IKROBIOLOGICZNE CENTRALNE ROZSZCZEPIENIE OKSYETYLENOWANYCH ALKOHOLI

M IKROBIOLOGICZNE CENT

OKSYETYLENOWANYCH AL I RENA B UDNIK

IKROBIOLOGICZNE CENTRALNE ROZSZCZEPIENIE OKSYETYLENOWANYCH ALKOHOLI

Rozprawa doktorska przedstawiona Radzie Wydziału Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej

Promotor

prof. dr hab. inż. Zenon Łukaszewski

Pozna ń 2014

W YDZIAŁ T ECHNOLOGII C HEMICZNEJ

RALNE ROZSZCZEPIENIE

KOHOLI

Projekt współfinansowany przez Unię ą

OŚWIADCZENIE DOTYCZĄ

pt. „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”,

Poddziałanie 8.2.2 PO KL realizowanego w

Oświadczam, że jestem

stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, współfinansowanego ze ś

Funduszu Społecznego.

I declare that I am a scholarship holder within the project “Scholarship support for PH.D. students specializing in majors strategic for W

measure 8.2.2 Human Capital Operation Union under the European Social Fund.

Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

do Regulaminu Stypendialnego

ŚWIADCZENIE DOTYCZĄCE PROMOCJI PROJEKTU

„Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”,

Poddziałanie 8.2.2 PO KL realizowanego w latach 2013

ś że jestem stypendystą w ramach projektu pt.: „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, współfinansowanego ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

I declare that I am a scholarship holder within the project “Scholarship support for PH.D. students specializing in majors strategic for Wielkopolska’s development”, Sub measure 8.2.2 Human Capital Operational Programme, co-financed by European Union under the European Social Fund.

…….……….

podpis Doktoranta / Doktorantki ę ą w ramach Europejskiego Funduszu

Załącznik nr 11 do Regulaminu Stypendialnego

Ś ĄCE PROMOCJI PROJEKTU

„Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”,

latach 2013-2014

ą w ramach projektu pt.: „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu Operacyjnego Kapitał w ramach Europejskiego

I declare that I am a scholarship holder within the project “Scholarship support for ielkopolska’s development”, Sub-

financed by European

…….……….

podpis Doktoranta / Doktorantki

Szczególne podziękowania kieruję

do promotora rozprawy doktorskiej

prof. dr hab. inż. Zenona Łukaszewskiego

za cenne uwagi i pomoc

w opracowywaniu tej pracy

Serdecznie dziękuję

dr inż. Joannie Zembrzuskiej

za okazaną cierpliwość i wyrozumiałość

za poświęcony czas i cenne wskazówki,

które umożliwiły nadanie te pracy

ostatecznego kształtu

I. W STĘP ………..……….

II. C ZĘŚĆ L ITERATUROWA ……….

1. Związki powierzchniowo czynne………...

1.1. Budowa i właściwości związków powierzchniowo czynnych……….

1.2. Produkcja i zużycie związków powierzchniowo czynnych……….

1.3. Klasyfikacja związków powierzchniowo czynnych………..

1.3.1. Oksyetylenowane alkohole………

1.3.1.1. Budowa i właściwości……….

1.3.1.2. Wykorzystanie i zużycie oksyetylenowanych alkoholi………..

1.3.1.3. Toksyczność……….…...…

1.3.1.4. Biodegradacja………..

2. Techniki używane do wydzielania związków powierzchniowo czynnych z matrycy wodnej………..……….

3. Metody oznaczania związków powierzchniowo czynnych………

3.1. Metody spektrofotometryczne………

3.2. Metody elektroanalityczne………..

3.3. Metody chromatograficzne i techniki łączone……….………….

3.3.1. Chromatografia gazowa……….…………

3.3.2. Chromatografia cieczowa połączona ze spektrometrem mas………….

3.3.2.1. Spektrometria mas………..………...

3.3.2.2. Budowa aparatu………..

3.3.2.2.1. Elektrorozpylanie………

3.3.2.2.2. Analizator kwadrupolowy………..

3.3.2.3. Analiza ilościowa i jakościowa w tandemowej spektrometrii mas…

3.3.2.3.1. Skanowanie jonów potomnych………..………..

3.3.2.3.2. Skanowanie jonów macierzystych…………...………

3.3.2.3.3. Monitorowanie wielu reakcji………..

3.3.2.4. Zastosowanie chromatografii cieczowej do oznaczania związków powierzchniowo czynnych……….……….

4. Ocena jakości wyników pomiarów analitycznych……….……….

4.1. Kalibracja techniką krzywej wzorcowej……….

4.2. Metoda wielokrotnego dodatku wzorca………

4.3. Granica wykrywalności………

4.4. Granica oznaczalności………

5. Testy biodegradacyjne………..

III. C EL P RACY ………..

10 12 12 12 13 14 14 15 16 16 18

18 22 23 23 23 23 24 26 26 27 28 30 30 30 30

31

33

33

34

34

35

35

38

IV. C ZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA ………..

1. Odczynniki i aparatura………

1.1. Aparatura………...

1.2. Drobny sprzęt laboratoryjny………

1.3. Odczynniki……….

1.4. Przygotowanie roztworów wzorcowych………

2. Analiza LC-MS/MS………..

2.1. Analiza jakościowa………...

2.2. Analiza ilościowa………..

2.2.1. Bezpośrednie oznaczanie C ₁₂ EO _2-9 ……….

2.2.1.1. Warunki detekcji MS/MS………

2.2.1.2. Dobór warunków rozdzielenia chromatograficznego……….

2.2.1.2.1. Dobór stężenia octanu amonu w fazie ruchomej do

rozdzielenia techniką chromatograficzną………

2.2.1.2.2. Dobór temperatury kolumny……….

2.2.1.2.3. Optymalne warunki rozdzielania chromatograficznego…………

2.2.1.2.4. Analiza jakościowo-ilościowa techniką LC-MS/MS………...

2.2.2. Oznaczanie oksyetylenowanych alkoholi i poli(etylenowanych glikoli) po reakcji derywatyzacji z izocyjanianem fenylu………

2.2.2.1. Dobór warunków rozdzielania chromatograficznego……….

2.2.2.1.1. Optymalne warunki rozdzielenia chromatograficznego…………

2.2.2.2. Warunki detekcji MS/MS………

3. Procedura derywatyzacji izocyjanianem fenylu………..

3.1. Dobór warunków reakcji derywatyzacji ………

3.1.1. Dobór czasu derywatyzacji………

3.1.2. Dobór temperatury derywatyzacji……….

3.1.3. Dobór nadmiaru środka derywatyzującego……….

3.2. Opracowana i zoptymalizowana procedura derywatyzacji………

3.2.1.1. Walidacja metod analitycznych……….

3.2.1.1.1. Liniowość……….

3.2.1.1.2. Granica wykrywalności i oznaczalności………..

4. Procedury ekstrakcji………

4.1. Ekstrakcja ciecz-ciecz oksyetylenowanych alkoholi z próbek

modelowych……….……….

4.2. Ekstrakcja ciecz-ciecz oksyetylenowanych alkoholi z próbek wody rzecznej……….………..………..

39 39 39 41 42 42 43 43 43 43 44 45

45 46 46 46

47 47 47 47 48 49 49 49 49 50 50 50 50 50

50

51

4.3. Ekstrakcja ciecz-ciecz oksyeylenowanych alkoholi i ich metabolitów z testów biodegradacyjnych………….………..

4.4. Ekstrakcja do fazy stałej oksyetylenowanych alkoholi z próbek

modelowych……….……….

4.5. Ekstrakcja do fazy stałej oksyetylenowanych alkoholi z próbek

rzeczywistych………..………..

4.6. Ekstrakcja do fazy stałej z zastosowaniem nowego wypełnienia………….

4.6.1. Charakterystyka ziemi okrzemkowej wykorzystywanej w badaniach..

4.6.2. Przygotowanie ziemi okrzemkowej do pracy………

4.6.3. Procedura adsorpcji na ziemi okrzemkowej……….

4.7. Adsorpcja na powierzchni kapilarnej pułapki PTFE………

5. Zakres prac przygotowawczych do testów biodegradacyjnych………...

5.1. Przygotowanie wody………

5.2. Przygotowanie szkła laboratoryjnego………

5.3. Przygotowanie podłoża z agarem odżywczym………

5.4. Przygotowanie roztworu bakteryjnego………..

5.5. Przygotowanie pożywki mineralnej………

5.6. Woda rzeczna wykorzystywana w eksperymentach………..

5.7. Izolacja o otrzymanie czystych kultur bakterii……….

5.7.1. Charakterystyka szczepu bakteryjnego użytego do badań………..

6. Badania biodegradacji oksyetylenowanych alkoholi……….

6.1. Badania jakościowe w ściekach……….

6.2. Opis testów biodegradacyjnych……….

6.2.1. Test biodegradacyjny wody rzecznej modelowego polidyspersyjnego oksyetylenowanego alkoholu……….

6.2.2. Testy biodegradacyjne z wyizolowanymi szczepami bakteryjnymi…….

6.2.3. Testy biodegradacyjne modelowych homologów C ₁₂ EO ₄ i C ₁₂ EO ₉ przez bakterie szczepu Enterobacter sp. strain Z3………...

V. W YNIKI I ICH OMÓWIENIE ………..

1. Badania w celu usprawnienie metod separacji i oznaczania

oksyetylenowanych alkoholi………..

1.1. Badania bezpośredniego oznaczania oksyetylenowanych alkoholi

techniką LC-MS/MS……….

1.1.1. Dobór warunków pracy kolumny………...

1.1.2. Dobór warunków detekcji………...

1.1.3. Analiza jakościowo-ilościowa………

51

51

52 53 54 55 55 55 57 57 57 57 57 58 58 60 62 62 63 64

64 64

65 67

67

67

67

69

71

1.1.4. Walidacja metody………

1.2. Badania oznaczania oksyetylenowanych alkoholi poli(etylenowanych glikoli) techniką LC-MS/MS z zastosowaniem derywatyzacji analitów……

1.2.1. Dobór fazy ruchomej………...

1.2.2. Dobór warunków detekcji………...

1.2.3. Analiza jakościowo-ilościowa oksyetylenowanych alkoholi………..

1.2.4. Analiza jakościowo-ilościowa poli(etylenowanych glikoli)………

1.2.5. Dobór warunków derywatyzacji………

1.2.5.1. Wpływ czasu reakcji derywatyzacji………

1.2.5.2. Wpływ temperatury reakcji derywatyzacji……….

1.2.5.3. Wpływ ilości środka derywatyzującego……….

1.2.6. Walidacja metody analitycznej………..

1.3. Badanie wydzielania oksyetylenowanych alkoholi technika ekstrakcji ciecz-ciecz……….………

1.3.1. Dobór układu ekstrakcyjnego………

1.4. Badania separacji oksyetylenowanych alkoholi techniką ekstrakcji do fazy stałej………..………

1.4.1. Dobór układu ekstrakcyjnego………

1.5. Sprawdzenie metod ekstrakcji na próbce środowiskowej (woda rzeczna).

1.6. Badania separacji oksyetylenowanych alkoholi techniką ekstrakcji do fazy stałej z zastosowaniem nowych wypełnień ……….

1.7. Badania separacji oksyetylenowanych alkoholi w pułapce PTFE…………

2. Badania biodegradacji oksyetylenowanych alkoholi……….

2.1. Sprawdzenie czystości wzorca oksyetylenowanego dodekanolu

C ₁₂ EO ₁₀ ………..………

2.2. Badania jakościowe pod kątem obecności oksyetylatów

w ściekach……….

2.2.1. Identyfikacja niejonowych surfaktantów w ściekach surowych i

oczyszczonych ………

2.3. Biodegradacja modelowego polidyspersyjnego oksyetylowanego

alkoholu w teście wody rzecznej………

2.4. Izolacja szczepów bakteryjnych z wody rzecznej………...

2.5. Sprawdzenie możliwości biodegradacyjnych wyizolowanych szczepów bakterii………...

2.6. Badania zdolności do centralnego rozszczepienia wyizolowanych

szczepów……….…..

73

74 74 76 78 80 82 82 83 84 85

87 87

87 87 90

92 94 97

97

98

98

108 111

113

117

2.6.1. Dobór odpowiedniego stężenia zaszczepki bakteryjnej………

2.7. Badania biodegradacji modelowego polidyspersyjnego

oksyetylenowanego dodekanolu przez bakterie Enterobacter sp. strain Z3 w środowisku wyjałowionej wody rzecznej……….

2.8. Badania biodegradacji modelowych homologów C 12 EO 4 i C 12 EO 9 przez bakterie szczepu Enterobacter sp. strain Z3………...

2.8.1. Badania biodegradacyjne na modelowym homologu C 12 EO 4 …………..

2.8.2. Badania biodegradacyjne na modelowym homologu C ₁₂ EO ₉ …………..

VI. D YSKUSJA WYNIKÓW ………

VII. W NIOSKI ……….

VIII. S TRESZCZENIE ………..

IX. S UMMARY ………..

X. L ITERATURA ………..

XI. S PIS TABEL I RYSUNKÓW ………..

XII. S PIS SKRÓTÓW ………..

XIII. Z AŁĄCZNIK ……….

119

127

134

134

137

144

149

150

154

156

170

176

178

I. W STĘP

Oksyetylenowane alkohole są głównym składnikiem niejonowych związków powierzchniowo-czynnych (niejonowych surfaktantów (NS)), a tym samym głównym składnikiem strumienia surfaktantów. Związki powierzchniowo-czynne, określane skrótowo jako surfaktanty, detergenty lub tenzydy, dzięki amfifilowej budowie, umożliwiają zwilżanie powierzchni ciała stałego, mieszanie się nierozpuszczalnych cieczy, ułatwiają procesy prania, czyszczenie itp. Nieomal cały strumień surfaktantów jest kierowany do środowiska wodnego via kolektory i oczyszczalnie ścieków. Dlatego biodegradacja surfaktantów zasługuje na szerokie badania.

Według European Committee of Surfactants and their Organic Intermediates (CESIO) [1] aktualnie produkcja oksyetylatów w EU wynosi 1,397 Mt i jest nieznacznie wyższa od produkcji anionowych surfaktantów (1,201 Mt), podczas gdy produkcja innych niejonowych surfaktantów stanowi trochę ponad 0,1 Mt, kationowych surfaktantów – 0,225 Mt a amfoterycznych surfaktantów – 0,110 Mt. Główną część produkcji oksyetylatów stanowią oksyetylenowane alkohole, których produkcja oparta na odnawialnych źródłach surowcowych wynosi około 0,55 Mt a oparta na petrochemicznych źródłach surowcowych – około 0,38 Mt.

Oksyetylenowane alkohole (AE) są uważane jako łatwo ulegające biodegradacji, w odróżnieniu od oksyetylenowanych alkilofenoli [2]. Od czasu publikacji Pattersona i współpracowników [3] ugruntowany jest pogląd, poparty licznymi pracami, że AE ulegają centralnemu rozszczepieniu z utworzeniem poli(glikoli etylenowych) (PEG) i wolnego alkoholu tłuszczowego. Inna ścieżka biodegradacyjna występuje w przypadku oksyetylenowanych alkilofenoli [2]; uważa się, że ulegają one biodegradacji przez stopniowe skracanie łańcucha oksyetylenowego. Obie ścieżki biodegradacyjne mogą jednak przebiegać równolegle [4]. Szczep bakterii Microbacterium strain E19, biodegradując AE, prowadzi także do powstawania, obok PEG, pochodnych karboksylowych w położeniu ω- łańcucha oksyetylenowego [5].

Trudno jednak przyjąć, że wszystkie metabolity biodegradacji AE są znane.

Zachowanie się AE w obecności różnych zidentyfikowanych szczepów bakterii jest tylko fragmentaryczne. Większość prac dotyczy biodegradacji AE przez konsorcja mikroorganizmów występujące w wodzie powierzchniowej lub w ściekach.

Zważywszy na skalę zastosowań, zaskakująco mało prac dotyczy badania AE

w środowisku wodnym. Jedną z przyczyn małej liczby prac dotyczących monitoringu

i biodegradacji AE, są słabo rozwinięte narzędzia analityczne. Jedną z głównych

trudności jest polidyspersyjność oksyetylatów. Na skutek polidyspersyjności

mieszanina AE zawiera kilkadziesiąt indywidualnych substancji a oznaczanie tak dużej

liczby stanowi istotny problem. Co więcej, tylko niewielka liczba homogenicznych indywidualnych AE jest dostępna w handlu.

Istotnym problemem jest wydzielanie AE z matrycy wodnej. Składniki mieszaniny

o znacznej różnicy w długości łańcucha oksyetylenowego a tym samym dużej różnicy

w proporcji części hydrofobowej i hydrofilowej zachowują się inaczej w procesach

separacji. Pomimo tego badania biodegradacji AE powinny być prowadzone

ze względu na znaczący strumień AE kierowany do środowiska wodnego. Obok badań

dotyczących biodegradacji konieczne jest doskonalenie metod wydzielanie AE

z matrycy wodnej oraz metod ich oznaczania.

II. C ZĘŚĆ L ITERATUROWA

1. Z WIĄZKI POWIERZCHNIOWO CZYNNE

1.1. B UDOWA I WŁAŚCIWOŚCI ZWIĄZKÓW POWIERZCHNIOWO CZYNNYCH Związki powierzchniowo czynne (ZPC) (lub surfaktanty) zwane również detergentami są substancjami obniżającymi napięcie powierzchniowe, umożliwiają zwilżanie powierzchni ciała stałego, jak również mieszanie się nierozpuszczalnych cieczy. Cząsteczki tych związków zbudowane są z dwóch grup o skrajnie różnych właściwościach: hydrofilowej i hydrofobowej (rysunek 1). Część hydrofilowa (tworzona przez grupy kwasowe, zasadowe itp.) wykazuje powinowactwo do wody i innych cieczy polarnych, a jej obecność w cząsteczkach surfaktantu nadaje jej zdolność do rozpuszczania się w cieczach. Część hydrofobowa (tworzy ją łańcuch węglowy C 12 - C ₁₈ ) charakteryzuje się odmiennymi właściwościami: duże powinowactwo do cieczy niepolarnych, natomiast brak powinowactwa do wody [6].

Rysunek. 1. Schemat budowy cząsteczki surfaktantu [6 - 8]

Związki powierzchniowo czynne charakteryzują się [7, 9]:

⇒ rozpuszczalnością w wodzie i wodnych roztworach elektrolitów i nieelektrolitów,

⇒ niską toksycznością (toksyczne jedynie wobec niektórych mikroorganizmów i grzybów),

⇒ wysokim stopniem biodegradacji (chemio- i biodegradowalne surfaktanty

zmniejszają szkodliwie oddziaływanie na środowisko),

⇒ adsorpcją na powierzchni ciała stałego i absorpcją w cieczy (umożliwia to zmniejszenie lub zwiększenie zwilżania powierzchni ciała stałego przez ciecz),

⇒ wpływają na równowagę powietrze-woda,

⇒ zdolnością tworzenia struktur micelarnych (umożliwia to między innymi pranie i mycie).

1.2. P RODUKCJA I ZUŻYCIE ZWIĄZKÓW POWIERZCHNIOWO CZYNNYCH

W 2011 roku krajowa sprzedaż detaliczna wyrobów chemii gospodarczej kształtowała się na poziomie ok 3,7 mld zł. Środki piorące należą jednak do jednego z największych segmentów na rynku chemii gospodarczej (ponad 50% wartości sprzedaży w 2011 r.) [10]. Sprzedaż proszków do prania charakteryzuje się dużą stabilnością. Najczęściej wybierane są opakowania 2 - 3 kg. Według badań przeprowadzonych przez firmę Henkel polski konsument w proszkach do prania ceni sobie walory takie jak: skuteczność usuwania plam, wybielanie oraz ładny świeży zapach [10].

Większość środków piorących jest trudna do zneutralizowania lub usunięcia ze ścieków, stąd też są niekorzystne dla środowiska. Coraz więcej krajów zaostrza normy ograniczające stosowanie detergentów [11]. W Unii Europejskiej w ostatnich latach wprowadzono wiele zmian w celu ograniczenia niekorzystnego wpływu produktów chemii gospodarczej na środowisko. Parlament Europejski i Rada w 2004 r.

postanowiły, że na rynek UE nie mogą być wprowadzone detergenty, jeżeli zawarte w nich związki powierzchniowo czynne mają średnią biodegradację niższą niż 80%.

Rozporządzenie weszło w życie 8 października 2005 r. Mimo obowiązującego przepisu, wciąż nie do końca rozstrzygnięto sprawy ich nieszkodliwości dla środowiska.

Proszki do prania zawierają albo niejonowe surfaktanty, albo mieszaninę jonowych i niejonowych surfaktantów. Płyny do prania zawierają od 7 - 25% jonowych surfaktantów i 6 - 30% niejonowych.

1.3. K LASYFIKACJA ZWIĄZKÓW POWIERZCHNIOWO CZYNNYCH

Surfaktanty, dzielimy z uwagi na rodzaj występujących w nich grup funkcyjnych, które decydują o ich właściwościach i zastosowaniu. Rozróżniamy surfaktanty jonowe, których grupy funkcyjne posiadają ładunek elektryczny i surfaktanty niejonowe, których grupy funkcyjne nie są obdarzone ładunkiem (rysunek 2.). Klasyfikacja ta jest zgodna z normą STAS 6399-61, która rozróżnia związki powierzchniowo czynne według kryterium dysocjacji elektrolitycznej [6 -8, 12].

Anionowymi związkami powierzchniowo czynnymi (anionowe surfaktanty, AZPC) są

w większości środki piorące, emulgujące, czyszczące, w których częścią czynną

cząsteczki jest anion bezpośrednio związany z łańcuchem hydrofobowym.

Podstawową grupę kationowych surfaktantów (kationowe związki powierzchniowo czynne, KZPC) stanowią zasady organiczne (najczęściej zasady azotowe), substancje zawierające siarkę, fosfor lub arsen nie są często stosowane. KZPC posiadają właściwości grzybobójcze, bakteriobójcze, dezynfekujące. Rzadko stosowane są jako środki piorące częściej jako inhibitory korozji [6].

Związki Powierzchniowo Czynne (ZPC)

Jonowe Niejonowe

Anionowe Amfoteryczne

Kationowe

Rysunek 2. Podział związków powierzchniowo czynnych ze względu na budowę cząsteczki [6]

Niejonowe detergenty to związki o aktywności powierzchniowej, które z powodu braku dysocjującej grupy hydrofilowej nie ulegają w roztworach wodnych dysocjacji elektrolitycznej. Posiadają węglowodorowy łańcuch alifatyczny lub ugrupowanie alicykliczne jako hydrofobowy fragment cząsteczki. W odróżnieniu od jonowych związków powierzchniowo czynnych zawierają z reguły nie jedną, lecz większą ilość grup hydrofilowych w cząsteczce, co jest nieodzownym warunkiem posiadania przez te związki wyraźnej czynności powierzchniowej. Związki te posiadają dobre właściwości powierzchniowe niezależne od pH środowiska i na drodze syntezy chemicznej dają się stosownie do potrzeb, modyfikować. Znalazły zastosowanie w niemal wszystkich dziedzinach gospodarki. Główną grupą niejonowych ZPC są oksyetylenowe alkohole (ang. Alcohol Ethoxylates – AE). Modelowym niejonowym surfaktantem jest polidyspersyjny oksyetylenowany alkohol zawierający łańcuch dodecylowy oraz średnio 10 grup oksyetylenowych – surfaktant C ₁₂ EO 10 [6].

1.3.1. O KSYETYLENOWANE ALKOHOLE

Niejonowe związki powierzchniowo czynne (NZPC) wraz z anionowymi ZPC

stanowią 90% produkcji surfaktantów w UE [13]. Oksyetylenowe alkohole stanowią

główną grupę niejonowych związków powierzchniowo czynnych. Istotną jej część

tworzą etoksylaty otrzymane na bazie oleju kokosowego i palmowego. Ważne z ekologicznego punktu jest oznaczanie stężenia okyetylenowanych alkoholi i metabolitów biodegradacji, gdyż ich toksyczność dla środowiska jest różna i wzrasta wraz ze wzrostem hydrofobowości [14].

1.3.1.1. B UDOWA I WŁAŚCIWOŚCI

Oksyetylenowane alkohole stanowią największą grupę surfaktantów niejonowych, które powstają w reakcji kondensacji alkoholi tłuszczowych (laurylowego, cetylowego, stearynowego i olejowego) z tlenkiem etylenu (czy też tlenkiem polipropylenu). Ich wzór sumaryczny to [7, 15]:

CH ₃ (CH ₂ ) _x O(CH ₂ CH ₂ O) _n H gdzie: x=7-17, n=hydrofilowe1-100

Alkohole wykorzystywane w produkcji AE zawierają zazwyczaj łańcuch alkilowy składający się z 8 do 18 atomów węgla, podczas gdy oksyetylowany łańcuch zawiera średnio od 3 do 12 jednostek tlenku etylenu (rysunek 3). Wzrost długości łańcucha węglowego związany jest ze wzrostem hydrofobowości alkilopolioksyeterów.

W etoksylatach ugrupowanie hydrofobowe to zazwyczaj liniowe, pierwszorzędowe alkohole tłuszczowe, zdarzają się także alkohole drugorzędowe pochodzenia petrochemicznego bądź alkohole rozgałęzione. Z kolei część hydrofilową tworzą ugrupowania cząstek tlenku etylenu [7, 15, 16].

Rysunek 3. Dwie podstawowe struktury etoksylatów obecne w środkach czyszczących stosowanych w gospodarstwach domowych [16]

AE charakteryzują się wieloma pożądanymi cechami, takimi jak: szybka

biodegradacja, niska lub umiarkowana zdolność do pienienia, dobre czyszczenie

włókien chemicznych, stabilność w szerokim pH, czy też niewrażliwość na twardą

wodę. Związki te posiadają konsystencję od płynnej do woskowatej i wykazują

odmienne powinowactwo do fazy wodnej i olejowej. W zależności od budowy i liczby

ugrupowań etoksylowych uzależniony jest stopień powinowactwa tych związków do wody [16].

1.3.1.2. W YKORZYSTANIE I ZUŻYCIE OKSYETYLENOWANYCH ALKOHOLI

Oksyetylenowane alkohole tłuszczowe znalazły zastosowanie jako stabilizatory emulsji, solubilizatory dla olejków perfumowanych i witamin, a także jako środki natłuszczające. Są szeroko stosowane w środkach piorących, w mniejszym stopniu w środkach czystości, kosmetykach, rolnictwie, a także w wielu innych procesach przemysłowych, takich jak włókienniczy i papierniczy. Ta różnorodność występowania AE w detergentach używanych w gospodarstwach domowych ukazuje różnorodność możliwości pośrednich i bezpośrednich kontaktów, na jakie człowiek napotyka się podczas ich stosowania. Nasza skóra ma bezpośredni kontakt z etoksylatami podczas prania, możemy wdychać te związki stosując środki czyszczące w aerozolu, a także spożywać je, jeśli jakieś ich pozostałości zostały na naczyniach. Oszacowano, że człowiek może maksymalnie podlegać dawce 6,48 µg/kg mc./dzień [16].

Znaczne ilości danych toksykologicznych pokazują, że AE nie są genotoksyczne, mutagenny czy rakotwórczy. Są substancjami dobrze tolerowanymi przez skórę.

Ocena ryzyka dla zdrowia człowieka pokazała, że wykorzystywanie etoksylatów w proszkach do prania i detergentach czyszczących nie powinno niepokoić nabywców tych produktów [16].

W 1998 roku etoksylaty stanowiły około 22% produkcji wszystkich surfaktantów w Unii Europejskiej. Pomimo zapewnień, że są nieszkodliwe dla zdrowia producenci tych związków powierzchniowo czynnych są zaniepokojeni rosnącymi cenami kluczowych surowców i ograniczeniami w dostawach. Uważa się, że rynek środków czyszczących i pielęgnacji ciała jest odporny na recesję, jednakże w ostatnich latach z powodu spadku marż i rosnących cen tlenku etylenu i alkoholi tłuszczowych konieczne było zamknięcie zdolności produkcyjnej w Wielkiej Brytanii i Europie wschodniej. Innym efektem było przeniesienie produkcji z Europy do USA, z uwagi na konkurencyjne koszty surowców [17].

1.3.1.3. T OKSYCZNOŚĆ

W organizmach wodnych, środki powierzchniowo czynne, powodują wzrost

produkcji śluzu w naskórku i w skrzelach, prawdopodobnie są przyczyną pogorszenia

ekstrakcji tlenu z wody (niedotlenienie i śmierć organizmów wodnych). Ponadto, mogą

powodować krwotoki i uszkodzenia nabłonka [18 - 20]. Ważne, z ekologicznego

punktu, jest oznaczanie stężenia okyetylenowanych alkoholi i metabolitów

biodegradacji, gdyż ich toksyczność dla środowiska jest różna i wzrasta wraz ze

wzrostem hydrofobowości [14]. Toksyczność względem Daphni wynosi 1,3 mg/L (LD ₅₀ ) dla liniowych C ₁₂ EO ₉ i 6,1 mg/L dla rozgałęzionego C ₁₃ EO ₇ [21]. Toksyczność względem ryb jest również większa dla liniowych etoksylatów niż dla rozgałęzionych homologów [22]. Badania przeprowadzone przez Pietra Cardellini i Lino Ometto wykazały, że toksyczność oksyetylenowanych alkoholi serii C 12 wynosi (LD 50 ) 4,59 mg/L dla embrionów ryb. Udowodnili oni również, że najbardziej podatne na działanie teratogenne oksyetylenowanych alkoholi są ryby w stadium rozwoju embrionalnym (wówczas podatny na działanie AE jest nabłonek i skrzela) [23].

Wyraźnym przykładem działania związków powierzchniowo czynnych na organizmy żywe są badania opublikowane w pracy Pietra Cardellini i Lino Ometto (Rysunek 5).

Badania wykazały, że już po 24 godzinach, zarodki traktowane alkilo etoksysulfonianami (ang. Alkyl ethoxy sulfates – AES) (LC ₅₀ ) wykazywały miejscowe zmniejszenie masy endodermalnego żółtka (wklęsły zarys brzusznej powłoki) (Rysunek 4c), a podczas kolejnych dni widoczne były opóźnienia w rozwoju (zwłaszcza na odcinku ogona); obrzęk serca lub brzucha (Rysunek 4f, 4i). Opóźnienia w rozwoju zarodków bardziej widoczne były u osobników traktowanych oksyetylenowanymi alkoholami (LC ₅₀ ), w których trudne było ustalenie etapów wzrostu: wystąpiła utrata pigmentacji, szczególnie w oku i wystąpiła mikrocefalia (nienaturalnie małe wymiary czaszki)(Rysunek. 4b , 4e, 4h)

Rysunek 4. Boczny widok zarodków kontrolnych (A, D, G) i zarodków poddanych działaniu

(LC 50 ) AE (b, e, h) i AES (C, F, I), wykonanych po 24, 48 i 72 godz. (opóźniony

wzrost (e, f, h, i) zmniejszona długość (e, f, h, i) oraz wady są widoczne u leczonych

osobników: obrzęk (f, h, i) utrata zabarwienia (e, h) oraz małe wymiary czaszki (e, f,

h, i)) [23].

1.3.1.4. B IODEGRADACJA

Biodegradacja to proces biochemicznego rozkładu związków organicznych przez organizmy żywe (pierwotniaki, bakterie, promieniowce, grzyby, glony, robaki) na prostsze składniki chemiczne. Produktami biodegradacji są: dwutlenek węgla, woda, biomasa oraz częściowo utlenione produkty uboczne (metabolity). W procesie biodegradacji oksyetylenowanych alkoholi biorą udział bakterie, które wytwarzają enzymy powodujące hydrolizę [24]. Surfaktant w wyniku reakcji enzymatycznej ulega centralnemu rozszczepieniu. Produktami tego rozszczepienia są długołańcuchowe poli(glikole etylenowe) – PEG oraz alkohol tłuszczowy [25]. Biodegradacja surfaktantów jest jednym z najbardziej opisanych procesów dotyczących tych związków. Bakterie są prawdopodobnie największą grupą organizmów odpowiedzialnych za rozpad wiązań w związkach powierzchniowo czynnych, mikroorganizmy wykorzystują te substancje jako źródło energii [26]. Możliwe ścieżki biodegradacji tych związków opisane w literaturze to centralne rozszczepienie [4], ω, β oksydacja, hydroliza utlenianie i „obcinanie” grup etoksylowych (Rysunek 5).

Rysunek 5. Schemat ścieżek biodegradacji oksyetylenowanego alkoholu [26]

2. T ECHNIKI UŻYWANE DO WYDZIELANIA ZWIĄZKÓW POWIERZCHNIOWO CZYNNYCH Z MATRYCY WODNEJ

Związki powierzchniowo czynne występują często w ilościach śladowych (ppb lub

mniej) w matrycach środowiskowych, często poniżej granicy wykrywalności większości

technik analitycznych. Dlatego też konieczne jest przeprowadzenie nie tylko ich

ekstrakcji, lecz również ich zatężania do osiągnięcia właściwego poziomu stężeń umożliwiającego identyfikację i oznaczanie.

Istnieje wiele technik wykorzystywanych do zatężania i wydzielania analitów z wodnych próbek środowiskowych, które przydatne są w analizie związków powierzchniowo czynnych i metabolitów ich biodegradacji.

Najstarszą z nich jest ekstrakcja ciecz-ciecz (ang. Liquid-Liquid Extraction – LLE) jest ona pierwszą szeroko rozpowszechnioną techniką separacji związków powierzchniowo czynnych (wykorzystywaną zarówno do surfaktantów jonowych i niejonowych). Izolacja polega na wykorzystaniu różnicy względnej rozpuszczalności związków w dwóch niemieszających się fazach, zazwyczaj jedną z nich jest woda a drugą rozpuszczalnik organiczny.

Niektóre kationowe związki powierzchniowo czynne [27, 28] jak również anionowe związki powierzchniowo czynne [29, 30] są ekstrahowane przy użyciu chloroformu, natomiast dichlorometan [31] i octan etylu [32] wykorzystuje się do ekstrakcji niejonowych surfaktantów.

Główną zaletą stosowania techniki LLE jest to, że może być ona stosowana do oznaczania całkowitego stężenia tych związków w wodzie. Niestety związki te wykazują tendencję do gromadzenia się na granicy dwóch faz i tworzenia emulsji.

Utrudnia to dokładne oddzielenie fazy organicznej podczas ekstrakcji. Można uniknąć tego zjawiska tworząc pary jonowe surfaktantu z reagentem [33] (np. błękit disulfonowy) dla kationowych związków powierzchniowo czynnych [34 - 36] błękitem metylenowym [29, 30, 37] albo zielenią metylenową dla anionowych surfaktantów [38], modyfikowanym odczynnikiem Dragendorffa dla niejonowych [32]).

Inną techniką ekstrakcji jest ekstrakcja do fazy stałej (ang. Solid Phase Extraction – SPE) Szeroka dostępność wypełnień do ekstrakcji do fazy stałej sięga 35 lat, jednak użyteczność tej techniki, zwłaszcza do analiz próbek środowiskowych rozwijała się dość wolno. Dość długo preferowaną techniką do wydzielania analitów z próbek środowiskowych była technika LLE [39]. Dopiero w latach dziewięćdziesiątych dwudziestego wieku, wraz z automatyzacją procesu SPE i wprowadzeniem nowych faz stacjonarnych technikę SPE zaczęto używać do wydzielania analitów z matryc wodnych [39]. Obecnie SPE jest najbardziej rozwiniętą techniką zatężania i oczyszczania próbek wykorzystywaną w analizach związków powierzchniowo czynnych. Do ekstrakcji ciecz-ciecz potrzebna jest duża objętość próbki (100-500 mL), zużywana jest ogromna objętość toksycznych rozpuszczalników organicznych;

natomiast technika SPE jest generalnie szybsza, objętość próbki potrzebna do

przeprowadzenia ekstrakcji i objętość rozpuszczalnika są o wiele mniejsze

(odpowiednio 7-100 mL i 5-20 mL).

Ekstrakcja do fazy stałej polega na przepuszczeniu próbki wodnej przez specjalne wypełnienie (fazę stałą), gdzie zatrzymywane są anality z próbki wodnej, a sole i inne składniki matrycy nie ulegają adsorpcji na złożu. Docelowo anality są wymywane ze złoża, przy użyciu minimalnej objętości rozpuszczalnika organicznego.

SPE jest szeroko stosowaną techniką do izolacji anionowych związków powierzchniowo czynnych z matrycy wodnej, faza oktadecylowa (C18) używana jest do izolacji alkilosulfonianów i produktów ich biodegradacji, gdzie eluentem jest metanol (najpopularniejszy ekstrahent) [40, 41]. Ze względu na ujemny ładunek związków, do SPE anionowych związków powierzchniowo czynnych używany jest także aniono- wymienne wypełnienie SAX (ang. Strong Anionic-Excange) często w połączeniu z wypełnieniem C18 dla lepszego oczyszczenie próbki. Mieszaniną wymywającą jest w tym przypadku mieszanina metanolu z kwasem solnym [42 - 45]. Przez obniżenie pH próbki lub przez dodatek soli (np. chlorku sodu) można zwiększyć odzysk większości polarnych związków [41, 42]. Inni badacze preferują wypełniania z grafityzowanego węgla (ang. Graphitized Black Carbon - GBC) [46, 47] lub wypełnienie sytren- divinylobenzen, [48] które także dają dobre odzyski. Inne anionowe surfaktanty (alkilo sulfoniany (AS) i alkilo etoksy sulfoniany) są wydzielane z matryc środowiskowych:

takich jak: ścieki, wody powierzchniowe, ekstrakty osadów; na krzemionce modyfikowanej grupami oktadecylowymi [40, 43] jak również na grafityzowanym węglu [49, 50].

W przypadku niejonowych związków powierzchniowo czynnych, opracowano wiele różnych metod do wydzielenia oksyetylenowanych alkohoil, oksyetylenowanych alkilofenoli i produktów ich biodegradacji z próbek wodnych. Grafityzowany węgiel [51, 52] jak również wypełnienia krzemionkowe (C2 do C18) [53 - 55] przy użyciu metanolu, dichlorometanu, octanu etylu i acetonitrylu jako roztworu wymywającego okazały się dobrym rozwiązaniem. Czasami łączy się wyżej wymienione wypełnienia z wypełnieniem kationowymiennym i aniono wymiennym [52, 55] dla lepszego usunięcia potencjalnych anionowych i kationowych zanieczyszczeń, na których to wypełnieniach NZPC nie zatrzymują się ze względu na ich obojętny ładunek.

Dodatkowo, wypełnienie C18 stosowane jest do ekstrakcji większości metabolitów biodegradacji etoksylatów nonylofenoli składających się z nonylofenolu (ang.

Nonylphenol – NP) i krótkiego łańcucha oligomerów (NP _1-3 EO _x ), - tlenek etylenu (ang.

Ethylene Oxide) w której to ekstrakcji do wymycia stosuje się głownie metanol, aceton i dichlorometan [56, 57].

Poza konwencjonalnymi kolumienkami do SPE używano także dysków SAX, do

ekstrakcji poli(karboksylowanych nonynofenoli) z ekstraktu osadów ściekowych.

Cassani i współpracownicy [58] zastosowali także wypełnienia C18 do oznaczenia oksyetylenowanych alkoholi w próbkach ścieków i osadów ściekowych.

Większość naukowców wykorzystuje wypełnienia C18 [59, 60] i grafityzowany węgiel [49, 50], ponieważ są to wypełnienia odpowiednie do wydzielania szerokiej gamy anionowych związków powierzchniowo czynnych i niejonowych związków powierzchniowo czynnych (takich jak: oksyetylenowane alkohole i oksyetylenowane alkilofenole) jak również polarnych produktów biodegradacji tych związków poli(etylenowanych glikoli) (ang. poly(ethylene glycols) – PEGs), poli(karboksylowanych nonylofenoli) (ang. Nonylophenol polyethoxycarboxylates – NPECs) w jednym etapie ekstrakcji używając mieszani heksanu, dichlorometanu, metanolu, acetonu i octanu etylu jako rozpuszczalników wymywających.

Badano także nowe polimerowe wypełnienia [57, 61, 62] takie jak hydrofilowo- lipofilowy kopolimer Oasis HLB [63] Lara-Martin i współpracownicy użyli tego wypełnienia jako alternatywnego wypełnienia do ekstrakcji alkilio sulfonianów, oksyetylenowanych nonylofenoli i ich karboksylowanych metabolitów, jak również oksyetylenowanych alkoholi i ich polarnych metabolitów poli(etylenowanych glikoli) z próbek wodnych w jednym etapie ekstrakcji.

Badania prowadzone w celu wydzielania kationowych związków powierzchniowo czynnych przy zastosowaniu wypełnień SPE z próbek wodnych [64 - 67] i próbek osadów ściekowych [68] wykazały, że technika SPE ma ograniczone zastosowanie dla tych związków. Niepolarne wypełnienia (np. C18) nie są odpowiednie dla czwartorzędowych związków amoniowe przez silne oddziaływania tych związków z grupami silanowymi i bardzo szerokimi pasmami elucji [69]. Problem ten częściowo rozwiązano wykorzystując naturalne polimerowe wypełnienia [66, 68] , jednakże lepsze wyniki osiąga się używając siarczanu dodecylosodowego (SDS) połączonych z żywicami anionowymiennymi [64, 65, 67]. Najefektywniejszą metoda ekstrakcji kationowych związków powierzchniowo czynnych jest jednak ekstrakcja ciecz-ciecz [70].

Postęp w dziedzinie ekstrakcji do ciała stałego, jaki dokonał się na przestrzeni

ostatnich lat, doprowadził do powstania nowej techniki ekstrakcji za pomocą

rozpuszczalnika z próbki zmieszanej z wypełniaczem (ang. Matrix Solid-Phase

Dispersion, MSPD), która jest używana jako metoda oczyszczania związków z matryc

stałych. Technika ta została zastosowana do próbek ryb, gdzie fragmenty zmieszano

z wypełnieniem C18 w kolumience, w celu wydzielenia alkilosulfonianów i niejonowych

surfaktantów [71]. Stosuje się silnie niepolarny eluent (np. Heskanu) i metanol do

usunięcia tłuszczów (w etapie przemycia) i odpowiednio ekstrakcji surfaktantów w

etapie elucji. Zaletami tej metody są: krótki czas i prostota przygotowania, redukcja zużycia rozpuszczalników organicznych [72 - 81].

Technika dyspersyjnej mikroekstrakcji w układzie ciecz-ciecz (ang. Dispersive Liquid-Liquid Microextraction - DLLME) to nowa technika opierająca się na migracji analitów w postaci bardzo małych kropli do roztworu, którego zmętnienie wywołane jest przed dyspersję rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (niska rozpuszczalność w wodzie; np.

chloroform) do mieszaniny dyspersyjnej (rozpuszczalnej w wodzie np. aceton) w próbkach wodnych. Po migracji małe zdyspergowane cząsteczki ekstraktu zawierające anality są odwirowywane. Główne trudności związane z DLLME to: niestabilność kropli rozpuszczalnika przy działaniu sił fizycznych powodujące problemy z automatyzacją procesu. Problem ten można rozwiązać przez zastosowanie membran kapilarnych, które są impregnowane organicznym rozpuszczalnikiem (np. 1-oktanol) i umieszczone w próbce wodnej zawierającej związki powierzchniowo czynne. Membrana kapilarna, jest usuwana z próbki a anality desorbowane przez dyfuzje do innego rozpuszczalnika (np. metanolu) [72]. Technika ta została zastosowana do wydzielania kationowych [72, 73], niejonowych [74] i anionowych związków powierzchniowo czynnych [75] z próbek wodnych.

Mikroekstrakcja do fazy stałej (ang. Solid Phase Microextraction, SPME) i ekstrakcja ruchomym elementem sorpcyjnym (ang. Stir Bar Sorptive Extraction, SBSE) może być także skutecznym narzędziem do ekstrakcji surfaktantów. Obie techniki opierają się na przenoszeniu analitów bezpośrednio z próbki, bez udziału jakichkolwiek organicznych rozpuszczalników, do włókien lub elementu sorpcyjnego wykonanych ze specjalnego polimeru. Objętość polimeru waha się od 0,5 µL w włóknach do SPME do 300 µL w elementach sorpcyjnych w SBSE. Testowano różne typy włókien w technice SPME, w celu separacji anionowych związków powierzchniowo czynnych: pierwszym z nich był polidimetylosiloksan (PDMS) [76], poliakrylan (PA) [77] natomiast do niejonowych związków powierzchniowo czynnych używane są: żywica carbowax (CWAX/TR) [78], polidimetylosiloksan /divinylobenzen (DVB), PA [79]. Do tej pory użyto techniki SBSE do ekstrakcji nonylofenoli i oktylofenoli z próbek wodnych [80]. Po adsorpcji na powierzchni polimeru, anality były termicznie desorbowane bezpośrednio w dozowniku chromatografu gazowego lub w małej ilości rozpuszczalnika organicznego (desorpcja w przypadku chromatografii cieczowej).

3. M ETODY OZNACZANIA ZWIĄZKÓW POWIERZCHNIOWO CZYNNYCH

Przez ostatnich kilka dekad analiza surfaktantów w próbkach środowiskowych była

wykonywana przy użyciu kilku technik instrumentalnych. Do tej pory spektrofotometria,

potencjometria czy tensammetria były optymalnymi technikami do pomiaru całego spektrum jonowych [82 - 84] i niejonowych związków powierzchniowo czynnych [85, 86]. Niestety czułość i specyficzność tych technik jest bardzo niska w porównaniu z technikami chromatograficznymi połączonymi z różnego typu detektorami, stąd obserwuje się duże zainteresowanie tymi technikami w oznaczaniu związków powierzchniowo czynnych.

3.1. M ETODY SPEKTROFOTOMETRYCZNE

Techniki spektrofotometryczne znalazły zastosowanie w rutynowych analizach środowiskowych ze względu na ich szybkość i prostotę. Metodę spektrofotometryczną stosuje się do określenia sumarycznego stężenia surfaktantów, polega ona na utworzeniu specyficznych par jonowych analitów i ekstrakcji ich do rozpuszczalnika organicznego. Pomiary spektrofotometryczne wykonywane są w zakresie światła widzialnego oraz ultrafioletu. Pomimo wielu zalet metod spektrofotometrycznych techniki te mają również wady takie jak generowanie dużych ilości toksycznych odpadów (np. chloroform) i ograniczenie do całkowitego określenia stężenie związków w próbce [87 - 89].

3.2. M ETODY ELEKTROANALITYCZNE

Metody elektroanalityczne charakteryzują się dużą czułością oraz krótkim czasem analizy [90, 91]. Pomiar polega na ocenie prądu pojemnościowego związanego z procesami adsorpcji analitów na powierzchni elektrody. Metody te są przeznaczone do oznaczania całkowitego stężenia jonowych i niejonowych związków powierzchniowo czynnych [83].

W dzisiejszych czasach ważne jest oznaczenie nie tylko całkowitego stężenia ZPC ale również udziału poszczególnych homologów w próbkach środowiskowych. Takie możliwości dają techniki chromatograficzne chromatografia: gazowa i cieczowa w połączeniu z różnego typu detektorami.

3.3. M ETODY CHROMATOGRAFICZNE I TECHNIKI ŁĄCZONE

3.3.1. C HROMATOGRAFIA GAZOWA

Chromatografia gazowa (ang. Gas Chromatography – GC) jest częściej używanym narzędziem do analizy surfaktantów od wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

Wadą tej techniki jest to, że zarówno wszystkie anionowe i niejonowe związki

powierzchniowo czynne i ich metabolity trzeba poddać reakcji przeprowadzenia

w pochodne ze specyficznymi odczynnikami, aby rozwiązać problem lotności,

rodzielenia lub odparowania analitu przed nastrzykiem na kolumnę. Najczęściej używanymi odczynnikami derywatyzującymi są trifluoroetanol [45, 46], diazometan [92], N,O-bis(trimetylosililo)-trifluoro-acetamid (BSTFA) [53, 93, 94] bezwodnik octowy [80, 95] i bromowodór [52], jak również wiele innych reagentów. W przypadku niektórych niejonowych surfaktantów (nonylofenoli i krótko łańcuchowych oksyetylenowanych nonylofenoli) możliwa jest bezpośrednia analiza przy użyciu chromatografii gazowej, gdyż związki te są lotne lecz w przypadku przeprowadzenia derywatyzacji osiąga się lepsze wyniki [31, 96]. W stosunku do oznaczania związków powierzchniowo czynnych chromatografia gazowa posiada takie zalety jak: kolumny do GC mają większą zdolność rozdzielczą do rozdzielenia homologów i izomerów wielu związków powierzchniowo czynnych po reakcji derywatyzacji. GC może być narzędziem używanym do oceny stopnia biodegradacji lub toksyczności takich związków jak alkilosulfoniany lub oksyetylenowane nonylofenole [97]. W większości badań anionowe i niejonowe związki powierzchniowo czynne były rozdzielane na niepolarnych kapilarnych kolumnach skałdających się z fazy 5% fenylo, 95%

dimetylosiloxan (np. HP-5 [45, 96, 98], SE-54 [99], DB-5 [38, 74, 80]). W tych przypadkach fazą ruchomą był hel. Do tej pory nie opisano w literaturze zastosowania chromatografii gazowej do analizy kationowych związków powierzchniowo czynnych [33].

Detektory używane do analizy w GC to detektor: płomieniowo-jonizacyjny (ang Flame-Ionization detektor FID) Był ona zastosowany do analizy anionowych surfaktantów w próbkach wodnych [100]. Często używane są spektrometry mas (MS) lub tandemowe spektrometry mas (MS/MS), ponieważ pozwalają na identyfikację analitów, przez pomiar m/z jonów macierzystych i specyficznych jonów fragmentacyjnych. Wielu badaczy zastosowało chromatografię gazową połączoną ze spektrometrem mas [62, 76, 79] lub z tandemowym spektrometrem mas [101] do analizy anionowych i niejonowych związków powierzchniowo czynnych.

3.3.2. CHROMATOGRAFIA CIECZOWA POŁĄCZONA ZE SPEKTROMETREM MAS

Chromatografia cieczowa (ang. – High Performance Liquid Chromatography) jest

techniką używaną od lat siedemdziesiątych, stosowaną do identyfikacji związków

chemicznych różnej postaci. Warunkiem koniecznym do zastosowania metody jest

rozpuszczalność próbki w fazie ruchomej. Proces chromatograficzny oparty jest na

różnej sile oddziaływań składników substancji poddawanej analizie z fazą ruchomą

(zwanej eluentem) i fazą stacjonarną (wypełnieniem kolumny chromatograficznej), a

rozdzielenie mieszaniny zachodzi w wyniku powtarzających się aktów sorpcji i

desorpcji [102]

Wyróżnia się następujące typy chromatografii cieczowej [102]:

⇒ Chromatografię adsorpcyjną (faza stacjonarna jest stałym sorbentem)

⇒ Chromatografię podziałową (faza stacjonarną jest ciecz osadzona na stałym nośniku)

⇒ Chromatografię wykluczeniową (fazą stacjonarną jest żel o ściśle określonych wielkościach porów).

Rozdzielenie chromatograficzne można prowadzić w normalnym układzie faz (ang.

Normal Phase, - NP – HPLC) lub odwróconym układzie faz (ang, Reversed Phase - RP – HPLC). W normalnym układzie faz kolumna jest bardziej polarna niż faza ruchoma, więc polarne próbki będą zatrzymywane dłużej, a mniej polarne związki będą natychmiast wymywane. Natomiast w odwróconym układzie faz wypełnienie kolumny jest mniej polarne niż eluent [102].

Proces rozdziału chromatograficznego prowadzi się w kolumnie wypełnionej sorbentem. Rozróżnia się mikrokolumny, kolumny preparatywne i najczęściej stosowane kolumny analityczne o długości 5 – 35 cm i średnicy wewnętrznej 4,6 mm.

Często w celach ochronnych stosuje się przedkolumnę (lub kolumnę ochronną), w której zbierają się zanieczyszczenia, co wpływa na wydłużenie przydatności do użycia właściwej kolumny. Wypełnieniami stosowanymi w HPLC są między innymi: żel krzemionkowy, polimery porowate i nieorganiczne tlenki pokryte polimerem. [102, 103]

Jednym z kluczowych elementów analizy HPLC jest dobór fazy ruchomej, mającej wpływ na zdolność rozdzielczą układu. Próbka wraz z eluentem przepływa przez kolumnę, jej składniki wymywane są z niej w zależności od siły oddziaływań z fazą stacjonarną. Miarą zdolności eluentu do wymywania analitów z wypełnienia kolumny jest siła elucji, charakteryzowana za pomocą indeksów polarności. W NP – HPLC siła elucji rośnie wraz ze wzrostem polarności, a stosowanymi fazami ruchomymi są między innymi: pentan, heksan, toluen, benzen. Natomiast w RP – HPLC siła elucji fazy ruchomej maleje ze wzrostem polarności i jest związana ze zdolnością rozpuszczalnika do oddziaływań van der Waalsa. Przykładowymi fazami ruchomymi stosowanymi w tej technice są: metanol, woda, etanol, aceton i ich mieszaniny. Przy zastosowaniu mieszanin rozpuszczalników można stosować elucję izokratyczną (przez cały czas analizy skład eluentu jest taki sam) lub gradientową (zmiana składu fazy ruchomej podczas analizy) [102, 103].

Detektory stosowane w chromatografii cieczowej można podzielić na dwie grupy:

detektory różnicujące i detektory wykorzystujące charakterystyczne właściwości

substancji. Do najczęściej stosowanych należą: reflaktometryczny,

spektrofotometryczny UV, fluorescencyjny, fotometryczny absorpcji w nadfiolecie

i spektrometr mas [102, 103].

Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest techniką, która znalazła zastosowanie do oznaczania między innymi środków ochrony roślin, węglowodorów policyklicznych (benzopiren), w badaniach biomedycznych i klinicznych (preparaty farmaceutyczne, antybiotyki, hormony, narkotyki) [102, 103].

3.3.2.1. S PEKTROMETRIA MAS

Dzięki szybkiemu rozwojowi technik spektrometrii mas, w tym opracowaniu nowych metod jonizacji próbki, technika ta umożliwia badanie związków polarnych, jak również skomplikowanych mieszanin związków z dużą czułością. Nowe metody spektrometrii mas wykorzystuje się w badaniu sekwencji kwasów nukleinowych, struktury i funkcji białek, kompleksów eterów, kompleksów białek [104].

3.3.2.2. B UDOWA APARATU

Spektrometr masowy niezależnie od konstrukcji i przeznaczenia jest urządzeniem mierzącym stosunek masy jonów do ładunku (m/z). Należy więc zwrócić szczególną uwagę przy interpretacji widm masowych, że zależność m/z nie zawsze musi być kojarzona z masą danego związku [105].

Spektrometr masowy składa się z kilku podstawowych elementów przedstawionych schematycznie na rysunku 6 [105].

Próbki do spektrometru można wprowadzać przy pomocy urządzeń do bezpośredniego wstrzykiwania np. strzykawkowe pompy dozujące, obecnie jednak coraz częściej stosuje się połączenie MS z różnymi typami chromatografów (chromatografu cieczowego, gazowego lub instrumentu do elektroforezy kapilarnej).

Rozwiązanie takie umożliwia przeprowadzenie analiz większej liczby składników [106].

Spektrometria mas umożliwia analizę jedynie zjonizowanych cząsteczek w fazie gazowej, dlatego funkcją źródła jonów jest przeprowadzenie analizowanych roztworów z niezjonizowanych postaci do stanu zjonizowanego. Do metod jonizacji zalicza się:

jonizację elektorami, chemiczną, pod ciśnieniem atmosferycznym i jonizację plazmą

sprzężoną indukcyjnie. [105, 106], ESI, APCI.

Rysunek.

Analizatory służą do rozdziału czą ź

masy do ładunku. Istnieje wiele typów analizatorów dobieranych w zależ ś badań, należą do nich: analizator czasu przelotu, ruchliwoś

pułapka jonowa i analizator cyklotronowy

3.3.2.2.1. E LEKTROROZPY

Elektrorozpylanie (ang.

techniką jonizacji w badaniu materiałów pochodzenia biologicznego. Zasada działania (Rysunek 7) polega na wprowadzeniu cieczy do komory jonizacyjnej przez kapilarę

której przyłożone jest napię ę ń

(najczęściej azot). Na wylocie z kapilary odrywają ę

dostarczeniu kolejnej porcji podgrzanego gazu zmniejszają ą ę ść odparowanie rozpuszczalnika.

metanol, acetonitryl, woda i ich mieszaniny. Po przekroczeniu krytycznej wielkoś tracą stabilność i rozpadają

kumulację ładunku elektrycznego na ich powierzchni. Proces ten w konsekwencji prowadzi do powstania jonów, które są

powstałe przy użyciu techniki ESI mają

zastosowanie jej do oznaczania indywiduów chemicznych mają oddziaływania niekowalencyjne

Rejestracja i opracowanie danych (komputer)

Rysunek. 6. Schemat budowy spektrometru masowego [105]

do rozdziału cząsteczek powstałych w źródle jonów, w funkcji ich . Istnieje wiele typów analizatorów dobieranych w zależ ś

ń żą do nich: analizator czasu przelotu, ruchliwości jonów, kwadrupolowy, pułapka jonowa i analizator cyklotronowy [105, 106].

LEKTROROZPYLANIE

Elektrorozpylanie (ang. – Electrospray- ESI) jest najbardziej rozpowszechnioną ą jonizacji w badaniu materiałów pochodzenia biologicznego. Zasada działania

polega na wprowadzeniu cieczy do komory jonizacyjnej przez kapilarę żone jest napięcie rzędu kilku kV, na końcu której doprowadzony jest gaz ęściej azot). Na wylocie z kapilary odrywają się drobne kropelki, które po

ejnej porcji podgrzanego gazu zmniejszają swoją ę ść odparowanie rozpuszczalnika. Do najczęściej używanych rozpuszczalników należą metanol, acetonitryl, woda i ich mieszaniny. Po przekroczeniu krytycznej wielkoś

ą ść i rozpadają się, co powoduje zmniejszenie ich iloś ż ę ładunku elektrycznego na ich powierzchni. Proces ten w konsekwencji prowadzi do powstania jonów, które są dalej analizowane w spektrometrze mas. Jony życiu techniki ESI mają nadmiar energii wewnętrznej, co wpływa na zastosowanie jej do oznaczania indywiduów chemicznych mających w swojej budowie oddziaływania niekowalencyjne [104, 105, 107, 108].

Układ wprowadzania próbki

Ź ródło jonów

Analizator

Detektror

Rejestracja i opracowanie danych (komputer)

[105]

ą źródle jonów, w funkcji ich . Istnieje wiele typów analizatorów dobieranych w zależności od celu

ń żą ści jonów, kwadrupolowy,

jest najbardziej rozpowszechnioną ą jonizacji w badaniu materiałów pochodzenia biologicznego. Zasada działania polega na wprowadzeniu cieczy do komory jonizacyjnej przez kapilarę, do

ż ę ę ńcu której doprowadzony jest gaz

ęś ą ę drobne kropelki, które po

ą swoją objętość, przez ęś żywanych rozpuszczalników należą:

metanol, acetonitryl, woda i ich mieszaniny. Po przekroczeniu krytycznej wielkości

ę, co powoduje zmniejszenie ich ilości, jak również

ę ładunku elektrycznego na ich powierzchni. Proces ten w konsekwencji

ą dalej analizowane w spektrometrze mas. Jony

ętrznej, co wpływa na

ących w swojej budowie

Widma masowe ESI przedstawiają najczęściej serię pików odpowiadających kolejnym, protonowanym widmom atomowym, natomiast nie zawierają praktycznie pików powstałych na skutek dysocjacji i fragmentacji jonów [107].

Do otrzymywania widm ESI złożonych mieszanin należy połączyć spektrometr mas z chromatografią cieczową [107].

Rysunek 7. Schemat procesów zachodzących w źródle jonów [104, 108]

Do podstawowych zalet elektrorozpylania należą [105]:

⇒ jonizacja w warunkach ciśnienia atmosferycznego,

⇒ jonizacja bez fragmentacji,

⇒ otrzymywanie jonów wielokrotnie naładowanych.

3.3.2.2.2. A NALIZATOR KWADRUPOLOWY

Analizator kwadrupolowy zbudowany jest z czterech prętów, mających przekrój

hiperboliczny. Jony poruszające się wzdłuż osi podlegają działaniu pola elektrycznego,

składającego się z pola zmiennego nałożonego na pole stałe. Spowodowane to jest

przyłożeniem do prętów odpowiednich potencjałów. Pary prętów działają jak filtry dla

mas wyższych i niższych od masy wybranej, natomiast cząsteczka o wybranym

stosunku m/z uzyskuje stabilną drogę lotu i przechodzi do detektora [105, 107]. Na

rysunku 8 przedstawiono schemat analizatora kwadrupolowego.

Rysunek 8. Analizator kwadrupolowy [107]

Kwadrupole wykorzystuje się także w spektrometrach, gdzie używa się wielu szeregowo połączonych analizatorów. Rysunek 9 przedstawia schemat takiego analizatora. Potrójny kwadrupol składa się z dwóch analizatorów kwadrupolowych (Q1, Q3) rozdzielonych komorą kolizyjną (Q2). Jony, które są generowane przez źródło jonów trafiają do animatora Q1, w którym następuje „selekcja” dalej przepuszczane są tylko jony o wybranej wartości m/z. Następnie trafiają one do komory kolizyjnej (Q2), do której wprowadzane są cząsteczki gazu obojętnego, które po kolizji z jonami powodują ich rozpad. Fragmenty trafiają do analizatora Q3, gdzie są rozdzielane za względu na ich wartość m/z, co pozwala na zapisanie widma fragmentacyjnego [105, 107].

Rysunek 9. Schemat aparatu z tzw. „potrójnym kwadrupolem”. Pierwszy i środkowy są spektrometrami mas; środkowy jest komorą kolizyjną zbudowaną z kwadrupola [105]

Zaletami analizatora kwadrupolowego są [105]:

⇒ niewielkie wymiary,

⇒ możliwość szybkiego skanowania,

⇒ wysoka transmitancja,

⇒ relatywnie niska cena.

Kwadrupol ma dość wąski zakres pomiarowy, można go jednak poszerzyć przez połączenie ze źródłem jonów typu ESI. Wielokrotna jonizacja analizowanej substancji pozwala na analizę większych cząstek mimo ograniczonego zakresu mas [105].

3.3.2.3. A NALIZA ILOŚCIOWA I JAKOŚCIOWA W TANDEMOWEJ SPEKTROMETRII MAS Potrójny kwadrupol jest jedną z najpopularniejszych konfiguracji spektrometrów masowych. Może on zostać wykorzystany w kilku trybach, które pozwalają na analizę jakościową i ilościową substancji [105].

3.3.2.3.1. S KANOWANIE JONÓW POTOMNYCH

Tryb skanowania jonów potomnych (ang. – daughter product ion scan) polega na ustawieniu analizatora Q1 tak, aby przepuszczał jony o ustalonej wartości m/z i odczycie otrzymanych mas w analizatorze Q3 (komora kolizyjna jest wówczas pozbawiona dopływu gazu kolizyjnego [105].

3.3.2.3.2. S KANOWANIE JONÓW MACIERZYSTYCH

Skanowanie jonów macierzystych (ang. – parent scan) polega na takiej konfiguracji analizatora Q3, aby przepuszczał wyłącznie fragmenty o wybranej masie, wówczas analizator Q1 może skanować jony i wykryć wszystkie jony macierzyste, z których powstaje wybrany fragment. Taki tryb pracy przydatny jest w analizie i porównywaniu związków o zbliżonej strukturze dających takie same fragmenty [105].

3.3.2.3.3. M ONITOROWANIE WIELU REAKCJI

Monitorowanie wielu reakcji (ang. – Multiple Reaction Monitoring - MRM) polega na

ustawieniu analizatorów Q1 i Q3 na transmisję wybranych mas. Do detektora docierają

wówczas wyłącznie jony fragmentacyjne o wybranej wartości m/z powstałe

z konkretnego prekursora. Przebieg chromatogramu MRM dla wybranej pary prekursor

– fragment jest odzwierciedleniem rzeczywistego zachowania się obserwowanego

składnika na kolumnie chromatograficznej. Tryb MRM pozwala na weryfikację

i właściwą identyfikację analizowanej cząsteczki (w analizach prowadzonych dla

sądownictwa tryb MRM przy obecności jonu macierzystego i jednego lub dwóch jonów

potomnych jest wymagany do jednoznacznej identyfikacji analitu) Tryb tenpozwala

również na analizę ilościową analitów. [105].

3.3.2.4. Z ASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ DO OZNACZANIA ZWIĄZKÓW POWIERZCHNIOWO CZYNNYCH

Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest obecnie najczęściej używaną techniką do rozdziału i analizy mieszanin surfaktantów w próbkach środowiskowych, głównie z powodu możliwości analizy związków w dużym zakresie mas bez konieczności wcześniejszej derywatyzacji. Kolumny do odwróconej fazy głównie RP-18 [59, 66, 77] i RP-8 [42, 65], są często używane do rozdzielania anionowych i niejonowych związków powierzchniowo czynnych według długości łańcucha alkilowego. Fazą ruchomą są zazwyczaj mieszaniny zawierające wodę, acetonitryl i metanol. Rozdzielczość można poprawić przez dodatek np. octanu amonu, kwasu octowego, kwasu mrówkowego) [41, 51, 68]. Kilka prac ukazuje doskonały rozdział oksyetylenowanych nonylofenoli i ich metabolitów [109] na kolumnach amino krzemionkowych lub cyjanowych w normalnym układzie faz, gdze rozdział dokonywany jest według długości części hydrofilowej. Elucja składników jest wówczas odwrócona (hydrofobowe związki takie jak nanylofenole eluują na początku, natomiast oksyetylenowane nonylofenole na końcu) w tym przypadku preferowane są niepolarne rozpuszczalniki (np. heksan, chloroform czy izopropanol).

Zespół Lee Fergusona [56, 110] przetestował kolumnę pakowaną polimerem C8 przeznaczoną do rozdziału oksyetylenowanych surfaktantów (oksyetylenowanych nonylofenoli i nonylofenoli) przy zastosowaniu odwróconego układu faz. Inni badacze także zastosowani tą technikę do oznaczania oktynofenoli i oksyetylenowanych oktylofenoli w próbkach środowiskowych [57]. Do rozdziału kationowych i niejonowych związków powierzchniowo czynnych zastosowano również wypełnienie zawierające grupy hydrofobowe (łańcuch węglowy) i hydrofilowe grupy funkcyjne (amidowe) [111].

Alkilo sulfoniany i oksyetylenwoane nonylofenole) i ich metabolity są odpowiednimi związkami do zastosowania techniki HPLC połączonej z detektorem UV lub fluorescencyjnym. Powodem tego jest występowanie w ich strukturze pierścienia aromatycznego umożliwiającego detekcję wyżej wymienionymi detektorami [112, 113, 109, 114, 115].

Chromatografia cieczowa połączona z detektorem fluorescencyjnym została użyta

jako narzędzie do rozdzielenia izomerów i układu łańcucha alkilowego w

alkilosulfonianach w próbkach wody rzecznej [116]. Oksyetylenowane alkohole

i oksyetylenowane alkilosulfoniany nie mogą zostać bezpośrednio oznaczone

z wykorzystaniem detektora UV ze względu na brak grupy aromatycznej, dopiero po

przeprowadzeniu reakcji derywatyzacji z izocyjanianem fenylu [117], izocyjanianem

naftylu lub chlorkiem naftylu [50, 118], możliwa jest ich detekcja UV.