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*0 o o BIBLIOTHEEK TU Delft P 1660 5116 488418A S Y S T E M A T I C A P P R O A C H
TO M O B I L E P H A S E EFFECTS
IN R E V E R S E D P H A S E
L I Q U I D C H R O M A T O G R A P H Y
P E T E R J . S C H O E N M A K E R S sA SYSTEMATIC APPROACH
TO MOBILE PHASE EFFECTS
IN REVERSED PHASE
LIQUID CHROMATOGRAPHY
P R O E F S C H R I F T ter v e r k r i j g i n g v a n de g r a a d v a n d o c t o r i n de t e c h n i s c h e w e t e n s c h a p p e n a a n de T e c h n i s c h e H o g e s c h o o l D e l f t , o p g e z a g v a n de r e c t o r m a g n i f i c u s p r o f . i r . B . P . T h . V e l t m a n , v o o r e e n c o m m i s s i e a a n g e w e z e n d o o r h e t c o l l e g e v a n d e k a n e n te v e r d e d i g e n o p d o n d e r d a g 11 j u n i 1 9 8 1 te 1 4 . 0 0 u u r d o o r P E T R U S J O H A N N E S S C H O E N M A K E R S s c h e i k u n d i g i n g e n i e u r , g e b o r e n te S c h i e d a m . D e l f t 1 9 8 1V O O R W O O R D
H e t is e e n v o r m v a n b u r g e r l i j k e o n g e h o o r z a a m h e i d g e w o r d e n o m een p r o e f -schrift a a n te v a n g e n m e t e e n w o o r d v a n d a n k aan de p r o m o t o r . D a t i k m i j a a n s l u i t bij deze g e w o o n t e , is e c h t e r a l l e s b e h a l v e e e n g e m e e n p l a a t s . M i j n p r o m o t o r , p r o fessor L e o de G a l a n is i n h o g e m a t e d e b e t aan h e t t o t s t a n d k o m e n v a n d i t p r o e f -schrift. I k heb v a a k , m a a r n o o i t tevergeefs een b e r o e p g e d a a n o p z i j n a a n d a c h t e n (vrije) t i j d . V o o r z i j n i n s p i r e r e n d e e n c o r r i g e r e n d e i n v l o e d g e d u r e n d e de a f g e l o p e n zes j a a r b e n i k h e m echt d a n k b a a r .
D a a r n a a s t is v e e l v a n d i t proefschrift het w e r k v a n H u g o B i l l i e t . M e t h e m h e b i k i n de v o o r b i j e p e r i o d e z e e r i n t e n s i e f s a m e n g e w e r k t . T o e n i k i n 1975 b e g o n m e t m i j n a f s t u d e e r p r o j e c t o p het g e b i e d v a n de c h r o m a t o g r a f i e , b e s t o n d d i e g r o e p n o g slechts uit H u g o . E e n k l e i n beetje v o l h o u d e n h e b i k i n m i d d e l s o o k g e l e e r d .
Z e k e r het b e g i n v a n m i j n p r o e f s c h r i f t v e r r a a d n o g sterk de i n v l o e d v a n R o b T i j s s e n , d o o r w i e i k m i d d e n i n de c h r o m a t o g r a f i e terecht k w a m . D a t het c o n t a c t d a a r n a w a t m i n d e r is g e w o r d e n , is n a a r i k h o o p g e e n o n o m k e e r b a r e z a a k . I n de p e r i o d e a p r i l tot e n m e t d e c e m b e r 1 9 7 8 h e b i k g e w e r k t o p het l a b o r a t o -r i u m v a n de N o -r t h e a s t e -r n U n i v e -r s i t y te B o s t o n ( M a s s a c h u s e t t s , U . S . A . ) o n d e -r l e i d i n g v a n p r o f e s s o r B . L . K a r g e r . D i t w e r d m e d e m o g e l i j k g e m a a k t d o o r f i n a n c i ë l e steun v a n de N e d e r l a n d s e O r g a n i s a t i e v o o r Z u i v e r W e t e n s c h a p p e l i j k O n d e r z o e k ( Z . W . O . ) . I n de laatste j a r e n h e b i k m e t v e l e m e n s e n b o e i e n d e en s t i m u l e r e n d e g e s p r e k -k e n m o g e n v o e r e n o v e r m i j n w e r -k en de c h r o m a t o g r a f i e i n het a l g e m e e n . E e n a a n t a l z e e r n u t t i g e g e d a c h t e w i s s e l i n g e n m e t d r . L l o y d S n y d e r ( T e c h n i c o n , T a r r y t o w n , N . Y . , U . S . A . ) is m i j e c h t e r i n het b i j z o n d e r b i j g e b l e v e n . M e t d i v e r s e c o l l e g a ' s a a n de T e c h n i s c h e H o g e s c h o o l h e b i k g o e d e n v r u c h t -b a a r m o g e n s a m e n w e r k e n . D a t geldt m e t n a m e v o o r G e r t B e r e n d s e n , R i j n P i k a a r t , P a u l K e e h n e n e n i n e e n l a t e r s t a d i u m C l a u d e L a u r e n t e n A n t o n D r o u e n . D e m u z i k a l e l e i d i n g was i n h a n d e n v a n J o h a n K n o l l . W i e w a t presteert i n de s c h e i k u n d e , w o r d t a l h e e l s n e l v a n a l l e r l e i titels v o o r z i e n ( n e e m m i j b i j v o o r b e e l d ) . V o o r de m e e r p r a k t i s c h e b e r o e p e n is de w a a r d e -r i n g v a a k m i n d e -r s p -r e k e n d . V o o -r alle staaltjes v a n t e c h n i s c h en e l e c t -r o n i s c h k u n n e n d i e i k heb m o g e n a a n s c h o u w e n geldt echter: vakmanschap is meesterschap.
O o k de vele m e e s t e r s v a n het G e b o u w v o o r A n a l y t i s c h e S c h e i k u n d e w o r d e n h i e r b i j b e d a n k t .
D e s t u d e n t e n R o b H a z e l e g e r , J o s H o e v e n , M i c h e l M a r i c a u , V e r s t r a e t e F r a n k en A r c o de V i s s e r h e b b e n a l l e n h u n e n t h o u s i a s m e o p o n d e r d e l e n v a n d i t p r o e f s c h r i f t k u n n e n u i t l e v e n . D a t s o m m i g e o n d e r d e l e n m e t m e e r succes w e r d e n b e k r o o n d d a n a n d e r e , d o e t a a n h u n prestaties niets af.
V o o r de u i t e i n d e l i j k e v e r w e z e n l i j k i n g v a n d i t proefschrift b e n i k v o o r a l d a n k v e r s c h u l d i g d a a n T r u j a E e k h o u t , V i c k y T i g g e l o v e n e n de h e r e n F r a n s B o l m a n ,
C . W a r n a a r e n J . P a a p . I k h o o p dat de u i t e r l i j k e s c h o o n h e i d v a n het resultaat e n i g e c o m p e n s a t i e v o r m t v o o r de v o l s l a g e n o n b e g i j p e l i j k h e i d v a n de i n h o u d .
T e n s l o t t e d a n k i k m i j n o u d e r s , v o o r alles.
D i t proefschrift is g o e d g e k e u r d d o o r de p r o m o t o r
C O N T E N T S S A M E N V A T T I N G 3 S U M M A R Y 9 C h a p t e r 1 T H E S O L U B I L I T Y P A R A M E T E R A S A T O O L I N U N D E R S T A N D I N G C h a p t e r 2 G R A D I E N T S E L E C T I O N I N R E V E R S E D P H A S E L I Q U I D C H R O M A -C h a p t e r 3 I N F L U E N C E O F O R G A N I C M O D I F I E R S O N T H E R E T E N T I O N B E -H A V I O U R I N R E V E R S E D - P -H A S E L I Q U I D C -H R O M A T O G R A P -H Y A N D I T S C O N S E Q U E N C E S F O R G R A D I E N T E L U T I O N 5 3 C h a p t e r 4 T H E U S E O F G R A D I E N T E L U T I O N F O R R A P I D S E L E C T I O N O F I S O C R A T I C C O N D I T I O N S I N R P H P L C 71 C h a p t e r 5 A S Y S T E M A T I C S T U D Y O F T E R N A R Y S O L V E N T B E H A V I O U R I N R E V E R S E D - P H A S E L I Q U I D C H R O M A T O G R A P H Y 91 L I Q U I D C H R O M A T O G R A P H Y 11 T O G R A P H Y 33 1
S A M E N V A T T I N G
D e m o d e r n e h o g e d r u k v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e ( H P L C ) is i n een s t a d i u m g e k o m e n , w a a r i n de technologische aspecten v a n de m e t h o d e i n grote l i j n e n b e g r e -p e n w o r d e n . D e o n t w i k k e l i n g v a n i n s t r u m e n t a t i e e n k o l o m m e n r i c h t z i c h n a a r d i t i n z i c h t . D e k e n n i s v a n de physische a c h t e r g r o n d v a n de H P L C is e c h t e r n o g steeds b e p e r k t . H e t i n h o o f d s t u k 1 b e s c h r e v e n v e r e e n v o u d i g d e o p l o s b a a r h e i d s p a r a m e t e r m o d e l v o r m t e e n p o g i n g o m e n i g t h e o r e t i s c h i n z i c h t te verschaffen i n de a c h t e r g r o n -d e n v a n -de v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e . H e t verschaft o n s e e n r a a m w e r k , w a a r b i n n e n de v e r s c h i l l e n d e v o r m e n v a n H P L C d u i d e l i j k tot u i t i n g k o m e n en w a a r m e e de o n d e r l i n g e v e r g e l i j k i n g v a n v e r s c h i l l e n d e s t a t i o n a i r e e n m o b i e l e fasen m o g e l i j k w o r d t g e m a a k t . D e eerste c o n c l u s i e , d i e o n m i d d e l l i j k v o l g t uit h e t v e r e e n v o u d i g d e o p l o s b a a r h e i d s p a r a m e t e r m o d e l v a n h o o f d s t u k 1, is dat e r twee i n p r i n c i p e e q u i v a -lente m o g e l i j k h e d e n z i j n o m een s c h e i d i n g langs v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i s c h e w e g te b e w e r k s t e l l i g e n . D e z e t w e e t e c h n i e k e n staan b e k e n d als normal phase en reversed phase v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e . I n h e t eerste g e v a l is de s t a t i o n a i r e fase m e e r p o l a i r
d a n de m o b i e l e fase, een situatie, die o v e r e e n k o m t m e t de i n de k l a s s i e k e v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e g e b r u i k t e s y s t e m e n . I n het o m g e k e e r d e g e v a l , w a a r i n de m o b i e l e fase de meest p o l a i r e is, s p r e k e n w e v a n r e v e r s e d phase v l o e i s t o f c h r o m a t o g -rafie ( R P L C ) .
D e oplosbaarheidsparameter k a n g e b r u i k t w o r d e n als e e n k w a n t i f i c e r i n g v a n het b e g r i p p o l a r i t e i t . O p d e z e s c h a a l z i j n a l k a n e n de m i n s t p o l a i r e stoffen en is w a t e r v e r r e w e g de meest p o l a i r e stof. H e t b e r e i k v a n de v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e w o r d t b e p a a l d d o o r het p o l a r i t e i t s t r a j e c t , dat tussen de s t a t i o n a i r e en de m o b i e l e fase o v e r b r u g d k a n w o r d e n . I n de R P L C is het grootst d e n k b a r e b e r e i k te r e a l i s e r e n , d o o r w a t e r als m o b i e l e fase te g e b r u i k e n en d o o r e e n s t a t i o n a i r e fase te c r e ë r e n , d i e q u a p o l a r i t e i t o n g e v e e r m e t a l k a n e n o v e r e e n k o m t . D i t laatste k a n g e b e u r e n d o o r lange a l k y l k e t e n s c h e m i s c h te v e r a n k e r e n aan het o p p e r v l a k v a n een s i l i c a drager. I n de n o r m a l phase versie v a n v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e k u n n e n a l k a n e n a a n g e w e n d w o r d e n als m o b i e l e fase, m a a r het g e b r u i k v a n w a t e r als s t a t i o n a i r e fase stuit o p g r o t e p r a k t i s c h e b e z w a r e n . A l s s t a t i o n a i r e fase w o r d t s i l i c a , als o n g e m o d i f i c e e r d vast a d s o r b e n s , het meest g e b r u i k t . D e p o l a r i t e i t d a a r v a n is e c h t e r a a n z i e n l i j k lager d a n die v a n w a t e r , z o d a t het b e r e i k v a n de n o r m a l phase v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e v e e l k l e i n e r is d a n dat v a n de r e v e r s e d phase v e r s i e .
D e c o m b i n a t i e v a n de s t a t i o n a i r e en de m o b i e l e fase is b e p a l e n d v o o r de retentie i n de H P L C . H o e m e e r f l e x i b e l w e z i j n i n het k i e z e n v a n g e s c h i k t e fasen, h o e m e e r v e r s c h i l l e n d e stoffen er m e t e e n b e p a a l d e v o r m v a n v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e k u n n e n w o r d e n g e ë l u e e r d . D a a r n a a s t w o r d t i n h o o f d s t u k 1 a a n g e t o o n d , dat het a b s o l u t e v e r s c h i l tussen de p o l a r i t e i t v a n de s t a t i o n a i r e en de m o b i e l e fase als m a a t g e b r u i k t k a n w o r d e n v o o r het s c h e i d e n d v e r m o g e n (de selectiviteit) v a n een H P L C -s y -s t e e m . V o o r de r e v e r -s e d pha-se t e c h n i e k b l i j k t de -s e l e c t i v i t e i t b i j n a a l t i j d h o g e r te z i j n d a n v o o r de n o r m a l phase t e c h n i e k . D a a r n a a s t w o r d t i n h o o f d s t u k 1 gesug-g e r e e r d , dat de s e l e c t i v i t e i t i n de R P L C n o gesug-g k a n w o r d e n v e r h o o gesug-g d , d o o r i n plaats v a n a l k y l k e t e n s sterk g e f l u o r i d e e r d e k o o l s t o f k e t e n s te v e r a n k e r e n o p het o p p e r v l a k . I n
dat g e v a l z o u een s y s t e e m o n t s t a a n m e t e e n h o g e r e s e l e c t i v i t e i t d a n e n i g a n d e r e v o r m v a n H P L C .
D o o r a l k y l f a s e n te g e b r u i k e n i n c o m b i n a t i e m e t m o b i e l e fasen v a n u i t e e n l o -p e n d e -p o l a r i t e i t k u n n e n i n -p o l a r i t e i t sterk u i t e e n l o -p e n d e stoffen w o r d e n g e ë l u e e r d . O m g e k e e r d echter, k u n n e n v o o r é é n stof z e e r grote v e r s c h i l l e n i n r e t e n t i e t i j d e n w o r d e n w a a r g e n o m e n . A l s w e i n plaats v a n w a t e r m e t h a n o l als m o b i e l e fase g e b r u i -k e n , l o o p t de retentie v a a -k m e t e e n factor 1 0 0 0 t e r u g , z o a l s i n h o o f d s t u -k 2 b l i j -k t . D o o r w a t e r en m e t h a n o l i n de j u i s t e v e r h o u d i n g te m e n g e n , k a n i e d e r e stof met e e n o p t i m a l e retentie w o r d e n g e ë l u e e r d . I n het a l g e m e e n b l i j k t de l o g a r i t h m e v a n de k a p a c i t e i t s f a c t o r (In k) af te n e m e n m e t de v o l u m e fractie m e t h a n o l (<p) v i a e e n t w e e d e g r a a d s v e r g e l i j k i n g . D e k r o m m i n g v a n de c u r v e is e c h t e r n o g a l g e v o e l i g v o o r de k e u z e v a n de o n v e r t r a a g d e t i j d . I n h o o f d s t u k 3 is e e n r e ë l e r e w a a r d e g e b r u i k t d a n in h o o f d s t u k 2, m e t als g e v o l g dat het v e r b a n d tussen In k en <p i n het m e t h a n o l - w a t e r s y s t e e m n a g e n o e g l i n e a i r w o r d t . A l s i n plaats v a n m e t h a n o l m i n d e r p o l a i r e o r g a n i sche o p l o s m i d d e l e n (modifiers) w o r d e n g e m e n g d m e t w a t e r , z o a l s e t h a n o l o f n p r o -p a n o l (zie h o o f d s t u k 2 ) , a c e t o n i t r i l o f t e t r a h y d r o f u r a n ( T H F ) (zie h o o f d s t u k 3 ) , d a n b l i j k t de k r o m m i n g v a n de l i j n d i e In k als functie v a n (p weergeeft v e e l g r o t e r te z i j n , o n g e a c h t de k e u z e v a n de o n v e r t r a a g d e t i j d .
D o o r d a t de retentie i n R P L C z o sterk w o r d t b e ï n v l o e d d o o r de s a m e n s t e l l i n g van de m o b i e l e fase, k a n e e n b e p a a l d e s t o f slechts o v e r een b e p e r k t s a m e n s t e l l i n g s traject w o r d e n g e ë l u e e r d m e t r e d e l i j k e r e t e n t i e t i j d e n . I n een m e n g s e l v a n v e r -s c h i l l e n d e -stoffen, w a a r v o o r -s c h e i d i n g verei-st w o r d t , k a n het d a a r o m g e m a k k e l i j k v o o r k o m e n , dat e r geen e n k e l e m o b i e l e fase te v i n d e n is, w a a r m e e alle stoffen o p r e d e l i j k e t i j d e n g e ë l u e e r d k u n n e n w o r d e n . I n z o ' n g e v a l k a n het t o e p a s s e n v a n g r a d i ë n t - e l u t i e u i t k o m s t b i e d e n .
B i j gradiënt-elutie w o r d t de s a m e n s t e l l i n g v a n de m o b i e l e fase t i j d e n s de e l u t i e v e r a n d e r d . Z o d o e n d e is het m o g e l i j k o m i e d e r e c o m p o n e n t i n e e n sterk u i t e e n l o -p e n d m e n g s e l te e l u e r e n met e e n g e s c h i k t e r e t e n t i e t i j d . G r a d i ë n t - e l u t i e begint a l t i j d m e t het z w a k s t e e l u e n s , dat w i l zeggen m e t de m o b i e l e fase, die de h o o g s t e r e t e n -t i e -t i j d e n o p l e v e r -t . I n R P L C b e g i n -t m e n me-t w a -t e r , o f me-t e e n e l u e n s da-t v e e l w a -t e r bevat. Slechts de meest p o l a i r e c o m p o n e n t e n v a n het m o n s t e r z u l l e n d a n d o o r de k o l o m m i g r e r e n , t e r w i j l de a n d e r e c o m p o n e n t e n n a u w e l i j k s verplaatst w o r d e n . A l s v e r v o l g e n s steeds m e e r w a t e r g e l e i d e l i j k v e r v a n g e n w o r d t d o o r m e t h a n o l o f e e n a n d e r e m o d i f ï e r , b e g i n n e n de v e r s c h i l l e n d e stoffen é é n v o o r é é n te m i g r e r e n , i n v o l g o r d e v a n a f n e m e n d e p o l a r i t e i t . I n een t y p i s c h e g r a d i ë n t - r u n v a n 15 m i n u t e n , die l o o p t v a n p u u r w a t e r tot p u u r m e t h a n o l , k u n n e n a l d u s zeer u i t e e n l o p e n d e stoffen w o r d e n g e ë l u e e r d .
I n h o o f d s t u k 2 w o r d e n t h e o r e t i s c h e u i t d r u k k i n g e n a f g e l e i d v o o r de retentie van e e n b e p a a l d e stof o n d e r g r a d i ë n t - c o n d i t i e s , als het i s o c r a t i s c h r e t e n t i e g e d r a g (als functie v a n de m o b i e l e fase s a m e n s t e l l i n g ) v a n die s t o f b e k e n d is. E e n g o e d e o v e r e e n s t e m m i n g tussen t h e o r i e en p r a k t i j k k a n w o r d e n w a a r g e n o m e n .
O p basis v a n de i n h o o f d s t u k 2 afgeleide v e r g e l i j k i n g e n v o o r het r e t e n t i e g e -d r a g i n -de R P L C o n -d e r g r a -d i ë n t - c o n -d i t i e s , w o r -d t i n h o o f -d s t u k 3 een -discussie g e w i j -d a a n de o p t i m a l e v o r m v a n de toegepaste g r a d i ë n t e n , dat w i l zeggen de w i j z e w a a r o p de s a m e n s t e l l i n g v a n de m o b i e l e fase met de t i j d d i e n t te v a r i ë r e n . H e t i s o c r a t i s c h e
v e r b a n d tussen In k en cp v o o r v e r s c h i l l e n d e stoffen b l i j k t b e p a l e n d te z i j n v o o r de v o r m v a n de o p t i m a l e g r a d i ë n t . V o o r d i t d o e l b l i j k t het v o l d o e n d e te z i j n o m het k w a d r a t i s c h e v e r b a n d tussen In k en q> o v e r een b e p e r k t traject (1 < k < 10) te b e n a d e r e n d o o r e e n r e c h t e l i j n :
In k = In k„ — S q>
A l s de w a a r d e v a n 5 v o o r alle stoffen o n g e v e e r d e z e l f d e is, d a n is een l i n e a i r e g r a d i ë n t o p t i m a a l . D i t b l i j k t a l l e e n het g e v a l te z i j n als a c e t o n i t r i l als o r g a n i s c h e m o d i f i e r w o r d t g e b r u i k t . I n de s y s t e m e n w a t e r - m e t h a n o l en w a t e r - T H F b l i j k t e c h t e r een s t e r k e c o r r e l a t i e te b e s t a a n tussen de asafsnede In k0 en de h e l l i n g S. D a a r d o o r is v o o r deze s y s t e m e n een c o n v e x e g r a d i ë n t o p t i m a a l . D e t o e p a s s i n g v a n m i c r o p r o -cessoren v o o r de s t u r i n g v a n g r a d i ë n t - a p p a r a t u u r z a l het m o g e l i j k m a k e n o m d e r g e l i j k e o p t i m a l e g r a d i ë n t e n o o k z o n d e r v e e l m o e i t e i n de p r a k t i j k te r e a l i s e r e n . H o o f d s t u k 4 gaat i n o p de t o e p a s s i n g e n v a n g r a d i ë n t - e l u t i e . G r a d i ë n t - e l u t i e geeft o n s de m o g e l i j k h e i d o m e e n m o n s t e r m e t sterk u i t e e n l o p e n d e c o m p o n e n t e n te s c h e i d e n . E r z i j n e c h t e r twee d u i d e l i j k e n a d e l e n , d i e b e p a l e n , dat g r a d i ë n t - e l u t i e n i e t g e s c h i k t is v o o r t o e p a s s i n g i n r o u t i n e m a t i g e analyses. I n de eerste plaats is de c h r o m a t o g r a f i s c h e k o l o m niet b e s t a n d tegen r e g e l m a t i g e s c h o k s g e w i j z e v e r a n d e r i n g e n i n de s a m e n s t e l l i n g v a n de m o b i e l e fase. V e r a n d e r i n g e n d i e n e n dus g e l e i d e -l i j k te w o r d e n d o o r g e v o e r d . O o k is e e n b e p a a -l d e ( c o n s t a n t e ) e q u i -l i b r a t i e t i j d n o d i g v ó ó r de a a n v a n g v a n de analyse. D a a r d o o r is er een t a m e l i j k lange t i j d (ca. 3 0 m i n u t e n ) n o d i g v o o r het v e r r i c h t e n v a n e e n a n a l y s e m e t b e h u l p v a n g r a d i ë n t - e l u t i e .
E e n t w e e d e p r o b l e e m v o r m t de detectie v a n de m o n s t e r c o m p o n e n t e n . U n i -versele d e t e c t o r e n z i j n niet b r u i k b a a r , o m d a t deze te g e v o e l i g z o u d e n z i j n v o o r de v e r a n d e r i n g v a n de s a m e n s t e l l i n g v a n de m o b i e l e fase. E r b l i j k t e c h t e r o o k geen s e l e c t i e v e detectie m o g e l i j k te z i j n , d i e v o o r d e z e v e r a n d e r i n g g e h e e l o n g e v o e l i g is. D i t h a n g t v o o r a l s a m e n m e t o n z u i v e r h e d e n i n de e l u e n t i a . Z e l f s z e e r z u i v e r e o p l o s m i d d e l e n g e v e n a a n l e i d i n g tot e e n a a n z i e n l i j k b l a n c o s i g n a a l , zoals de v o o r -b e e l d e n i n h o o f d s t u k 4 laten z i e n . D a a r d o o r k a n de i n t r i n s i e k e g e v o e l i g h e i d v a n de d e t e c t o r niet ten v o l l e w o r d e n benut.
D o o r b o v e n s t a a n d e p r o b l e m e n is het v o o r r o u t i n e b e p a l i n g e n v e e l a a n t r e k -k e l i j -k e r o m g e b r u i -k te m a -k e n v a n -kolomscha-kelingstechnie-ken, w a a r b i j o p e e n s l i m m e m a n i e r m e e r d a n é é n c h r o m a t o g r a f i s c h e k o l o m w o r d t g e b r u i k t . G r a d i ë n t -e l u t i -e blijft a a n g -e w -e z -e n v o o r d-e n i -e t - r o u t i n -e m a t i g -e analys-e v a n m o n s t -e r s m -e t -e -e n g r o o t p o l a r i t e i t s t r a j e c t . H o o f d s t u k 4 beschrijft e e n a n d e r e g e ë i g e n d e t o e p a s s i n g v a n g r a d i ë n t - e l u t i e . I n d i t h o o f d s t u k w o r d t b e s c h r e v e n , h o e v o o r e e n v o l l e d i g o n b e k e n d m o n s t e r o p zeer snelle w i j z e geschikte c h r o m a t o g r a f i s c h e c o n d i t i e s te b e p a l e n z i j n d o o r g e b r u i k te m a k e n v a n g r a d i ë n t - e l u t i e als scanningstechniek.
E e n gegeven m o n s t e r k a n i n R P L C i m m e r s slechts o v e r een b e p e r k t s a m e n -stellingstraject v a n de m o b i e l e fase met r e d e l i j k e r e t e n t i e t i j d e n w o r d e n g e ë l u e e r d . E e n m o b i e l e fase, die t e v e e l w a t e r bevat, z a l l e i d e n tot o n p r a k t i s c h h o g e r e t e n t i e t i j -d e n , t e r w i j l te w e i n i g w a t e r z a l r e s u l t e r e n i n e r g la^(ge r e t e n t i e t i j -d e n e n -d a a r -d o o r e e n slechte s c h e i d i n g .
O m v o o r een b e p a a l d m o n s t e r g e s c h i k t e i s o c r a t i s c h e c o n d i t i e s te b e p a l e n w o r d t i n de p r a k t i j k een t i j d r o v e n d e ' t r i a l a n d e r r o r ' p r o c e d u r e g e v o l g d . O m d a t i n e e n g r a d i ë n t - r u n een g r o o t a a n t a l v e r s c h i l l e n d e s a m e n s t e l l i n g e n d o o r l o p e n w o r d t , is het m o g e l i j k o m v a n u i t é é n , o n d e r g r a d i ë n t - c o n d i t i e s o p g e n o m e n , c h r o m a t o g r a m te v o o r s p e l l e n o f het b e w u s t e m o n s t e r g e s c h i k t is o m i s o c r a t i s c h g e ë l u e e r d te w o r d e n en z o j a , b i j w e l k e s a m e n s t e l l i n g d i t d a n z o u m o e t e n g e b e u r e n . I n h o o f d s t u k 4 w o r d t d e z e m o g e l i j k h e i d m e t een t w e e t a l v o o r b e e l d e n g e ï l l u s t r e e r d . D e meest n a u w k e u r i -ge m a n i e r o m v a n u i t e e n g r a d i ë n t - r u n u i t s p r a k e n te d o e n o m t r e n t het i s o c r a t i s c h r e t e n t i e g e d r a g v a n een b e p a a l d m o n s t e r is v i a e e n g r a d i ë n t i n het s y s t e e m w a t e r m e t h a n o l . A l s i s o c r a t i s c h e e l u t i e m o g e l i j k b l i j k t te z i j n , v i n d e n w e d a n de s a m e n s t e l l i n g v a n e e n b i n a i r m e n g s e l v a n w a t e r en m e t h a n o l , w a a r v a n w e m o g e n v e r -w a c h t e n dat het r u -w -w e g o p t i m a l e r e t e n t i e t i j d e n z a l o p l e v e r e n v o o r het b e -w u s t e m o n s t e r .
D i t hoeft e c h t e r n o g n i e t te b e t e k e n e n , dat o o k een g o e d e scheiding tussen de v e r s c h i l l e n d e c o m p o n e n t e n v a n het m o n s t e r z a l w o r d e n v e r k r e g e n . N e t zoals de m o b i e l e fase i n de R P L C v e r a n t w o o r d e l i j k is v o o r de mate v a n Fetentie, z o k a n o o k de s c h e i d i n g d o o r de m o b i e l e fase w o r d e n b e ï n v l o e d . D i t k a n niet g e b e u r e n d o o r v e r a n d e r i n g v a n het w a t e r g e h a l t e , o m d a t d a n de r e t e n t i e t i j d e n a l s n e l te l a n g o f te k o r t w o r d e n . W e l k a n de s c h e i d i n g b e ï n v l o e d w o r d e n d o o r de k e u z e v a n de o r g a n i sche m o d i f i e r . I n h o o f d s t u k 4 w o r d e n o v e r d r a c h t s r e g e l s a f g e l e i d , o m m e t h a n o l w a -ter mengsels te k u n n e n v e r v a n g e n d o o r a c e t o n i t r i l - w a t e r en T H F - w a t e r mengsels, z o n d e r dat de retentie v e e l v e r a n d e r t . I n het a l g e m e e n b e v a t t e n d e r g e l i j k e b i n a i r e mengsels, d i e d e z e l f d e retentie v e r t o n e n v o o r e e n ' g e m i d d e l d e stof' (iso-eluotrope mengsels), v e r s c h i l l e n d e p e r c e n t a g e s w a t e r . M e t b e h u l p v a n de i n h o o f d s t u k 4 vastgelegde overgangsregels is h e t m o g e l i j k o m s n e l te o n d e r z o e k e n , o f het v e r v a n -gen v a n m e t h a n o l i n de m o b i e l e fase d o o r a c e t o n i t r i l o f T H F v o o r het o n d e r h a v i g e m o n s t e r v e r b e t e r i n g i n de s c h e i d i n g o p l e v e r t . D e i n dit h o o f d s t u k gegeven v o o r b e e l -d e n i l l u s t r e r e n -die m o g e l i j k h e i -d .
I n h o o f d s t u k 5 w o r d t h i e r o p v o o r t g e b o u w d , d o o r naast de b i n a i r e mengsels v a n m e t h a n o l , a c e t o n i t r i l o f T H F m e t w a t e r , o o k ternaire mengsels, w a a r i n d r i e v a n d e z e v i e r c o m p o n e n t e n v o o r k o m e n , i n het o n d e r z o e k te b e t r e k k e n . O o k h i e r k a n het c o n c e p t v a n i s o - e l u o t r o p e mengsels w o r d e n toegepast, m a a r het a a n t a l t e r n a i r e mengsels, dat met e e n g e g e v e n b i n a i r r e f e r e n t i e m e n g s e l o v e r e e n k o m t , is n u i n p r i n c i p e o n e i n d i g . I n h o o f d s t u k 5 w o r d e n iso-eluotrope diagrammen g e c o n s t r u e e r d , w a a r u i t i s o e l u o t r o p e t e r n a i r e mengsels k u n n e n w o r d e n afgelezen. D e e x p e r i m e n -tele c u r v e n i n een d e r g e l i j k d i a g r a m , b l i j k e n g o e d o v e r e e n te k o m e n m e t de uit het v e r e e n v o u d i g d e o p l o s b a a r h e i d s p a r a m e t e r m o d e l b e r e k e n d e rechte l i j n e n . R e t e n -tie i n t e r n a i r e s y s t e m e n b l i j k t b e s c h r e v e n te k u n n e n w o r d e n met e e n e e n v o u d i g e t w e e d e g r a a d s v e r g e l i j k i n g . H e t o v e r e e n k o m s t i g e d r i e - d i m e n s i o n a l e v l a k is zeer r e g e l m a t i g en v e r t o o n t geen l o c a l e m a x i m a o f m i n i m a . Q u a retentie b l i j k e n t e r n a i r e s y s t e m e n e e n g e l e i d e l i j k e o v e r g a n g te v o r m e n tussen twee b i n a i r e s y s t e m e n .
H o e w e l i s o - e l u o t r o p e mengsels g e m i d d e l d tot d e z e l f d e retenties a a n l e i d i n g z u l l e n g e v e n , z u l l e n er z o w e l u i t z o n d e r i n g e n n a a r b e n e d e n als n a a r b o v e n z i j n . D e z e r e l a t i e v e v e r s c h u i v i n g e n k u n n e n w e a f m e t e n a a n het s y s t e e m m e t h a n o l - w a t e r . I n h o o f d s t u k 5 w o r d t v o o r i e d e r e t e r n a i r e m o b i e l e fase het i s o - e l u o t r o p e b i n a i r e m e n g s e l v a n m e t h a n o l en w a t e r als r e f e r e n t i e m e n g s e l g e d e f i n i e e r d . A l s een b e p a a l
-de stof s n e l l e r w o r d t g e ë l u e e r d , d a n i n het o v e r e e n k o m s t i g e r e f e r e n t i e m e n g s e l , d a n s p r e k e n w e v a n een p o s i t i e f specifiek effect, o f e e n p o s i t i e v e specificiteit. A l s de retentie d a a r e n t e g e n l a n g e r w o r d t , s p r e k e n w e v a n e e n n e g a t i e v e s p e c i f i c i t e i t . I n h o o f d s t u k 5 b l i j k t , dat de s p e c i f i c i t e i t v a n b i n a i r e mengsels g r o t e r is d a n die v a n de t u s s e n l i g g e n d e t e r n a i r e s y s t e m e n . T e r n a i r e s y s t e m e n b i e d e n n i e t z o z e e r een m o g e -l i j k h e i d tot v e r g r o t i n g v a n het s p e c i f i e k e effect, a-ls w e -l een ge-leide-lijke overgang tussen v e r s c h i l l e n d e b i n a i r e mengsels. T e r n a i r e m e n g s e l s z i j n dus de a a n g e w e z e n w e g , als de s p e c i f i e k e effecten v a n b i n a i r e mengsels t.o.v. m e t h a n o l - w a t e r te g r o o t z i j n . I n h o o f d s t u k 5 b l i j k t o o k , dat de s p e c i f i e k e effecten het grootst z i j n v o o r d i e m o b i e l e fasen, d i e i s o - e l u o t r o o p z i j n m e t mengsels v a n o n g e v e e r 5 0 % w a t e r en 5 0 % m e t h a n o l . Z o w e l v o o r de zeer s t e r k e als v o o r de z e e r z w a k k e e l u e n t i a z i j n de s p e c i e k e effecten s y s t e m a t i s c h k l e i n e r .
H e t i n h o o f d s t u k 5 b e s c h r e v e n v o o r b e e l d laat z i e n , dat de met t e r n a i r e mengsels b e h a a l d e s p e c i f i c i t e i t t a m e l i j k v o o r s p e l b a a r is, v a n u i t de c h r o m a t o g r a m -m e n , d i e -m e t b i n a i r e -mengsels v e r k r e g e n z i j n . D e strategie, die i n h o o f d s t u k 4 b e s c h r e v e n w e r d v o o r de a a n p a k v a n v o l l e d i g o n b e k e n d e m o n s t e r s m e t R P L C , k a n n u v e r l e n g d w o r d e n i n de r i c h t i n g v a n de t e r n a i r e s y s t e m e n v a n h o o f d s t u k 5. A l s geen v a n de b i n a i r e mengsels v o l d o e n d e s c h e i d i n g o p l e v e r t , k u n n e n t e r n a i r e m e n g sels ( i n s o m m i g e g e v a l l e n ) u i t k o m s t b i e d e n . V o o r m o n s t e r s d i e n i e t g e h e e l o n b e -k e n d z i j n , b l i j -k t het m o g e l i j -k o m een m e e r b e r e d e n e e r d e w e g te v o l g e n b i j het z o e k e n n a a r o p t i m a l e e l u t i e - c o n d i t i e s . D i t k a n aan de h a n d v a n vuistregels, d i e de o p t r e d e n d e s p e c i f i e k e effecten als g e v o l g v a n het v e r v a n g e n v a n m e t h a n o l d o o r a c e t o n i t r i l o f T H F o n d e r v e r d e l e n n a a r de i n de m o n s t e r c o m p o n e n t e n a a n w e z i g e f u n c t i o n e l e g r o e p e n . C O N C L U S I E I n dit p r o e f s c h r i f t is e e n p o g i n g g e d a a n o m de i n v l o e d v a n de m o b i e l e fase o p de r e t e n t i e e n de s e l e c t i v i t e i t i n de R P L C s y s t e m a t i s c h te b e s t u d e r e n en te b e s c h r i j -v e n . D e o p l o s b a a r h e i d s p a r a m e t e r t h e o r i e k a n w o r d e n a a n g e w e n d v o o r de o n t w i k -k e l i n g v a n e e n a l g e m e e n r a a m w e r -k , dat g e b r u i -k t -k a n w o r d e n o m de i n v l o e d v a n de m o b i e l e fase te v o o r s p e l l e n . D e r e l a t i e s , d i e het o p l o s b a a r h e i d s p a r a m e t e r m o d e l o p l e v e r t v o o r het r e t e n -t i e g e d r a g als func-tie v a n de m o b i e l e fase s a m e n s -t e l l i n g , k u n n e n w o r d e n g e b r u i k -t als e e n k w a l i t a t i e v e basis v o o r de r e t e n t i e b e s c h r i j v i n g i n de R P L C . V o o r i e d e r e stof d i e n e n de c o ë f f i c i ë n t e n e x p e r i m e n t e e l b e p a a l d te w o r d e n .
G r a d i ë n t e l u t i e k a n k w a n t i t a t i e f b e s c h r e v e n w o r d e n , als het i s o c r a t i s c h r e -t e n -t i e g e d r a g als func-tie v a n de m o b i e l e fase s a m e n s -t e l l i n g b e k e n d is. D a a r d o o r is he-t m o g e l i j k o m u i t s p r a k e n te d o e n o m t r e n t de o p t i m a l e v o r m v a n g r a d i ë n t e n i n R P L C - s y s t e m e n . G r a d i ë n t - e l u t i e k a n o o k w o r d e n g e b r u i k t als s c a n n i n g s t e c h n i e k , t e n e i n d e g e s c h i k t e i s o c r a t i s c h e e l u t i e - c o n d i t i e s v o o r een o n b e k e n d m o n s t e r s n e l te k u n n e n b e p a l e n . 7
I n de R P L C k u n n e n v e r s c h i l l e n d e o r g a n i s c h e m o d i f i e r s i n b i n a i r e en t e r n a i r e mengsels met w a t e r w o r d e n g e b r u i k t . D i e m e n g s e l s , d i e g e m i d d e l d d e z e l f d e r e t e n -t i e -t i j d e n o p l e v e r e n n o e m e n w e i s o - e l u o -t r o o p . D e s a m e n s -t e l l i n g v a n i s o - e l u o -t r o p e mengsels k a n e x p e r i m e n t e e l w o r d e n b e p a a l d , o f w o r d e n geschat v i a het o p l o s b a a r -h e i d s p a r a m e t e r m o d e l .
V o o r e e n gegeven stof l e v e r e n i s o - e l u o t r o p e m e n g s e l s niet steeds d e z e l f d e r e t e n t i e t i j d e n o p . W e s p r e k e n v a n s p e c i f i e k e effecten.
S p e c i f i e k e effecten k u n n e n tot v e r b e t e r d e s c h e i d i n g e n l e i d e n , als g e b r u i k g e m a a k t w o r d t v a n g e s c h i k t e b i n a i r e o f t e r n a i r e m o b i e l e fase s a m e n s t e l l i n g e n .
H e t i n dit proefschrift g e h a n t e e r d e v e r e e n v o u d i g d e o p l o s b a a r h e i d s p a r a m e t e r m o d e l v o l d o e t niet als b e t r o u w b a r e k w a n t i t a t i e v e b e s c h r i j v i n g v o o r de retentie i n de v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e . D e o n t w i k k e l i n g v a n e e n d e r g e l i j k m o d e l is de b e l a n g -r i j k s t e u i t d a g i n g , d i e -restee-rt n a de s t o -r m a c h t i g e o n t w i k k e l i n g e n i n de H P L C g e d u r e n d e de a f g e l o p e n t i e n jaar. E e n b e t r o u w b a r e , e e n v o u d i g e p h y s i s c h - c h e m i s c h e t h e o r i e v o o r het g e d r a g v a n v l o e i s t o f f e n e n o p l o s s i n g e n v a n e e n z o sterk u i t e e n l o p e n d k a r a k t e r als d i e , w e l k e w e i n de v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i e t e g e n k o m e n , is m o m e n t e e l niet v o o r h a n d e n . D a a r n a a s t resteert e e n g r o o t a a n t a l c h r o m a t o g r a f i s c h e v r a g e n , m e t n a m e v o o r wat betreft de R P L C . D e k a r a k t e r i s e r i n g v a n c h e m i s c h g e b o n d e n s t a t i o n a i r e fasen, de i n t e r a c t i e v a n d e z e fasen met de m o n s t e r c o m p o n e n t e n é n met de m o b i e l e fase, de f e i t e l i j k e s a m e n s t e l l i n g en s t r u c t u u r v a n de s t a t i o n a i r e fase e n v a n het g r e n s v l a k m e t de m o b i e l e fase z i j n alle h i n d e r n i s s e n , d i e e e n g o e d e k w a n t i t a t i e v e m o d e l v o r m i n g v o o r R P L C b e m o e i l i j k e n .
D i t b e t e k e n t echter niet, dat i e d e r e p o g i n g i n d i e r i c h t i n g m o e t w a c h t e n o p u i t s l u i t s e l o m t r e n t a l l e h i e r b o v e n g e n o e m d e p r o b l e m e n . D e k w a l i t a t i e v e en s e m i -k w a n t i t a t i e v e u i t s p r a -k e n , d i e o p g r o n d v a n de i n p r o e f s c h r i f t b e s c h r e v e n b e n a d e r i n g g e d a a n k u n n e n w o r d e n , b i e d e n d a n o o k w e l d e g e l i j k m o g e l i j k h e d e n v o o r e e n v e r b e t e r d i n z i c h t i n het v l o e i s t o f c h r o m a t o g r a f i s c h e s c h e i d i n g s y s t e e m .
S U M M A R Y
T h e i n f l u e n c e o f the m o b i l e phase o n r e t e n t i o n a n d s e l e c t i v i t y i n r e v e r s e d phase l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( R P L C ) is the subject o f this thesis.
I n chapter 1 a g e n e r a l f r a m e w o r k is d e v e l o p e d , b a s e d o n s i m p l i f i e d s o l u b i l i t y p a r a m e t e r t h e o r y . T h e r e v e r s e d phase m o d e o f l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , w h e r e the m o b i l e p h a s e is m o r e p o l a r t h a n the s t a t i o n a r y phase, t u r n s o u t to be the m o s t p o w e r f u l s e p a r a t i o n t e c h n i q u e i n h i g h p r e s s u r e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) . It is s h o w n , that the n a t u r e a n d c o m p o s i t i o n o f the m o b i l e p h a s e h a v e a d r a m a t i c i n f l u e n c e o n retention i n R P L C . T h e g e n e r a l selectivity o f a l i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c s y s t e m is d e f i n e d i n c h a p t e r 1 as the a b s o l u t e d i f f e r e n c e b e t w e e n the p o l a r i t i e s o f the t w o phases. U n f o r t u n a t e l y , it a p p e a r s that the g e n e r a l s e l e c t i v i t y o f a g i v e n R P L C c o l u m n c a n n o t be i n c r e a s e d - b y a d a p t i n g the m o b i l e phase - w i t h o u t i n c r e a s i n g r e t e n t i o n at the same t i m e . I n c r e a s e d s e l e c t i v i t y t o w a r d s c e r t a i n p a i r s o f solutes, r e f e r r e d t o as specificity, c a n be i n f l u e n c e d b y c h a n g i n g the n a t u r e o f the m o b i l e phase, but s u c h specific effects are difficult to p r e d i c t . T h e v i t a l r o l e o f w a t e r i n R P L C is m a d e c l e a r i n c h a p t e r 1.
I n chapter 2 it is s h o w n , h o w r e t e n t i o n v a r i e s w i t h m o b i l e phase c o m p o s i t i o n i n b i n a r y m i x t u r e s o f w a t e r w i t h t h r e e different o r g a n i c m o d i f i e r s : m e t h a n o l , e t h a n o l , a n d n - p r o p a n o l . A q u a d r a t i c r e l a t i o n s h i p b e t w e e n the l o g a r i t h m o f the c a p a c i t y f a c t o r a n d t h e v o l u m e f r a c t i o n o f the o r g a n i c m o d i f i e r is p r e d i c t e d a n d o b s e r v e d . A n i n t r i g u i n g aspect o f the i n f l u e n c e o f the m o b i l e p h a s e i n R P L C is the a p p l i c a t i o n o f gradient elution. It is s h o w n , that the k n o w n v a r i a t i o n o f i s o c r a t i c r e t e n t i o n w i t h
m o b i l e p h a s e c o m p o s i t i o n c a n be u s e d to p r e d i c t a c c u r a t e l y t h e r e t e n t i o n o f a solute s u b j e c t e d t o v a r i o u s g r a d i e n t p r o g r a m s . T h e i s o c r a t i c r e t e n t i o n b e h a v i o u r c o u l d n o t be p r e d i c t e d f r o m the s o l u b i l i t y p a r a m e t e r m o d e l o f c h a p t e r 1, unless e m p i r i c a l m o d i f i c a t i o n s w h e r e i n c o r p o r a t e d i n t h e m o d e l .
I n chapter 3 we discuss t h e optimal shape of binary gradients i n R P L C . T h r e e different o r g a n i c m o d i f i e r s are u s e d : m e t h a n o l , a c e t o n i t r i l e a n d t e t r a h y d r o f u r a n ( T H F ) . F o r g r a d i e n t e l u t i o n p u r p o s e s , it a p p e a r s to be p o s s i b l e to a p p r o x i m a t e the q u a d r a t i c r e l a t i o n s h i p b e t w e e n the l o g a r i t h m o f the c a p a c i t y factor a n d the v o l u m e f r a c t i o n o f o r g a n i c m o d i f i e r b y a straight l i n e o v e r a l i m i t e d i n t e r v a l (1 < k < 10). F o r m e t h a n o l - w a t e r a n d T H F - w a t e r m i x t u r e s , a s t r o n g c o r r e l a t i o n b e t w e e n the slopes a n d i n t e r c e p t s o f s u c h straight lines is o b s e r v e d . F o r m i x t u r e s o f a c e t o n i t r i l e a n d w a t e r , this c o r r e l a t i o n is v i r t u a l l y absent. A s a result o f this, the o p t i m a l shape o f g r a d i e n t s u s i n g m e t h a n o l o r T H F t u r n s o u t to be c o n v e x , w h i l e l i n e a r g r a d i e n t s s h o u l d be a p p l i e d w i t h a c e t o n i t r i l e .
I n chapter 4 it is d e m o n s t r a t e d , h o w g r a d i e n t e l u t i o n c a n be u s e d as a scanning technique for the r a p i d e s t a b l i s h m e n t o f o p t i m a l c h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n s . It is s h o w n h o w a single g r a d i e n t - r u n , p r e f e r a b l y i n m e t h a n o l - w a t e r , can serve t w o p u r p o s e s . F i r s t , it a l l o w s us to d e c i d e w h e t h e r o r n o t a c o m p l e x s a m p l e c a n be 9
a n a l y s e d u n d e r i s o c r a t i c c o n d i t i o n s . I f this is i n d e e d the case, the results f r o m the g r a d i e n t - r u n also e n a b l e us to d e r i v e the a p p r o p r i a t e m e t h a n o l - w a t e r c o m p o s i t i o n to o b t a i n a c h r o m a t o g r a m , i n w h i c h a l l s a m p l e b a n d s are e l u t e d w i t h r e a s o n a b l e c a p a c i t y factors (1 < k < 1 0 ) . I f the r e s u l t i n g i s o c r a t i c c h r o m a t o g r a m s h o w s insufficient s e p a r a t i o n , the b i n a r y m i x t u r e o f m e t h a n o l a n d w a t e r c a n be r e p l a c e d b y a n a c e t o n i t r i l e - w a t e r o r T H F - w a t e r m i x t u r e , that y i e l d s r o u g h l y the same r e t e n t i o n t i m e s . T h i s is f a c i l i t a t e d b y s i m p l e transfer rules, w h i c h are e s t a b l i s h e d e m p i r i c a l l y f r o m r e t e n t i o n d a t a o n a large n u m b e r o f solutes. It is s h o w n , that different o r g a n i c m o d i f i e r s i n the m o b i l e phase c a n g i v e rise to specific effects, a n d h e n c e , c a n i n c r e a s e the extent o f s e p a r a t i o n .
I n chapter 5 the d i s c u s s i o n o n specific effects is e x t e n d e d to ternary systems. T e r n a r y systems are s h o w n to o b e y a s i m p l e s e c o n d degree e q u a t i o n , that relates r e t e n t i o n to m o b i l e phase c o m p o s i t i o n . T h e r e s u l t i n g t h r e e - d i m e n s i o n a l surface is v e r y r e g u l a r , w i t h o u t l o c a l m a x i m a o r m i n i m a . F o r the systems m e t h a n o l T H F w a ter a n d m e t h a n o l a c e t o n i t r i l e w a t e r , s o c a l l e d isoeluotropic diagrams are c o n -s t r u c t e d . I n the-se d i a g r a m -s , a l l c o m p o -s i t i o n -s that y i e l d r o u g h l y the -s a m e r e t e n t i o n t i m e s as b i n a r y reference m i x t u r e s o f m e t h a n o l a n d w a t e r are i n d i c a t e d . E x p e r i -m e n t a l i s o - e l u o t r o p i c c u r v e s fall close to the straight lines p r e d i c t e d f r o -m the s i m p l i f i e d s o l u b i l i t y p a r a m e t e r m o d e l o f c h a p t e r 1. Specific effects i n t e r n a r y m i x -tures are discussed r e l a t i v e to b i n a r y m i x t u r e s o f m e t h a n o l a n d w a t e r o f the same e l u o t r o p i c strength. T h e specificity o f t e r n a r y m i x t u r e s a p p e a r s t o be i n t e r m e d i a t e b e t w e e n those o f the l i m i t i n g b i n a r y c o m p o s i t i o n s . T h e t e r n a r y m o b i l e phase system c a n be r e g a r d e d as a s m o o t h t r a n s i t i o n b e t w e e n different b i n a r y systems. H e n c e , the specific effects that o c c u r i n b i n a r y m i x t u r e s c a n be u s e d to p r e d i c t those i n t e r n a r y m o b i l e phases. A c l a s s i f i c a t i o n is m a d e o f the specific effects o b s e r v e d i n b i n a r y m i x t u r e s o f T H F - w a t e r a n d a c e t o n i t r i l e - w a t e r .
C H A P T E R 1 T H E S O L U B I L I T Y P A R A M E T E R A S A T O O L I N U N D E R S T A N D I N G L I Q U I D C H R O M A T O G R A P H Y . S U M M A R Y T h e s o l u b i l i t y p a r a m e t e r c o n c e p t is b r i e f l y d i s c u s s e d . It is t h e n u s e d to e x p l a i n s o m e o f the c u r r e n t features o f l i q u i d p a r t i t i o n a n d a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y .
V a r i o u s phase systems are d i s c u s s e d o n the basis o f t h r e e c h a r a c t e r i s t i c s : retention, selectivity (the g e n e r a l s e p a r a t i o n p o w e r o f a system) a n d specificity ( i n c r e a s e d s e p a r a t i o n p o w e r t o w a r d s c e r t a i n p a i r s o f solutes).
T h e e m e r g e n c e o f t w o essentially different t e c h n i q u e s , the ' n o r m a l p h a s e ' a n d ' r e v e r s e d p h a s e ' m o d e s , w i l l a p p e a r as a l o g i c a l c o n s e q u e n c e o f s i m p l i f i e d t h e o r y . It also b e c o m e s o b v i o u s w h y ' r e v e r s e d p h a s e ' a p p l i c a t i o n s are so m u c h m o r e n u m e -r o u s . S o m e suggestions a-re g i v e n fo-r the d e v e l o p m e n t o f n e w s t a t i o n a -r y phases a n d the i m p r o v e m e n t o f e x i s t i n g ones.
T h e usefulness o f the s o l u b i l i t y p a r a m e t e r c o n c e p t to p r e d i c t the s o l v e n t strength o f m i x e d eluents i n R P L C is d e m o n s t r a t e d .
S o m e p r a c t i c a l rules for the s e l e c t i o n a n d o p e r a t i o n o f s t a t i o n a r y a n d m o b i l e p h a s e systems are f o r m u l a t e d .
I N T R O D U C T I O N
D u r i n g the past d e c a d e s e v e r a l a t t e m p t s h a v e b e e n m a d e to d e s c r i b e a n d p r e d i c t s o l u t e r e t e n t i o n i n h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . T w o g e n e r a l d i r e c t i o n s c a n b e d i s t i n g u i s h e d . I n the e m p i r i c a l a p p r o a c h e x p e r i m e n t a l d a t a are a n a l y s e d a n d classified for systematic features i n o r d e r to d e r i v e g e n e r a l r e t e n t i o n rules ( 1 - 3 ) . I n the absence o f a t h e o r e t i c a l f r a m e , it a l w a y s r e m a i n s d a n g e r o u s to e x t r a p o l a t e t o solutes o r phase systems not c o n t a i n e d i n the o r i g i n a l d a t a set. T h e a l t e r n a t i v e d i r e c t i o n is the d e v e l o p m e n t o f a t h e o r e t i c a l d e s c r i p t i o n o f the s e p a r a t i o n processes i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y .
E x a m p l e s o f the latter a p p r o a c h are the s o l v o p h o b i c t h e o r y for r e v e r s e d phase l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y (4, 5) a n d the s o l u b i l i t y p a r a m e t e r m o d e l ( 6 9 ) . U n f o r t u n a -t e l y , q u a n -t i -t a -t i v e p r e d i c -t i o n s h a v e b e e n -t o o u n r e l i a b l e -t o be o f p r a c -t i c a l use. T h e u n d e r s t a n d a b l e d i s a p p o i n t m e n t seems t o o b s c u r e the fact that the t h e o r e t i c a l p r e d i c t i o n s are f r e q u e n t l y i n m o r e t h a n just q u a l i t a t i v e a g r e e m e n t w i t h the o b s e r v a -tions. A s a result, s u c h t h e o r i e s c a n be u s e d to e v a l u a t e a n d c o m p a r e different phase systems a n d to f o r m u l a t e d i r e c t i o n s for further i m p r o v e m e n t .
I n this p a p e r we s h a l l e x p l o r e the p o t e n t i a l o f the s o l u b i l i t y p a r a m e t e r c o n c e p t for l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y .
T h e s o l u b i l i t y p a r a m e t e r c o n c e p t was e s t a b l i s h e d b a c k i n the t h i r t i e s b y the w o r k o f H i l d e b r a n d a n d S c a t c h a r d ( 1 0 ) . T h e o r i g i n a l c o n c e p t c o v e r s r e g u l a r s o l u -t i o n s , i.e. s o l u -t i o n s -tha-t d o no-t s h o w a n e n -t r o p y effec-t u p o n m i x i n g . I n p r a c -t i c e , r e g u l a r s o l u t i o n s are r a r e ( 1 0 ) .
O n the o t h e r h a n d , the s o l u b i l i t y p a r a m e t e r c o n c e p t carries s o m e v e r y a t t r a c t i -ve features, w h i c h h a v e t e m p t e d v a r i o u s g r o u p s o f c h r o m a t o g r a p h e r s to a p p l y the c o n c e p t o u t s i d e its l i m i t e d scope ( 6 - 9 , 1 1 , 1 2 ) :
1) T h e s o l u b i l i t y p a r a m e t e r c o n c e p t is b a s e d o n the a s s u m p t i o n that the p r o p e r t i e s o f m i x t u r e s c a n b e d e s c r i b e d b y the p r o p e r t i e s o f the p u r e c o m p o n e n t s . 2) T h e a r i t h m e t i c e x p r e s s i o n s i n v o l d e d ( r e g u l a r m i x i n g r u l e ) are r e l a t i v e l y s i m p l e . 3) T h e s o l u b i l i t y p a r a m e t e r c o n c e p t relates to c o m p o u n d s r a t h e r t h a n to m o l e c u l e s . It is a m a c r o s c o p i c p h e n o m e n o l o g i c a l a p p r o a c h a n d as s u c h relates to p r a c t i c a l d a t a i n a m u c h m o r e c o n v e n i e n t w a y t h a n a m o l e c u l a r statistical a p p r o a c h w o u l d . In e a r l i e r d i s c u s s i o n s r e g a r d i n g the a p p l i c a b i l i t y o f s o l u b i l i t y p a r a m e t e r t h e o r y to l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , a t t e n t i o n has b e e n focussed o n q u a n t i t a t i o n . T o that e n d , the m o d e l has n o t p r o v e n to be succesful. W e feel, h o w e v e r , that the a b i l i t i e s o f the s o l u b i l i t y p a r a m e t e r as a n a i d i n d e s i g n i n g a g e n u i n e f r a m e w o r k for r e t e n t i o n b e h a v i o u r i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y have b e e n g r e a t l y u n d e r e s t i m a t e d . I n this p a p e r w e w i l l l o o k u p o n the v a r i o u s p a r a m e t e r s that affect r e t e n t i o n a n d s e l e c t i v i t y i n LC.
It w i l l be s h o w n , that s u c h a d i s c u s s i o n c a n g r e a t l y i n c r e a s e o u r u n d e r s t a n d i n g o f the l i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n process.
T H E S O L U B I L I T Y P A R A M E T E R C O N C E P T
Solubility parameter and polarity
T h e s o l u b i l i t y p a r a m e t e r (d) is d e f i n e d as f o l l o w s :
<5 = V — (1)
v
w h e r e E is the c o h e s i v e e n e r g y r e q u i r e d to transfer o n e m o l e o f a substance f r o m the i d e a l gasphase t o its l i q u i d state, a q u a n t i t y that w i l l a l w a y s b e n e g a t i v e ; v is the m o l a r v o l u m e o f the l i q u i d .
W e c a n use the s o l u b i l i t y p a r a m e t e r to g i v e a q u a n t i t a t i v e m e a n i n g to the w o r d p o l a r i t y . C o m p o u n d s that are u s u a l l y r e f e r e d t o as n o n - p o l a r (e.g. n - a l k a n e s ) h a v e a l o w (but n o n - z e r o ) c o h e s i v e e n e r g y , l e a d i n g to a v a l u e f o r 6 a r o u n d 7 c a l '2 c m "> / 2. P o l a r c o m p o u n d s e x h i b i t m u c h s t r o n g e r i n t e r a c t i o n s i n the l i q u i d state, l e a d i n g t o a n i n c r e a s e i n 6 u p to a m a x i m u m v a l u e o f 2 5 c a l ' ' ' c m " ', ! o b s e r v e d f o r w a t e r . S o m e further c o m p o u n d s o f p a r t i c u l a r c h r o m a t o g r a p h i c interest are l i s t e d i n t a b l e 1.
It is c l e a r , that the p o l a r i t y scale thus d e f i n e d , agrees w i t h i n t u i t i o n . A t t e n t i o n is d r a w n t o the e x t r e m e p o l a r i t y o f w a t e r , w h i c h has m a j o r c o n s e q u e n c e s i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , as w i l l be seen later.
S E L E C T E D V A L U E S O F S O L U B I L I T Y P A R A M E T E R S ( C A L . '/ 2 cm 'h)
Solutility parameter Compound Partial polarities Ref. polarity scale Ô àd à„ àind Ref. 25- 20- 15- 10-c 25.52 water 7.2 ? 9 21.7 14.2 - 25- 20- 15- 10-c ~ 16 alumina 10.8 9.8 ? 11.4 2.5 8 25- 20- 15- 10-c 15.85 methanol 7.2 3.9 0.1 17.1 5.4 - 25- 20- 15- 10-c
~ 14 pyrocarbon - 1 4 small small small small 8
25- 20- 15- 10-c 13.14 acetonitrile 7.3 5.8 0.2 ~ 10 ~ 4 - 25- 20- 15- 10-c 10.68 methylenechloride 8.0 4.38 1.0 ~ 4 ~ 1 - 25- 20- 15- 10-c 10.65 dioxane 8.10 1.2 3.4 small 2.0 - 25- 20- 15- 10-c 9.88 tetrahydrofuran 8.0 3.3 0.3 6.2 1.5 - 25- 20- 15- 10-c 9.57 toluene 8.5 0.8 0.7 8 0.4
J -9.53 ethylacetate 7.6 3.6 1.4 3.5 1J -~ 7 alkanes ~ 7 0 0 0 0 -~ 5 perfluorinated alkanes ~ 5 0 0 0 0 10
The regular mixing rule
T h e c o n n e c t i o n b e t w e e n the s o l u b i l i t y p a r a m e t e r a n d c h r o m a t o g r a p h i c r e t e n -t i o n p a r a m e -t e r s is e s -t a b l i s h e d -t h r o u g h -the a c -t i v i -t y coefficien-t ( y ) . T h e f o r m u l a -t i o n is the m o s t s i m p l e , i f w e define the p u r e l i q u i d as the s t a n d a r d state, since t h e n a s o l u t e has the same s t a n d a r d state i n b o t h c h r o m a t o g r a p h i c phases. T h e r e g u l a r m i x i n g r u l e d e s c r i b e s the a c t i v i t y coefficient o f a solute i i n a phase ƒ as:
w h e r e the superscripts oo a n d H refer to i n f i n i t e d i l u t i o n o f the solute a n d to the a s s u m p t i o n that the t o t a l free e n e r g y effect results o n l y f r o m e n t h a l p y differences b e t w e e n the m i x t u r e a n d the p u r e l i q u i d s . I f the m o l a r v o l u m e vh o f l i q u i d i is e x p r e s s e d i n c m3 a n d the gas constant, R, i n c a l m o l lK 1 the s o l u b i l i t y p a r a m e t e r , d, is e x p r e s s e d i n c a l '/ !c m ~J /\ If SI units are u s e d , 6 is e x p r e s s e d i n J 'hm~'h ox Pa'2, w h e r e 1 c a l, / !c m -, / ! = 2 . 0 5 1 03 Pa'11.
In the present d i s c u s s i o n w e w i l l a l w a y s use the c o m m o n units o f c a l '/ j. c m ~5 / ! f o r the s o l u b i l i t y p a r a m e t e r . F o r c o n v e n i e n c e w e w i l l u s u a l l y o m i t these units.
O n e c o n c l u s i o n that can be d r a w n f r o m e q . (2) is that a solute i n a l i q u i d phase o f the s a m e p o l a r i t y (o, = df) has an a c t i v i t y c o e f f i c i e n t o f 1. T h i s is e q u i v a l e n t t o a perfect s o l u t i o n f o l l o w i n g R a o u l t ' s l a w . M o r e i m p o r t a n t is the p r e d i c t i o n b y e q . (2), that a c t i v i t y coefficients are n e v e r s m a l l e r t h a n o n e . T h i s is t a n t a m o u n t to a p o s i t i v e heat o f m i x i n g , i.e. the m i x t u r e is e n e r g e t i c a l l y less f a v o u r a b l e t h a n the c o m b i n a t i o n o f the p u r e constituents separately. T h i s is i n c o n t r a d i c t i o n to p r a c t i c e , w h e r e m i x i n g can be e n d o t h e r m i c a n d the a c t i v i t y coefficient s m a l l e r t h a n o n e . O n e a n s w e r (13) to this p r o b l e m is to e x p a n d e q . (2) w i t h a n e n t r o p y t e r m , c o m p l e t e l y i n d e p e n d e n t o f the e n t h a l p y t e r m d e s c r i b e d b y e q . (2). H o w e v e r , we h a v e n o t e d b e f o r e that s u c h an e x t e n s i o n is o f l i m i t e d v a l u e i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( 1 4 ) . It a p p e a r s that the e n t r o p y a n d e n t h a l p y c o n t r i b u t i o n s are s t r o n g l y c o r r e l a t e d a n d that for p o l a r c o m -p o u n d s m u c h o f the e n t r o -p y effect is a l r e a d y c o n t a i n e d i n e q . (2). A t the e n d o f this p a p e r w e s h a l l discuss a n o t h e r p o s s i b i l i t y to r e c o n c i l e the o b s e r v a t i o n o f n e g a t i v e a c t i v i t y coefficients w i t h the s o l u b i l i t y p a r a m e t e r c o n c e p t .
P r e s e n t l y , w e s h a l l i g n o r e the p r o b l e m a n d d e l e t e the s u p e r s c r i p t s H a n d « i n
Liquid chromatographic retention
T h e basic r e t e n t i o n p a r a m e t e r i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y is the c a p a c i t y factor,
k. It c a n b e e x p r e s s e d as the r a t i o o f the a c t i v i t y coefficients o f the s o l u t e i n the t w o
c h r o m a t o g r a p h i c phases ( 1 4 ) : (2) eq. ( 2 ) . ki = Yi,m (3) n m
w h e r e the subscripts m a n d s refer t o the m o b i l e p h a s e a n d the s t a t i o n a r y p h a s e , r e s p e c t i v e l y . T h e q u a n t i t y AT is the n u m b e r o f m o l e s o f each p h a s e i n the c h r o m a t o -g r a p h i c c o l u m n .
W e n o w t a k e a drastic step b y a s s u m i n g that the s o l u b i l i t y p a r a m e t e r c o n c e p t , o r i g i n a l l y f o r m u l a t e d for regular liquid solutions c a n also be a p p l i e d t o the v a r i o u s phases e n c o u n t e r e d i n L C ( s o l i d a d s o r b e n t s , c h e m i c a l l y b o n d e d phases). T h i s a p p -r o a c h has b e e n s h o w n t o be useful ( 8 , 9 ) . T h e c o m b i n a t i o n o f eqs. (2) a n d (3) n o w p r o v i d e s an e x p r e s s i o n for the c a p a c i t y factor o f solute i i n t e r m s o f s o l u b i l i t y p a r a m e t e r s .
\nkl = — (6m + d s- 2 6 i) ( 6 m- d s) + l n — (4)
RT n.m
E q . (4) p r e d i c t s t w o ways to o b t a i n s m a l l c a p a c i t y factors a n d h e n c e r a p i d analysis. O n e w a y is to c h o o s e m o b i l e a n d s t a t i o n a r y phases o f e q u a l p o l a r i t y (dm = ds), but such a system c l e a r l y offers n o c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n , since w o u l d be e q u a l for a l l solutes.
T h e a l t e r n a t i v e is t o select the m o b i l e phase a n d s t a t i o n a r y p h a s e i n s u c h a w a y that the s o l u t e has a n i n t e r m e d i a t e p o l a r i t y , o r
d, = >/2 (6m + d,) (5)
If e q . (5) a p p l i e s the c a p a c i t y factor b e c o m e s e q u a l t o kt = njnm a n d b e c a u s e njnm w i l l u s u a l l y be m u c h s m a l l e r t h a n 1, r e t e n t i o n t i m e s are v e r y short. A p a r t f r o m the fact that e q . (5) c a n strictly a p p l y to o n e solute o n l y , the e l u t i o n is m u c h t o o r a p i d to p r o v i d e g o o d s e p a r a t i o n . C o n s e q u e n t l y , w e can a f f o r d to use a m o b i l e phase o f slightly different p o l a r i t y . E v e n a m i n o r v a r i a t i o n o f dm has a large i n f l u e n c e , as is c l e a r b y d i f f e r e n t i a t i n g e q . (4) t o w a r d s dm for a g i v e n phase s y s t e m , w h e r e ds is constant a n d e q . (5) c a n be a p p l i e d
A ki v,
— = — ( dm- 6s) A 6m (6)
A C , KI
S i n c e dm-ds c a n easily be e q u a l to 10 c a lV lc m 3 / 2 (fig. 1) a n d v, is o f the o r d e r o f 100 c m3, m o l e " ' , we f i n d w i t h RT = 6 0 0 c a l . m o l e '
Ak
= 1,5 Adm
k
C o n s e q u e n t l y , e v e n a m i n o r v a r i a t i o n i n the m o b i l e phase p o l a r i t y c a n h a v e a d r a m a t i c effect u p o n the c a p a c i t y factor. T h i s is a w e l l k n o w n o b s e r v a t i o n i n c h r o m a t o g r a p h i c systems u t i l i z i n g b i n a r y solvents ( 1 4 , 15). A n o t h e r c o n c l u s i o n to be d r a w n f r o m e q . (4) is the i n c r e a s e i n r e t e n t i o n w i t h m o l a r v o l u m e , v,, o r w i t h solute size, a n o t h e r f a m i l i a r o b s e r v a t i o n i n l i q u i d c h r o m a -t o g r a p h i c p r a c -t i c e . F o r h i g h e r m e m b e r s o f a h o m o l o g o u s series, dh w i l l be r o u g h l y e q u a l . T h e f r e q u e n t l y o b s e r v e d l i n e a r i n c r e a s e o f In Ac, w i t h c a r b o n n u m b e r i n a h o m o l o g o u s series t h e n f o l l o w s f r o m e q . 4. 15
W e also n o t e that r e l a t i v e v a r i a t i o n o f r e t e n t i o n w i t h m o b i l e phase p o l a r i t y (eq. 6) increases w i t h solute size. I n d e e d , i f t h e w a t e r c o n t e n t o f t h e m o b i l e phase i n r e v e r s e d phase LC is i n c r e a s e d w e u s u a l l y o b s e r v e d i v e r g i n g r e t e n t i o n c u r v e s ( 1 5 ) , d e m o n s t r a t i n g that t h e m o r e r e t a i n e d , l a r g e r solute is m o r e s u s c e p t i b l e t o m o b i l e phase i n f l u e n c e t h a n t h e s m a l l e r s o l u t e . H o w e v e r , the q u e s t i o n o f c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n deserves a m o r e e x t e n s i v e d i s c u s s i o n . Selectivity F r o m e q . (4) a n e x p r e s s i o n f o r the r e l a t i v e r e t e n t i o n o f t w o solutes w i t h e q u a l m o l a r v o l u m e s (v, = vy) is r a p i d l y d e r i v e d : 2v, In a,,, = In k/k, = ( 6t - 6,,) ( 6m - 6,) ( 7 ) RT
It shows that the s e p a r a t i o n b e t w e e n t w o solutes can b e i n f l u e n c e d b y t w o factors: (i) T h e difference i n p o l a r i t y b e t w e e n t h e t w o solutes (<$y - <$,•). T h e m o r e t h e t w o
solutes r e s e m b l e e a c h o t h e r , t h e c l o s e r (5, a p p r o a c h e s d, a n d t h e m o r e difficult t h e i r s e p a r a t i o n b e c o m e s . S t r o n g l y d i f f e r i n g solutes (fy — <5, ! > 0 ) , s h o u l d b e easily s e p a r a t e d .
(ii) T h e difference i n p o l a r i t y b e t w e e n t h e m o b i l e a n d t h e s t a t i o n a r y p h a s e (8m — 6S). T h i s factor is i n d e p e n d e n t o f the solutes i n t h e s a m p l e . W e c a n define the selectivity o f t h e c h r o m a t o g r a p h i c phase s y s t e m as t h e a b s o l u t e difference b e t w e e n t h e p o l a r i t i e s o f t h e t w o phases: | dm-6s | . T h e l a r g e r t h e difference i n p o l a r i t y b e t w e e n t h e t w o phases, t h e m o r e p o w e r f u l is t h e s y s t e m f o r t h e s e p a r a t i o n o f v e r y s i m i l a r solutes (<$;-~<5,-).
H o w e v e r , w e h a v e seen f r o m e q . ( 4 ) that a n i n c r e a s e o f \dm—d,\ n o t o n l y increases s e p a r a t i o n p o w e r , b u t also has a d r a m a t i c effect o n r e t e n t i o n , unless w e select t h e t w o c h r o m a t o g r a p h i c phases i n s u c h a w a y that e q . ( 5 ) is o b e y e d . T h e i m p l i c a t i o n is i l l u s t r a t e d g r a p h i c a l l y i n fig. 1, w h e r e t h e p o l a r i t i e s o f s t a t i o n a r y p h a s e , solutes a n d m o b i l e phase are p r e s e n t e d o n t h r e e p a r a l l e l axes.
F o r a n y solute a straight l i n e t h r o u g h t h e p o i n t i n d i c a t i n g its p o l a r i t y o n the solute scale intersects t h e t w o o t h e r scales i n t w o p o i n t s f o r m i n g a m o b i l e p h a s e / s t a -t i o n a r y phase p a i r sa-tisfying e q . ( 5 ) .
T h e t w o m o s t c o m m o n s t a t i o n a r y phases i n H P L C are a l k y l a t e d s i l i c a , w i t h 8 — 1, a n d bare s i l i c a w i t h a s o l u b i l i t y p a r a m e t e r that is p r o b a b l y c l o s e t o that o f a l u m i n a : 6 = 16 ( 8 ) . I f we n o w c h o o s e a solute o f i n t e r m e d i a t e p o l a r i t y (6, = 1 2 . 5 ) , we f i n d t w o straight lines c o n n e c t i n g o n t h e o n e h a n d s i l i c a w i t h a l o w p o l a r i t y m o b i l e phase (8m = 9) a n d o n the o t h e r h a n d a l k y l a t e d s i l i c a w i t h a p o l a r e l u e n t (8m = 1 8 ) . A s d i s c u s s e d a b o v e , w e c o u l d a l l o w m o b i l e phases w i t h a p o l a r i t y s l i g h t l y different f r o m t h o s e c a l c u l a t e d f r o m e q . ( 5 ) . T h o s e are r e p r e s e n t e d b y the s h a d e d areas i n fig. 1.
T h e t w o straight lines i n f i g . 1 r e p r e s e n t t h e t w o w e l l - k n o w n s e p a r a t i o n systems i n c u r r e n t H P L C .
n-alkylphases silica
f luoroalkanes • pyrocarbon i
2 0 _ l 2 5t t t
aIkanes THF
methanol
acetonitrile
water
Figure 1: Illustration of the selection of phase systems for L C according to eq. (5). A sample with a polarity of 12.5 (middle scale) can be eluted from silica (ds = 16; top scale) with a non-polar
mobile phase (dm = 9; bottom scale), or with a polar solvent in a reversed phase system. The
shaded areas represent the latitude with respect to a possible variation in mobile phase composition.
(i) F o r a c u r v e w i t h a p o s i t i v e s l o p e i n f i g . 1 ds> dm, a n d h e n c e it r e p r e s e n t s a n o r m a l o r straight phase s y s t e m . A c c o r d i n g to e q . (7) a m o r e p o l a r c o m p o u n d (dj > Si) w i l l be m o r e r e t a i n e d o n this s y s t e m t h a n a less p o l a r o n e .
(ii) C u r v e s w i t h n e g a t i v e s l o p e i n fig. 1 h a v e 6S < 6m a n d r e p r e s e n t r e v e r s e d phase systems, w h e r e n o w the m o r e p o l a r c o m p o u n d w i l l be r e t a i n e d less a n d e l u t e m o r e r a p i d l y .
A n i m p o r t a n t o b s e r v a t i o n to be m a d e i n fig. 1 is the difference i n s l o p e o f the t w o sets o f c u r v e s . A c c o r d i n g to e q . ( 7 ) , this s l o p e | 5m — 8S | i n d i c a t e s the s e l e c t i v i t y o f the phase s y s t e m . T h e steeper the c u r v e is, the less selective the s y s t e m . F o r i n f i n i t e s l o p e (a v e r t i c a l t h r o u g h 6,) w e h a v e ds = 6, = dm a n d the c h r o m a t o g r a p h i c phase s y s t e m s h o w s n o s e l e c t i v i t y at a l l . F i g . 1 a l l o w s the i m p o r t a n t c o n c l u s i o n that for a l l but the e x t r e m e l y n o n p o l a r c o m p o u n d s a r e v e r s e phase s y s t e m p r o v i d e s g r e a t e r s e l e c t i v i t y t h a n a straight phase s y s t e m .
In r e a l i t y the s i t u a t i o n is even m o r e f a v o u r a b l e for r e v e r s e d phase H P L C . I f 17
