CLOSTRIDIUM DIFFICILE – ŹRÓDŁA ZAKAŻEŃ, CZYNNIKI WIRULENCJI
CLOSTRIDIUM DIFFICILE – SOURCE OF INFECTIONS, VIRULENCE FACTORS
STRESZCZENIE: Najnowsze badania wykazują wzrost częstości występowania, nawrotów oraz ciężkości przebiegu zakażeń Clostridium difficile (ang. Clostridium difficile infection – CDI). W ostatnim dziesięcioleciu w skali światowej odnotowano wyraźne zmiany w epidemiologii CDI. Obecnie coraz częściej laseczki C. difficile są uznawane za przyczynę biegunki u ludzi. Stan-dardowo CDI odnosi się do zakażeń szpitalnych, jednak infekcje o etiologii Clostridium diffici-le pojawiają się obecnie w populacji zaliczanej uprzednio do grupy niskiego ryzyka, tj. wśród osób bez czynników predysponujących do tego zakażenia. Ostatnie badania wykazały bardzo dużą zmienność genetyczną C. difficile. Ważnym źródłem tego typu zakażeń, związanym z roz-przestrzenianiem spor, mogą być pacjenci z objawami, bezobjawowi nosiciele, a także: zwie-rzęta, rośliny, woda, żywność i środowisko szpitalne. W pracy przedstawiono epidemiologię, wzrost znaczenia, źródła zakażenia oraz czynniki wirulencji C. difficile.
SŁOWA KLUCZOWE: CDI, Clostridium difficile, czynniki wirulencji, źródła zakażeń
ABSTRACT: Recent studies have shown increasing incidence, severity, and recurrence rates of Clostridium difficile infection (CDI). There has been a startling shift in the epidemiology of CDI over the last decade worldwide, and it is now increasingly recognized as a cause of diarr-hea in the community. Classically considered a hospital-acquired infection, it has now emer-ged in populations previously considered to be low-risk and lacking the traditional risk factors for C. difficile infection. Recent studies have demonstrated great genetic diversity for C. diffici-le. Symptomatic patients and asymptomatic carriers, animals, plants, water, food and hospital environmental may play an important source in these infections, apart from the role play in spore dispersal. This review focuses on the epidemiology, increasing importance, source infec-tious and virulence factors of C. difficile.
KEY WORDS: CDIs, Clostridium difficile, source infections, virulence factor
Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu M. Kopernika w Toruniu
} EUGENIA GOSPODAREK
Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu M. Kopernika w Toruniu, ul. Skłodowskiej-Curie 9, 85-094 Bydgoszcz, Tel./Fax: (52) 585 40 47, e-mail: gospodareke@cm.umk.pl Wpłynęło: 12.09.2014 Zaakceptowano: 16.10.2014 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2014051
WSTĘP
W ostatniej dekadzie stwierdzono 400% wzrost występo-wania zakażeń o etiologii Clostridium difficile (CDI), głów-nie związanych z ochroną zdrowia, w tym wśród dzieci oraz osób niehospitalizowanych pozaszpitalnych i młodych, bez czynników ryzyka. Ponadto zaobserwowano zwiększenie chorobowości, ciężkości przebiegu infekcji oraz czterokrot-ny wzrost śmiertelności [1–4]. Te zmiaczterokrot-ny są uwarunkowa-ne wieloma czynnikami. Wiążą się ze zwiększeniem zuży-cia cefalosporyn i chinolonów, wzrostem czynników ryzyka,
starzeniem się populacji, rozwojem szczepów C. difficile hi-perwirulentnych i hipersporulujących, a także doskonale-niem metod wykrywania tych bakterii i ich toksyn. Stoso-wanie antybiotyków podwyższa ryzyko kolonizacji oraz wy-twarzania toksyn od dwu do 16 razy. Antybiotyki sprzyja-ją w jelicie tworzeniu środowiska, które ułatwia C. difficile germinację, namnażanie oraz wytwarzanie toksyn. CDI jest powiązane w 35% ze szczepami o podwyższonej wirulencji, szczególnie rybotypu NAP1/BI/PCR/027 (ang. North Ame-rican PFGE type 1/restriction endonuclease analysis BI/ri-botype 027), dla uproszczenia określanego także jako PCR
rybotyp 027. Wytwarzają one około dwudziestokrotnie wię-cej toksyn A i B, co wiąże się z delecją genu regulatorowego tcdC. W Polsce po raz pierwszy szczep rybotypu NAP1/BI/ PCR/027 wyizolowano w 2008 roku [5]. Stwierdza się tak-że nowe rybotypy C. difficile, np. NAP7 i NAP8, a ich rola w zakażeniach u ludzi nie jest jeszcze w pełni wyjaśniona. W 2008 roku w wieloośrodkowych badaniach europejskich współczynnik występowania CDI oceniono na 4,1/10 000 osobodni na szpital i wyróżniono 65 rybotypów [6]. Bakte-rie te rzadko mogą wywoływać zakażenia poza przewodem pokarmowym [7]. Infekcje o etiologii C. difficile są naby-wane przez transmisję przetrwalników tej bakterii od osób i zwierząt zakażonych lub skolonizowanych oraz w wyni-ku kontaktu z powierzchnią zanieczyszczoną przetrwalni-kami [8]. Przetrwalniki C. difficile są oporne na kwas żo-łądkowy, natomiast w jelicie cienkim kiełkują do form we-getatywnych, które wytwarzają egzotoksyny A i B, a około 10% szczepów toksynę binarną – transferazę (ang. C.
diffi-cile transferases – CDT). Kiełkowaniu przetrwalników
prze-ciwdziała naturalny mikrobiom jelitowy [8]. Do CDI do-chodzi w wyniku zaburzenia naturalnej mikrobioty jelito-wej oraz rozwoju własnych, kolonizujących lub nowo naby-tych przetrwalników C. difficile [9].
EPIDEMIOLOGIA CDI
W Stanach Zjednoczonych co roku odnotowuje sie 700 000 nowych przypadków CDI. Pobyt w szpitalu cho-rych z infekcją Clostridium difficile, jako wtórną diagnozą, w porównaniu z pacjentami hospitalizowanymi bez CDI jest trzykrotnie dłuższy; u tych osób koszty hospitalizacji są 3,5 raza wyższe, a prawdopodobieństwo zgonu – sze-ściokrotnie większe. Dane z 28 szpitali w Stanach Zjedno-czonych wskazują, że C. difficile zastępuje szczepy
Staphy-lococcus aureus oporne na metycylinę, najczęściej
dotych-czas wywołujące zakażenia związane z opieką zdrowotną, zajmując trzecie miejsce po infekcjach układu moczowego związanych ze stosowaniem cewnika i zakażeniach miej-sca operowanego [10]. W Stanach Zjednoczonych wskaź-niki hospitalizacji z powodu CDI na 1000 pacjentów wypi-sanych ze szpitali wzrosły z 5,6 w 2001 roku do 11,5 w 2010 roku [11]. Raporty United States National Vital Records wykazały, że w latach 1999–2008 liczba zgonów z powo-du zapalenia jelit o etiologii C. difficile (jako podstawowej przyczyny) wzrosła z 793 do 7483, głównie u osób powyżej 65. roku życia [12].
Dane dotyczące nabycia CDI związanego z ochro-ną zdrowia, uzyskane w 2005 roku z 38 szpitali 14 euro-pejskich krajów, wskazały na wzrost śmiertelności spowo-dowany tym zakażeniem – z 2,8 do 29,8% [13]. Nawro-ty infekcji o etiologii C. difficile wynosiły od 1% (Francja) do 36% (Irlandia).
W badaniu ECDIS-Net (ang. European Clostridium
diffi-cile Infection Surveillance Network), przeprowadzonym
w la-tach 2008–2009, zebrano dane ze 106 laboratoriów 34 eu-ropejskich krajów [14]. Zidentyfikowano 65 różnych rybo-typów C. difficile, wśród których najczęściej występującymi były: 014/020 (16%), 001 (9%), 078 (8%). Rybotyp PCR 027 nadal wywołuje zakażenia w szpitalach europejskich i stano-wi 5% wśród wszystkich rybotypów. Zi stano-wiązek infekcji C.
dif-ficile ze zgonem chorego odnotowano w 40% przypadków
i najczęściej korelowało to z wiekiem powyżej 65. roku życia i zakażeniem szczepem należącym do rybotypu 018 lub 056, które istotnie wpływały na komplikacje w przebiegu choroby.
Punktowe badanie dotyczące diagnostyki zakażeń
C. dif-ficile EUCLID (ang. European Multicentre Prospective
Bian-nual Point Prevalence Study of Clostridium difficile Infection in Hospitalized Patients With Diarrhea), w którym wzięły udział 482 szpitalne laboratoria z dwudziestu krajów Euro-py, wykazało znaczne zróżnicowanie schematów diagno-stycznych [15]. Tylko 27,5% laboratoriów stosuje zoptyma-lizowane metody do diagnostyki zakażeń C. difficile. Fałszy-wie dodatnie wyniki stFałszy-wierdzono w 5% przypadków, a fał-szywie ujemne – w 2,3%. Odsetki te nie są wysokie, jednak niewłaściwe rozpoznanie dotyczyło 166 chorych. W bada-niu wykazano również, że w ciągu jednego dnia aż w przy-padku 82 pacjentów nie badano próbki w kierunku C.
diffi-cile z powodu braku podejrzenia klinicznego zakażenia tym
drobnoustrojem. Niewłaściwe rozpoznanie, które potencjal-nie dotyczy około 23% pacjentów, może prowadzić do potencjal-nie- do nie-właściwego leczenia i stosowania niewystarczających pro-cedur kontroli zakażeń, dlatego konieczne jest wprowadze-nie jednolitych schematów postępowania w zakresie zleca-nia badań i diagnostyki w kierunku C. difficile.
Współcześnie coraz częściej odnotowywane są przypad-ki CDI nabyte poza szpitalem oraz u dzieci i kobiet po poło-gu (wcześniej uważanych za populacje o niskim ryzyku wy-stąpienia zakażenia) [16–18]. Raporty z Ameryki Północnej i Europy wskazują, że infekcje C. difficile nabyte poza szpi-talem stanowią 20–27% przypadków i występują z częstotli-wością 20–30 na 100 000 mieszkańców [19]. Prawie 40% tej populacji wymaga hospitalizacji [16].
CZŁOWIEK JAKO ŹRÓDŁO CLOSTRIDIUM
DIFFICILE
Przewód pokarmowy jest złożonym ekosystemem eks-ponowanym na stały przepływ drobnoustrojów, z których liczne nie osiedlają się lub nie wywołują choroby. Ta po-pulacja charakteryzuje się ogromną różnorodnością ge-netyczną. Przewód pokarmowy jest zasiedlony i kolonizo-wany przez ponad 100 trylionów mikroorganizmów, zna-nych jako mikrobiom jelitowy [20]. Reguluje on odporność i metabolizm gospodarza oraz uniemożliwia kolonizację
C. difficile. Kolonizacja przewodu pokarmowego laseczkami C. difficile u zdrowych ludzi wynosi od 1 do 15%,
a u noworod-ków może sięgać aż 80% [21, 22]. Notowany wzrost CDI u dzie-ci nie wiąże się ze zwiększeniem u dzie-ciężkośu dzie-ci przebiegu choroby. Pomimo wyższego odsetka nosicielstwa tej bakterii, u nowo-rodków rzadko rozwija się zakażenie. Hiperwirulentne szcze-py są odpowiedzialne za 20% CDI u dzieci, natomiast u doro-słych za ponad 50%. Bezobjawowa kolonizacja C. difficile jest powszechna u małych dzieci (najczęściej w pierwszym tygo-dniu życia). Nosicielstwo wynosi od 1 do 84% u zdrowych no-worodków i dzieci, ale do 8. roku życia spada do mniej niż 5%. Wytwarzanie toksyn jest większe u dzieci ze stałą kolonizacją
C. difficile niż z kolonizacją przejściową (67% vs. 25%).
Dzie-ci karmione wyłącznie mlekiem matki są rzadziej kolonizowa-ne C. difficile niż te, które otrzymują preparaty do karmienia niemowląt (16% vs. 62%), co wynika z zanieczyszczenia tych produktów przetrwalnikami. Wrażliwość dzieci na kolonizację tą bakterią wiąże się z niedojrzałością jelit i brakiem ochronnej mikrobioty jelitowej. Mechanizmy oporności na CDI są powią-zane z przeciwciałami w mleku matki, które hamują wiązanie toksyny A z receptorami jelitowymi oraz z brakiem receptorów jelitowych u noworodków, które wiążą tę toksynę [6]. Źródłem transmisji C. difficile są inne dzieci i zanieczyszczone środo-wisko, natomiast matki rzadko są źródłem zakażenia. Bezob-jawowo skolonizowane dzieci stanowią potencjalny rezerwu-ar transmisji C. difficile na członków rodziny lub inne osoby. Brak receptorów dla toksyn wyjaśnia bezobjawową koloniza-cję w pierwszym roku życia. Oporność na CDI u dzieci wiąże się z różnicami w budowie śluzu jelitowego, który chroni przed wiązaniem toksyn lub brakiem naboru i aktywacji neutrofili przez niedojrzały układ immunologiczny [23].
Kolonizacja zdrowych niehospitalizowanych dorosłych nie jest powszechna, a kolonizacja chorych hospitalizowa-nych wynosi od 25 do 50% [24].
CLOSTRIDIUM DIFFICILE – CZYNNIKI
WIRULENCJI
Do rozwoju CDI usposabiają następujące czynniki: eks-pozycja na przetrwalniki C. difficile, zaburzenie naturalnej
mikrobioty jelitowej i upośledzenie mechanizmów obron-nych potrzebobron-nych do skutecznej prewencji przed ostrą cho-robą i nawrotem. Tylko ekspozycja na C. difficile jest ko-nieczna do rozwoju zakażenia, a pozostałe z powyższych trzech czynników nie są wystarczające [23]. Laseczki
C. dif-ficile wykazują szereg właściwości przystosowawczych
do rozwoju zakażeń, które przedstawiono w Tabeli 1.
WYTWARZANIE TOKSYN
Głównymi czynnikami wirulencji powiązanymi z CDI są dwie toksyny – A i B – o dużym ciężarze molekularnym, które wykazują odpowiednio aktywność enterotoksyny i cy-totoksyny (Tabela 2) [25–34]. Początkowo sądzono, że tok-syna A jest najważniejsza w rozwoju zakażenia, ale ostatnie dane wskazują, że toksyna B może być bardziej istotna, po-nieważ szczepy, które nie wytwarzają toksyny A, a wytwa-rzają toksynę B, powodują znacząco cięższy przebieg oraz sprzyjają nawrotom choroby [23]. Obydwie toksyny są in-ternalizowane w komórkach nabłonka jelit i wywołują śmierć komórek, a następnie zapalenie. Są kodowane w re-gionie genomu zwanym locus patogenności (ang. pathoge-nicity locus – PaLoc). Region ten zawiera 5 genów (cdA, tcdB, tcdC, tcdR, Tode), które są odpowiedzialne za regula-cję i syntezę toksyny A (TcdA) i B (TcdB). Dwa dodatkowe geny (cdtA i cdtB), które nie są częścią PaLoc, kodują wy-twarzanie toksyny binarnej. Szczepy C. difficile nietoksyno-twórcze nie mają genów loci PaLoc.
Wystąpienie objawów zakażenia wywołanego szczepami niewytwarzającymi toksyny A i wytwarzającymi B sugeruje, że szczepy C. difficile wykazujące toksyczne synergistyczne interakcje nie zawsze są konieczne do zaostrzenia objawów chorobowych [26]. Szczepy C. difficile wytwarzające toksynę B wywołują infekcje o cięższym przebiegu niż szczepy pro-dukujące tylko toksynę A.
W 2003 roku w Stanach Zjednoczonych i Kanadzie wy-stąpiło kilka ognisk CDI wywołanych rybotypem NAP1/BI/ PCR/027. Następnie szczepy te izolowano z przypadków za-każeń w Europie (Anglia, Belgia, Holandia, Francja, Niem-cy, Irlandia, Austria, Islandia, Polska, Szkocja, Luksemburg, Szwajcaria, Dania i Finlandia), Azji, Afryce i na Bliskim
Struktury zewnątrzkomórkowe Aktywność biochemiczna
Rzęski: t XJǗLT[PǴǎT[D[FQØX t QS[FNJFT[D[BOJFXQS[FXPE[JFQPLBSNPXZN Fimbrie: t VE[JBXBEIF[KJ t SP[QP[OBXBOJFSFDFQUPSØXQPMJTBDIBSZEPXZDI w komórce gospodarza Otoczka: t PDISPOBQS[FEXZTZDIBOJFN GBHPDZUP[nj t VE[JBXBEIF[KJ t CBSJFSBEMBBOUZCJPUZLØXJQS[FDJXDJB
Zewnętrzna warstwa komórkowa = „kometa z ogonem”
Wysoka
Enzymy hydrolityczne Wykorzystywanie sacharozy Wytwarzanie p-krezolu:
toksyczny dla innych gatunków bakterii (dysbakterioza)
Tabela 1. Czynniki przystosowawcze
Czynniki wirulencji
Charakterystyka Czynniki
wirulencji
Charakterystyka
Toksyna A Największe białko prokariotyczne (380 kDa) Największa egzotoksyna
Działa letalnie, cytotoksycznie, cytotonicznie Enterotoksyna
Chemoatraktant dla neutrofilii (musi być internalizowana dla wywołania efektu) Wywołuje: t JOUFOTZXOnjPEQPXJFEȇ[BQBMOnj t TUZNVMVKFNBLSPGBHJJNPOPDZUZEPVXBMOJBOJB*-C t XǴSØEMFVLPDZUØXXJFMPKnjES[BTUZDInadherencji, pL- selektyny, pBLUZXOPǴDJPLTZEBUZXOFK t IFNBHMVUZOBDKǗ t EZTGVOLDKǗNJUPDIPOESJØX t TFLSFDKǗQZOVLSXJTUFHPXKFMJUBDI t NBSUXJDǗOBCPOLBKFMJUPXFHP t CJFHVOLǗ
Indukuje zmianę kształtu przyległych leukocytów wielojądrza-stych ze sferycznego lub piramidalnego do cienkiego i ciągliwego t SFBSBOȈBDKBBLUZOZ'DZUPT[LJFMFUVXBHSFHBUZ 8JnjȈFTJǗ[TFLXFODKnj(BMB 1⁄3 zakończenia: t XJnjȈFLPNØSLJHPTQPEBS[BoSFDFQUPSUSØKTBDIBSZE t QPXUØS[POZDIQFQUZEØXoOJFUPLTZD[OF BMFXZNBHBOF
dla efektu toksycznego 1⁄3 N-zakończenia: t EPNFOBUPLTZOZ t JOBLUZXVKFCJBLP3IPQS[F[NPOPHMJLP[ZMBDKǗ t CJBLP3IPJOEVLVKFQPMJNFSZ[BDKǗBLUZOZ t 1B-PD 5DE"oVUSBUBGVOLDKJCBSJFSZDZUPUPLTZD[OPǴDJ EPDFMPXFK3IP(51B[Z t XBSJBOU5DE#$JOBLUZXVKF3IP 3BD $ED 3BQ 3BM 33BT t vUZQ4wJOBLUZXVKF3IPJ33BT
Wszystkie fragmenty, które konkurują z holotoksyną A indukują endocytozę
1-15 mg/ml:
t EFTUSVLDKBLPTNLØX
tn aktywności metyloperoksydazy w świetle jelita
Toksyna B 63% homologii aminokwasów z toksyną A t EVQMJLBDKBHFOØX
Brak enterotoksyczności in vivo (270 kDa)
W niewielkich ilościach działa letalnie, cytotoksycznie: t VT[LBE[BNJLSPöMBNFOUZo[BPLSnjHMBOJFLPNØSFL t DZUPUPLTZD[OPǴǎin vitro_¨ OJȈUPLTZOZ" Stabilna w temperaturze 37°C, pH 5,5
Podana parenteralne wywołuje śmierć wielu gatunków zwierząt Nie wpływa na migrację leukocytów
Podobna budowa antygenowa do letalnej toksyny Clostridium
sordellii
Działa tylko przy uszkodzeniu śluzówki
Jest inhibitorem inkorporacji prekursorów mikrocząsteczkowych Zaburza procesy syntezy RNA, DNA i białek (w tym aktyny) Jej działanie powiązane jest z Ca++ i prostaglandynami Domena N-terminalna
t XZTPDFLPOTFSXBUZXOBBLUZXOPǴǎKBLUPLTZOZ" Domena C-terminala:
t NPȈFSP[QP[OBXBǎSØȈOFSFDFQUPSZ t [BXJFSBQPXUBS[BKnjDFTJǗTFLXFODKF
Specyficzny inhibitor rodziny białek Rho (Rho A/B/C, Rac J̓$EDXJnjȈnjDZDI(51
t JOEVLVKFBQPQUP[Ǘ
t [BQPCJFHBGBHPDZUP[JFLPNØSLJBQPQUZD[OFK t IBNVKFHSPNBE[FOJFBLUZOZ'GPTGPUZSP[ZOZ
Stymuluje w wieloraki sposób apoptozę komórek gospodarza t LBTQB[P[BMFȈOnjJLBTQB[POJF[BMFȈOnj
NHNMJOBLUZXVKFoCJBFLFOEPUFMJBMOZDI 3IPoNJOVU
Hamuje wykorzystanie glukozy
Czynniki wirulencji Charakterystyka
Toksyna A+B Działanie synergistyczne: t 1B-PD 5DE#oJOUFSBLDKFTZOFSHJTUZD[OF[UPLTZOnj" t UPLTZOB"VT[LBE[BLPNØSLJǴMV[ØXLJ DPTQS[ZKBNBLTZNBMOFNVVT[LBE[BOJVUPLTZOZ̓# t VT[LPE[FOJFLPTNLØXKFMJUPXZDIo t [NJBOBQS[FQVT[D[BMOPǴDJFOUFSPDZUØX t TUZNVMBDKBXZUXBS[BOJB5/'Ⱥ 8BSJBOUUPLTZOZ"o# "LUZXOPǴǎLBSEJPUPLTZD[OBoOJFXZEPMOPǴǎXJFMVOBS[njEØX Toksyna binarna, C. difficile
transfera-za (CDT) (1988)
Występuje u ~10% szczepów i wśród szczepów hiperepidemicznych Aktyno-swoista ADP-rybozylotransferaza
Zawiera dwa niepowiązane łańcuchy białkowe:
t FO[ZNBUZD[OZ$%5B L%B LPEPXBOZQS[F[HFOcdt" t XJnjȈnjDZ$%5C L%B LPEPXBOZQS[F[HFOcdtB Przenosi fragmenty rybozylo-ADP na aktynę G
nadherencję i kolonizację Szczepy oporne na fluorochinolony Białka adhezyjne
Flagelina FLiC, FLiD S-layer P36 i P47 Cw66 Proteaza Cwp84 Gen slpA: t LPEVKFBEIFSFODKǗQPXJFS[DIOJLPNØSFL t TUZNVMVKF[BQBMFOJF
Kowalencyjne przyczepienie do peptydoglikanu
Frakcja C Wywołuje sekrecję płynu jasnego w jelitach Czynnik mioelektryczny Wywołuje zmiany aktywności motorycznej jelit Pochodna fenolu (p-krezol) i lotne
kwasy tłuszczowe
0EE[JBZXBOJF[SØȈOZNJHBUVOLBNJCBLUFSJJKFMJUPXZDI
Sporulacja Wolne przetrwalniki pokrywają białka, które indukują zapalenie (peroksyredoksyny-1 i chitynaza)
Wschodzie. Badania dowiodły, że szczep 027 wytwarza tok-syny A i B szybciej oraz w większych ilościach (hiperpro-dukcja). 027 jest także zdolny do produkowania toksyny ry-bozylującej aktynę-ADP, zwanej toksyną binarną (CDT). Przyczynia się ona do wywoływania CDI poprzez aktyw-ność cytotoksyczną (włączając tworzenie cienkich mikro-tubul na zewnętrznej powierzchni komórek nabłonkowych) oraz podwyższa adherencję laseczek do powierzchni komó-rek jelita [35]. Szczepy rybotypu NAP1/BI/PCR/027 wyka-zują wyższe tempo germinacji w porównaniu z innymi wi-rulentnymi rybotypami i są oporne na fluorochinolony (le-wofloksacynę i moksifloksacynę). Obecnie stanowią ponad 35% wszystkich szczepów C. difficile izolowanych z zaka-żeń [36, 37]. Niektóre inne rybotypy są powiązane z epide-miami, włączając rybotypy: 053, 106, 078 i 017. Warto odno-tować, że 078 wywołuje zakażenia u osób młodych i w zbio-rowiskach ludzi, a także jest czynnikiem etiologicznym in-fekcji u świń [37]. Ciężkość przebiegu i nawrotowość CDI zależy od zdolności niektórych szczepów do szybkiej ger-minacji, np. szczepy rybotypu NAP1/BI/PCR/027. Tempo nawrotu wynosi 10–35% u chorych z zakażeniem C.
diffi-cile [38, 39]. Zakłada się, że nawrót występuje w przypadku
szczepów eksponowanych na selektywne czynniki, np. anty-biotyki lub związki myjąco-dezynfekujące o działaniu bak-teriobójczym [40, 41]. Badanie zewnętrznej powierzchni przetrwalników C. difficile wykazało obecność pięciu białek. Jedno z nich, CotE, jest dwufunkcyjnym białkiem o aktyw-ności peroksyredoksyny. Peroksyredoksyna 1 jest wydziela-na przez komórki nowotworowe oraz indukuje wytwarnie cytokin zapalnych przez makrofagi, które sprzyjają za-paleniu. Podczas germinacji chitynaza jest źródłem substan-cji odżywczych dla rozwoju laseczek i może przyczyniać się do wystąpienia objawów zapalenia żołądkowo-jelitowego, które towarzyszą zakażeniu C. difficile [42].
Chociaż wiedza na temat wirulencji C. difficile wiąże się z rozszyfrowaniem komponentów genetycznych PaLoc i ich toksynotwórczych wariantów, inne czynniki – takie jak ad-herencja i ruchliwość – są udokumentowane i wymaga-ją w przyszłości badania biologii tego znaczącego patogenu w ochronie zdrowia.
ODPOWIEDŹ IMMUNOLOGICZNA
Adaptacyjna odpowiedź immunologiczna na toksyny A i B wpływa na rozwój CDI. Ochrona przez zapewnienie wydłużonej kolonizacji częściowo jest powiązana ze wzro-stem stężenia przeciwciał przeciw toksynom C. difficile, co skutkuje spadkiem ciężkości i nawrotów infekcji. Oko-ło 60% dzieci i dorosłych posiada przeciwciała przeciw tok-synom C. difficile w surowicy, nawet przy braku koloniza-cji lub zakażenia. Prawdopodobnie wytwarzanie przeciwciał jest stymulowane w okresie niemowlęctwa lub w wyniku ekspozycji na C. difficile lub inne gatunki Clostridium spp.
zawierające krzyżowo aktywne antygeny. Chorzy z ciężką postacią CDI wykazują silną odpowiedź humoralną przeciw toksynie A [43, 44]. U zdrowych dorosłych sprawnie funk-cjonujący układ immunologiczny wraz z wytwarzaniem przeciwciał przeciw toksynie A i prawidłową (niezmienio-ną) fizjologiczną mikrobiotą jelitową chroni przed koloni-zacją oraz rozwojem zakażenia. Przeciwciała IgG występują częściej u bezobjawowych nosicieli niż u chorych z aktywną chorobą. Przypuszcza się, że u osób, które są wcześnie sko-lonizowane, najprawdopodobniej rozwija się pamięć immu-nologiczna, która działa ochronnie w okresie dojrzałości, ale obniża się w 6. lub 7. dekadzie życia [25].
ZAKAŻENIA CLOSTRIDIUM DIFFICILE
– PATOFIZJOLOGIA
Rozprzestrzenianie się C. difficile następuje zwykle za po-mocą przetrwalników, natomiast komórki wegetatywne są wrażliwe na tlen. Do transmisji tych laseczek dochodzi drogą powietrzną (aerozol) lub fekalno-oralną (brak higie-ny). Po dostaniu się przetrwalników do organizmu człowieka właściwości C. difficile sprzyjają ich przeżyciu w warunkach żołądka, a kwasy żółciowe indukują germinację.
C. difficile są bakteriami nieinwazyjnymi, choć
rzad-ko mogą wywoływać inwazję tkanek jelita, głównie u dzie-ci z chorobą nowotworową oraz z niewydolnym układem odpornościowym. Rozwój CDI wymaga zmiany naturalnej mikrobioty jelit oraz odporności śluzówki, nabycia i kiełko-wania przetrwalników, namnażania C. difficile i wytwarza-nia toksyn, szczególnie A (enterotoksyna, cytotoksyna, two-rzenie pseudobłon) i B (cytotoksyna). Spadek stężenia anty-biotyku w organizmie sprzyja szybkiemu wzrostowi C.
diffi-cile w niszach wolnych od drobnoustrojów. Komórki
wege-tatywne wytwarzają toksyny, które uszkadzają śluzówkę je-lita. Dochodzi do gromadzenia włóknika i mucyny. W wy-niku działania czynników powiązanych z komórką oraz pozakomórkowych następuje śmierć komórek gospoda-rza, a na powierzchni jelita tworzona jest żółtawa warstwa (pseudobłony), która oddziela zmiany chorobowe.
CLOSTRIDIUM DIFFICILE – SZPITALNE
I POZASZPITALNE ŹRÓDŁA ZAKAŻEŃ
Laseczki C. difficile występują powszechnie w środowisku naturalnym i szpitalnym. Źródła zakażeń są upatrywane:
t wśród bezobjawowych nosicieli (5–10%);
t w środowisku szpitalnym (do 25% pacjentów; 15–25% chorych osłabionych; 15–25% dorosłych hospitalizowanych leczonych antybiotykami, włą-czając profilaktykę okołooperacyjną; 17–83% pa-cjentów z biegunką (na skórze); do 50% niemowląt i dzieci);
t pośród różnych gatunków zwierząt (15-dniowe pro-sięta – 76%; świnie – 26%; psy i koty – do 35%; owce australijskie – 4%, w tym: młode owce – 7%, doro-słe – 1%);
t w glebie, wodzie, osadzie morskim (głównie prze-trwalniki);
t w żywności (wołowina – 8,3%, wieprzowina – 4,2%, warzywa) [1, 4, 21, 24, 25, 45].
C. difficile to bakteria przystosowana do życia
w warun-kach środowiska szpitalnego, a pacjenci hospitalizowani w salach zanieczyszczonych tym drobnoustrojem są naraże-ni na zakażesą naraże-nie. Każda powierzchsą naraże-nia, która styka się z wy-dalinami chorego na CDI, może łatwo ulec zanieczyszcze-niu. Kontaminacja środowiska szpitalnego jest kluczowym elementem w łańcuchu transmisji C. difficile, a kontrola za-każeń jest trudna ze względu na sposób rozprzestrzeniania się bakterii (przetrwalniki, droga powietrzna oraz kontakto-wa). Przetrwalniki C. difficile na powierzchniach nieożywio-nych zachowują żywotność przez 5–6 miesięcy. Są oporne na detergenty i środki zawierające alkohol stosowane do hi-gieny rąk. W czasie endemii powierzchnie w środowisku szpitalnym (podłogi, toalety, łóżka szpitalne, szafki pacjen-tów, parapety, pościel, przyciski do przywoływania, ciśnie-niomierze, termometry elektroniczne, stetoskopy i inne) ulegają zanieczyszczeniu w 9–48%. W okresie występowa-nia biegunki na skórze 60% pacjentów stwierdza się
C. dif-ficile, a jego wydalanie – u 37% chorych. Obecność
toksy-notwórczych szczepów, poza obszarem przebywania cho-rych, wykrywa się w 23% próbek dodatnich; w 21% próbek pobranych z pokoi lekarzy, w 10% – z miejsc pracy pielę-gniarek oraz w 21% – z powierzchni przenośnych (aparatu-ra, sprzęt, wózki na leki, skanery kodów kreskowych na wo-zach leków). W niezamkniętej toalecie C. difficile jest obec-ny w aerozolu do 25 cm nad powierzchnią lustra wody; naj-więcej tuż po spłukaniu, a ośmiokrotny spadek liczby drob-noustrojów następuje po 60 minutach.
Szpitale i domy opieki są ważnym rezerwuarem C.
diffici-le. Transmisja tych bakterii w jednostkach ochrony zdrowia
zachodzi poprzez ręce personelu lub przez zanieczyszczenie środowiska szpitalnego przetrwalnikami laseczek. Bakterie mogą być nabywane bezpośrednio ze środowiska, od pra-cowników ochrony zdrowia lub z kału osób zakażonych albo skolonizowanych drogą fekalno-oralną [46].
Naturalne miejsce występowania C. difficile nie jest ograniczone do przewodu pokarmowego ludzi. Dotych-czas obecność tej bakterii wykazano u zwierząt gospodar-skich, domowych i dziko żyjących (zarówno jako komen-sali, jak i patogenów) oraz w żywności (świeże warzywa, mięso, owoce morza) [47–50]. Różnorodność genetycz-na szczepów C. difficile, podobieństwo szczepów tych bak-terii izolowanych od zwierząt i z żywności oraz brak kla-sycznych czynników ryzyka wśród ogromnej populacji po-zaszpitalnie nabywającej CDI utwierdzają w przekonaniu
o przenoszeniu tych drobnoustrojów w środowisku pozasz-pitalnym przez żywność i o pochodzeniu odzwierzęcym. Liczni autorzy izolowali C. difficile z drobiu, kurcząt, owiec, świń, kóz i bydła, a badacze niemieccy wykazali, że rybotyp 078 – powszechny wśród świń i cieląt – jest także drugim pod względem częstości wywołującym zakażenia u ludzi, szczególnie w populacji pozaszpitalnej [51–55]. Kanadyjscy naukowcy udokumentowali, że koty są nosicielami toksyno-twórczych szczepów C. difficile (włączając hiperwirulentny rybotyp 027) [53]. Najczęściej z żywności i ze zwierząt izolo-wane są szczepy NAP1, w dalszej kolejności NAP7 i NAP8, które stanowią mniej niż 7% wśród pacjentów z pozaszpital-nie nabytym CDI [45].
Wykazano, że przetrwalniki C. difficile przeżywają tem-peraturę 71°C zalecaną do gotowania mięsa mielonego. Stwierdzono obecność szczepów tej bakterii w żywności detalicznej (włączając mięso wołowe, bawole, wieprzowe i drobiowe) oraz wykryto podobieństwo między szczepami izolowanymi z żywności pochodzenia zwierzęcego i wywo-łującymi CDI u ludzi. Ponadto drobnoustroje te izolowano z mielonej wołowiny, mielonej cielęciny i przetworzonego mięsa tureckiego przeznaczonego dla psów i kotów [56, 57].
Przypuszczalnie transmisja C. difficile od zwierząt to-warzyszących człowiekowi może być bardziej powszechna niż wcześniej sądzono. Weese i wsp. wykazali, że 10% psów i 21% kotów było skolonizowanych rybotypem 001, patoge-nem pospolitym wśród ludzi [57]. Wyosobnienie od zwie-rząt domowych C. difficile jest niepokojące z punktu widze-nia możliwej transmisji odzwierzęcej.
PODSUMOWANIE
Clostridium difficile to beztlenowe Gram-dodatnie
la-seczki, które mogą przeżyć w formie przetrwalników w śro-dowisku przez wiele miesięcy w obecności wysokiej tempe-ratury, kwasów, antybiotyków i większości dezynfektantów.
Ewolucja szczepów C. difficile w kierunku zwiększenia wirulencji i możliwości rozprzestrzeniania się w środowisku oraz oporności na antybiotyki stwarza realne zagrożenie ko-lejnymi epidemiami oraz ryzyko wzrostu ciężkości przebie-gu i nawrotów CDI, a także śmiertelności chorych. Podjęte w ostatnich latach w Europie inicjatywy, m.in. ECDIS-Net i EUCLID, w których uczestniczy także Polska, mają na celu poszerzenie wiedzy na temat epidemiologii zakażeń C.
dif-ficile w Europie, wypracowanie standardów postępowania
w zakresie szybkiej i wiarygodnej diagnostyki oraz nowych strategii leczenia i profilaktyki zakażeń (stosowanie szcze-pionek, immunoterapii). Priorytetem jest wczesna diagnoza CDI, która pozwala na wdrożenie odpowiedniego leczenia i działań zapobiegających rozprzestrzenianiu się szczepów w środowisku szpitalnym i pozaszpitalnym. W tym zakre-sie konieczne jest także interdyscyplinarne podejście oparte
na współpracy klinicystów, mikrobiologów i epidemiolo-gów. W świetle ostatnich badań nad rezerwuarami C.
diffi-cile niezbędna jest również współpraca mikrobiologów
róż-nych specjalności – medyczróż-nych, weterynaryjróż-nych, żywno-ści oraz środowiskowych.
KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.
PIŚMIENNICTWO
1. Freeman J, Bauer MP, Baines SD et al. The changing epidemiology of
Clostri-dium difficile infections. Clin Microbiol Rev 2010;23(3):529– 549.
2. Kuijper EJ, Barbut F, Brazier JS et al. Update of Clostridium difficile infection due to PCR ribotype 027 in Europe. Euro Surveill 2008;13(31).
3. Mullane K. Fidaxomicin in Clostridium difficile infection: latest evidence and clinical guidance. Ther Adv Chronic Dis 2014;5(2):69– 84.
4. Warrack S, Duster M, Van Hoof S, Schmitz M, Safdar N. Clostridium difficile in a children’s hospital: assessment of environmental contamination. Am J In-fection Control 2014;42(7):802– 804.
5. Pituch H, Bakker D, Kuijper E et al. First isolation of Clostridium difficile PCR-ri-botype 027/toxinotype III in Poland. Pol J Microbiol 2008;57(3):267– 268. 6. Shim JO. Clostridium difficile in children: to treat or not to treat? Pediatr
Ga-stroenterol Hepatol Nutr 2014;17(2):80– 84.
7. Deptuła A, Kruszyńska E, Mikucka A et al. Toxin A-producing Clostridium
dif-ficile as an aetiological factor of post-traumatic wound infection. J Med
Mi-crobiol 2009;58(7):963– 964.
8. Shaughnessy MK, Micielli RL, DePestel DD et al. Evaluation of hospital room assignment and acquisition of Clostridium difficile infection. Infect Control Hosp Epidemiol 2011;32(3):201– 216.
9. Hensgens MP, Goorhuis A, Dekkers OM, Kuijper EJ. Time interval of increased risk for Clostridium difficile infection after exposure to antibiotics. J Antimi-crob Chemother 2012;67(3):742– 748.
10. Miller BA, Chen LF, Sexton DJ, Anderson DJ. Comparison of the burdens of hospital-onset, healthcare facility-associated Clostridium difficile infec-tion and of healthcare-associated infecinfec-tion due to methicillin-resistant
Sta-phylococcus aureus in community hospitals. Infect Control Hosp Epidemiol
2011;32(4):387– 390.
11. Steiner C, Barrett M, Terrel L. HCUP projections: Clostridium difficile hospitali-zations 2011 to 2012. HCUP projections report # 2012– 01. US Agency for He-althcare Research and Quality (online) 2012; http://www.hcup-us.ahrq.gov/ reports/projections/CDI_Regional_projections_Final.pdf
12. Miniño AM, Xu J, Kochanek KD. Deaths: preliminary data for 2008. National Vital Statistics Reports 2010;59(2):1– 52.
13. Barbut F, Mastrantonio P, Delmée M et al. Prospective study of Clostridium
dif-ficile infections in Europe with phenotypic and genotypic characterization of
the isolates. Clin Microbiol Infect 2007;13(11):1048– 1057.
14. Bauer MP, Notermans DW, van Benthem BH et al. Clostridium difficile infection in Europe: a hospital-based survey. Lancet 2011;377(9759):63– 73. 15. Davies KA, Longshaw CM, Davis GL et al. First report from EUropean,
mul-ti-centre, prospective bi-annual point prevalence study of Clostridium
diffi-cile infection in hospitalised patients with diarrhea. 23th European Congress
of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 27– 30 April 2013, Berlin, poster.
16. Khanna S, Pardi DS, Aronson SL, Kammer PP, Baddour LM. Outcomes in community-acquired Clostridium difficile infection. Aliment Pharmacol Ther 2012;35(5):613– 618.
17. Khanna S, Pardi DS, Aronson SL et al. The epidemiology of community-acqu-ired Clostridium difficile infection: a population-based study. Am J Gastroen-terol 2012;107(1):89– 95.
18. Lessa FC, Gould CV, McDonald LC. Current status of Clostridium difficile infec-tion epidemiology. Clin Infect Dis 2012;55(Suppl. 2):S65– S70.
19. Kutty PK, Woods CW, Sena AC et al. Risk factors for and estimated incidence of community-associated Clostridium difficile infection, North Carolina, USA. Emerg Infect Dis 2010;16(2):197– 204.
20. Walia R, Kunde S, Mahajan L. Fecal microbiota transplantation in the treat-ment of refractory Clostridium difficile infection in children: an update. Curr Opin Pediatr 2014;26(5):573– 578.
21. Indra A, Lassnig H, Baliko N et al. Clostridium difficile: a new zoonotic agent. Wien Klin Wochenschr 2009;121(3– 4):91– 95.
1994;330(4):257– 262.
23. Tamma PD, Sandora TJ. Clostridium difficile infection in children: current sta-te and unanswered questions. J Pediatric Infect Dis Soc 2012;1(3):230– 243. 24. Gupta A, Khanna S. Community-acquired Clostridium difficile infection: an
in-creasing public health threat. Infect Drug Resistance 2014;7:63– 72. 25. Badger VO, Ledeboer NA, Graham MB, Edmiston CE Jr. Clostridium
diffi-cile: epidemiology, pathogenesis, management, and prevention of a
re-calcitrant healthcare-associated pathogen. JPEN J Parenter Enteral Nutr 2012;36(6):645– 662.
26. Carter GP, Rood JI, Lyras D. The role of toxin A and toxin B in the virulence of
Clostridium difficile. Trends Microbiol 2012;20(1):21– 29.
27. Bacon AE, Fekety R. Immunoglobulin G directed against toxin A and B of
Clostridium difficile in the general population and patients with
antibiotic--associated diarrhea. Diagn Microbiol Infect Dis 1994;18(4):205– 209. 28. Corthier G, Muller MC, Wilkins TD, Lyerly D, L’Haridon R. Protection against
experimental pseudomembranous co litis in gnotobiotic mice by use of monoclonal antibodies against Clostridium difficile toxin A. Infect Immun 1991;59(3):1192– 1195.
29. Dobson G, Hickey C, Trinder J. Clostridium difficile co litis causing toxic me-gacolon, severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Intensi-ve Med 2003;29(6):1030.
30. Geric B, Rupnik M, Gerding DN, Grabnar M, Johnson S. Distribution of
Clostri-dium difficile variant toxinotypes and strains with binary toxin genes among
clinical isolates in an American hospital. J Med Microbiol 2004;53(9):887– 894. 31. Hamm EE, Voth DE, Ballard JD. Identification of Clostridium difficile toxin B car-diotoxicity using zebrafish embryo model of intoxication. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103(38):14176– 14181.
32. Jank T, Aktories K. Structure and mode of action of clostridial glucosylating toxins: the ABCD model. Trends Microbiol 2008;16(5):222– 229.
33. Lyras D, O’Connor JR, Howarth PM et al. Toxin B is essential for virulence of
Clostridium difficile. Nature 2009;458(7242):1176– 1179.
34. Mitchell TJ, Ketley JM, Haslam SC et al. Effect of toxin A and B of Clostridium
difficile on rabbit ileum and colon. Gut 1986;27(1):78– 85.
35. Carroll KC, Bartlett JG. Biology of Clostridium difficile: implications for epide-miology and diagnosis. Annu Rev Microbiol 2011;65:501– 522.
36. Barbut F, Jones G, Eckert C. Epidemiology and control of Clostridium
dif-ficile infections in healthcare settings: an update. Curr Opin Infect Dis
2011;24(4):370– 376.
37. Cheknis AK, Sambol SP, Davidson DM et al. Distribution of Clostridium difficile strains from a North American, European and Australian trial of treatment of
C. difficile infections: 2005– 2007. Anaerobe 2009;15(6):230– 233.
38. Barbut F, Richard K, Hamadi K, Chomette V, Burghoffer B, Petit JC. Epidemio-logy of recurrence or reinfection of Clostridium difficile-associated diarrhea. J Clin Microbiol 2000;38(6):2386– 2388.
39. McFarland LV, Elmer GW, Surawicz CM. Breaking the cycle: treatment strate-gies for 163 cases of recurrent Clostridium difficile disease. Am J Gastroente-rol 2002;97(7):1769– 1775.
40. Fawley WN, Underwood S, Freeman J et al. Efficacy of hospital cleaning agents and germicides against epidemic Clostridium difficile strains. Infect Control Hosp Epidemiol 2007;28(8):920– 925.
41. Oka K, Osaki T, Hanawa T et al. Molecular and microbiological characteriza-tion of Clostridium difficile isolates from single, relapse and reinfeccharacteriza-tion cases. J Clin Microbiol 2012;50(3):915– 921.
42. Permpoonpattana P, Tolls EH, Nadem R, Tan S, Brisson A, Cutting SM. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J Bacteriol 2011;193(23):6461– 6470. 43. Bacon AE, Fekety R. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of
Clostridium difficile in the general population and patients with
antibiotic-associated diarrhea. Diagn Microbiol Infect Dis 1994;18(4):205– 209. 44. Corthier G, Muller MC, Wilkins TD, Lyerly D, L’Haridon R. Protection against
experimental pseudomembranous c olitis in gnotobiotic mice by use of monoclonal antibodies against Clostridium difficile toxin A. Infect Immun 1991;59(3):1192– 1195.
45. Gould LH, Limbago B. Clostridium difficile in food and domestic animals: a new foodborne pathogen? Clin Infect Diseases 2010;51(5):577– 582. 46. Samady W, Pong A, Fisher E. Risk factors for the development of
Clo-stridium difficile infection in hospitalized children. Curr Opin Pediatr
2014;26(5):568– 572.
47. Bakri MM, Brown DJ, Butcher JP, Sutherland AD. Clostridium difficile in ready-to-eat salads, Scotland. Emerg Infect Dis 2009;15(5):817– 818.
48. Burke KE, Lament JT. Clostridium difficile infection: a worldwide disease. Gut Liver 2014;8(1):1– 6.
among Clostridium difficile isolates from pigs, calves, and other species. J Clin Microbiol 2007;45(6):1963– 1964.
50. Rupnik M, Widmer A, Zimmermann O, Eckert C, Barbut F. Clostridium
diffi-cile toxinotype V, ribotype 078, in animals and humans. J Clin Microbiol
2008;46(6):2146.
51. al Saif N, Brazier JS. The distribution of Clostridium difficile from the
environ-ment of South Wales. J Med Microbiol 1996;45(2):133– 137.
52. Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN et al. Diversity of the human intestinal mi-crobial flora. Science 2005;308(5728):1635– 1638.
community in Zimbabwe. Trans R Soc Trop Med Hyg 2006;100(12):1146– 1150. 54. Songer JG, Post KW, Larson DJ, Jost BH, Glock RD. Infection of neonatal swine
with Clostridium difficile. Swine Health Prod 2000;8(4):185– 189.
55. Goorhuis A, Bakker D, Corver J et al. Emergence of Clostridium difficile infec-tion due to a new hypervirulent strain, polymerase chain reacinfec-tion type 078. Clin Infect Dis 2008;47(9):1162– 1170.
56. Weese JS, Rousseau J, Arroyo L. Bacteriological evaluation of commercial ca-nine and feline raw diets. Can Vet J 2005;46(6):513– 516.
57. Weese JS, Finley R, Reid-Smith RR, Janecko N, Rousseau J. Evaluation of
Clo-stridium difficile in dogs and other household environments. Epidemiol Infect
