Transport oraz metabolizm tiaminy w komórkach Saccharomyces cerevisiae

POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 28, 2001 SUPLEMENT 16 (221-228)

TRANSPORT ORAZ METABOLIZM TIAMINY W KOMÓRKACH SACCHAROMYCES CEREVISIAE

THIAMINE TRANSPORT AND METABOLISM IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE CELLS

Robert DULIŃSKI

Zakład Biochemii Analitycznej, Instytut Biologii Molekularnej UJ, Kraków

Streszczenie: Praca przedstawia wybrane aspekty transportu oraz metabolizmu tiaminy w komórkach Saccharomyces cerevisiae, podkreślając działanie w tych procesach białek, unikalnych dla tego mikro­

organizmu. Jedno z nich (produkt genu TH 16), łączy w jednej cząsteczce dwie aktywności niezbędne na kolejnych etapach syntezy tiaminy. Inny enzym, kwaśna fosfataza występująca w przestrzeni perypla- zmatycznej (produkt genu PHO3), wykazuje dodatkowo odrębną aktywność wiązania tiaminy. Pełni ona najprawdopodobniej funkcję defosforylacji fosforanów tiaminy pobranych z zewnątrz. Uwolniona w tym procesie tiamina przechodzi przez błonę komórkową przy udziale błonowego transportera, kodo­

wanego przez gen THI10.

(Postępy Biologii Komórki 2001: supl. 16: 221-228)

Słowa kluczowe: transport przez błony, przestrzeń peryplazmatyczna, fosforany tiaminy.

Summary: This review presents selected problems of thiamine transport and metabolism in Saccharo­

myces cerevisiae cells with focus on the proteins that are unique in this microorganism. The protein, encoded by THI6 gene, combines in one molecule two enzymatic activities, necessary at two steps of thiamine biosynthesis. Another enzyme, the periplasmic acid phosphatase (PHO3 gene product), exihibits the additional thiamine binding property. It probably dephosphorylates thiamine phosphate taken up from the medium. Free thiamine crosses the cell membrane via the membrane-bound transporter encoded by THI10 gene.

(Advances in Cell Biology 2001: suppl. 16: 221-228)

Key words: membrane transport, periplasmic space, thiamin phosphates.

222 R. DULIŃSK1

I. WSTĘP

Drożdże Saccharomyces cerevisiae przez wiele lat stanowiły niezwykle efektywne źródło dla izolacji tiaminy oraz wielu enzymów wykorzystujących jako kofaktor difosforan tiaminy (ThDP) [1, 3]. S.

zyskały status swoistego modelu eukariotycznego organizmu. Kulminacją ogromnego zaawansowania badań z zakresu inżynierii genetycznej, biochemii oraz biologii komórki stało się zidentyfikowanie sekwencji nukleotydowej kompletnego genomu tych drożdży, kodującej ponad 6000 genów zlokalizowanych na 16 niezależnych chromosomach [2, 26, 29].

Podobnie jak rośliny oraz wiele mikroorganizmów 5. cerevisiae są zdolne do syntezy tiaminy de novo [12]. Mogą jednak również pobierać zewnątrzkomórkową tiaminę i wykorzystywać ją do syntezy ThDP. Zjawiska aktywnego transportu wi ­ taminy B 1 cechuje imponująca wydajność, manifestująca się 200-krotnym wzrostem stężenia wewnątrzkomórkowej tiaminy w ciągu kilku minut [3]. W niniejszym ar ­ tykule przedstawiono te cechy transportu i metabolizmu w S.

które, przynajmniej w chwili obecnej, przypisać można wyłącznie temu mikroorganizmowi.

II. BIOSYNTEZA DIFOSFORANU TIAMINY

Pomimo faktu, iż ThDP stanowi jeden z kluczowych kofaktorów, znajomość wielu genetycznych aspektów biosyntezy tego związku wciąż pozostaje na nieza ­ dowalającym poziomie [25]. Zidentyfikowane do tej pory geny kodujące białka zaangażowane w tym procesie wyliczono w tabeli 1.

Tak jak w innych organizmach syntezujących tiaminę, w pierwszych fazach biosyntezy tej substancji powstają dwa prekursory: 5-(2-hydroksyetylo)-4-metylo- tiazol (HET) oraz 4-amino-5-hydroksymetylo-2-metylopirymidyna (HMP) [3, 25].

Prekursory te, ulegają następnie fosforylacji: HMP dwustopniowej, a HET jed-

nostopniowej, po czym następuje ich kondensacja z utworzeniem monofosforanu

tiaminy. Unikalną własnością

to, że aktywność enzymatyczną

odpowiedzialną za kondensację (pirofosforylaza fosforanu tiaminy, EC 2. 5. 1. 3. )

niesie łańcuch polipeptydowy, który ma jednocześnie aktywność kinazy HET (EC

2. 7. 1. 50). To dwufunkcyjne białko kodowane jest przez gen THI6 [23]. Natywny

enzym jest oktamerem zbudowanym z podjednostek o masie cząsteczkowej 60

kDa. Stwierdzono, iż 70-aminokwasowy region na końcu karboksylowym proteiny

jest niezbędny dla funkcjonowania obu aktywności i prawdopodobnie utrzymania

przez białko odpowiedniej konformacji. Ostatnie etapy syntezy ThDP, już typowe

dla większości organizmów, obejmują najpierw defosforylację fosforanu tiaminy,

a następnie wolna tiamina ulega pirofosforylacji przy udziale pirofosfokinazy tiaminy

[3, 19]. Warto jednak zaznaczyć, że ten ostatni kluczowy enzym został najlepiej

scharakteryzowany pod względem właściwości enzymatycznych właśnie w S.

­

Jest on kodowany przez gen

TRANSP0RTT1AM1NY W DROŻDŻACH 223

TABELA 1. Geny oraz białka odpowiedzialne za syntezę difosforanu tiaminy u S. cerevisiae

Gen Chromo­

som

Masa cząsteczkowa białka (KDA)/Licz- ba aminokwasów

Funkcja białka

TH 16 14 58/540 pirofosforylaza fosforanu tiaminy i kinaza hydroksyetylotiazolu,

TH180 15 36, 6/314 pirofosfokinaza tiaminy, unikalna kopia THI4 7 35/322 biosynteza prekursora tiazolowego, THI5 6 38, 6/340 biosynteza prekursora pirymidynowego THI11 10 38, 6/340 biosynteza prekursora pirymidynowego THI12 14 38, 6/340 biosynteza prekursora pirymidynowego THI13 4 38, 6/340 biosynteza prekursora pirymidynowego PHO3 2 51/450 reprymowalna przez tiamine kwaśna fosfataza,

hydroliza fosforanów tiaminy w przestrzeni periplazmatycznej

THI10/

THI7

12 66, 9/598 transporter tiaminy w błonie komórkowej

TH12/

PHO6

2 51, 8/450 aktywator transkrypcji, wiązanie z DNA!

THI3 4 68, 4/576 regulacja ekspresji genów PDC2 4 103, 9/925 regulacja ekspresji genów,

RPI1 9 46, 6/407 aktywator transkrypcji, bogaty w Asn + Ser

III. TRANSPORT TIAMINY PRZEZ BŁONĘ KOMÓRKOWĄ S. CEREVISIAE

Wymienione procesy biosyntezy wymagają znacznego zaangażowania energety ­ cznego, bowiem wyprodukowanie przez komórkę jednej cząsteczki ThDP stanowi równoważnik pięciu fosforylacji [3, 9]. W kontekście tych danych nie zaskakuje fakt, iż drożdże wykształciły niezwykle efektywny mechanizm pozyskiwania oraz sekwestracji dostępnej pozakomórkowo tiaminy. Dzięki systemowi aktywnego trans ­ portu komórki

są zdolne do akumulacji tiaminy w stę­

żeniach przekraczających 10 000 razy zewnątrzkomórkowy poziom witaminy BI.

W ciągu 30 minut dochodzi do całkowitej sekwestracji 1 mM tiaminy ze środowiska

zewnętrznego [5, 8]. Procesy transportu są stymulowane przez glukozę, natomiast

inhibitorami są jony fluorkowe oraz azotanowe. Transporter operuje w optimum

pH wynoszącym 4, 5, a wartość stałej Km wynosi 0, 18 pM 11 ]. Z obserwacji wpływu

rozlicznych analogów tiaminy wynika, iż system transportu wykazuje większą swoi ­

stość względem fragmentu pirymidynowego niż pierścienia tiazolu [7, 15, 22]. Wśród

badanych związków najlepszym inhibitorem okazał się dwusiarczek o-benzoilo-

224 R. DUL1ŃSKI

tiaminy, hamujący transport w sposób kompetycyjny, z wartością stałej inhibicji Ki wynoszącą 1, 8 nM [15]. Jego skuteczność może wynikać z wysokiej rozpu ­ szczalności w lipidowej komponencie błony komórkowej drożdży.

Pod koniec lat siedemdziesiątych w komórkach drożdży zidentyfikowano aktyw ­ ność wiązania tiaminy zlokalizowaną w błonie komórkowej [4]. Zgodność para ­ metrów wiązania; optimum pH i stałej dysocjacji, z odpowiednią charakterystyką całego układu transportu sugerowała, że białko wiążące bierze bezpośredni udział w przemieszczaniu cząsteczki tiaminy przez błonę komórkową. Hipoteza ta, została również potwierdzona przez badania m. in. przy zastosowaniu chemicznie (o-bro- moetylotiamina) oraz fotochemicznie (4-azydo-2-nitrobenzoilotiamina) reaktywnych pochodnych tiaminy [14, 15, 28]. Okazało się, iż zastosowanie powyższych pochod­

nych prowadzi do inaktywacji jednocześnie aktywności wiążącej tiaminę, zlokali ­ zowanej w błonie komórkowej oraz aktywności systemu transportu tiaminy w komórkach drożdży. Druga z wymienionych, fotoreaktywna pochodna posłużyła ponadto do wyznakowania miejsc wiążących w błonie.

Przełomem w badaniach nad transportem witaminy BI w drożdżach było ziden­

tyfikowanie w 1997 roku genu transportera tiaminy

[2,26,29]. Należy pod ­ kreślić, iż były to pierwsze prace, charakteryzujące gen kodujący białko transportujące tiaminę. Produkt genu TH110 stanowi polipeptyd o masie cząsteczkowej 66,903 Da składający się z 598 aminokwasów, który wykazuje zaskakująco wysokie po ­ dobieństwo do permeazy uracylu (30,1 % homologii) oraz permeazy alantoiny (27,9%

homologii) [2]. Sekwencja aminokwasów jednoznacznie sugeruje cechy strukturalne integralnego białka błony komórkowej. Białko Thi lOp składa się z licznych regionów transmembranowych, jakkolwiek N- oraz C-terminalne fragmenty mają charakter hydrofilowy. Jednocześnie gen nie zawiera cech strukturalnych wyróżniających pep- tyd sygnałowy. Potencjalne miejsca N-glikozylacji, Asn-X-(Ser/Thr) zidentyfikowa­

no w pozycjach aminokwasowych 39, 323 oraz 390 [2].

Okazuje się również, iż repertuar genów kodujących potencjalne transportery tiaminy nie ogranicza się tylko do sekwencji THI10. Geny YOR071c oraz YOR192c wykazują uderzające podobieństwo do THI10, aczkolwiek trudno przesądzić, czy podlegają ekspresji i są zaangażowane w transport tiaminy w komórkach drożdży.

Rezultaty wstępnych badań sugerują, iż produkty tych genów mogą stanowić zaplecze analogów transportera, wykazujących stosunkowo niskie powinowactwo dla naturalnego ligandu.

IV. BIAŁKO WIĄŻĄCE TIAMINĘ W PERYPLAZMIE 5. CEREVISIAE

W przestrzeni peryplazmatycznej 5. cerevisiae, tj. między błoną komórkową

a ścianą komórkową, występuje inne białko wiążące tiaminę, rozpuszczalna gli-

TRANSPORT TIAMINY W DROŻDŻACH 225

koproteina wyizolowana po raz pierwszy w 1978 roku [4]. Białko ma masę czą ­ steczkową 140 kDa i charakteryzuje się stałą dysocjacji kompleksu białko-ligand wynoszącą 29 nM [16,27]. Optymalne pH dla procesu interakcji z darniną oscyluje wokół wartości 5,5, oddziaływanie to jest odwracalnie hamowane w obecności 8 M mocznika.

Sondowanie analogami tiaminy oraz szereg innych badań wykluczyło możliwość, że to białko jest składnikiem transportu tiaminy do wnętrza komórki [7,14,22].

Przykładowo, pirytiamina hamuje wiązanie tiaminy tak jak i transport, ale dwu­

siarczek o-benzoilodaminy nie wykazuje podobieństwa w efektach wywieranych na zdolność wiążącą oraz układ transportu. Co więcej, mutant transportu tiaminy w komórkach S. cerevisiae (PT-R2) izolowany jako szczep oporny na pirydaminę wciąż zawiera rozpuszczalne peryplazmatyczne białko w ilościach porównywalnych do szczepu dzikiego.

W 1986 roku przedstawiono rezultaty badań, z których wynikało, iż perypla ­ zmatyczne białko wiążące darninę jest jednocześnie kwaśną fosfatazą, której synteza hamowana jest przez tiaminę w pożywce, kodowaną przez gen

[21,24].

Przemawiały za tym następujące argumenty:

zewnątrzkomórkowa tiamina prowadziła do równoległego zaniku obu aktyw ­ ności,

detekcja obu aktywności podczas niedenaturującej elektroforezy na żelu polia- krylamidowym natywnych oraz deglikozylowanych białek nastąpiła w iden­

tycznych pozycjach,

obie aktywności wykazywały niemal identyczny przyrost w trakcie procedury oczyszczania,

denaturacja cieplna prowadziła do podobnego stopnia inaktywacji w przypad­

ku obu aktywności,

mutanty defekty wne pod względem aktywności „reprymowalnej” przez tiami­

nę kwaśnej fosfatazy nie wykazywały zdolności wiążącej tiaminę [21].

Jakkolwiek spektrum pH dla aktywności wiążącej tiaminę oraz fosfatazowej wykazuje pewne różnice [17,18], można przyjąć z dużym prawdopodobieństwem, iż szczelina wiążąca witaminę BI oraz miejsce aktywne enzymu, zlokalizowane są na jednym łańcuchu polipeptydowym - kodowanym przez wspólny gen. Enzym wykazywał wielokrotnie wyższe powinowactwo do fosforanów tiaminy niż do stan­

dardowego substratu fosfataz 7 - fosforanu p-nitrofenolu [17]. Dysproporcja po ­ między wartościami stałej Km wynosiła 2-3 rzędy wielkości na korzyść monofosforanu tiaminy (TMP) oraz pirofosforanu tiaminy (TPP). Należy podkreślić, iż dwa wspomniane związki stanowią główne postaci tiaminy w środowisku na ­ turalnym.

Postawiono zatem hipotezę dotyczącą funkcji tego białka w mechanizmach trans ­ portu związków spokrewnionych z witaminą BI. Tak więc, pomimo stosunkowo

Wtti.OZBK u

^vdztutu Biotechni

' lafiiello

226 R. DULIŃSKI

niskiej specyficzności substratowej, T-rAPaza pełni prawdopodobnie funkcję w pro­

cesie hydrolizy zewnątrzkomórkowych fosforanów tiaminy, obecnych w stosunkowo niskich stężeniach oraz utylizacji komponenty tiaminowej fosforanów, które stanowią główne źródło tej witaminy w naturze [18]. Hipoteza ta została poparta za pomocą eksperymentów genetycznych. Okazuje się bowiem, iż komórki S. cerevisiae i wyciętym regionem kodującym produkt genu PH03, wykazują zredukowaną aktyw ­ ność wiązania znakowanych radioaktywnym węglem fosforanów tiaminy [17]. Nie­

wątpliwie jednak, fizjologiczna rola reprymowalnej przez tiaminę kwaśnej fosfatazy wciąż pozostaje kwestią otwartą, wymagającą ostatecznej weryfikacji.

V. REGULACJA BIOSYNTEZY ORAZ TRANSPORTU TIAMINY

Podobnie jak inne kluczowe szlaki metabolizmu, biosynteza tiaminy jest procesem ściśle regulowanym w celu zapobieżenia ewentualnym stratom energii [3,10,11,12].

Już wczesne badania sygnalizowały spadek aktywności wszystkich biosyntetycznych enzymów w komórkach, rosnących w warunkach dostępności zewnątrzkomórkowej witaminy B 1 [20]. Naturalną konsekwencją wysokiego poziomu tiaminy jest również zahamowanie wiązania oraz transportu tej substancji, co potwierdzają obserwacje kultur komórkowych, w których nieobecne są T-rAP-aza oraz związane z błoną białko transportujące. Fakt ten sugeruje, iż przynajmniej częściowo regulacja na­

stępuje na poziomie ekspresji genów. Jednak nie można wykluczyć innych me ­ chanizmów, bowiem S. cerevisiae są w stanie błyskawicznie akumulować tiaminę do poziomu wewnątrzkomórkowego sięgającego 1600 pmoli/10 7 komórek, a na­

stępnie wstrzymać proces transportu [5].

Ekspresja genu transportera TH110

komórkach S.

jest regulowana na poziomie mRNA przez pirofosforan tiaminy (TPP), podobnie jak innych genów zaangażowanych w metabolizm tiaminy [29]. Natomiast ekspresja genu PHO3, kodującego wspomnianą wcześniej reprymowalną przez tiaminę kwaśną fosfatazę (T-rAP), jest kontrolowana na poziomie transkrypcji. Zanalizowano region odpo ­ wiedzialny za transkrypcyjną aktywację genu PHO3 w odpowiedzi na tiaminę w medium [24]. Aktywująca sekwencja

została zidentyfikowana w regionie niekodującym genu PHO3 oraz THI6 w postaci dwóch kopii dla każdego z nich [2]. Okazało się jednocześnie, iż mechanizmy regulujące ekspresję THI10 są różne od tych, które sterują produkcją białek kodowanych przez inne geny

zaangażowane w metabolizm witaminy BI [3,13,19].

VI. PODSUMOWANIE

Drożdże Saccharomyces

pomimo zdolności do syntezy tiaminy

novo, dysponują możliwością aktywnego transportu tego związku ze środowiska

TRANSPORT TIAMINY W DROŻDŻACH 227

zewnątrzkomórkowego. Alternatywna droga pozyskiwania oraz sekwestracji wi ­ taminy BI jest w znacznej mierze podyktowana wysokim pułapem energetycznym procesu biosyntezy.

W przestrzeni peryplazmatycznej komórek drożdży występuje swoista kwaśna fosfataza, której funkcją jest prawdopodobnie defosforylacja fosforanów tiaminy, docierających tu ze środowiska. Natomiast wolna tiamina transportowana jest przez odrębne białko, wbudowane w błonę komórkową. Gen THI10, kodujący ten rze ­ czywisty transporter tiaminy, zidentyfikowano dopiero w ostatnich latach. Odkrycie to otworzyło nowe możliwości dla analizy regulacji genetycznej oraz wzajemnej korelacji pomiędzy procesami biosyntezy oraz transportu tiaminy w tym mikro­

organizmie.

LITERATURA

[1] BILIŃSKI CA, RUSSEL I, STEWART GG. Thiamine secretion in yeast. Can J Microbiol 1992; 38: 1156-1160.

[2] ENJO F, NOSAKA K, OGATA M. IWASH1MA A, NISHIMURA H. Isolation and charac­

terization of a thiamin transport gene, TH110, from Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 1997;272:19165-19170.

[3] HOHMANN S, MEACKOCK PA. Thiamin metabolism and thiamin diphosphate-dependent enzymes in the yeast Saccharomyces cerevisiae: genetic regulation. Bioch Biophys Acta 1998;

1385: 201-219.

[4] IWASHIMA A, NISHIMURA H. Isolation of a thiamine-binding protein from Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 1979; 577: 217-220.

[5] IWASHIMA A, NOSAKA K, NISHIMURA H, ENJO F. Thiamin transporters in yeast.

Methods Enzvmol 1997; 279: 109-117.

[6] IWASHIMA A, KAWASAKI Y, NOSAKA K, NISHIMURA H. Effect of thiamin on cordycepin sensivity in Saccharomyces cerevisiae. FEBS 1992; 311: 60-62.

[7] IWASHIMA A, KIMURA Y, KAWASAKI Y. Transport overshoot during 2-methyl-4-ami- no-5-hydroxymethylpyrimidyne uptake by Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 1990; 1028: 1620-1626.

[8] IWASHIMA A, WAKABAYASHI Y, NOSE Y. Thiamine transport mutants of Saccharomy­

ces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 1975; 413: 243-247.

[9] KAWASAKI Y, NOSAKA K, KANEKO Y, NISHIMURA H, IWASHIMA A. Regulation of thiamine biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol 1990; 172: 6145-6157.

[10] LLORENTE B, FAIRHEAD C, DUJON B. Genetic redundancy and gene fusion i n the genome of Baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae: functional characterization of a three member family involved in the thiamine biosynthetic pathway. Mol Microbiol 1999; 32: 1140-1152.

[11] MACHADO CR, PRAEKELT UM, DE OLIVEIRA RC, BARBOSA AC, BYRNE KL, MEACKOCK PA, MENCK CF. Dual role for the yeast THI4 gene in thiamine biosynthesis and DNA damage tolerance. J Mol Biol 1997; 273: 114-121.

[12] NISHIMURA H, KAWASAKI Y, KANEKO Y, NOSAKA K, IWASHIMA A. Cloning and characteristics of a positive regulatory gene, THI2(PHO6) of thiamin biosynthesis in Saccha­

romyces cerevisiae. FEBS 1992; 297: 155-158.

[13] NISHIMURA H, KAWASAKI Y, KANEKO Y, NOSAKA K, IWASHIMA A. A constitutive metabolism mutation, thi80, causing reduced thiamine pyrophosphokinase activity in Saccha­

romyces cerevisiae. J Bacteriol 1991; 173: 2716-2719.

228 R. DULINSKI

[14] NISHIMURA H, SEMPUKU K, KAWASAKI Y, NOSAKA K, IWASHIMA A. Photoaffinity labeling of thiamin-binding component in yeast plasma membrane with 4-azido-2-nitrozoben- zylthiamin. FEBS 1989; 255: 154-158.

[15] NISHIMURA H, SEMPUKU K, NOSAKA K, IWASHIMA A. Inactivation of the thiamine transport system in Saccharomyces cerevisiae with O-bromoacethylthiamine. Arch Biochem Biophys 1988; 266: 249-253.

[16] NISHIMURA H, SEMPUKU K, IWASHIMA A. Possible roles of carboxyl and histidine residues in a soluble thiamin-binding protein of Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 1981; 668: 333-338.

[17] NOSAKA K. High affinity of acid phosphatase encoded by PH03 gene in Saccharomyces cerevisiae for thiamin phosphates. Biochim Biophys Acta 1990; 1037: 147-154.

[18] NOSAKA K, KANEKO Y, NISHIMURA H, IWASHIMA A. A possible role for acid phosphatase with thiamin binding activity encoded by PH03 in yeast. FEMS Microbiol Lett 1989; 60: 55-60.

[19] NOSAKA K, KANEKO Y, NISHIMURA H, IWASHIMA A. Isolation and characterization of a thiamin pyrophosphokinase gene, TH180, from Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem

1993; 268: 17440-17447.

[20] TANAKA K, TAZUYA K, YAMADA K, KUMAOKA H. Biosynthesis of thiamin under anaerobic conditions in Saccharomyces cerevisiae. Biofactor 2000; 11: 121-122.

[21] NOSAKA K, NISHIMURA H, IWASHIMA A. Identity of soluble thiamin-binding protein with thiamin-repressible acid phosphatase in Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 1988; 967: 49-55.

[22] NOSAKA K, NISHIMURA H, IWASHIMA A. Effect of tunicamycin on thiamine transport in Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 1986; 858: 309-311.

[23] NOSAKA K, NISHIMURA H, KAWASAKI Y, TSUJIHARA T, IWASHIMA A. Isolation and characterization of the TH16 gene encoding a bifunctional thiamin phosphate pyrophos- phorylase/hydroksyethylthiazole kinaze from Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 1994;

269: 30510-30516.

[24] NOSAKA K, YAMANISHIK, NISHIMURA H, IWASHIMA A.Upstream activation element of PHO3 gene encoding for thiamine-repressible acid phosphatase in Saccharomyces cerevisiae.

FEBS 1992; 305: 244-248.

[25] PRAEKELT VM, BYRNE KL, MEACKOCK PA. Regulation of TH14(MOL1 ), a thiamine­

biosynthetic gene of Saccharomyces cerevisiae. Yeast 1994; 10; 481-490.

[26] RUML T, SILHANKOWA L. Mapping of gene controlling thiamine transport in Saccharo­

myces cerevisiae. Yeast 1996; 30: 1279-1283.

[27] SCHWE1NGRUBER ME, FLURI R, MAUNDRELL R, SCHWEINGRUBER AM, DUMER- MUTH E. Identification and characterization of thiamin repressible acid phosphatase in yeast.

J Biol Chem 1986; 261: 15877-15882.

[28] SEMPUKU K. Photoinactivation of the thiamin transport system in Saccharomyces cerevisiae with azidobenzoyl derivatives of thiamin. Biochim Biophys Acta 1988; 944: 177-184.

[29] SINGLETON CK. Identification and characterization of the thiamine transporter gene of Saccharomyces cerevisiae. Gene 1997; 199: 111-121.

Adres autora: Al. Mickiewicza 3, 31-120 Krakow e-mail: dennis@mol.uj.edu.pl