ZASTOSOWANIE TLC I HPLC W ANALIZIE JAKOŚCIOWEJ SAPONIN

JO A N N A M ILA L A , B O G U SŁA W KRÓL

ZASTOSOWANIE TLC I HPLC W ANALIZIE JAKOŚCIOWEJ SAPONIN

S t r e s z c z e n i e

M etodą chrom atografii cieczowej cienkowarstwowej TLC porównano skład jakościow y wybranych saponin i produktów ich hydrolizy kwasowej (aglikonów). D obrano w arunki rozdziału: glicyryzyny, saponiny białej i saponin z buraka cukrowego m etodą wysokosprawnej chrom atografii cieczowej HPLC z zastosowaniem metanolu, jak o głównego rozpuszczalnika.

Stwierdzono, że zastosow anie chrom atografii cieczowej TLC i HPLC um ożliw ia udokumentowanie ogrom nego zróżnicow ania składu jakościow ego i ilościowego badanych saponin. D obry rozdział saponin z grupy glukuronidów m etodą HPLC uzyskuje się przy elucji metanolem w fazie z dodatkiem TBA (w o­

dorotlenek tetrabutyloam oniow y) o indyw idualnie dobranym udziale metanolu.

Wstęp

Saponiny (łac. sapo-m ydło) są to glikozydy pochodzenia roślinnego w ykazujące silne w łaściw ości pianotw órcze. Zalicza się je do grupy w tórnych m etabolitów prze­

m ian biochem icznych roślin. P od w zględem budow y chem icznej saponiny n ależ ą do glikozydów triterpenoidow ych lub steroidow ych, które w w yniku w yczerpującej h y ­ drolizy kw asow ej, zasadow ej lub enzym atycznej ulegają rozpadow i na aglikony (sapo- geniny) oraz składniki cukrow e (pentozy, heksozy lub kw asy uronow e).

P odstaw ow ym aglikonem saponin triterpenoidow ych je st β -am yryna (rys. 1), k tó ­ ra m oże m ieć różne podstaw niki (grupy: hydroksylow e, karboksylow e, ketonow e, m etoksylow e i estrow e). W ystępow anie przy aglikonach różnych grup funkcyjnych, a także m ożliw ość różnych połączeń m iędzy cukrow cam i i aglikonem , spraw ia, iż w przyrodzie znajduje się olbrzym ia ilość saponin różniących się strukturą i w łaściw o­

ściam i [3, 4, 6], D okładnie poznanym i i opisanym i w literaturze są saponiny w yizolo­

w ane z soi, korzenia żeń-szeń, m ydlnicy lekarskiej, lucerny.

M gr inż. J. Milala, d r hab. B. Król, Instytut Chemicznej Technologii Żywności, Politechnika Łódzka, u l Stefanowskiego 4/10, 90-924 Łódź.

40 Joanna M ilala, B ogusław Król

Rys. 1. Chem iczna struktura β -amyryny.

Fig. 1. Chem ical structures o f β-amyryn.

C hem iczną strukturę w ybranych saponin triterpenoidow ych przedstaw iono w tab.

1 [1 ,6 , 7],

W yodrębnianie i oczyszczanie poszczególnych saponin z surow ców roślinnych jest trudne, poniew aż m ają one silne w łaściw ości adsorpcyjne, pow lekające, pieniące, łatwo tw orzą zw iązki kom pleksow e z barw nikam i, cholesterolem i innym i związkam i chem icznym i. Ponadto bardzo trudno ulegają krystalizacji. W ykazują też ró żn ą p odat­

ność na działanie kw asów i zasad.

Do klasycznych m etod w ykryw ania i oznaczania saponin należą następujące m e­

tody [4]:

■ biologiczne, a zw łaszcza hem oliza erytrocytów ,

■ fizykochem iczne, w tym próba dotycząca zdolności pianotw órczej,

■ chem iczne ja k np. próby ze stężonym kw asem siarkow ym , trichlorkiem antym onu, w aniliną, które są p odstaw ą do jakościow ych i ilościow ych oznaczeń kolorym e­

trycznych.

Próby z hem olizą erytrocytów są uciążliw e i obarczone błędem ze w zględu na różną aktyw ność hem olityczną poszczególnych saponin. N atom iast spektrofotom e- tryczne m etody analityczne są m ało przydatne do oznaczania tej grupy zw iązków, głów nie ze w zględu na różną intensyw ność tw orzenia barw nych połączeń i brak od­

pow iednich wzorców.

O d daw na przy oczyszczaniu i w analityce saponin znajdują zastosow anie m etody chrom atograficzne - szczególnie TLC i HPLC. Do rozdzielania saponin m etod ą HPLC stosuje się różne fazy ruchom e zaw ierające najczęściej acetonitryl przy elucji izokra- tycznie i w gradiencie [1,2].

T a b e l a ¹

Chem iczna struktura saponin triterpenoidowych.

Chemical structures o f triterpene saponins.

42 Joanna Milala, Bogusław Król

Cel pracy

C elem pracy było porów nanie jakościow ego składu saponin, z w ybranych źródeł, m etodą chrom atografii cienkow arstw ow ej i dobranie w arunków rozdzielania niektó­

rych saponin m etodam i HPLC z zastosow aniem w fazie ruchom ej m etanolu jak o roz­

puszczalnika - tańszego i mniej toksycznego od pow szechnie stosow anego acetoni- trylu.

Materiały i metody badań

M ateriał badaw czy stanowiły:

■ handlow e preparaty saponin: glicyryzyna (glycyrrhizic acid - SIGM A), saponina biała (saponin w hite pure - M ER CK ), saponina czysta (Saponin rein D AB - FLU K A ),

■ saponiny w yodrębnione z handlow ych produktów farm aceutycznych: hederyna z syropu H edelix, escyna z żelu Aescin,

■ saponiny w yodrębnione z produktów cukrow niczych: soku surow ego, soku gęste­

go i w ysłodków ,

■ kw as oleanolow y (oleanolic acid - SIGM A).

W yodrębnianie saponin z produktów farm aceutycznych i cukrow niczych prow adzono przez trzykrotną ekstrakcję butanolem odpow iednich w odnych roztw orów w temp.

pokojow ej, po czym ekstrakty butanolow e przem yw ano w o dą i po oddestylow aniu butanolu, saponiny rozpuszczano w bezw odnym m etanolu.

R oztw ory m etanolow e w szystkich badanych saponin (1 -5 m g/m l) poddano b ez­

pośrednio analizie TLC. Ponadto glicyryzynę, saponinę b ia łą saponiny z soku suro­

w ego i gęstego poddano hydrolizie w roztw orze IM HC1, w środow isku 50% M eOH , w zatopionych am pułkach, w e wrzącej łaźni w odnej, w czasie 90 m in oraz analogicz­

nie z użyciem 0,5 M H2S 0 4 , po czym oznaczano skład jakościow y saponin i agliko- nów m eto d ą TLC w dw óch układach rozw ijających.

C hrom atografię cienkow arstw ow ą w ykonano na płytkach chrom atograficznych (DC - A lufolien K ieselgel 60 F254 M ER C) 20x20 cm pokrytych 0,2 cm w arstw ą żelu krzem ionkow ego. F azą ruchom ą dla saponin był: octan etylu-kw as octow y-w oda (7:2:2, v/v/v) dla produktów hydrolizy benzen-m etanol (9:1 v/v).

Po rozw inięciu chrom atogram y suszono w suszarce, spryskiw ano odczynnikiem aldehyd anyżow y - kw as octow y lodow aty - m etanol - stężony H2S 04 (0.5:10:85:5, v/v/v/v) i ogrzew ano w tem p. 110°C przez 5 min.

A nalizie H PLC poddano saponiny z trzech różnych źródeł, będące glukuronida- mi: glicyryzynę, saponinę b ia łą saponiny z buraka cukrowego.

A nalizę chrom atograficzną prow adzono z użyciem chrom atografu firm y K nauer z system em sterow ania obróbki danych EuroC hrom 2000, z zastosow aniem detektora

U V o długości fali 206 nm i kolum ny Lichrosorb RP-18 250x4,6 mm. C hrom atografię prow adzono z szybkością przepływ u 0,8 m l/m in w fazie m etanol-w oda (75:25, v/v) oraz chrom atografię w odw róconej fazie z dodatkiem TBA (w odorotlenek tetrabutylo- am oniow y) o składzie:

• 70% m etanolu 30% w ody z dodatkiem 3m M /l TB A i kw asu H³P O⁴ do pH = 4,

• 75% m etanolu 25% w ody z dodatkiem 3m M /l TB A i kw asu H3P O4do pH = 4,

• 85% m etanolu 15% w ody z dodatkiem 3m M /l TB A i kw asu H3PO4do pH = 4.

Wyniki i dyskusja

W yniki chrom atografii cienkow arstw ow ej badanych saponin przedstaw iono na rys. 2. i 3., a uzyskane w artości R f saponin zaw iera tab. 2. C hrom atogram y TLC (rys.

2) św iadczą o dużym zróżnicow aniu badanych saponin pod w zględem zabarw ienia plam (od brązow ych do różow ofioletow ych), co w skazuje na istotne różnice jak o ścio ­ w e i ilościowe. Z porów nania położenia plam saponin w zorcow ych na płytce (glicyry- zyny, saponiny białej i escyny) i plam pozostałych saponin w ynika, iż zakres R f od 0,15 do 0,65 odpow iada grupie zw iązków o charakterze saponin, zaś plam y o R f od 0,65 do 0,91 odnoszą się do prosapogenin i innych substancji. W w iększości badane saponiny w y stęp u ją jak o grupa kilku zw iązków o R f 0,15-0,65. Saponina DAB z drzew a kw ilaiow ego (Quillaja saponaria) i saponiny otrzym ane z w ysłodków i soku surow ego charakteryzują się dużym zróżnicow aniem jakościow ym (rys. 2). Z rys. 2.

w ynika też, iż saponiny z soku jak o dom inujący składnik zaw ierają saponinę o R f = 0,34 zaś saponiny z w ysłodków jak o głów ny składnik saponinę o R f = 0,43.

Rys. 2. Chrom atogram TLC badanych saponin w układzie 1.

Fig. 2. TLC chrom atogram o f exam ined saponins in mobile phase 1.

44 Joanna M ilala, B ogusław K ról T a b e l a 2 W artości Rf dla badanych saponin i prosapogenin.

Value Rf o f examined saponins and prosapogenins.

Saponina Zakres R f Rf i barwa głównego składnika

Saponins Range o f R f Colour o f main constituen

Saponiny z wysłodków

Saponins o f beet pulp 0.21-0.91 0.43 ciem nofioletowy - dark-violet Saponiny z soku

Saponins o f juice 0.21-0.91 0.34 fioletowy - violet Osad z soku w metanolu

M ethanolic sediment from juice 0.21-0.36 0.34 fioletowy - violet Glicyryzyna

Glycyrrhizic acid 0.30-0.52 0.38 różowy - pink Saponina DAB

Saponin DAB 0.15-0.91 0.35 brunatny - brown

Escyna

β-Escin 0.30-0.39 0.36 ciem nofioletowy - dark-violet

H ederyna

H ederyn 0.26-0.78 0.65 brązowy - brown

Saponina biała

W hite saponin 0.15-0.35 0.28 brązowy - brown

1 - saponina biała po hydrolizie IM HC1, 4 - glicyryzyna po hydrolizie 0,5M H2SO4,

2 - saponina biała po hydrolizie 0,5M H2SO4, 5 - saponiny z soku gęstego po hydrolizie IM HC1, 3 - glicyryzyna po hydrolizie IM HC1, 6 - saponiny z soku surowego po hydrolizie IM HC1,

7 - kwas oleanolowy.

Rys. 3. Chrom atogram saponin po hydrolizie w układzie 2.

Fig. 3. TLC chrom atogram o f hydrolysed saponins in mobile phase 2.

C hrom atogram y TLC produktów hydrolizy glicyryzyny, saponiny białej, saponi­

ny z soku gęstego i surow ego przedstaw iono na rys. 3. W szystkie saponiny poddane działaniu IM HC1 uległy w yczerpującej hydrolizie. G łów nym aglikonem saponin z buraka cukrow ego je st kw as oleanolowy.

N astępnie podjęto próbę doboru fazy ruchomej do rozdziału: glicyryzyny, sapo­

niny białej, saponin buraka cukrow ego (z soku surow ego), z zastosow aniem techniki HPLC, z użyciem fazy m etanol-w oda (75:25, v/v) oraz chrom atografii w odwróconej fazie. W yniki analiz H PLC przedstaw iono na rys. 4, 5, 6. Z rys. 4. w ynika, że w fazie m etanol-w oda (75:25, v/v) glicyryzyna, saponina biała i saponiny buraka cukrow ego (z soku) nie ulegają zadow alającem u rozdziałow i na składniki.

Rys. 4. Chrom atogram H PLC badanych saponin w fazie metanol: woda 75:25 (liczby nad pikam i po­

dają czasy retencji).

Fig. 4. HPLC chrom atogram o f examined saponins in phase m ethanol : w ater 75:25 (num ber over pik indicates retention time).

N a rys. 5. przedstaw iono w yniki rozdziału glicyryzyny w fazie z dodatkiem 3m M /l TB A i udziale m etanolu odpow iednio: 70, 75, 85%. Z rys. 5. w ynika, że najko­

rzystniejszą fazą do rozdziału glicyryzyny je st faza o składzie 75% m etanolu 25% w o­

dy, 3 m m TB A o pH 4. W tych w arunkach otrzym uje się trzy ostre piki. Zm niejszenie bądź zw iększenie udziału m etanolu w fazie ruchomej w pływ a niekorzystnie n a ro z­

dział. W przypadku chrom atografii w odwróconej fazie o 70% udziale m etanolu piki poprzedzające pik głów ny stają się rozm yte, w ydłuża się też czas analizy, natom iast w przypadku chrom atografii w odw róconej fazie z 85% m etanolu nie następuje d o ­ kładny rozdział typu „base line” .

N a rys. 6. przedstaw iono rozdział trzech badanych saponin o charakterze gluku- ronidów w fazie ruchom ej w yznaczonej dla glicyryzyny.

46 Joanna Milala, Bogusław Król

Rys. 5. Chrom atogram HPLC glicyryzyny w fazie z TBA o różnym udziale m etanolu (liczby nad pika­

mi podają czasy retencji).

Fig. 5. H PLC chrom atogram o f glycyrrhizic acid in phase w ith TBA and different methanol content (num ber over pik indicates retention time).

Rys. 6. Chrom atogram HPLC badanych saponin w fazie z TBA o 75% udziale metanolu (liczby nad pikam i podają czasy retencji).

Fig. 6. HPLC chrom atogram o f exam ined saponins in phase w ith TBA and 75% methanol content (num ber over pik indicates retention time).

W tych w arunkach rozdziela się dobrze rów nież saponina biała, a znacznie gorzej saponiny z surow ego soku z buraków . D alsze badania w ykazały, że do rozdzielenia saponin z buraka cukrow ego korzystne je st stosow anie chrom atografii w odwróconej fazie z 85% udziałem m etanolu.

Wnioski

1. Technika TLC je st korzystna ze w zględu na stosunkow o prosty i zarazem niedrogi sposób analizy. Przydatna je s t podczas w yodrębniania i oczyszczania saponin oraz do szybkiej oceny składu preparatów saponin.

2. T echnika H PLC um ożliw ia analizę ilościow ą roztw orów o niskich stężeniach sa­

ponin.

3. Do rozdzielania saponin z grupy glukuronidów m etodą H PLC w odwróconej fazie niezbędne je st dostosow anie fazy ruchom ej do poszczególnych saponin.

LITERATURA

[1] M. B um ouf-Radosevich, N.E. Delfel.: High-perform ance liquid chrom atography o f triterpene sapo­

nins. J. Chrom., 368 ,1986, 433.

[2] E. M ax Henry, D. Pauthe-Dayde, M. Rochd.: Extraction and high-perform ance liquid chromatografie determination o f gypsogenin 3,0-glucuronide.J. Chrom., 519, 1990, 109.

[3] M. Jurzysta, S Burda, W Oleszek, M Płoszyński.: Studies on M edicago lupulina saponins. Isolation and chemical characterization o f blossom saponins. Acta Soc. Bot. Polon., 56, 1987, 101.

[4] J. M uszyński: Farm akognozja. PZW L, W arszawa 1957.

[5] W. Oleszek: Solid Phase Ekstraction.: Fractionation o f alfaalfa saponins. J. Sci. Food. Agric., 44, 1988,43.

[6] H. Schiweck, G. Steinie, E. Fischer.: Bestimm ung des Saponingehaltes in Zuckerfabriksprodukten und V erhalten W ahrend des Prozesses. Proceedings 19th Gen Assambley, Comm. Tech. Sucrerie, Cambridge, 1991,441.

[7] O. Tanaka.: Im provem ent o f taste o f natural sweeteners. Pure and Applied Chemistry JUPAC, 69, 997, 675.

D E T E C T IO N AND D E T E R M IN A T IO N O F SA PO N IN S W IT H A P P L IC A T IO N O F D IF F E R E N T C H R O M A T O G R A P H IC T E C H N IQ U E S

S u m m a r y

Qualitative com position o f selected saponins and products o f their acid hydrolysis were compared by TLC method. The conditions o f separation o f glycyrrhizic acid, white saponin, and sugar beet saponins by HPLC method with the use o f methanol as a m ain solvent were elaborated.

The use o f liquid chrom atography TLC and HPLC makes it possible to prove the huge differentia­

tion o f com position o f qualitative and quantitative com position o f examined saponins. Good separation o f saponins from group o f glucuronides w as achived with m ethanol elution in phase m ethod w ith addition o f TBA (tetrabutyloam m onium hydroxide). ^