PRACE ORYGINALNE
Małgorzata ZWOLIŃSKA-WCISŁO Tomasz BRZOZOWSKI
AlicjaBUDAK Zbigniew ŚLIWOWSKI Danuta DROZDOWICZ Sławomir KWIECIEŃ Danuta TROJANOWSKA LucynaRUDN1CKA-SOSIN Tomasz MACH
StanisławJ. KONTUREK Wiesław W. PAWLIK Aneta TARGOSZ
Wpływ kolonizacji grzybów Candida na gojenie zmian zapalnych błony śluzowej jelita grubego w modelu zwierzęcym colitis ulcerosa
Studies on the influence of Candida fungal colonization on the healing process of inflammatory lesions
in the colon in rat animal model
Katedra Fizjologii Kliniczneji Doświadczalnej CollegiumMedicum
UniwersytetuJagiellońskiego wKrakowie Kierownik:
Prof, dr hab. med. Wfes/aw W. Pawlik
Klinika Gastroenterologiii Hepatologii CollegiumMedicum
Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie Kierownik:Prof,dr hab. med. Tomasz Mach
Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej CollegiumMedicum
UniwersytetuJagiellońskiegow Krakowie CollegiumMedicum
Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie Kierownik:Prof,dr hab. Alicja Budak
Katedra Patomorfologu Klinicznej iDoświadczalnejCollegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie Kierownik: Prof,dr hab. med.Jerzy Stachura
Dodatkowe słowakluczowe:
Candida jelito grube
zapalenie jelita grubego szczury
Additionalkey words:
Candida colon colitis rats
Adres do korespondencji:
Prof, dr hab. n. med. Tomasz Brzozowski Katedra Fizjologii Klinicznej i Doświadczalnej CM UJ
31-501 Kraków, ul. Grzegórzecka 16 e-mail: mpbrzozo@ cyf-kr.edu.pl
Współczesne zasady leczenia nie
swoistych zapaleń przewodu pokar
mowego (NZPP) wynikają z lepszego zrozumienia ich patofizjologii, wskutek rozwoju badań podstawowych. Do nie
dawna badania nad wpływem drobno
ustrojów na gojenie się zmian zapal
nych w jelicie grubym koncentrowały się na roli bakterii. W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie obecnością grzybów w przewodzie pokarmowym.
W niniejszych badaniach na modelu zwierzęcym wrzodziejącego zapalenia jelita grubego przeprowadzono anali
zę wpływu kolonizacji grzybiczej jelita grubego na nasilenie zmian zapalnych w jelicie oraz przebieg gojenia owrzo- dzeń w doświadczalnym modelu coli
tis ulcerosa. W ocenie różnic w goje
niu pomiędzy badanymi grupami bra
no pod uwagę kryteria makroskopowe i mikroskopowe oraz wagę badanych fragmentów jelita grubego. Badano parametry wskazujące na nasilenie zmian zapalnych w jelicie poprzez ocenę jelitowego przepływu śluzówko- wego (CBF) i poziom MPO, jak również poziom interleukiny (IL-1 (3) i czynnika martwicy guzów (TNF-a). Podanie do
odbytnicze szczurom haptenu kwasu trinitrobenzenosulfonowego (TNBS) indukowało w 3 dobie nekrotyczne uszkodzenia błony śluzowej jelita gru
bego oraz wzrost masy zmienionego zapalnie odcinka jelita grubego, spa
dek śluzówkowego przepływu krwi i 4- 5 krotny wzrost aktywności MPO. Zna
mienna kolonizacja grzybicza Candida w jelicie grubym szczurów opóźniła gojenie się zmian zapalnych wywoła
nych TNBS i efekt ten korelował z ob
serwowanym spadkiem CBF w obsza
rze owrzodzeń, wraz z towarzyszącą wzmożoną ekspresją cytokin IL-1 p i TNF-a w surowicy krwi. Podanie leku przeciwgrzybiczego (flukonazol) lub probiotyku (Lacidofil) u szczurów in
fekowanych przez Candida przyspie
szało gojenie się zmian zapalnych w jelicie grubym. Powierzchnie owrzo
dzeń w tych grupach były statystycz
nie istotnie mniejsze w porównaniu z
Present- day methods of success
ful treatment of inflammatory bowel diseases (IBD) result from a better un
derstanding of their pathophysiology due to advances in preclinical studies in this area of knowledge. Until re
cently microbiological studies have been focused on the bacterial aspects in pathogenesis of Gl disorders, how
ever in the last years an interest in the presence of fungi in the gastrointe
stinal tract has also increased. In this study using an animal model of ulcera
tive colitis, the impact of fungal colo
nization of the colon on the intensity of inflammatory changes in the colonic mucosa and the course of their heal
ing was carried out. The macroscopic and microscopic criteria relating to the changes of weight of examined frag
ments of the colon were evaluated while assessing differences between groups tested. The intensity of intesti
nal inflammatory changes was deter
mined by assessment of such param
eters, as colonic blood flow (CBF), the level of MPO as a marker of colonic neutrophil infiltration intensity and the plasma levels of IL-1 P; and TNF-a con
centrations. Results at the 3rd day af
ter TNBS rectal administration re
vealed an increase of weight of iso
lated segments of inflammed colon, a decrease of CBF and the 4-5 fold in
crease of plasma MPO activity. Can
dida colonization of colon mucosa of rats delayed healing of colonic ulcers, induced by TNBS and this was asso
ciated with the increased expression of plasma IL-ip and TNF-a levels. Ad
ministration of antifungal (fluconazole) or probiotic (Lacidofil) treatment to C.
albicans infected rats exerted favo
rable effect on healing of inflammatory changes in the colon because the area of ulcerations in groups of rats treated with fluconazole or Lacidofil was sig
nificantly smaller in comparison with those inoculated with Candida solution only. Administration of fluconazole or Lacidofil significantly decreased the weight of colon segments, the MPO
grupą kontrolną lub otrzymującą wyłącznie Candida albi
cans. Podanie flukonazolu lub probiotyku spowodowało spadek wagi bioptatów z jelita grubego w porównaniu z grupą zwierząt zakażonych przez Candida. Wyniki niniej
szych badań dowodzą przedłużenia gojenia zmian zapal
nych wywołanych przez TNBS w szczurzym jelicie grubym pod wpływem Candida. W tych warunkach implementa
cja probiotyku przyspiesza gojenie uszkodzeń błony ślu
zowej jelita grubego poprzez redukcję zmian zapalnych wyrażonych wskaźnikami zmian makro- i mikroskopo
wych, spadkiem wagi badanego odcinka jelita a także za
hamowaniem aktywności MPO, TNF-a i IL-1ß w surowicy krwi.
activity and the plasma IL-1 pand TNF-a levels, as compared with respective values in the group receiving Candida only.
The results of our studies indicate the deteriorating influ
ence of Candida on the healing process of inflamed colon in the animal model of ulcerative colitis. Concomitant therapy with probiotic or antifungal treatment improved healing of colonic lesions, decreased the weight of inflamed colonic tissue and also attenuated the MPO activity and plasma proinflammatory cytokines IL-ip and TNF-a levels.
Wstęp
Wrzodziejące zapalenie jelita grubego oraz choroba Leśniowskiego-Crohna nale
żą do nieswoistych zapaleń przewodu po
karmowego (NZPP). Współczesne zasady skutecznej terapii tych chorób wynikają z lepszegozrozumienia ich patofizjologii, wskutek rozwoju badań doświadczalnych, zmierzającychdo stworzenia doświadczal
negomodelu colitisulcerosa, naśladujące gozmiany wjelicie grubym towarzyszące temu schorzeniu u ludzi [2, 3,18, 23, 25].
Uważa się, że w etiopatogenezie NZPP biorą udział trzy podstawowe czynniki, ta
kiejak: osobnicza podatnośćbłony śluzo
wej jelita na uszkodzenia, mikroflora prze
wodu pokarmowe gooraz własności immu nologiczne błony śluzowej przewodu pokar
mowego [8,11,23]. W ostatnim czasiewzro
sło zainteresowanie udziałem drobnoustro
jów w etiopatogenezie tych chorób [1, 4, 6, 9, 23, 27].
Mikroflora przewodu pokarmowego może ulegać modyfikacji pod wpływem czynników wewnątrzpochodnych, takich jak wydzielanie kwasusolnego, motorykażo
łądka i jelit, układ immunologicznygospo
darza lub czynników zewnątrzpochodnych, w tym głównie przyjmowanych leków, prze
bytych infekcji bakteryjnych i grzybiczych orazdiety[15-17, 21, 24].
Istotną rolę czynnika mikrobiologiczne
go wetiopatogenezie NZPP wydająsiępo
twierdzać wyniki badańeksperymentalnych na zwierzętach, którewskazują na brak możliwości prawidłowej ocenytychzmian w modelu zapaleniajelita grubego wwarun kachjałowego środowiska przewodu pokar
mowego [25]. Do niedawna obserwacjemi krobiologiczne koncentrowały się głównie na roli zakażeniabakteryjnego wjelicie, leczw ostatnich latach wzrosło zainteresowanie także obecnościągrzybów w przewodzie pokarmowym.
Przewód pokarmowyjest głównym re zerwuarem grzybówzrodzaju Candida, któ
re zaliczasię dosaprofitów przewodu po
karmowego [1, 5, 7]. Cohen i wsp. wykazali obecność gatunkuCandida w jamie ustnej, jelicie czczym ikrętymuodpowiednio30%, 54%i 55% zdrowych osób [7].Wraz z za
interesowaniem udziałem drobnoustrojów w etiopatogenezie nieswoistychzapaleń prze
wodu pokarmowego, zanotowano wzrost zainteresowania roląprobiotyków, które należądo drobnoustrojów występujących w pożywieniu. Stwierdzono, że probiotyki po
przez zmianę układu mikroflory przewodu
pokarmowego, a zapewne także poprzez aktywację układu immunologicznego, mogą wywierać korzystny wpływ na leczenie i ewentualną profilaktykę nawrotu objawów choroby. Wstępne wyniki badań ekspery
mentalnychwskazująna korzystnywpływ probiotyków na przebiegeksperymentalne gozapaleniajelitagrubegou szczurów [1, 23]. Również u ludzi wykazano korzystny wpływ probiotyków w profilaktycenawrotu pouchitisu chorych po przebytej kolektomii [12, 14].
Naturalny przebiegwrzodziejącego za palenia jelitagrubego oraz choroby Leśniow skiego-Crohna polega na naprzemiennych zaostrzeniach i remisjach. Zaostrzenie może byćwywołane przez czynniki zewnątrzpo- chodne, takie np. jakniesteroidowe leki prze
ciwzapalne (NLPZ), czy lokalne zmianyw składziemikroflory jelita.
Celem naszejpracybyła ocena wpływu zakażeniagrzybamizgatunku Candida, a także porównanie leczenia probiotykiem (Lacidofil) i lekiem przeciwgrzybiczym (flu- konazol) na proces gojenia wrzodziejących zmian zapalnych w jeliciegrubym szczurów, wywołanych doodbytniczym podaniem kwa su trinitrobenzenosulfonowego (TNBS).
Skoncentrowano się głównie naocenie makro- i mikroskopowych efektów terapii Lacidofilemi flukonazolem na szybkość go
jenia zmian zapalnychwjelicie grubym, u zwierząt zakażonych przez grzyby rodzaju Candida.
Ponadto badano wpływ zakażeniajelita grubego przez Candida albicans oraz rów nolegle prowadzonejterapii Lacidofilem i flu konazolem, na zmianyjelitowego przepły wu krwi, wagę badanego zapalnegofrag
mentu jelita grubego oraz aktywność mielo- peroksydazy (MPO), jakowskaźnika aktyw
ności neutrofili i prozpalnychcytokin IL-1 p i TNF-a w osoczu krwi.
Materiałi metody
Badania wykonywanona szczurach płci męskiej, rasyWistar, o wadze 180-220g, które miały swobodny dostęp dowody i pożywienia i były przystosowanedo warunków laboratoryjnych orazdo cyklów12 godzinnych dzień/nocprzez 7 dni.
Badania na zwierzętachbyłyprowadzonezgodnie z międzynarodowymiwytycznymi, dotyczącymiopieki nad zwierzętami laboratoryjnymi izostały zaakceptowa
ne przez Komisję ds. Bioetyki Doświadczeń na Zwierzę tach UniwersytetuJagiellońskiego w Krakowie.
Wywoływanie zapalenia jelita grubego Wrzodziejącezapalenie jelita grubego u szczurów, wywoływanoprzez doodbytnicze podanie TNBS (Sig
ma Pharmaceutical, Slough UK) w dawce 10 mg/kg, roz puszczonego w 50%roztworze etanolu według meto
dyopisanejprzez Reutera i Kennedy[21].
W myśl założenia tej metody [21]zwierzęta usypia
no zapomocą pentobarbitalu, podawanegowdawce60 mg/kg dootrzewnowo, a następnie przystępowanododo
odbytniczejaplikacji TNBS,którybył wprowadzany do jelita grubego za pomocą miękkiegopolietylenowego cewnika na głębokość 8 cmod ujścia zwieraczaodbytu.
Po wstępnych wynikach badań zwielomarozcieńcze- niamiTNBS ustalono, że optymalną do wywoływania owrzodzeń w jeliciegrubym byłą dawka 10 mg/ kg, którą podawano w objętości 0,25 ml/dla każdegozwierzęcia.
Do momentuwybudzenia, zwierzętabyły ułożonew po
zycji Trendelenburga,aby zapobiec utracie roztworu TNBSprzezwyciekz odbytu.
Zwierzęta z grupykontrolnejotrzymały analogicz ną jakw przypadku TNBSobjętość0,9% roztworu soli fizjologicznej. Następnie powybudzeniu podawano czę ści zwierząt kontrolnychi tymz wywołanymi owrzodze- niamiprzezTNBS, zawiesinę grzybów Candida albicans (C. albicans), wedługschematu opisanegoponiżej. Po 1 godzinie od podania Candidazwierzęta uzyskały nor malnydostęp do wodyi pożywienia.
Badania nad rozwinięciem modelu zwierzęcego colitis ulcerosa przeprowadzono wKatedrze Fizjologii CollegiumMedicum UJ w Krakowie (Kierownik Prof, dr hab. med.W. Pawlik).
Wpływkolonizacji grzybiczej na przebieg inasileniezmian zapalnych w jeliciegrubym Zwierzęta z wywołanymi TNBS zmianami zapalny
mi jelita grubego zostały przydzielonedo następujących grup badawczych, liczących po 10 szczurów każda, któ
rym podawano dożołądkowo poczynając od 1 dobyeks
perymentuprzez kolejne 8 dni zawiesinę C. albicans 109 CFU/w objętości/1 ml soli fizjologicznej,w następujących kombinacjach:
A. grupakontrolna: sól fizjologiczna (vehiculum), B. C. albicans 109 CFU/ml
C. C. albicans 109CFU/ml+ Lacidofil 10»CFU/ml, D. C. albicans 109 CFU / ml +flukonazol 10 mg/kg
domięśniowo(i.m. ).
Szczepygrzybów Candida uprzednio wyizolowane i następnie zastosowane wtychdoświadczeniach po
chodziły z biopsji jelita grubego pobranych od chorych na wrzodziejące zapaleniejelitagrubego oraz chorobę Leśniowskiego-Crohna.
VI grupie C,na dwie godziny przedpodaniem za
wiesinyC.albicans,dodawano do wody pitnej5% roz twór Lacidofiluwdawce 10“ CFU/ ml, przygotowanej uprzednioprzez wytrącanie przez 3 godziny w tempera turze 37° C. Natomiastwgrupie D, zastosowano lecze nie przeciwgrzybicze flukonazolem, w dawcelO mg/kg domięśniowo (i. m. ).Zwierzętausypiano w 14 dobie od podania TNBS.
Celemczynnościowejoceny wpływu inokulacji Can dida albicans, osobno lub w kombinacjiz Lacidofilem i flukonazolem na przebieg gojenia wrzodów jelitowych, natychmiast pootwarciu jamy brzusznej iwyłonieniu je lita grubego mierzono jelitowy przepływ krwi (CBF) w obszarze błony śluzowej nie objętymzmianamizapal
nymi, stosująctechnikę laserową Dopplera, szczegóło wo opisaną uprzednio dla pomiaru żołądkowego prze-
Przegląd Lekarski 2007 /64/3 125
Rycina 1
Wpływ inokulacjigrzybów Candida z lub bez podanego lacidofilui/lub flukonazolu na powierzchnię zmian zapalnych wjelicie grubym,indukowanych TNBSoraz jelitowyprzepływ krwi.14 doba obserwacji odwywołania zmian zapalnych.
Theinfluence of Candida fungi inoculation withor without additionof lacidofil or fluconazole on thearea of colonic lesions,induced with TNBS and colonicblood flow (CBF).14th day ofobservationafter induction of inflammatory lesions.
Rycina 2
Wpływ grzybów Candidaz/lubbez podanegolacidofilui/lubflukonazolu nawagę zmienionejzapalnie tkanki jelita grubegoszczurów. 14 doba obserwacji.
Theinfluenceof Candidafungiwith or withoutaddition oflacidofil or fluconazole on the weight of inflamedcolonictissue. 14th day after induction ofinflammatorylesions.
Rycina 3
Wpływ grzybów Candida z/lub bez podanego lacidofilu i/lubflukonazolu naindeks uszkodzeń w jeliciegrubym szczurów, indukowanych TNBS. 14doba obserwacji.
Theinlfuenceof Candida inoculation with or without additionof lacidofil or fluconazole on the indexof colonic lesions induced withTNBS in rats. 14thdayafter induction of inflammatorylesions.
Rycina 4
Wpływ inokulacji grzybów Candida z/lub bez podanegolacidofilu lub flukonazolu na histologicznyindeks uszkodzeń zmian zapalnych w jelicie grubym wywołanych TNBS. 14 doba obserwacji.
Theinfluence of Candida inoculationwith or withoutlacidofilor fluconazole on the histological index ofinflammatory lesions in the colon, induced with TNBS. 14thday after inductionofinflammatorylesions.
pływu krwi [6]. Jelitowyprzepływkrwi u badanych zwie
rzątbył wyrażony odsetkowow stosunku do przepływu śluzówkowegokrwiu szczurów nie poddanych działa niu TNBS, natomiast otrzymujących w zamiansól fizjo logiczną.
Usunięty ośmiocentymetrowy odcinek jelita grube
go był otwierany wzdłużdługiejosi. Nasilenie makro
skopowychzmian zapalnych byłooceniane przy po
mocy metody planimetrycznej(Morphomat, Carl Zeiss, Berlin, Niemcy) przez dwóch niezależnych badaczy, zgodnie z kryteriami podanymi przez Reutera i wsp.[21 ].
Następnie usunięty odcinek jelita ważono.Frag
mentyzmienionego zapalniejelita grubego wielkości ok.20 mmpobierano, utrwalanow formalinie i zatapia
no w parafinie,a następniebarwiono rutynowo hema- toksylinąi eozyną(H-E). Histologiczne zmiany w błonie śluzowej jelita grubego badano w mikroskopie świetl nym, biorąc poduwagęnastępujące kryteria: obecność, powierzchnia igłębokośćowrzodzenia, obecność i na
silenie naciekówzapalnych, owrzodzeń, obecnośćwłók- nienia, posługującsię punktowaną skalą zapropono waną przez Vilaseca i wsp. [26].
Preparaty histologiczne z błony śluzowej jelita gru
begoszczurówbyły barwione dodatkowo metodą G/em- zy, wcelu oceny stopnia zakażenia grzybiczego w tkan ce jelitowej.
Badania histologiczne byływykonywane w Katedrze Patomorfologii Klinicznej i Doświadczalnej CM UJ w Kra kowie(Kierownik:prof,dr hab. med. J. Stachura).
Badania mitologiczne, jakościowe i ilościowew celu obecności Candida w błonieśluzowej jelita grubego wykonywano zgodnie zmetodyką Mullera [19]. Wycinki homogenizowano w 4ml sterylnej soli fizjologicznej,a następnie inkubowanowytrząsając z 0, 25% roztworem trypsyny. Roztwórhomogenatu był wysiewany na podło żu Sabourauda (DifcoLab. USA), zawierającym 50 ug/
ml chloramfenikolu. Ilośćkolonii Candida była liczona po uprzedniej inkubacji wysianego materiału przez 48 go dzin w temperaturze37 stopni. Identyfikacjagatunków grzybów była przeprowadzonazgodnieze standardami laboratoryjnymi, w oparciu o morfologię kolonii, charak terystykę enzymatyczną z użyciemtestówCandidaID, pasków ID32C (system ATB, Bio Merieux).Badania te były wykonywane wZakładzie Mikrobiologii Farmaceu
tycznej CM UJ w Krakowie (Kierownik: prof,dr hab.Ali
cjaBudak).
Celemocenynasilenia nacieków neutrofilowych w zmienionej zapalnie błonie śluzowej jelita grubego ozna czano aktywność MPOw tkance jelita grubego o masie około 200 mg, którą popobraniuzamrażanodomomentu rozpoczęcia pomiaruaktywności MPO w temperaturze -80 °C. Aktywność MPO oznaczanoza pomocązesta
wu Biosource, Dortmund Germany.
Wyniki
Wpływ zakażeniagrzybamiCandida na wielkośćuszkodzeńjelita grubego.Efekty leczenia Lacidofilem
Podanie doodbytnicze TNBSwywołało zmiany zapalne w jelicie grubym,z rozle głymi owrzodzeniami błony śluzowej. Zmia
ny makroskopowe jelita, obserwowanew 3 dobie od momentu podania TNBS,były po
równywalnewe wszystkich badanych gru-
Zapalenie jelita grubego indukowane TNBS Zapalenie jelita grubego indukowane TNBS
Rycina 5
Miano grzybóww błonie śluzowejjelita grubego orazwagatkankijelita w 14 dobie od wywołania zmian zapalnych w jelicie grubymu szczurów inokulowanych grzybami z/lub bezpodania lacidofilu lub flukonazolu.
The titre of Candida in colonic mucosa and the weightof colonic tissue on the 14th day after inoculation of inflammatorylesions in rats.
Rycina 6
WpływinokulacjiCandida z/lubbez podanegolacidofilu lubflukonazolu na powierzchnię zmian zapalnych w jelicie grubym szczurów,wywołanych TNBS oraz na aktywność enzymuMPO wsurowicy krwi i CBF. 14 doba obserwacji.
The influence of Candida inoculation with or without additionof lacidofil or fluconazole on the inflammatory lesions induced with TNBS in colon mucosa, andon theactivityof MPOinthe serum and CBFon the14th day after induction oflesions.
Rycina 7
Wpływinokulacji Candida z/lubbez podanegolacidofilu lubflukonazolu na stężenie 111-p oraz TNF-a w osoczu krwi uszczurów ze zmianamizapalnymi w jeliciegrubym, indukowanymi TNBS, w 14 dobie obserwacji.
Theinfluence ofCandida inoculationwithor without lacidofil or fluconazole addition, on the serum IL-1p and TNF-a levelin rats with inflammatory colonic lesionsinduced with TNBS. 14thdayafterinduction of lesions.
pachzwierząt i obejmowały rozległe zmia ny o charakterze martwicy i krwotocznej.
Histologicznie stwierdzono obecność obrzę
ku podśluzówkowego, mikrozakrzepów, ostrychneutrofilowych nacieków zapalnych oraz martwicy błonyśluzowej jelitagrubego.
W 14 dobiebadania, a więcwfazie go
jenia zmian makroskopowych w jelicie ob
serwowano znamienne różnicew poszcze
gólnych grupach zwierząt, którewyrażono za pomocą średnich wartościpowierzchni uszkodzeń w badanych grupach, cięża rem tkanki pobranej zjelita grubegooraz zmianami przepływu krwi w jelicie grubym.
Średnia powierzchnia owrzodzeńw grupie B szczurów, które otrzymywałydożołądko- wo zawiesinę Candida wynosiła ok. 731 mm2. U zwierzątzakażonych Candida, któ re otrzymywałyjednocześnie Lacidofil (gru paC) lub flukonazol (grupa D) powierzch nia owrzodzeń była statystycznie znamien
nie mniejszaw porównaniu z grupą kontro lną(grupa A) (rycina 1).
U zwierząt zakażonych Candida zaob
serwowano statystycznie znamiennywzrost średniej wagi tkanki jelita grubego, w po
równaniu z grupąkontrolną. W 14 dobie badaniawaga taosiągnęła wartośćodpo wiednio ok. 1567 mg uzwierząt zakażonych
Candida i 727mg w grupiekontrolnej.
U zwierząt, którym podawano Lacidofil w wodzie pitnejlub flukonazol, średnia waga tkankijelita grubego osiągnęłastatystycz
nie niższą wartośćwporównaniu z grupą szczurów zakażonych przez Candida(ryci na 2).
Analiza wskaźników uszkodzenia błony śluzowej jelita grubego u szczurów, prze
prowadzonaw 14 dobie badania w oparciu o kryteria podane przez Reutera i wsp.[21], wykazała, że podawanie dożołądkowe Can
dida albicans (grupa B) statystycznie zna
miennie zwiększyło średnią powierzchnię uszkodzeń jelitowych.
LeczenieLacidofilem lubflukonazolem spowodowałostatystycznie znamienne ob
niżenie średniejpowierzchni uszkodzeń je litowych,przy czym spadek byłbardziej wi
doczny w grupie zwierząt otrzymujących otrzymujących Lacidofil, w porównaniu z grupą leczoną flukonazolem (rycina 3).
Ocena histologicznawg skali punktowej nasilenia zmian mikroskopowych w bada
nym jelicieuszczurów została dokonana w oparciu o klasyfikację zaproponowaną przez Vilaseca i wsp. w 14 dobie badania [26].
Największe nasilenie zmian zapalnych ob
serwowano u zwierząt zakażonych przez
Candida albicans (grupa D). Pouwzględ nieniu takich kryteriów, jak: wielkość owrzo dzeń, nasilenienacieków zapalnych, głębo kość owrzodzeń,włóknienie, obecność ziar- niniaków, średni wskaźnik zmian histopato
logicznych wynosiłw tej grupie 5, 5 i war tość ta byłastatystycznie znamiennie niż
sza niż odpowiadającajej wartość wgrupie kontrolnej (rycina 4). Lacidofil i flukonazol znamienniezredukowały wartość indeksu uszkodzeńw porównaniudo wartości tego indeksu uzwierząt zakażonych Candida.
Wpływ zakażenia grzybami Candida bez i w kombinacji z Lacidofilem i flukonazolem na miano grzybów w błonie śluzowej jelita grubego Badania mikologiczne treści jelita gru begobadanychzwierząt przeprowadzone w 4 dobie stwierdziły, że mianogrzybów Can dida wynosiłopowyżej 104 CFU/mlwgru pie zwierząt zakażonych Candida albicans, podczasgdywgrupie zwierzątzakażonych Candida albicans ileczonych Lacidofilem, zanotowano spadekmiana Candida, które osiągnęło wartość poniżej 102 CFU/ml. W tej ostatniej grupie szczurówstwierdzono jednocześniewysokie miano grzybów Sac charomyces cerevisiae, ok.lO4 CFU/ml,ilo
Przegląd Lekarski 2007 /64/3 127
ściowo znacznie przewyższającemianotych grzybów wgrupie kontrolnej.MianoCandi- da w biopsjach jelitowych pobranych od szczurów otrzymujących flukonazol różniło się od koncentracji grzybów w grupie leczo nej Lacidofilem nieznamiennie (poniżej 103CFU/ml), chociaż osiągnęło wyższą war tość od obserwowanegowgrupie kontrol nej (rycina 5).
Wpływ zakażenia grzybami Candida na zmiany CBF, aktywność MPO icytokin prozapalnych 11-1/3, TNF-a Zgodniez danymi zawartymi narycinie 6, stwierdzono spadek przepływu jelitowe go krwi (CBF) oraz 4-5 krotny wzrost ak tywności MPO we krwi oraz w tkance ze zmienionego zapalnie jelita grubego.Kolo
nizacji grzybiczej jelitagrubego towarzyszył wzrostpoziomu IL-1 p i TNF-a wosoczutych zwierząt. Uszczurów otrzymujących C. al- bicansobserwowanowybitne przedłużenie gojenia się uszkodzeń błony śluzowej jelita grubego nawet po 14 dniach obserwacji, wraz z towarzyszącym spadkiemCBFi zna
miennym wzrostem MPO w tkance zapal nej (rycina6,7). Podanie Lacidofilu spowo
dowało znamiennywzrost CBF ispadek ak tywności MPO oraz cytokin prozapalnych w porównaniu z grupą otrzymującą wyłącznie Candida albicans.
Dyskusja
Wraz z doniesieniami natemat możli wości terapeutycznegodziałania probioty- kówwzrosło zainteresowanie udziałem flo ry korzystnejdla przewodu pokarmowego w etiopatogenezie NZPP [17, 23, 25 ]. Mikro flora przewodu pokarmowego obejmuje400 -500 gatunków drobnoustrojów, którewraz ze swoim metabolizmem stanowią „dodat kowynarząd" człowieka,dotąd zaniedbywa
ny,w kontekście zarówno patogenezyscho rzeńjelita grubego, jak i potencjalnej ochron
nej roli, jaką pełniąbakterie o działaniu pro- biotycznym. Do niedawna obserwacjemi krobiologiczne koncentrowały sięgłównie na roli bakterii w nieswoistych zapaleniach przewodupokarmowego. W ostatnich latach wzrosło jednak zainteresowanie obecnością grzybów w przewodzie pokarmowym. Zjed nejstrony grzyby Candidasą częścią flory przewodu pokarmowego, z drugiej zaś ko lonizując jelito mogą przy obniżonej odpor ności stanowić źródło grzybiczego rozsie wu ogólnoustrojowego [1, 4]. Dotychczas mniej uwagi poświęcono obecności grzybów Candidaw jelicie grubym oraz ich udziało
wi w indukowaniulub podtrzymywaniu sta nuzapalnego przewodu pokarmowego.Dla tego w niniejszych badaniach na modelu zwierzęcymwrzodziejącegozapalenia jeli ta grubego przeprowadzono ocenę wpływu kolonizacji grzybiczejjelitagrubego na na
silenie zmian zapalnych w błonie śluzowej jelitagrubego oraz na przebieg ich gojenia.
W ocenie różnic w gojeniu pomiędzy po
szczególnymi badanymi grupami brano pod uwagę kryteriamakroskopowe i mikrosko
powezmian oraz różnice wagowe zapal nychfragmentów jelita zapalnych w jelicie poprzez ocenę jelitowego przepływu śluzów- kowego (CBF) i aktywności MPO,będącej wskaźnikiem nacieczenia błony śluzowej jelita grubego przez neutrofile, jakrównież
mierzono poziom prozapalnych cytokin IL- 1P iTNF-a wosoczu.
Ocenawyników zmian zarównozmian makroskopowych, takich jak uszkodzenia krwotoczne i mikroskopowych, takich jak uszkodzenia struktury jelitao typieobrzęku podśluzówkowego, przeprowadzona w 3 dobie odpodania TNBS nie wykazałazna miennychróżnicpomiędzy badanymigrupa mi zwierząt nie zakażonych i zakażonych przez Candida.
W badaniach mikroskopowych, ocenia nych w 3 dobie dominowałyzwłaszcza zmia nyocharakterze martwiczym oraz krwotocz nym. Natomiastwyraźne różnicew dynami
ce procesu gojenia zaobserwowano w 14 dobie badania, ponieważ u zwierzątzaka
żonych przezCandidaalbicans zaobserwo
wano utrzymywanie sięstatystycznie istot nie większej powierzchni owrzodzeń błony śluzowejjelita grubego, w porównaniu z gru pą kontrolną cowskazuje jednoznacznie na przedłużenie procesu gojenia się tych owrzo dzeń u zwierząt zakażonych. Włączenie le czenia przeciwgrzybiczego lub zawiesiny bakterii probiotycznych u szczurów otrzymu
jących zawiesinę Candidawpłynęło korzyst
nie na szybkość gojenia się zmian zapal nych w jeliciegrubym.Jednocześnieprze
pływ krwi w jelicie grubym był znaczącowy ższy u zwierząt leczonych Lacidofilem lub flukonazolemniżwodpowiednich grupach kontrolnych, co wskazuje na znacznyudział mikrokrążeniajelitowegow procesach goje
nia się wrzodów jelitowych pod wpływemle ków przeciwgrzybiczych i niektórych bakte rii probiotycznych, wtym głównie Lacidofilu.
Ocena nasileniastanuzapalnegowjeli cie na podstawie porównania ciężaru wy izolowanych odcinków jelita grubego wyka załanajwyższą wagę badanego odcinka je
lita wgrupie zwierząt otrzymujących zawie
sinęCandida, a znacznie niższą w grupie, która nie otrzymała leczenia probiotykami.
Podanie flukonazolu lub Lacidofilu przyczy niłosię do zmniejszeniawagi badanychod
cinków jelita grubego, przy czym średnia waga badanych odcinkówjelit byłanajniż
szawgrupie otrzymującej Lacidofil, co wska
zuje na możliwośćprzyspieszenia gojenia się tych zmian w jelicie grubympoprzez hamo
wanieprocesu zapalnego przez probiotyki.
Analiza zmian makroskopowych w jelicie grubym, oparta na punktowanej skali uwzględniającejwielkośći głębokość owrzo dzeniaorazobecnośćzrostów potwierdziła korzystny wpływ terapii flukonazolem i Laci
dofilem, skutkującyw szybszymgojeniusię owrzodzeń pod wpływem probiotyku u zwie rząt, które oprócz zawiesiny Candida otrzy mywały dożołądkowoprobiotyk.
Nasilenie zaawansowania zmianzapal nych wjeliciegrubym u szczurów wobrazie mikroskopowym,uwzględniało takie kryteria jak wielkość owrzodzeń, nasilenienacieków zapalnych, ich głębokość, włóknienie, obec
ność ziarniniaków. Spadeknasilenia zmian zapalnychstwierdzonou zwierząt otrzymu
jących probiotykiw grupie kontrolnej, w po
równaniu do grupy otrzymującej dożołądko wo tylko i wyłącznie zawiesinę grzybów Can
dida.
Potwierdziły to równieżbadania mitolo giczne treści jelita grubego stwierdzające znamienny spadek miana grzybów Candida,
(poniżej 102 CFU/g) u zwierząt traktowa nych Lacidofilem, zjednoczesnym wzro
stem,w porównaniu z innymi grupamizwie rząt grzybówSaccharomyces cerevisiae, będących fizjologicznym składnikiemmikro flory przewodu pokarmowego szczurów.
MianoSaccharomyces cerevisiae przewyż
szało ilościowomiano tych grzybów wgru piekontrolnej. Prawdopodobnie wynikato z uruchamiania pod wpływem bakterii pro biotycznych dodatkowych mechanizmów obronnych przewodupokarmowego w po
staci wzrostu miana grzybów, biorących udział wprzeciwdziałaniu nadmiernej kolo
nizacji Candidaw jeliciegrubym. Rozwinię cie tychzagadnień w modelu doświadczal nymwymagajednak dalszych badań.
Wyniki badań eksperymentalnych po
twierdzają korzystny wpływ probiotyków na przebieg zapalenia jelita grubego u szczu
rów [23]. Jak wykazaliśmy wobecnej pra cy, kolonizacja jelitagrubegoprzez grzyby Candida pogarszena proces gojenia się zmian zapalnych w tym odcinku jelita u szczurów. Włączenie probiotyku poprawia
łoparametry gojenia zmian zapalnych,wy rażonych wskaźnikamizmian makro- i mi kroskopowych, spadkiem wagi badanego odcinkajelita,a także redukcjąaktywności MPOi prozapalnych cytokin TNF-a i IL-1 ß w osoczu. Wartym szczególnej uwagi jest fakt, że zmniejszenie nasilenia stanuzapal nego, acoza ty idzie przyspieszenie goje nia się owrzodzeńjelitowych pod wpływem bakterii probiotycznychbyło większe w po
równaniu z efektem przeciwzapalnym po podaniu leku przeciwgrzybiczego - fluko
nazolu.
Wnioski
1. Podanie doodbytnicze szczurom TNBS, powodujew3 dobie zmiany makro skopowe w jeliciegrubym oraz wzrostmasy zmienionego zapalnie odcinka jelita, spa dek przepływuśluzówkowego i 4-5 krotny wzrostaktywności MPO.
2. Znamienna kolonizacja grzybicza Candidaw jelicie grubym szczurów opóź
nia gojenie się zmian zapalnychwywoła
nych za pomocąTNBS.Najpewniej jestto związaneze spadkiem CBFw obszarze owrzodzeń, ponadto wzmożonąekspresją cytokin IL-1ß iTNF-a wekrwi.Terapia pro- biotykiem może okazaćsię skuteczna wle czeniu zaostrzenia wrzodziejącego zapale
niajelita grubego, związanego z koloniza
cjągrzybiczą.
3. Probiotyk (Lacidofil) wydaje się być skuteczniejszyod flukonazoluw indukowa niu gojenia sięzmian zapalnych w jelicie grubym szczurów,z kolonizacją grzybiczą Candida.
Piśmiennictwo
1. BengmarkS.: Ecologicalcontro! ofgastrointestinal tract. The role of probiotic flora. Gut 1998, 42,2.
2. BergR. D.: The indlgenous gastrointestinal micro- flora. TrendsIn Microbiology 1996, 4, 430.
3. Berg R., BernasconiP., Fowler D. et al.: Inhibition of Candida albicans translocation from the gastrointestinal tract of mice by oral administration of Saccharomyces boulardii.J. Infect.Dis. 1993, 168, 1314.
4. BernhardtH., Knoke M.: Mycological aspects of gastrointestinal microflora. Scand. J. Gastroenterol.
1997, 32, (Suppl. 222),102.
5. Blumberg R. S, Saubermann L. J., Strober W.: Ani-
malmodels of mucosalinflammation and their rela tiontohuman inflammatorybowel disease. Current Opinionin Immunology 1999,11, 648.
a.Brzozowski T.,Konturek P. C,DrozdowiczD.et al.:Nitric oxidereleasing aspirinprotects the gastric mucosa againststressand promoteshealingof stress- induced gastric mucosal damage;roleof heat shock protein 70. Digestion 2002, 66, 160.
7. CannonR.D.,Holmes A. R., MasonA.B.etal.:Oral Candida, clearance, colonization or candidiasis? J.
Dent. Res. 1995, 74,1152.
8. Cole G. T, Lynn K. T, Seshan K. R.:Ananimal model for oropharyngeal, esophageal and gastric candidia
sis. Mycoses 1990,33, 7.
9. D'HaensG.R., Geboes K.,PeetersM. et al.: Early lesions of recurrent Crohn'n disease caused byinfu
sion of intestinal contents in excluded ileum.Gastro enterology 1998,114, 262.
10. ElsonC., Sartor B., Tennyson G. et al.: Experi mental modelsof inflammatory bowel disease. Gas
troenterology 1995, 109,1344.
11. Galeazzi F.,BlennerhassettP. A., Qiu B. et al.: Ciga
rettesmoke aggravates experimental colitis in rats.
Gastroenterology 1999, 117, 877.
12. Gionchetti P., Rizzello F., Venturi A., G. et al.: Oral bacteriotherapy as maintenance treatmentinpa
tients with chronic pouchitis: a double- blind, placebo-
controlled trial. Gastroenterology 2000, 119, 305.
13. HoffmannP., Reinshagen M., ZechJ.M. et al.: In creased expression ofepidermal growthfactor - receptor in an experimental model ofcolitis in rats.
Scand. J. Gastroenterol. 2000,11,174.
14. IsolauriE., Kirjavainen P. V., SalminenS.:Pro
biotics: a role in the treatment of intestinal infection and inflammation. Gut 2002, 50, (Suppl.Ill), 54.
15. Kennedy R. J., Hoper M., Deodhar K. et al.:
Gardiner. Probiotic therapy fails toimprove gut per meability in a hapten model ofcolitis. Scand. J.
Gastroenterol. 2000,12,1266.
16. Levi S.,Shaw- Smith C.: Non-steroidal anti-inflam
matorydrugs: how do theydamage the gut. Br.J.
Rheumatol. 1994, 33,105.
17. LinskensR.K., Huijsdens X.W.,Savelkoul P. H. M.
et al.: The bacterial flora ininflammatory bowel dis
ease: current insights in pathogenesis and the influ
ence of antibiotics and probiotics.Scand. J. Gastro enterol. 2001, (Suppl.234),29.
18. Macpherson A., Maloy K.,Bjarnason I.: Intoler
ance ofdirty intestine.Gut1999,44, 774.
19. Muller J.: Pathogenidentification inindigenous deep mycoses. La Roche an Co. Colimited company,Basle 1986.
20. RachmilewitzD.: On smoking, rats and inflamma
tory bowel disease. Gastroenterology1999, 117,
1008, editorials.
21. Reuter B., Asfaha S.,Buret A.et al.: Exacerbation ofinflammation- associated colonicinjuryinrat through inhibition of cyclooxygenase- 2.J. Clin. In vest. 1996,98, 2076.
22. Samonis G., AnaisseE., RosenbaumB. etal.:A model ofsustained gastrointestinal colonizationby Candida albicans in healthy adult mice. Infect.
Immun. 1990, 1514.
23. Sandbom W., Targan S.: Biologic therapyof inflam matory bowel disease.Gastroenterology 2002, 122, 1592.
24. Shanahan F.: Inflammatorybowel disease: immuno diagnostics, immunotherapeuticsand ecothera- peutics.Gastroenterology2001,120, 622.
25. Sartor R.B.: Reviewarticle: role of the enteric microflora in thepathogenesis of intestinal inflam
mation andarthritis. Aliment. Pharmacol. Ther.1997, 11,(Suppl. 3), 17.
26. VilasecaJ.,Salas A., GuamerF.. Participation of thromboxane and other eicosanoid synthesis in the courseofexperimental inflammatory colitis.Gastro enterology 1990,98, 269.
27. Zwoliriska-Wcislo M., Budak A., TrojanowskaD.
et. al.:Effect of fungal colinization of gastricmucosa on the courseofgastriculcerhealing. Med.Sci. Monit.
2001,7, 266.
’rzeglqd Lekarski 2007 / 64 /3 129