDA z ekstraktem drożdżowym oraz na pożywce z dodatkiem celulozy

Fig. 2. Average daily increasing of colony diameters of the Thermomyces lanuginosus strains obtained during the incubation on the PDA with yeast extract and on the medium with cellulose

Otrzymane wyniki wskazują, że szczepy w obecności celulozy tworzyły kolo- nie o zdecydowanie większych średnicach. Obserwacje makroskopowe, jak i mi- kroskopowe grzybni powietrznych wykazały, że szczepy te zdolne były do wytwa- rzania zarodników. Należy jednak zaznaczyć, że mimo iż kolonie tworzone na podłożu z celulozą były większe, to wygląd morfologiczny grzybni nie był charak- terystyczny dla gatunku. Grzybnia powietrzna tworzona przez szczepy w tych wa- runkach była mniej puszysta i bardzo jasna. Dzięki jasnemu zabarwieniu słabo rozwiniętej grzybni powietrznej wyraźnie widoczne były wytwarzane przez nią licz- ne, ciemne zarodniki. |

Zdania autorów, którzy badali zdolność szczepów gatunku Thermomyces lanuginosus do biosyntezy enzymów celulolitycznych są podzielone. Badania FER- Gus [1969b] wykazały, że szczepy tego gatunku nie były zdolne do hydrolizy papie- ru filtrowego ani karboksymetylcelulozy. TANSEY [1971] badał aktywność celuloli- tyczną grzybów termofilnych na podłożu stałym z dodatkiem sproszkowanej celu- lozy. Wyniki jego badań dowiodły, że szczepy Thermomyces lanuginosus nie wyka- zały aktywności celulolitycznej. ROSENBERG [1978] badał zdolność wzrostu szcze- pów gatunków grzybów termofilnych w obecności celulozy oraz lignocelulozy, a także stopień degradacji tych substratów przez enzymy hodowanych grzybów.

Jego badania także potwierdziły, że szczepy Thermomyces lanuginosus ani nie rosły w obecności wymienionych substratów, ani ich nie hydrolizowały. Podobne rezultaty otrzymali także HEDGER i HUDSON [1974], BIŁAJ [1979] oraz AL-FASSI i in.

[1994]. GANNS-CHAVES i in. [1989a, 1989b] uzyskali natomiast wyniki świadczące о zdolności szczepów tego gatunku do biosyntezy enzymów celulolitycznych. Do- wiedli oni, że badane przez nich szczepy termofilnego gatunku Humicola sp., wy- odrębnione z obornika, zdolne były do wzrostu na podłożach zawierających 10 różnych źródeł węgla, w tym sproszkowaną celulozę. Zdolność wzrostu w obec-

ności testowanego źródła węgla równoznaczna była, zdaniem autorów, z aktyw- nością celulolityczną badanych szczepów. Również OLUTIOLA [1982] doniósł o wyi- zolowaniu szczepu Thermomyces lanuginosus zdolnego do syntetyzowania celulazy podczas hodowli na podłożu zawierającym karboksymetylcelulozę z dodatkiem ekstraktu drożdżowego.

Wnioski

l. Szczepy termofilnego grzyba Thermomyces lanuginosus zdolne były do hy- drolizowania skrobi zawartej w podłożu stałym.

2. Najwyższą aktywnością amylolityczną charakteryzowały się szczepy wyo- drębnione z łuskanych orzechów laskowych.

3. Badane szczepy zdolne były w warunkach doświadczenia do wzrostu i roz- woju w obecności celulozy jako źródła węgla.

Literatura

ADAMS PR. 1994. Extracellular amylase activities of Rhizomucor pusillus and Humi- cola lanuginosa at initial stages of growth. Mycopathologia 128: 139—141.

AL-FASSI EA., MALIBARI A.A., MOUSTAFA M.A. 1994. Physiological studies on ten ther- mophilic and thermotolerant fungi isolated from different locations in the western region of Saudi Arabia. Arab. Gulf. Journal of Scientific Research 12(2): 321-340.

ARNESEN S., ERIKSEN S.H., OLSEN J., JENSEN B. 1998. Increased production of alpha- amylase from Thermomyces lanuginosus by the addition of Tween 80. Enzyme Microb. Technol. 23: 249-252.

BARNETT E.A., FERGUS C.L. 1971. The relation of extracellular amylase, mycelium and the time in some thermophilic and mesophilic Humicola sp. Mycopathologia et Mycologia Applicata 44(2): 131-141.

BILAJ TI. 1979. Tiermostabilnyje fiermienty gribow. Izd. Naukowa Dumka, Kijew:

216 ss.

FERGUS C.L. 1969a. The production of amylase by some thermophilic fungi. MEGI gia 61: 1171-1175.

FeRGuS C.L. 1969b. The cellulolytic activity of thermophilic fungi and actinomycetes.

Mycologia 61: 120-129.

GANNS CHAVES V.M., SILVA D.S., BRUNE W., MOREIRA M.A. 1989a. Characterization of a thermophilic and cellulolytic Humicola sp. isolated from compost. Rev. Microbiol.

20(4): 470-476.

GANNS CHAVES V.M., SILVA D.S., BRUNE W., MOREIRA M.A. 1989b. Cellulolytic activities of Humicola sp. Rev. Microbiol. 20(4): 460-465.

HAASUM I., ERIKSEN S.H., JENSEN B., OLSEN J. 1991. Growth and glucoamylase pro- duction by the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus in a synthetic me- dium. Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 656-660.

HANKIN L., ANAGNOSTAKIS S.I. 1975. The use of solid media for detection of enzyme production by fungi. Mycologia 67: 597-607.

HARRIGAN W.E, Mc CANCE MLE. 1976. Laboratory methods in food and dairy micro- biology. Academic Press, London: 431 ss.

HEDGER J.N., HUDSON H.J. 1974. Nutritional studies of Thermomyces lanuginosus from wheat straw compost. Trans. Br. Mycol. Soc. 62(1): 129-143.

Ho H.H., FOSTER B. 1972. Starch utilization by Phytophthora spp. Mycopathologia et Mycologia Applicata 46(4): 335-339.

ILNICKA-OLEJNICZAK O., HORNECKA D., SOLAK G. 1983. Selekcja i izolacja wysokowy- dajnych szczepów wytwarzających. enzymy. Cz. 1. Szybka metoda selekcji wysokowy- dajnych szczepów wytwarzających glukoamylazę. Prace Instytutów i Lab. Bad.

Przem. Spoż., T. 37: 47-59.

JENSEN B., OLSEN J. 1992. Physicochemical properties of a purified alpha-amylase from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus. Enzyme Microb. Technol.

14: 112-116.

JENSEN B., WIEBE M.G., ROBSON G.D., TRINCI A.PJ., OLSEN J. 1993. Growth kinetics of the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus. Mycol. Res. 97(6): 665-669.

KRISTJANSSON J.K. 1989. Thermophilic organisms as a source of thermostable en- zymes. Trends in Biotechnology 7(12): 349-353.

Li-DUOCHUAN, YANG-YI JUN, PENG-YOULIANG, SHEN-CHONGYAO 1998. Purification and characterization of extracellular glucoamylase from the thermophilic Thermomyces lanuginosus. Mycological Research 102(5): 568-572.

MAHESHWARI R., BHARADWAJ G., BHAT M.K. 2000. Thermophilic fungi : their physio- logy and enzynes. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64(3): 461-488.

OLUTIOLA BO. 1982. Characterization of cellulase from Humicola lanuginosa. Expe- rientia 38: 1332-1333.

ROSENBERG S.L. 1978. Cellulose and lignocellulose degradation by thermophilic and thermotolerant fungi. Mycologia 70(1): 1-13.

TANSEY MLR. 1971. Agar — diffusion assay of cellulolytic ability of thermophilic fungi.

Arch. Mikrobiol. 77: 1-11.

WASSERMAN B.P. 1984. Thermostable enzyme production. Food Technology — Febru-

ary: 78-89. 2

Słowa kluczowe: grzyby termofilne, Thermomyces lanuginosus, skrobia, celuloza Streszczenie

Materiał badawczy stanowiły szczepy termofilnego grzyba Thermomyces lan- uginosus wyizolowane z kompostu liściowego, ogrodowego, biohumusu, podłoża pieczarkowego oraz surowego ziarna kawy i łuskanych orzechów laskowych. Ba- dania aktywności amylolitycznej i celulolitycznej prowadzono w temperaturze

55°C na podłożach stałych z dodatkiem skrobi (2%) oraz celulozy (5%). Uzyska- ne wyniki dowiodły, że wyodrębnione szczepy zdolne były zarówno do hydrolizo- wania skrobi, jak i wzrostu i rozwoju w obecności celulozy jako źródła węgla.

ESTIMATION OF AMYLOLYTIC AND CELLULOLYTIC ACTIVTFY OF THE THERMOPHILIC FUNGUS Thermomyces lanuginosus (syn. Humicola lanuginosa)

Katarzyna Janda, Joachim Falkowski

Department of Food Technology and Preservation, Agricultural University, Szczecin

Key words: thermophilic fungi, Thermomyces lanuginosus, amylolytic and cel- lulolytic activity

Summary

The material to study were the strains of thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus isolated from different composts, raw coffee beans and the hazelnuts.

The activity was tested on solid media supplemented with starch (2%) and cellu- lose (5%) at the temperature of 55°C. The study proved, that isolated strains were able both to the starch hydrolysis and to the growth and development at the presence of cellulose as a carbon source.

Dr inz. Katarzyna Janda

Katedra Technologii Rolnej i Przechowalnictwa Akademia Rolnicza w Szczecinie

ul. Słowackiego 17 71-434 SZCZECIN

e-mail: przechow@agro.ar.szczecin.pl