• Nie Znaleziono Wyników

Wpływ kolonizacji grzybów Candida na gojenie zmian zapalnych błony śluzowej jelita grubego w modelu zwierzęcym colitis ulcerosa

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Share "Wpływ kolonizacji grzybów Candida na gojenie zmian zapalnych błony śluzowej jelita grubego w modelu zwierzęcym colitis ulcerosa"

Copied!
6
0
0

Pełen tekst

(1)

PRACE ORYGINALNE

Małgorzata ZWOLIŃSKA-WCISŁO Tomasz BRZOZOWSKI

AlicjaBUDAK Zbigniew ŚLIWOWSKI Danuta DROZDOWICZ Sławomir KWIECIEŃ Danuta TROJANOWSKA LucynaRUDN1CKA-SOSIN Tomasz MACH

StanisławJ. KONTUREK Wiesław W. PAWLIK Aneta TARGOSZ

Wpływ kolonizacji grzybów Candida na gojenie zmian zapalnych błony śluzowej jelita grubego w modelu zwierzęcym colitis ulcerosa

Studies on the influence of Candida fungal colonization on the healing process of inflammatory lesions

in the colon in rat animal model

Katedra Fizjologii Kliniczneji Doświadczalnej CollegiumMedicum

UniwersytetuJagiellońskiego wKrakowie Kierownik:

Prof, dr hab. med. Wfes/aw W. Pawlik

Klinika Gastroenterologiii Hepatologii CollegiumMedicum

Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie Kierownik:Prof,dr hab. med. Tomasz Mach

Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej CollegiumMedicum

UniwersytetuJagiellońskiegow Krakowie CollegiumMedicum

Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie Kierownik:Prof,dr hab. Alicja Budak

Katedra Patomorfologu Klinicznej iDoświadczalnejCollegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie Kierownik: Prof,dr hab. med.Jerzy Stachura

Dodatkowe słowakluczowe:

Candida jelito grube

zapalenie jelita grubego szczury

Additionalkey words:

Candida colon colitis rats

Adres do korespondencji:

Prof, dr hab. n. med. Tomasz Brzozowski Katedra Fizjologii Klinicznej i Doświadczalnej CM UJ

31-501 Kraków, ul. Grzegórzecka 16 e-mail: mpbrzozo@ cyf-kr.edu.pl

Współczesne zasady leczenia nie­

swoistych zapaleń przewodu pokar­

mowego (NZPP) wynikają z lepszego zrozumienia ich patofizjologii, wskutek rozwoju badań podstawowych. Do nie­

dawna badania nad wpływem drobno­

ustrojów na gojenie się zmian zapal­

nych w jelicie grubym koncentrowały się na roli bakterii. W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie obecnością grzybów w przewodzie pokarmowym.

W niniejszych badaniach na modelu zwierzęcym wrzodziejącego zapalenia jelita grubego przeprowadzono anali­

zę wpływu kolonizacji grzybiczej jelita grubego na nasilenie zmian zapalnych w jelicie oraz przebieg gojenia owrzo- dzeń w doświadczalnym modelu coli­

tis ulcerosa. W ocenie różnic w goje­

niu pomiędzy badanymi grupami bra­

no pod uwagę kryteria makroskopowe i mikroskopowe oraz wagę badanych fragmentów jelita grubego. Badano parametry wskazujące na nasilenie zmian zapalnych w jelicie poprzez ocenę jelitowego przepływu śluzówko- wego (CBF) i poziom MPO, jak również poziom interleukiny (IL-1 (3) i czynnika martwicy guzów (TNF-a). Podanie do­

odbytnicze szczurom haptenu kwasu trinitrobenzenosulfonowego (TNBS) indukowało w 3 dobie nekrotyczne uszkodzenia błony śluzowej jelita gru­

bego oraz wzrost masy zmienionego zapalnie odcinka jelita grubego, spa­

dek śluzówkowego przepływu krwi i 4- 5 krotny wzrost aktywności MPO. Zna­

mienna kolonizacja grzybicza Candida w jelicie grubym szczurów opóźniła gojenie się zmian zapalnych wywoła­

nych TNBS i efekt ten korelował z ob­

serwowanym spadkiem CBF w obsza­

rze owrzodzeń, wraz z towarzyszącą wzmożoną ekspresją cytokin IL-1 p i TNF-a w surowicy krwi. Podanie leku przeciwgrzybiczego (flukonazol) lub probiotyku (Lacidofil) u szczurów in­

fekowanych przez Candida przyspie­

szało gojenie się zmian zapalnych w jelicie grubym. Powierzchnie owrzo­

dzeń w tych grupach były statystycz­

nie istotnie mniejsze w porównaniu z

Present- day methods of success­

ful treatment of inflammatory bowel diseases (IBD) result from a better un­

derstanding of their pathophysiology due to advances in preclinical studies in this area of knowledge. Until re­

cently microbiological studies have been focused on the bacterial aspects in pathogenesis of Gl disorders, how­

ever in the last years an interest in the presence of fungi in the gastrointe­

stinal tract has also increased. In this study using an animal model of ulcera­

tive colitis, the impact of fungal colo­

nization of the colon on the intensity of inflammatory changes in the colonic mucosa and the course of their heal­

ing was carried out. The macroscopic and microscopic criteria relating to the changes of weight of examined frag­

ments of the colon were evaluated while assessing differences between groups tested. The intensity of intesti­

nal inflammatory changes was deter­

mined by assessment of such param­

eters, as colonic blood flow (CBF), the level of MPO as a marker of colonic neutrophil infiltration intensity and the plasma levels of IL-1 P; and TNF-a con­

centrations. Results at the 3rd day af­

ter TNBS rectal administration re­

vealed an increase of weight of iso­

lated segments of inflammed colon, a decrease of CBF and the 4-5 fold in­

crease of plasma MPO activity. Can­

dida colonization of colon mucosa of rats delayed healing of colonic ulcers, induced by TNBS and this was asso­

ciated with the increased expression of plasma IL-ip and TNF-a levels. Ad­

ministration of antifungal (fluconazole) or probiotic (Lacidofil) treatment to C.

albicans infected rats exerted favo­

rable effect on healing of inflammatory changes in the colon because the area of ulcerations in groups of rats treated with fluconazole or Lacidofil was sig­

nificantly smaller in comparison with those inoculated with Candida solution only. Administration of fluconazole or Lacidofil significantly decreased the weight of colon segments, the MPO

(2)

grupą kontrolną lub otrzymującą wyłącznie Candida albi­

cans. Podanie flukonazolu lub probiotyku spowodowało spadek wagi bioptatów z jelita grubego w porównaniu z grupą zwierząt zakażonych przez Candida. Wyniki niniej­

szych badań dowodzą przedłużenia gojenia zmian zapal­

nych wywołanych przez TNBS w szczurzym jelicie grubym pod wpływem Candida. W tych warunkach implementa­

cja probiotyku przyspiesza gojenie uszkodzeń błony ślu­

zowej jelita grubego poprzez redukcję zmian zapalnych wyrażonych wskaźnikami zmian makro- i mikroskopo­

wych, spadkiem wagi badanego odcinka jelita a także za­

hamowaniem aktywności MPO, TNF-a i IL-1ß w surowicy krwi.

activity and the plasma IL-1 pand TNF-a levels, as compared with respective values in the group receiving Candida only.

The results of our studies indicate the deteriorating influ­

ence of Candida on the healing process of inflamed colon in the animal model of ulcerative colitis. Concomitant therapy with probiotic or antifungal treatment improved healing of colonic lesions, decreased the weight of inflamed colonic tissue and also attenuated the MPO activity and plasma proinflammatory cytokines IL-ip and TNF-a levels.

Wstęp

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego oraz choroba Leśniowskiego-Crohna nale­

żą do nieswoistych zapaleń przewodu po­

karmowego (NZPP). Współczesne zasady skutecznej terapii tych chorób wynikają z lepszegozrozumienia ich patofizjologii, wskutek rozwoju badań doświadczalnych, zmierzającychdo stworzenia doświadczal­

negomodelu colitisulcerosa, naśladujące­ gozmiany wjelicie grubym towarzyszące temu schorzeniu u ludzi [2, 3,18, 23, 25].

Uważa się, że w etiopatogenezie NZPP biorą udział trzy podstawowe czynniki, ta­

kiejak: osobnicza podatnośćbłony śluzo­

wej jelita na uszkodzenia, mikroflora prze­

wodu pokarmowe gooraz własności immu­ nologiczne błony śluzowej przewodu pokar­

mowego [8,11,23]. W ostatnim czasiewzro­

sło zainteresowanie udziałem drobnoustro­

jów w etiopatogenezie tych chorób [1, 4, 6, 9, 23, 27].

Mikroflora przewodu pokarmowego może ulegać modyfikacji pod wpływem czynników wewnątrzpochodnych, takich jak wydzielanie kwasusolnego, motorykażo­

łądka i jelit, układ immunologicznygospo­

darza lub czynników zewnątrzpochodnych, w tym głównie przyjmowanych leków, prze­

bytych infekcji bakteryjnych i grzybiczych orazdiety[15-17, 21, 24].

Istotną rolę czynnika mikrobiologiczne­

go wetiopatogenezie NZPP wydająsiępo­

twierdzać wyniki badańeksperymentalnych na zwierzętach, którewskazują na brak możliwości prawidłowej ocenytychzmian w modelu zapaleniajelita grubego wwarun­ kachjałowego środowiska przewodu pokar­

mowego [25]. Do niedawna obserwacjemi­ krobiologiczne koncentrowały się głównie na roli zakażeniabakteryjnego wjelicie, leczw ostatnich latach wzrosło zainteresowanie także obecnościągrzybów w przewodzie pokarmowym.

Przewód pokarmowyjest głównym re­ zerwuarem grzybówzrodzaju Candida, któ­

re zaliczasię dosaprofitów przewodu po­

karmowego [1, 5, 7]. Cohen i wsp. wykazali obecność gatunkuCandida w jamie ustnej, jelicie czczym ikrętymuodpowiednio30%, 54%i 55% zdrowych osób [7].Wraz z za­

interesowaniem udziałem drobnoustrojów w etiopatogenezie nieswoistychzapaleń prze­

wodu pokarmowego, zanotowano wzrost zainteresowania roląprobiotyków, które należądo drobnoustrojów występujących w pożywieniu. Stwierdzono, że probiotyki po­

przez zmianę układu mikroflory przewodu

pokarmowego, a zapewne także poprzez aktywację układu immunologicznego, mogą wywierać korzystny wpływ na leczenie i ewentualną profilaktykę nawrotu objawów choroby. Wstępne wyniki badań ekspery­

mentalnychwskazująna korzystnywpływ probiotyków na przebiegeksperymentalne­ gozapaleniajelitagrubegou szczurów [1, 23]. Również u ludzi wykazano korzystny wpływ probiotyków w profilaktycenawrotu pouchitisu chorych po przebytej kolektomii [12, 14].

Naturalny przebiegwrzodziejącego za­ palenia jelitagrubego oraz choroby Leśniow­ skiego-Crohna polega na naprzemiennych zaostrzeniach i remisjach. Zaostrzenie może byćwywołane przez czynniki zewnątrzpo- chodne, takie np. jakniesteroidowe leki prze­

ciwzapalne (NLPZ), czy lokalne zmianyw składziemikroflory jelita.

Celem naszejpracybyła ocena wpływu zakażeniagrzybamizgatunku Candida, a także porównanie leczenia probiotykiem (Lacidofil) i lekiem przeciwgrzybiczym (flu- konazol) na proces gojenia wrzodziejących zmian zapalnych w jeliciegrubym szczurów, wywołanych doodbytniczym podaniem kwa­ su trinitrobenzenosulfonowego (TNBS).

Skoncentrowano się głównie naocenie makro- i mikroskopowych efektów terapii Lacidofilemi flukonazolem na szybkość go­

jenia zmian zapalnychwjelicie grubym, u zwierząt zakażonych przez grzyby rodzaju Candida.

Ponadto badano wpływ zakażeniajelita grubego przez Candida albicans oraz rów­ nolegle prowadzonejterapii Lacidofilem i flu­ konazolem, na zmianyjelitowego przepły­ wu krwi, wagę badanego zapalnegofrag­

mentu jelita grubego oraz aktywność mielo- peroksydazy (MPO), jakowskaźnika aktyw­

ności neutrofili i prozpalnychcytokin IL-1 p i TNF-a w osoczu krwi.

Materiałi metody

Badania wykonywanona szczurach płci męskiej, rasyWistar, o wadze 180-220g, które miały swobodny dostęp dowody i pożywienia i były przystosowanedo warunków laboratoryjnych orazdo cyklów12 godzinnych dzień/nocprzez 7 dni.

Badania na zwierzętachbyłyprowadzonezgodnie z międzynarodowymiwytycznymi, dotyczącymiopieki nad zwierzętami laboratoryjnymi izostały zaakceptowa­

ne przez Komisję ds. Bioetyki Doświadczeń na Zwierzę­ tach UniwersytetuJagiellońskiego w Krakowie.

Wywoływanie zapalenia jelita grubego Wrzodziejącezapalenie jelita grubego u szczurów, wywoływanoprzez doodbytnicze podanie TNBS (Sig­

ma Pharmaceutical, Slough UK) w dawce 10 mg/kg, roz­ puszczonego w 50%roztworze etanolu według meto­

dyopisanejprzez Reutera i Kennedy[21].

W myśl założenia tej metody [21]zwierzęta usypia­

no zapomocą pentobarbitalu, podawanegowdawce60 mg/kg dootrzewnowo, a następnie przystępowanododo­

odbytniczejaplikacji TNBS,którybył wprowadzany do jelita grubego za pomocą miękkiegopolietylenowego cewnika na głębokość 8 cmod ujścia zwieraczaodbytu.

Po wstępnych wynikach badań zwielomarozcieńcze- niamiTNBS ustalono, że optymalną do wywoływania owrzodzeń w jeliciegrubym byłą dawka 10 mg/ kg, którą podawano w objętości 0,25 ml/dla każdegozwierzęcia.

Do momentuwybudzenia, zwierzętabyły ułożonew po­

zycji Trendelenburga,aby zapobiec utracie roztworu TNBSprzezwyciekz odbytu.

Zwierzęta z grupykontrolnejotrzymały analogicz­ jakw przypadku TNBSobjętość0,9% roztworu soli fizjologicznej. Następnie powybudzeniu podawano czę­ ści zwierząt kontrolnychi tymz wywołanymi owrzodze- niamiprzezTNBS, zawiesinę grzybów Candida albicans (C. albicans), wedługschematu opisanegoponiżej. Po 1 godzinie od podania Candidazwierzęta uzyskały nor­ malnydostęp do wodyi pożywienia.

Badania nad rozwinięciem modelu zwierzęcego colitis ulcerosa przeprowadzono wKatedrze Fizjologii CollegiumMedicum UJ w Krakowie (Kierownik Prof, dr hab. med.W. Pawlik).

Wpływkolonizacji grzybiczej na przebieg inasileniezmian zapalnych w jeliciegrubym Zwierzęta z wywołanymi TNBS zmianami zapalny­

mi jelita grubego zostały przydzielonedo następujących grup badawczych, liczących po 10 szczurów każda, któ­

rym podawano dożołądkowo poczynając od 1 dobyeks­

perymentuprzez kolejne 8 dni zawiesinę C. albicans 109 CFU/w objętości/1 ml soli fizjologicznej,w następujących kombinacjach:

A. grupakontrolna: sól fizjologiczna (vehiculum), B. C. albicans 109 CFU/ml

C. C. albicans 109CFU/ml+ Lacidofil 10»CFU/ml, D. C. albicans 109 CFU / ml +flukonazol 10 mg/kg

domięśniowo(i.m. ).

Szczepygrzybów Candida uprzednio wyizolowane i następnie zastosowane wtychdoświadczeniach po­

chodziły z biopsji jelita grubego pobranych od chorych na wrzodziejące zapaleniejelitagrubego oraz chorobę Leśniowskiego-Crohna.

VI grupie C,na dwie godziny przedpodaniem za­

wiesinyC.albicans,dodawano do wody pitnej5% roz­ twór Lacidofiluwdawce 10CFU/ ml, przygotowanej uprzednioprzez wytrącanie przez 3 godziny w tempera­ turze 37° C. Natomiastwgrupie D, zastosowano lecze­ nie przeciwgrzybicze flukonazolem, w dawcelO mg/kg domięśniowo (i. m. ).Zwierzętausypiano w 14 dobie od podania TNBS.

Celemczynnościowejoceny wpływu inokulacji Can­ dida albicans, osobno lub w kombinacjiz Lacidofilem i flukonazolem na przebieg gojenia wrzodów jelitowych, natychmiast pootwarciu jamy brzusznej iwyłonieniu je­ lita grubego mierzono jelitowy przepływ krwi (CBF) w obszarze błony śluzowej nie objętymzmianamizapal­

nymi, stosująctechnikę laserową Dopplera, szczegóło­ wo opisaną uprzednio dla pomiaru żołądkowego prze-

Przegląd Lekarski 2007 /64/3 125

(3)

Rycina 1

Wpływ inokulacjigrzybów Candida z lub bez podanego lacidofilui/lub flukonazolu na powierzchnię zmian zapalnych wjelicie grubym,indukowanych TNBSoraz jelitowyprzepływ krwi.14 doba obserwacji odwywołania zmian zapalnych.

Theinfluence of Candida fungi inoculation withor without additionof lacidofil or fluconazole on thearea of colonic lesions,induced with TNBS and colonicblood flow (CBF).14th day ofobservationafter induction of inflammatory lesions.

Rycina 2

Wpływ grzybów Candidaz/lubbez podanegolacidofilui/lubflukonazolu nawagę zmienionejzapalnie tkanki jelita grubegoszczurów. 14 doba obserwacji.

Theinfluenceof Candidafungiwith or withoutaddition oflacidofil or fluconazole on the weight of inflamedcolonictissue. 14th day after induction ofinflammatorylesions.

Rycina 3

Wpływ grzybów Candida z/lub bez podanego lacidofilu i/lubflukonazolu naindeks uszkodzeń w jeliciegrubym szczurów, indukowanych TNBS. 14doba obserwacji.

Theinlfuenceof Candida inoculation with or without additionof lacidofil or fluconazole on the indexof colonic lesions induced withTNBS in rats. 14thdayafter induction of inflammatorylesions.

Rycina 4

Wpływ inokulacji grzybów Candida z/lub bez podanegolacidofilu lub flukonazolu na histologicznyindeks uszkodzeń zmian zapalnych w jelicie grubym wywołanych TNBS. 14 doba obserwacji.

Theinfluence of Candida inoculationwith or withoutlacidofilor fluconazole on the histological index ofinflammatory lesions in the colon, induced with TNBS. 14thday after inductionofinflammatorylesions.

pływu krwi [6]. Jelitowyprzepływkrwi u badanych zwie­

rzątbył wyrażony odsetkowow stosunku do przepływu śluzówkowegokrwiu szczurów nie poddanych działa­ niu TNBS, natomiast otrzymujących w zamiansól fizjo­ logiczną.

Usunięty ośmiocentymetrowy odcinek jelita grube­

go był otwierany wzdłużdługiejosi. Nasilenie makro­

skopowychzmian zapalnych byłooceniane przy po­

mocy metody planimetrycznej(Morphomat, Carl Zeiss, Berlin, Niemcy) przez dwóch niezależnych badaczy, zgodnie z kryteriami podanymi przez Reutera i wsp.[21 ].

Następnie usunięty odcinek jelita ważono.Frag­

mentyzmienionego zapalniejelita grubego wielkości ok.20 mmpobierano, utrwalanow formalinie i zatapia­

no w parafinie,a następniebarwiono rutynowo hema- toksylinąi eozyną(H-E). Histologiczne zmiany w błonie śluzowej jelita grubego badano w mikroskopie świetl­ nym, biorąc poduwagęnastępujące kryteria: obecność, powierzchnia igłębokośćowrzodzenia, obecność i na­

silenie naciekówzapalnych, owrzodzeń, obecnośćwłók- nienia, posługującsię punktowaną skalą zapropono­ waną przez Vilaseca i wsp. [26].

Preparaty histologiczne z błony śluzowej jelita gru­

begoszczurówbyły barwione dodatkowo metodą G/em- zy, wcelu oceny stopnia zakażenia grzybiczego w tkan­ ce jelitowej.

Badania histologiczne byływykonywane w Katedrze Patomorfologii Klinicznej i Doświadczalnej CM UJ w Kra­ kowie(Kierownik:prof,dr hab. med. J. Stachura).

Badania mitologiczne, jakościowe i ilościowew celu obecności Candida w błonieśluzowej jelita grubego wykonywano zgodnie zmetodyką Mullera [19]. Wycinki homogenizowano w 4ml sterylnej soli fizjologicznej,a następnie inkubowanowytrząsając z 0, 25% roztworem trypsyny. Roztwórhomogenatu był wysiewany na podło­ żu Sabourauda (DifcoLab. USA), zawierającym 50 ug/

ml chloramfenikolu. Ilośćkolonii Candida była liczona po uprzedniej inkubacji wysianego materiału przez 48 go­ dzin w temperaturze37 stopni. Identyfikacjagatunków grzybów była przeprowadzonazgodnieze standardami laboratoryjnymi, w oparciu o morfologię kolonii, charak­ terystykę enzymatyczną z użyciemtestówCandidaID, pasków ID32C (system ATB, Bio Merieux).Badania te były wykonywane wZakładzie Mikrobiologii Farmaceu­

tycznej CM UJ w Krakowie (Kierownik: prof,dr hab.Ali­

cjaBudak).

Celemocenynasilenia nacieków neutrofilowych w zmienionej zapalnie błonie śluzowej jelita grubego ozna­ czano aktywność MPOw tkance jelita grubego o masie około 200 mg, którą popobraniuzamrażanodomomentu rozpoczęcia pomiaruaktywności MPO w temperaturze -80 °C. Aktywność MPO oznaczanoza pomocązesta­

wu Biosource, Dortmund Germany.

Wyniki

Wpływ zakażeniagrzybamiCandida na wielkośćuszkodzeńjelita grubego.Efekty leczenia Lacidofilem

Podanie doodbytnicze TNBSwywołało zmiany zapalne w jelicie grubym,z rozle­ głymi owrzodzeniami błony śluzowej. Zmia­

ny makroskopowe jelita, obserwowanew 3 dobie od momentu podania TNBS,były po­

równywalnewe wszystkich badanych gru-

(4)

Zapalenie jelita grubego indukowane TNBS Zapalenie jelita grubego indukowane TNBS

Rycina 5

Miano grzybóww błonie śluzowejjelita grubego orazwagatkankijelita w 14 dobie od wywołania zmian zapalnych w jelicie grubymu szczurów inokulowanych grzybami z/lub bezpodania lacidofilu lub flukonazolu.

The titre of Candida in colonic mucosa and the weightof colonic tissue on the 14th day after inoculation of inflammatorylesions in rats.

Rycina 6

WpływinokulacjiCandida z/lubbez podanegolacidofilu lubflukonazolu na powierzchnię zmian zapalnych w jelicie grubym szczurów,wywołanych TNBS oraz na aktywność enzymuMPO wsurowicy krwi i CBF. 14 doba obserwacji.

The influence of Candida inoculation with or without additionof lacidofil or fluconazole on the inflammatory lesions induced with TNBS in colon mucosa, andon theactivityof MPOinthe serum and CBFon the14th day after induction oflesions.

Rycina 7

Wpływinokulacji Candida z/lubbez podanegolacidofilu lubflukonazolu na stężenie 111-p oraz TNF-a w osoczu krwi uszczurów ze zmianamizapalnymi w jeliciegrubym, indukowanymi TNBS, w 14 dobie obserwacji.

Theinfluence ofCandida inoculationwithor without lacidofil or fluconazole addition, on the serum IL-1p and TNF-a levelin rats with inflammatory colonic lesionsinduced with TNBS. 14thdayafterinduction of lesions.

pachzwierząt i obejmowały rozległe zmia­ ny o charakterze martwicy i krwotocznej.

Histologicznie stwierdzono obecność obrzę­

ku podśluzówkowego, mikrozakrzepów, ostrychneutrofilowych nacieków zapalnych oraz martwicy błonyśluzowej jelitagrubego.

W 14 dobiebadania, a więcwfazie go­

jenia zmian makroskopowych w jelicie ob­

serwowano znamienne różnicew poszcze­

gólnych grupach zwierząt, którewyrażono za pomocą średnich wartościpowierzchni uszkodzeń w badanych grupach, cięża­ rem tkanki pobranej zjelita grubegooraz zmianami przepływu krwi w jelicie grubym.

Średnia powierzchnia owrzodzeńw grupie B szczurów, które otrzymywałydożołądko- wo zawiesinę Candida wynosiła ok. 731 mm2. U zwierzątzakażonych Candida, któ­ re otrzymywałyjednocześnie Lacidofil (gru­ paC) lub flukonazol (grupa D) powierzch­ nia owrzodzeń była statystycznie znamien­

nie mniejszaw porównaniu z grupą kontro­ lną(grupa A) (rycina 1).

U zwierząt zakażonych Candida zaob­

serwowano statystycznie znamiennywzrost średniej wagi tkanki jelita grubego, w po­

równaniu z grupąkontrolną. W 14 dobie badaniawaga taosiągnęła wartośćodpo­ wiednio ok. 1567 mg uzwierząt zakażonych

Candida i 727mg w grupiekontrolnej.

U zwierząt, którym podawano Lacidofil w wodzie pitnejlub flukonazol, średnia waga tkankijelita grubego osiągnęłastatystycz­

nie niższą wartośćwporównaniu z grupą szczurów zakażonych przez Candida(ryci­ na 2).

Analiza wskaźników uszkodzenia błony śluzowej jelita grubego u szczurów, prze­

prowadzonaw 14 dobie badania w oparciu o kryteria podane przez Reutera i wsp.[21], wykazała, że podawanie dożołądkowe Can­

dida albicans (grupa B) statystycznie zna­

miennie zwiększyło średnią powierzchnię uszkodzeń jelitowych.

LeczenieLacidofilem lubflukonazolem spowodowałostatystycznie znamienne ob­

niżenie średniejpowierzchni uszkodzeń je­ litowych,przy czym spadek byłbardziej wi­

doczny w grupie zwierząt otrzymujących otrzymujących Lacidofil, w porównaniu z grupą leczoną flukonazolem (rycina 3).

Ocena histologicznawg skali punktowej nasilenia zmian mikroskopowych w bada­

nym jelicieuszczurów została dokonana w oparciu o klasyfikację zaproponowaną przez Vilaseca i wsp. w 14 dobie badania [26].

Największe nasilenie zmian zapalnych ob­

serwowano u zwierząt zakażonych przez

Candida albicans (grupa D). Pouwzględ­ nieniu takich kryteriów, jak: wielkość owrzo­ dzeń, nasilenienacieków zapalnych, głębo­ kość owrzodzeń,włóknienie, obecność ziar- niniaków, średni wskaźnik zmian histopato­

logicznych wynosiłw tej grupie 5, 5 i war­ tość ta byłastatystycznie znamiennie niż­

sza niż odpowiadającajej wartość wgrupie kontrolnej (rycina 4). Lacidofil i flukonazol znamienniezredukowały wartość indeksu uszkodzeńw porównaniudo wartości tego indeksu uzwierząt zakażonych Candida.

Wpływ zakażenia grzybami Candida bez i w kombinacji z Lacidofilem i flukonazolem na miano grzybów w błonie śluzowej jelita grubego Badania mikologiczne treści jelita gru­ begobadanychzwierząt przeprowadzone w 4 dobie stwierdziły, że mianogrzybów Can­ dida wynosiłopowyżej 104 CFU/mlwgru­ pie zwierząt zakażonych Candida albicans, podczasgdywgrupie zwierzątzakażonych Candida albicans ileczonych Lacidofilem, zanotowano spadekmiana Candida, które osiągnęło wartość poniżej 102 CFU/ml. W tej ostatniej grupie szczurówstwierdzono jednocześniewysokie miano grzybów Sac­ charomyces cerevisiae, ok.lO4 CFU/ml,ilo­

Przegląd Lekarski 2007 /64/3 127

(5)

ściowo znacznie przewyższającemianotych grzybów wgrupie kontrolnej.MianoCandi- da w biopsjach jelitowych pobranych od szczurów otrzymujących flukonazol różniło się od koncentracji grzybów w grupie leczo­ nej Lacidofilem nieznamiennie (poniżej 103CFU/ml), chociaż osiągnęło wyższą war­ tość od obserwowanegowgrupie kontrol­ nej (rycina 5).

Wpływ zakażenia grzybami Candida na zmiany CBF, aktywność MPO icytokin prozapalnych 11-1/3, TNF-a Zgodniez danymi zawartymi narycinie 6, stwierdzono spadek przepływu jelitowe­ go krwi (CBF) oraz 4-5 krotny wzrost ak­ tywności MPO we krwi oraz w tkance ze zmienionego zapalnie jelita grubego.Kolo­

nizacji grzybiczej jelitagrubego towarzyszył wzrostpoziomu IL-1 p i TNF-a wosoczutych zwierząt. Uszczurów otrzymujących C. al- bicansobserwowanowybitne przedłużenie gojenia się uszkodzeń błony śluzowej jelita grubego nawet po 14 dniach obserwacji, wraz z towarzyszącym spadkiemCBFi zna­

miennym wzrostem MPO w tkance zapal­ nej (rycina6,7). Podanie Lacidofilu spowo­

dowało znamiennywzrost CBF ispadek ak­ tywności MPO oraz cytokin prozapalnych w porównaniu z grupą otrzymującą wyłącznie Candida albicans.

Dyskusja

Wraz z doniesieniami natemat możli­ wości terapeutycznegodziałania probioty- kówwzrosło zainteresowanie udziałem flo­ ry korzystnejdla przewodu pokarmowego w etiopatogenezie NZPP [17, 23, 25 ]. Mikro­ flora przewodu pokarmowego obejmuje400 -500 gatunków drobnoustrojów, którewraz ze swoim metabolizmem stanowią „dodat­ kowynarząd" człowieka,dotąd zaniedbywa­

ny,w kontekście zarówno patogenezyscho­ rzeńjelita grubego, jak i potencjalnej ochron­

nej roli, jaką pełniąbakterie o działaniu pro- biotycznym. Do niedawna obserwacjemi­ krobiologiczne koncentrowały sięgłównie na roli bakterii w nieswoistych zapaleniach przewodupokarmowego. W ostatnich latach wzrosło jednak zainteresowanie obecnością grzybów w przewodzie pokarmowym. Zjed­ nejstrony grzyby Candidasą częścią flory przewodu pokarmowego, z drugiej zaś ko­ lonizując jelito mogą przy obniżonej odpor­ ności stanowić źródło grzybiczego rozsie­ wu ogólnoustrojowego [1, 4]. Dotychczas mniej uwagi poświęcono obecności grzybów Candidaw jelicie grubym oraz ich udziało­

wi w indukowaniulub podtrzymywaniu sta­ nuzapalnego przewodu pokarmowego.Dla­ tego w niniejszych badaniach na modelu zwierzęcymwrzodziejącegozapalenia jeli­ ta grubego przeprowadzono ocenę wpływu kolonizacji grzybiczejjelitagrubego na na­

silenie zmian zapalnych w błonie śluzowej jelitagrubego oraz na przebieg ich gojenia.

W ocenie różnic w gojeniu pomiędzy po­

szczególnymi badanymi grupami brano pod uwagę kryteriamakroskopowe i mikrosko­

powezmian oraz różnice wagowe zapal­ nychfragmentów jelita zapalnych w jelicie poprzez ocenę jelitowego przepływu śluzów- kowego (CBF) i aktywności MPO,będącej wskaźnikiem nacieczenia błony śluzowej jelita grubego przez neutrofile, jakrównież

mierzono poziom prozapalnych cytokin IL- 1P iTNF-a wosoczu.

Ocenawyników zmian zarównozmian makroskopowych, takich jak uszkodzenia krwotoczne i mikroskopowych, takich jak uszkodzenia struktury jelitao typieobrzęku podśluzówkowego, przeprowadzona w 3 dobie odpodania TNBS nie wykazałazna­ miennychróżnicpomiędzy badanymigrupa­ mi zwierząt nie zakażonych i zakażonych przez Candida.

W badaniach mikroskopowych, ocenia­ nych w 3 dobie dominowałyzwłaszcza zmia­ nyocharakterze martwiczym oraz krwotocz­ nym. Natomiastwyraźne różnicew dynami­

ce procesu gojenia zaobserwowano w 14 dobie badania, ponieważ u zwierzątzaka­

żonych przezCandidaalbicans zaobserwo­

wano utrzymywanie sięstatystycznie istot­ nie większej powierzchni owrzodzeń błony śluzowejjelita grubego, w porównaniu z gru­ pą kontrolną cowskazuje jednoznacznie na przedłużenie procesu gojenia się tych owrzo­ dzeń u zwierząt zakażonych. Włączenie le­ czenia przeciwgrzybiczego lub zawiesiny bakterii probiotycznych u szczurów otrzymu­

jących zawiesinę Candidawpłynęło korzyst­

nie na szybkość gojenia się zmian zapal­ nych w jeliciegrubym.Jednocześnieprze­

pływ krwi w jelicie grubym był znaczącowy­ ższy u zwierząt leczonych Lacidofilem lub flukonazolemniżwodpowiednich grupach kontrolnych, co wskazuje na znacznyudział mikrokrążeniajelitowegow procesach goje­

nia się wrzodów jelitowych pod wpływemle­ ków przeciwgrzybiczych i niektórych bakte­ rii probiotycznych, wtym głównie Lacidofilu.

Ocena nasileniastanuzapalnegowjeli­ cie na podstawie porównania ciężaru wy­ izolowanych odcinków jelita grubego wyka­ załanajwyższą wagę badanego odcinka je­

lita wgrupie zwierząt otrzymujących zawie­

sinęCandida, a znacznie niższą w grupie, która nie otrzymała leczenia probiotykami.

Podanie flukonazolu lub Lacidofilu przyczy­ niłosię do zmniejszeniawagi badanychod­

cinków jelita grubego, przy czym średnia waga badanych odcinkówjelit byłanajniż­

szawgrupie otrzymującej Lacidofil, co wska­

zuje na możliwośćprzyspieszenia gojenia się tych zmian w jelicie grubympoprzez hamo­

wanieprocesu zapalnego przez probiotyki.

Analiza zmian makroskopowych w jelicie grubym, oparta na punktowanej skali uwzględniającejwielkośći głębokość owrzo­ dzeniaorazobecnośćzrostów potwierdziła korzystny wpływ terapii flukonazolem i Laci­

dofilem, skutkującyw szybszymgojeniusię owrzodzeń pod wpływem probiotyku u zwie­ rząt, które oprócz zawiesiny Candida otrzy­ mywały dożołądkowoprobiotyk.

Nasilenie zaawansowania zmianzapal­ nych wjeliciegrubym u szczurów wobrazie mikroskopowym,uwzględniało takie kryteria jak wielkość owrzodzeń, nasilenienacieków zapalnych, ich głębokość, włóknienie, obec­

ność ziarniniaków. Spadeknasilenia zmian zapalnychstwierdzonou zwierząt otrzymu­

jących probiotykiw grupie kontrolnej, w po­

równaniu do grupy otrzymującej dożołądko­ wo tylko i wyłącznie zawiesinę grzybów Can­

dida.

Potwierdziły to równieżbadania mitolo­ giczne treści jelita grubego stwierdzające znamienny spadek miana grzybów Candida,

(poniżej 102 CFU/g) u zwierząt traktowa­ nych Lacidofilem, zjednoczesnym wzro­

stem,w porównaniu z innymi grupamizwie­ rząt grzybówSaccharomyces cerevisiae, będących fizjologicznym składnikiemmikro­ flory przewodu pokarmowego szczurów.

MianoSaccharomyces cerevisiae przewyż­

szało ilościowomiano tych grzybów wgru­ piekontrolnej. Prawdopodobnie wynikato z uruchamiania pod wpływem bakterii pro­ biotycznych dodatkowych mechanizmów obronnych przewodupokarmowego w po­

staci wzrostu miana grzybów, biorących udział wprzeciwdziałaniu nadmiernej kolo­

nizacji Candidaw jeliciegrubym. Rozwinię­ cie tychzagadnień w modelu doświadczal­ nymwymagajednak dalszych badań.

Wyniki badań eksperymentalnych po­

twierdzają korzystny wpływ probiotyków na przebieg zapalenia jelita grubego u szczu­

rów [23]. Jak wykazaliśmy wobecnej pra­ cy, kolonizacja jelitagrubegoprzez grzyby Candida pogarszena proces gojenia się zmian zapalnych w tym odcinku jelita u szczurów. Włączenie probiotyku poprawia­

łoparametry gojenia zmian zapalnych,wy­ rażonych wskaźnikamizmian makro- i mi­ kroskopowych, spadkiem wagi badanego odcinkajelita,a także redukcjąaktywności MPOi prozapalnych cytokin TNF-a i IL-1 ß w osoczu. Wartym szczególnej uwagi jest fakt, że zmniejszenie nasilenia stanuzapal­ nego, acoza ty idzie przyspieszenie goje­ nia się owrzodzeńjelitowych pod wpływem bakterii probiotycznychbyło większe w po­

równaniu z efektem przeciwzapalnym po podaniu leku przeciwgrzybiczego - fluko­

nazolu.

Wnioski

1. Podanie doodbytnicze szczurom TNBS, powodujew3 dobie zmiany makro­ skopowe w jeliciegrubym oraz wzrostmasy zmienionego zapalnie odcinka jelita, spa­ dek przepływuśluzówkowego i 4-5 krotny wzrostaktywności MPO.

2. Znamienna kolonizacja grzybicza Candidaw jelicie grubym szczurów opóź­

nia gojenie się zmian zapalnychwywoła­

nych za pomocąTNBS.Najpewniej jestto związaneze spadkiem CBFw obszarze owrzodzeń, ponadto wzmożonąekspresją cytokin IL-1ß iTNF-a wekrwi.Terapia pro- biotykiem może okazaćsię skuteczna wle­ czeniu zaostrzenia wrzodziejącego zapale­

niajelita grubego, związanego z koloniza­

cjągrzybiczą.

3. Probiotyk (Lacidofil) wydaje się być skuteczniejszyod flukonazoluw indukowa­ niu gojenia sięzmian zapalnych w jelicie grubym szczurów,z kolonizacją grzybiczą Candida.

Piśmiennictwo

1. BengmarkS.: Ecologicalcontro! ofgastrointestinal tract. The role of probiotic flora. Gut 1998, 42,2.

2. BergR. D.: The indlgenous gastrointestinal micro- flora. TrendsIn Microbiology 1996, 4, 430.

3. Berg R., BernasconiP., Fowler D. et al.: Inhibition of Candida albicans translocation from the gastrointestinal tract of mice by oral administration of Saccharomyces boulardii.J. Infect.Dis. 1993, 168, 1314.

4. BernhardtH., Knoke M.: Mycological aspects of gastrointestinal microflora. Scand. J. Gastroenterol.

1997, 32, (Suppl. 222),102.

5. Blumberg R. S, Saubermann L. J., Strober W.: Ani-

(6)

malmodels of mucosalinflammation and their rela­ tiontohuman inflammatorybowel disease. Current Opinionin Immunology 1999,11, 648.

a.Brzozowski T.,Konturek P. C,DrozdowiczD.et al.:Nitric oxidereleasing aspirinprotects the gastric mucosa againststressand promoteshealingof stress- induced gastric mucosal damage;roleof heat shock protein 70. Digestion 2002, 66, 160.

7. CannonR.D.,Holmes A. R., MasonA.B.etal.:Oral Candida, clearance, colonization or candidiasis? J.

Dent. Res. 1995, 74,1152.

8. Cole G. T, Lynn K. T, Seshan K. R.:Ananimal model for oropharyngeal, esophageal and gastric candidia­

sis. Mycoses 1990,33, 7.

9. D'HaensG.R., Geboes K.,PeetersM. et al.: Early lesions of recurrent Crohn'n disease caused byinfu­

sion of intestinal contents in excluded ileum.Gastro­ enterology 1998,114, 262.

10. ElsonC., Sartor B., Tennyson G. et al.: Experi­ mental modelsof inflammatory bowel disease. Gas­

troenterology 1995, 109,1344.

11. Galeazzi F.,BlennerhassettP. A., Qiu B. et al.: Ciga­

rettesmoke aggravates experimental colitis in rats.

Gastroenterology 1999, 117, 877.

12. Gionchetti P., Rizzello F., Venturi A., G. et al.: Oral bacteriotherapy as maintenance treatmentinpa­

tients with chronic pouchitis: a double- blind, placebo-

controlled trial. Gastroenterology 2000, 119, 305.

13. HoffmannP., Reinshagen M., ZechJ.M. et al.: In­ creased expression ofepidermal growthfactor - receptor in an experimental model ofcolitis in rats.

Scand. J. Gastroenterol. 2000,11,174.

14. IsolauriE., Kirjavainen P. V., SalminenS.:Pro­

biotics: a role in the treatment of intestinal infection and inflammation. Gut 2002, 50, (Suppl.Ill), 54.

15. Kennedy R. J., Hoper M., Deodhar K. et al.:

Gardiner. Probiotic therapy fails toimprove gut per­ meability in a hapten model ofcolitis. Scand. J.

Gastroenterol. 2000,12,1266.

16. Levi S.,Shaw- Smith C.: Non-steroidal anti-inflam­

matorydrugs: how do theydamage the gut. Br.J.

Rheumatol. 1994, 33,105.

17. LinskensR.K., Huijsdens X.W.,Savelkoul P. H. M.

et al.: The bacterial flora ininflammatory bowel dis­

ease: current insights in pathogenesis and the influ­

ence of antibiotics and probiotics.Scand. J. Gastro­ enterol. 2001, (Suppl.234),29.

18. Macpherson A., Maloy K.,Bjarnason I.: Intoler­

ance ofdirty intestine.Gut1999,44, 774.

19. Muller J.: Pathogenidentification inindigenous deep mycoses. La Roche an Co. Colimited company,Basle 1986.

20. RachmilewitzD.: On smoking, rats and inflamma­

tory bowel disease. Gastroenterology1999, 117,

1008, editorials.

21. Reuter B., Asfaha S.,Buret A.et al.: Exacerbation ofinflammation- associated colonicinjuryinrat through inhibition of cyclooxygenase- 2.J. Clin. In­ vest. 1996,98, 2076.

22. Samonis G., AnaisseE., RosenbaumB. etal.:A model ofsustained gastrointestinal colonizationby Candida albicans in healthy adult mice. Infect.

Immun. 1990, 1514.

23. Sandbom W., Targan S.: Biologic therapyof inflam­ matory bowel disease.Gastroenterology 2002, 122, 1592.

24. Shanahan F.: Inflammatorybowel disease: immuno­ diagnostics, immunotherapeuticsand ecothera- peutics.Gastroenterology2001,120, 622.

25. Sartor R.B.: Reviewarticle: role of the enteric microflora in thepathogenesis of intestinal inflam­

mation andarthritis. Aliment. Pharmacol. Ther.1997, 11,(Suppl. 3), 17.

26. VilasecaJ.,Salas A., GuamerF.. Participation of thromboxane and other eicosanoid synthesis in the courseofexperimental inflammatory colitis.Gastro­ enterology 1990,98, 269.

27. Zwoliriska-Wcislo M., Budak A., TrojanowskaD.

et. al.:Effect of fungal colinization of gastricmucosa on the courseofgastriculcerhealing. Med.Sci. Monit.

2001,7, 266.

’rzeglqd Lekarski 2007 / 64 /3 129

Cytaty

Powiązane dokumenty

Proces ten podlega regulacji przez płytkowy czynnik wzrostu (PDGF, platelet derived growth factor), jak również czynnik wzrostu fibroblastów typu 1 (FGF-1, fibroblast growth factor

nieswoistych chorób zapalnych jelit (ECCO, European Crohn’s and Colitis Orga- nisation), wydany w 2013 roku, uwzględnia obie postaci MZJG [2], pojawiło się pytanie, czy

Na podsta- wie tych danych, w przypadku resekcji nisko położonego raka odbytnicy, za wystarczający uznaje się margines dalszy jelita długości 1 cm [1–6].. Ma to o tyle

Napromienianie uzupeł- niające operację u chorych na raka okrężnicy stosowane jest tylko w rzadkich przypadkach guzów zaawansowanych, naciekających na- rządy sąsiednie..

Z niektórych doniesień wynika, że mło- dy wiek w chwili rozpoznania WZJG może być czynnikiem dodatkowo zwiększającym ryzyko raka, są jednak prace ze zgoła odmien- nymi wynikami

roku życia za- kwalifikowanych do leczenia operacyjnego raka jelita grubego konieczne jest bez- względne przestrzeganie protokołów jakości zabiegu operacyjnego, gdyż w innym przy-

Pacjenci z wrzodziejącym zapaleniem je- lita grubego (CU, colitis ulcerosa) lub chorobą Crohna jelita grubego mają zwiększone ryzy- ka raka jelita grubego, szczególnie jeśli:

Występowanie nowotworów złośliwych w czasie ciąży to zjawisko rzadkie, przy czym jednym z najczęst- szych jest właśnie rak jelita grubego (tab. Ocena częstości