Quo vadis regenerative medicine?

Praca poglądowa/Review

Quo Vadis medycyno regeneracyjna?

Quo vadis regenerative medicine?

Mariusz Z. Ratajczak

*, Malwina Suszy ńska

1KatedraiZakładFizjologiiPomorskiego UniwersytetuMedycznego,Kierownik:prof.drhab. n.med.MariuszZ.

Ratajczak,Szczecin,Polska

2StemCellInstituteatJamesGrahamBrownCancerCenterUniversityofLouisville,Louisville,Kentucky,USA

Wstęp

Dzięki postępom nauki człowiek sięgnął u progu trzeciego tysiąclecia potechnologie, które do tej pory byłyprzypisy- wane istotom najwyższym. Rozwój fizyki doprowadził do

zgłębieniatajnikówenergiijądrowej,rozwójnaukbiologicz- nych i genetyki przybliżył z kolei tajemnice powstawania organizmów i ich regeneracji, wprowadzając tym samym ludzkośćwfascynującyświat komórekmacierzystych[1,2].

Komórkom macierzystym poświęca się coraz więcej uwagi iuważasię,żetechnologieprowadzącedooptymalizacjiich informacje o artykule

Historiaartykułu:

Otrzymano:31.05.2013 Zaakceptowano:04.07.2013 Dostępneonline:24.07.2013

Słowakluczowe:

 medycynaregeneracyjna

 macierzystekomórki pluripotencjalne

 komórkimacierzysteembrionalne

 indukowanekomórkimacierzyste

 VSELs

Keywords:

 Regenerativemedicine

 Pluripotentstemcells

 Embryonicstemcells

 Inducedpluripotentstemcells

 VSELs

abstract

Therearepresentedthemostimportantsourcesofpluripotentstemcellsfor potential application intheregenerative medicine.This reviewsummarizesalsotheadvantages anddisadvantagesforpotentialapplicationofthesecellsinclinicalmedicine.

©2013PolskieTowarzystwoHematologówiTransfuzjologów,InstytutHematologiii Transfuzjologii.PublishedbyElsevierUrban&PartnerSp.zo.o.Allrightsreserved.

*Adres dokorespondencji:Katedra iZakład FizjologiiPomorskiego UniwersytetuMedycznego,ul.Powst.Wlkp. 72,Szczecin70-111, Polska.Tel.:+48914661611;fax:+48914661612.

Adresemail:kzfizjol@pum.edu.pl(M.Z.Ratajczak).

ContentslistsavailableatSciVerseScienceDirect

Acta Haematologica Polonica

journalhomepage:www.elsevier.com/locate/achaem

0001-5814/$–seefrontmatter©2013PolskieTowarzystwoHematologówiTransfuzjologów,InstytutHematologiiiTransfuzjologii.PublishedbyElsevierUrban&PartnerSp.zo.o.Allrightsreserved.

http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2013.07.023

klinicznegowykorzystaniastanąsiękluczemdodługowiecz- ności w rozwijającej się jako nowa dyscyplina kliniczna medycynieregeneracyjnej[3].

Założeniem medycyny regeneracyjnej jest wykorzystanie komórek macierzystych w terapii uszkodzonych narządów i tkanek. Biorąc pod uwagę ogromny potencjał komórek macierzystychiuwzględniając,jakważnąrolęodgrywająone wcodziennejregeneracjiszeregutkanek(m.in.tkankikrwio- twórczej, naskórka czy nabłonka jelitowego), nie możnasię dziwić,żekomórkitestałysięprzedmiotemżywegozaintere- sowania klinicystów. Słusznieupatruje sięw nich klucz do poprawieniajakościorazprzedłużeniażycialudzkiego[1].

Uważa się, że przeszczepianie całych narządów będzie w przyszłości coraz częściej zastępowane przeszczepami zawiesiny komórek macierzystych, ukierunkowanych dla danego narządu, które będą miały za zadanie regenerację/

odbudowęuszkodzonychorganów[4,5].Szczególnenadzieje na wykorzystanie terapeutyczne komórek macierzystych wiąże się z takimi schorzeniami, jak zawał mięśnia serco- wego, udar mózgu, parkinsonizm, cukrzyca, dystrofie mięś- niowe, toksyczne uszkodzenia wątroby i nerek. Komórkami macierzystymiinteresuje się corazbardziej nowoczesna ga- stroenterologia. Wydaje się, że człowiek faktycznie zaczyna sięgaćcorazbardziejpoupragnionykluczdodługowieczności.

Komórki macierzyste – definicja, hierarchia i różnorodność

Mianem komórki macierzystej,jak wspomniano, określa się komórkęmającązdolnośćdosamoodnawianiaorazróżnico- waniasięwkomórkipotomne[2].Definicjatajestjednakzbyt uproszczona.Wyróżniamy bowiem wiele rodzajów komórek macierzystych, różniących się pomiędzy sobą potencjałem proliferacyjnym orazzdolnościądoróżnicowania.Wrzeczy- wistościkomórkimacierzystesąbardzoróżnorodne itrudno jejednoznacznieopisaćjednąwspólnądefinicją. Pulakomó- rekmacierzystychutrzymuje wrównowadzeliczbękomórek somatycznych w organizmie, a tym samym jest odpowie- dzialna zaodnawianie zużywającychsięz czasem komórek somatycznychorazzaregeneracjęnarządówitkanek[3].

Najbardziej charakterystyczną cechą komórki macierzy- stejjestjejzdolnośćdosamoodnawianiairóżnicowaniasię w coraz to bardziej ukierunkowane narządowo komórki potomne[6]. Stąd też w przedziale komórekmacierzystych

istnieje duży stopień hierarchii i zróżnicowania od tych najbardziej prymitywnych rozwojowo dobardziej już ukie- runkowanych tkankowo/narządowo (Tab. I). Dorosły ssak rozwija się z najwcześniejszej komórki macierzystej, jaką jest zapłodniona komórka jajowa (zygota). Zygota jest komórką macierzystątotipotencjalną(KMT). Komórka taka, zgodnie z definicją, daje początek zarówno komórkom łożyska, jak i zarodka. Zygota jako KMT po implantacji w macicy może więc dać początek nowemu osobnikowi.

KMT na pierwszych etapach rozwoju embrionalnegoróżni- cuje się natychmiast w komórki macierzyste pluripoten- cjalne (PKM), które występują m.in. w moruli (stadium zarodka składające się z 30 komórek) oraz następnie w węźle zarodkowym blastocysty (blastocysta składa się z 250 komórek)[2]. PKM niemogąodtworzyć łożyska,ale dają początek komórkom wszystkichtrzech listków zarod- kowych (ektodermy, mezodermyi endodermy)i mogą róż- nicować się w tzw. ukierunkowane tkankowo komórki macierzyste (UTKM).UTKM zewzględu już na ograniczoną możliwość różnicowania do jednego rodzaju tkanki zwane teżsąkomórkamimacierzystymimonopotencjalnymi.

Obliczono, że z zapłodnionej zygoty (KMT) po około 47 podziałachpowstajepodczasrozwojuembrionalnegołącznie

1010⁵ komórek należących do 200 różnych rodzajów tworzącychtkankiiorganyciała człowieka.Komórki macie- rzyste,,pracują’’ciężkoprzezcałeżycieosobniczeiwwyniku zsynchronizowanychprocesówsamoodnawianiairóżnicowa- nia komórek macierzystych rozwija się i funkcjonuje przez wielelatdorosły,ciągleregenerującysięorganizm.Wiadomo bowiem, że nabłonek jelitowy wymienia się co 48 godzin, naskórekco14dni,granulocytyco1–5dni,aerytrocytymają okres półtrwania 100–150 dni [7, 8]. W innych narządach i tkankach wymiana zużywanych komórek jest wolniejsza, niemniejistniejądzisiajdowody,żenawettakienarządy,jak serce czy mózg, wykazują powolną odnowę biologiczną.

Trudno sobie bowiem wyobrazić, aby pojedyncza komórka wnarządziemogłażyćprzez80lat.

Potencjalne źródła komórek macierzystych do regeneracji tkankowo/narządowej

Koncepcja wykorzystania klinicznego komórek macierzy- stych pojawiłasienajpierw whematologii. Od około45 lat wykorzystujesiębowiemkrwiotwórczekomórkimacierzyste TabelaI–Hierarchiakomórekmacierzystych(KM)

TableI–Developmentalhierarchyofstemcellcompartment

TotipotencjalneKM(KMT) Dająpoczątekzarównociałuzarodka,jakitkankomłożyska.Wwarunkachnaturalnych totipotencjalnymikomórkamisązapłodnionyoocyt(zygota)orazpierwszeblastomery.

Wwarunkachsztucznychtotipotencjęzachowujeodpowiednikzygoty–tzw.klonota, powstałanaskutektransferujądrakomórkisomatycznejdooocytu(nucleartransfer).

PluripotencjalneKM(PKM) Dająpoczątekkomórkomwszystkichtrzechlistkówzarodkowychpoprzeszczepieniu dorozwijającejsięblastocysty.Pluripotencjalnesąkomórkiwewnętrznejmasy blastocystyorazepiblastu.

MultipotencjalneKM(MKM) Dająpoczątekkomórkomdwóchlistkówzarodkowychlubjednegolistkazarodkowego.

MonopotencjalneKMlubukierunkowane tkankowokomórkimacierzyste(UTKM)

Obejmujątzw.komórkiukierunkowanetkankowo,dającepoczątekkomórkom tylkojednejlinii.Należątum.in.KMnabłonkajelit,krwiotwórczeKM,

KMnaskórka,KMnerwowe,KMwątrobyorazKMmięśniszkieletowych.

(KKM),które,zgodniezpodanąpowyżejdefinicją,należądo przedziału UTKM dla krwiotworzenia w leczeniu szeregu choróbukładukrwiotwórczego[6,9].Coraz częściejstosuje sięrównież UTKM naskórkaw leczeniu oparzeń skóry lub dlausprawnieniaprocesugojeniasięowrzodzeńtroficznych kończyn. Zaawansowana jestrównież technologia pozyski- wania fibroblastów szpiku kostnego – tzw. macierzystych komórekmezenchymalnych,któremożnauważaćzaUTKM dlatkanki łącznej wleczeniu ubytkówkostnych[7,10, 11].

Wspólną cechą komórek macierzystych krwiotwórczych, naskórkaczy mezenchymalnychjest stosunkowodużałat- wośćichpozyskiwania. Przeciwnie,zezrozumiałychwzglę- dówetycznych itechnicznych, znacznietrudniejjest uzys- kać od zdrowych dawców komórki macierzyste innych tkanek i narządów, jak np. mięśni szkieletowych, mięśnia sercowego, wątroby, wysepek trzustki lub ośrodkowego układunerwowego,wilościachpozwalającychnaichpoten- cjalnewykorzystanieterapeutyczne.

Wzwiązkuzpowyższym,wostatnichlatachpojawiłysię koncepcjewykorzystaniabardziejprymitywnychpluripoten- cjalnych komórek macierzystych (PKM), które, jak wspom- nianopowyżej,majązdolnośćróżnicowaniasięwewszyst- kie komórki zarodka – będąc tym samym źródłem UTKM.

Wykorzystanie PKM w medycynie klinicznej wzbudziło na świecie spore nadzieje na rozwój nowych metod leczni- czych, ale jednocześnie spowodowało szereg dyskusji i emocji natury religijno-etycznej. Problem wykorzystania tych komórek jest różnie postrzegany przez różne religie, gdyż dotykaproblemu początku życia człowieka,który jest różnie interpretowany przez różne główne religie świata [1, 12, 13]. Próbując otrzymać wczesnorozwojowe PKM, zbliżamy się bowiem bardzo blisko do TKM, a więc do komórkimacierzystej, któramożerozwinąćsięwdorosłego osobnika.Wtensposóbnaukadotykadogmatów,najakim etapieembriogenezyzaczynasiężycie.

Embrionalne i nieembrionalne źródła komórek macierzystych

PKMmogąbyćpotencjalniepozyskiwanezczterechróżnych źródeł,którewymienionowtabeliII.Każdeztychpotencjal- nych źródeł ma swoje zalety jak i ograniczenia, które

zostaną pokrótceprzedstawione poniżej. Omówimy zarów- no kontrowersyjne źródła PKM pochodzących z zarodków, jak i PKM otrzymywane z dorosłych tkanek [7, 11]. Takie szersze przedstawienie problemu może być pomocne w zrozumieniu zjawisk, natematktórychczęsto wypowia- dająsięosoby,którymbrakjestwiedzybiologicznej,niewie- dzący, cokryje siępod konkretnymipojęciami. Dlategoteż nie będziemy unikać trudnychi drażliwych tematów, wie- rząc, że każdy musi sam dokonać wyboru zgodniez włas- nym sumieniem i osobistym światopoglądem, jakie są po- tencjalne granice wykorzystania różnych źródeł komórek macierzystychwmedycynie.

Pluripotencjalnekomórkimacierzysteizolowanezzarodków (embrionalne)

Wiadomo, że tkanki zarodkowe są potencjalnym źródłem PKM. Komórki takie można pozyskać z rozwijającej się moruli lub blastocysty (Ryc. 1), wykorzystując np. zamro- żone wczesne ,,nadliczbowe’’ morule przechowywane wklinikach,gdziewykonujesięzapłodnieniainvitro.Wyko- rzystująctakiezarodki,uzyskanopierwszeustaloneludzkie linie komórek embrionalnych [11, 14]. Zgodnie z dekretem prezydenta Georga Busha, jeśli były one otrzymane przed 9 sierpnia 2001 roku, mogły być legalnie wykorzystane do badań finansowanych z funduszy federalnych. Jeśli otrzy- mane były ,,minutę’’ po północy z 9 na 10 sierpnia 2001 roku,takiegoprawajużsięniestosowało.Byłatooczywiście sztucznie ustalona granica, która nie rozwiązywała całego problemu. Szybko jednak okazało się, że wiele z około 60 ludzkich linii, na badania których zezwolono, jest mało przydatnych. Linietebowiemszybkozmieniaływłaściwości w hodowlach in vitro, co spowolniło, a często zatrzymało prowadzonebadania.

Źródło PKM z zarodków pochodzących od dawców do potencjalnychterapiibudzijednakrównieżsporozastrzeżeń natury naukowej.Zarodkitakie,jakwiadomo,sątkankowo odmienne od potencjalnego biorcy komórek. W związku z powyższym, ustalonelinie komórek embrionalnychbędą różnicowały się w komórki, które będą miały inny zestaw antygenów układu zgodności tkankowej niż potencjalny biorca. Będą więc rozpoznawane przez układ immunolo- gicznybiorcy jakocałkowicie obce,gdyż zarodek pochodził

TabelaII–Różnepotencjalneźródłapluripotencjalnychkomórekmacierzystych(PKM) TableII–Variouspotentialsourcesofpluripotentstemcells

izolowanezbankowanych zarodkówotrzymanych

drogązapłodnienia

izolowanezzarodkówotrzymanych poprzezutworzenieklonoty (klonowanieterapeutyczne)

uzyskanewwyniku transformacjikomórek

somatycznych (indukowanePKM) Ryzykopowstania

guzówpotworniaków

+ + +

Problemniezgodności tkankowej

+ – +/–

Wymaganydawca komórkijajowej

+ + –

Zastrzeżenianaturyetycznej tak tak/nie^* nie

* Problemróżniepostrzeganyprzezróżnegłównereligieświatowe.Szeregreligiipotencjalnieakceptujeklonowanieterapeutyczne(np.islam, buddyzm,judaizm),alezdecydowanawiększośćodrzucaklonowaniereprodukcyjne.

odniezgodnegow układzieHLAdawcy[15]. Zkolei trudno sobie wyobrazić, biorąc pod uwagę względy etyczne itechniczne(dostęp dokomórekrozrodczychrodziców), że otrzymywałoby się takie zarodki dla konkretnego pacjenta ,,na zamówienie’’ od biologicznych rodziców. Badania uzwierząt doświadczalnych wykazałyponadto, że podanie komórek ustalonych linii embrionalnych powoduje u nich powstawaniepotworniaków[16,17].Dlategoteżpozyskiwa- nie PKM dla celów klinicznych z normalnych ludzkich zarodków zostało słusznie zarzucone. Pozostał niemniej

jednaktrudnydylemat,cozrobićzzamrożonymiwbankach na świecie zarodkami. Trzymać je w nieskończoność w staniehibernacji,rozmrozić izniszczyć czyteż wykorzy- staćdobadańpodstawowych.

Pluripotencjalnekomórkimacierzysteuzyskiwanewwyniku klonowaniaterapeutycznego

Biorącpoduwagęaspektynaturyetycznejiproblemytech- nicznewpozyskiwaniunormalnychludzkichzarodkóworaz Ryc.1–PKMpozyskiwanezzarodków.PanelA–PKMobdarzonewłaściwościamiróżnicowaniasięwkomórkiwszystkich trzechlistkówzarodkowychpozyskujesiępoprzezekspansjęPKMizolowanychzwęzłazarodkowegoblastocysty.

Blastocystęmożnaotrzymaćinvitrozmoruli,którapowstajezzygotydrogązapłodnieniakomórkijajowejprzezplemnik invitro.PanelB–PKMmożnarównieżpozyskaćnadrodzetzw.klonowaniaterapeutycznego,podczasktóregozamiast zapłodnieniakomórkijajowejprzezplemnikwprowadzasiędocytoplazmyenukleowanejuprzedniokomórkijajowejjądro dojrzałejkomórkisomatycznej(np.fibroblastu).Wwynikutegoprocesuzwanegojako,,przeniesieniejądra’’(nucleartransfer) powstajeklonota,którapodobniejakzygotamożedaćpoczątekmoruli,apotemblastocyście.Wartonadmienić,żezarówno zygotajakiklonota,jeślizostanąumieszczonewmacicy,utworządojrzałegoosobnika.Jeśliosobniktakipowstajez klonoty,mówimyotzw.klonowaniureprodukcyjnym.Zastosowanietegotypustrategiiwwypadkuczłowiekabudziszereg zastrzeżeńnaturyetycznej

Fig.1–PKMobtainedfromembryos

świadomość,żePKMotrzymywane ztakichzarodków będą różnicowały się w niezgodne tkankowo z biorcą tkanki, opracowano strategię pozyskiwania PKM z wczesnych zarodkówtworzonychwlaboratoriumwwynikutzw.klono- waniaterapeutycznego(Tab.II).

Strategia klonowania terapeutycznego polega na utwo- rzeniu in vitro komórki, która jest równa pod względem potencjału rozwojowego zygocie [18, 19]. Komórka taka zwana jest ,,klonotą’’ (Ryc. 1). Podczas tworzenia klonoty wykorzystujesię,,jakoinkubatorbiochemiczny’’cytoplazmę komórkijajowej,zktórejuprzedniousuwasiejądromające połowę(haploidalnąliczbę) chromosomów.Dopozbawionej jądra komórki jajowej wprowadza się następnie jądro doj- rzałejkomórkisomatycznej(np.jądrofibroblastulub limfo- cytu),która ma pełen diploidalnygarnitur chromosomalny.

Proces ten różni się od zapłodnienia tym, że w przeci- wieństwie do zapłodnienia nie występuje tutaj połączenie haploidalnej liczby chromosomów matki i haploidalnej liczbychromosomów ojcaw unikatowy diploidalny zestaw genów,przeciwnie–wszystkiechromosomy(zestawdiplioi- dalny) w tym i geny zgodności tkankowej pochodzą zkomórkidawcyjądra[20].

Po przeniesieniu jądra somatycznego do cytoplazmy komórkijajowejwprowadzonechromosomyulegają,,odróż- nicowaniu’’. Jakwspomniano, cytoplazma komórki jajowej jest unikatowym inkubatorem biochemicznym zawierają- cymszeregenzymówmogącychmodyfikowaćDNA.Ogólnie ujmując, proces ten polega na procesach demetylacji DNA oraz odpowiedniej rearanżacji i ustaleniu odpowiedniego wzoru metylacji i acetylacji białek histonowych. Wszystko toprowadzidorozluźnieniastrukturychromatynyipowrotu zróżnicowanegojużrozwojowoDNAzkomórkisomatycznej dawcy do stanu, jaki miało ono w zapłodnionej komórce jajowej. Umożliwia to ekspresję wczesnych rozwojowo genów.

Powstajetymsamymklonotabędącasztuczniestworzo- nym rodzajem KMT, która w odróżnieniu od zygoty ma zestaw chromosomów – tym samym geny kodujące układ zgodności tkankowej, zgodny z komórką, od której pocho- dziło jądro. Strategia ta znana jako przeniesienie jądra komórkowego do komórki jajowej (nuclear transfer), jest ciągle jeszcze jednak w stadium eksperymentalnym w modelach zwierzęcych u ssaków. Jak wiadomo, ostatni głośny skandal w Korei wykazał, że wbrew wcześniejszym doniesieniom nie udało się otrzymać ludzkiej klonoty.

NiemniejjednakostatniogrupazUniwersytetuwOregonie, USAwykazała,żejesttotechniczniemożliwe.Dyskusjanad wykorzystaniem ludzkich zarodków otrzymanych techniką transferujądrowegorozpoczniesięzatemnanowo[21].

Należy nadmienić, że szereg emocji natury etycznej budzi potencjał rozwojowy klonoty [21]. Jak wspominano, klonota podobnie jak zapłodniona komórka jajowa jest komórką totipotecjalną (TKM). W hodowlach in vitro może dać początek moruli i blastuli, z których można pozyskać PKM, podobnie jak to próbowano czynić z zarodków roz- wijającychsięw wynikufizjologicznego zapłodnienia. Stra- tegiapozyskiwaniatakichkomórekzzarodkówtworzonych przez klonotę znana jest pod nazwą tzw. klonowania terapeutycznego. Z drugiej jednak strony, jeżeli klonotę umieści się w macicy, może ona podobnie jakzygota dać

początek nowemu osobnikowi. Powoduje to duże opory natury etycznej, gdyż stwarza podstawy tzw. klonowania reprodukcyjnego.Wtensposóbotrzymanonp.słynnąowcę Dolly[22].Możliwośćklonowaniaterapeutycznegojakodrogi pozyskaniakomórekzgodnychz dawcąjądrakomórkowego jest dopuszczana przez niektóre kręgi religijno-kulturowe.

Jakjednakwspomniano,należysięcieszyć,żenieudałosię do tejpory uzyskaćludzkiej klonoty ipochodzącychz niej ludzkichPKM[23].

MimototeoretycznamożliwośćuzyskanialudzkichPKM na drodze klonowaniaterapeutycznego spowodowała ostrą krytykęzestronykręgówkulturowo-religijnych.Postawiono bowiem słuszny zarzut, że zarodek otrzymany z klonoty powinien być traktowany jako istota żywa. W odpowiedzi na te zarzuty zaproponowano szereg modyfikacji pozyski- waniaPKMzzarodków.Zgodniezpowyższym,PKMzaczęto pozyskiwać z zarodków uzyskanych w wyniku partenoge- nezy (omijając proces fizjologicznego zapłodnienia), drogą mikrobiopsji rozwijającej się moruli uzyskując pojedyncze blastomery będącemateriałemwyjściowymdonamnażania PKM czy też tworząc niezdolnerozwojowo zarodki poprzez wprowadzenietzw.,,genu samobójczego’’, któryuniemożli- wiaukończeniepełnejemrbiogenezy[24].

Oprócz oporów natury etyczno-religijnej główną prze- szkodą szerszego wykorzystania klonowania terapeutycz- nego okazała się potrzeba dostępu do ludzkich komórek jajowych (oocytów) oraz obserwacje, że PKM otrzymane zzwierzęcychklonottworząrównież,podobniejakkomórki embrionalne,uzwierzątdoświadczalnychpotworniaki.

Komórkimacierzystepozyskiwanezdorosłychtkanek

Niejakorównoleglezpierwszymidoniesieniami,żemożliwe jest pozyskanie ludzkich linii komórek embrionalnych, zaczętoposzukiwaćalternatywnychźródełPKM.Pozyskanie takich komórek było oczekiwane szczególnie z zaintereso- waniem przez oponentów stosowania komórek embrional- nych w medycynie regeneracyjnej. Nie będzie przesadą stwierdzenie,żeniejako,,oczekiwano’’pojawieniasiętakich potencjalnych źródeł. Z tego więc powodu kilka lat temu zaproponowano teoriętzw. ,,plastyczności komórekmacie- rzystych’’lubichzdolnoścido,,transróżnicowania’’.Zgodnie z tą teorią, UTKM np.KKMpozyskane ze szpiku kostnego, skąd stosunkowo łatwo je wyizolować, byłyby zdolne do odróżnicowania się w komórki macierzyste swoiste dla innych narządów, np. mięśnia sercowego, ośrodkowego układu nerwowego lub wątroby [25, 26]. Ogromne nadzieje pokładanowpotencjalnymzastosowaniu KKMizolowanych ze szpiku kostnego, mobilizowanej krwi obwodowej oraz krwi pępowinowej w terapiach regeneracyjnych uszkodzo- nych narządów i tkanek. Szereg artykułów naukowych, opublikowanych w najlepszych pismachnaukowych, suge- rowało teorięplastyczności KKM, demonstrując pozytywne wyniki wykorzystania tych komórek w zwierzęcych mode- lach regeneracyjnych w zawale serca [27], udarze mózgu [28], mechanicznym uszkodzeniu rdzenia kręgowego [29]

oraztoksycznymuszkodzeniuwątroby[30].

Pomimo przytoczonych powyżej obiecujących wyników rolaszpikukostnegoorazzawartychwnimKKMwregenera- cji uszkodzonych narządów budziła jednak od początku

kontrowersje[31, 32]. Seriabadań z zastosowaniem fenoty- powo zdefiniowanych i oczyszczonych subpopulacji macie- rzystych komórek hematopoetycznych przyniosła bowiem rozczarowanie,ukazującnegatywnewynikiwmodelachrege- neracjimięśniasercowego[33]orazmózgu[34].Tenieoczeki- wane obserwacje podważyły koncepcje plastyczności KKM.

Częśćuzyskanychpoprzedniopozytywnychwynikówzaczęto tłumaczyć poprzez fenomen fuzji komórkowej [35]. Według tejteorii, przeszczepiane KKM mogłybyulegać fuzji (stopie- niu)zkomórkamiuszkodzonychnarządów.Takwięckomórki w uszkodzonych narządach, leczonych przeszczepionymi KKM,byływtedyheterokarionamipowstałyminaskutekfuzji przeszczepionych KKM orazkomórek należących douszko- dzonego narządu. Warto nadmienić, że fuzja komórkowa należy jednak do bardzo rzadkich, przypadkowych zjawisk iniemożewpełnitłumaczyćopublikowanychpozytywnych wyników badań wskazującychudziałkomórek izolowanych z dorosłych tkanekw regeneracji.Zaczęto więcposzukiwać innego wytłumaczenia ,,zjawiska plastyczności’’ komórek macierzystych.

Ostatniedoniesieniawskazałym.in.namożliwośćmody- fikacji fenotypu komórek znajdujących się w tkankach poprzez przeniesienie receptorów komórkowych, białek cytoplazmatycznych oraz mRNA z sąsiednich komórek, za pomocąwymianymikrofragmentówkomórkowych(microve- sicles).Mikrofragmentykomórkowesąkulistymistrukturami, w których fragmentcytoplazmy komórkowej jest otoczony błoną komórkową [36, 37]. Złuszczanie mikrofragmentów z powierzchni błony komórkowej opisane zostało jako zjawisko fizjologiczne towarzyszące wzrostowi komórek oraz ichaktywacjiw procesach, takich jaknp.niedotlenie- nie tkanek czy ich uszkodzenie [37]. W związku z tym, wspomniane przeniesienie receptorów powierzchniowych, białek oraz informacjigenetycznej, jakąjest mRNA,pomię- dzy wszczepionymi KKM szpiku kostnego a komórkami gospodarza za pomocą mikrofragmentów błonowych mog- łoby przejściowo prowadzić do zmiany fenotypu komórek uszkodzonegoorganu.

Wydaje się to najbardziej logicznym wytłumaczeniem wyjaśniającympozytywnewynikiwykazujące,,plastyczność’’

KKM oraz udział komórekszpikowych w regeneracjiuszko- dzonych narządów. Od początku badań nad plastycznością niewziętopoważniepoduwagęmożliwości,żeszpikkostny zawiera heterogenną populację komórek macierzystych [38, 39]. To oraz brak odpowiednich kontroli w prowadzonych badaniach nad regeneracją tkanek niehematopoetycznych zudziałemprzeszczepionychkomórek szpikukostnego oraz krwipępowinowejdoprowadziłodowielunieścisłościi nie- właściwychinterpretacjiomawianychzjawisk.Zgodniezpo- wyższym, najlepszym wyjaśnieniem zjawiska plastyczności KKMwydajesięobecnośćwszpikukostnym,mobilizowanej krwiobwodowejorazkrwipępowinowejheterogennejpopu- lacji komórek macierzystych, których udział w regeneracji uszkodzonych tkanek może tłumaczyć opisywane zjawiska ,,plastycznościitransróżnicowania’’KKM[39].Występowanie wczesnych rozwojowo niehematopoetycznych komórek macierzystychwszpikukostnym,krwiobwodowejlubpępo- winowej może zatem wyjaśnić bardziej wiarygodnie niż transróżnicowanie KKM pozytywne wyniki ,,plastyczności’’

[39].

Rozpoczęto więc poszukiwaniatakich komórekw szpiku kostnym, krwipępowinowej i mobilizowanej krwi obwodo- wej. Planem tych poszukiwań było zidentyfikowanie m.in.

populacji tzw. małych embrionalnopodobnych komórek macierzystych (very small embryonic-like stem cells; VSELs).

Wykazano, że komórki te są zdeponowane w tkankach podczasrozwojuembrionalnegojakopopulacjaPKMiźródło dla bardziej zróżnicowanych UTKM. Stanowią one jednak bardzo rzadką populację komórek, np. w dorosłym szpiku kostnym ok.1komórka VSELprzypadana10⁴–10⁵komórek jednojądrowych[40,41].Wykazanorównież,żeszpikkostny, jak inne tkanki młodych osobników,zawiera więcej komó- rek o fenotypie VSELs i liczba tych komórek maleje z wiekiem [42]. Wiadomo, że komórki te pojawiają się w krwi obwodowej w stanach uszkodzeń narządowych, uwidaczniając niejako naturalny mechanizm organizmu polegający na mobilizacji tych komórek, aby brały udział w próbie regeneracjiuszkodzonychtkanek[43, 44]. Zmyślą o wykorzystaniu tych komórek do potencjalnych celów terapeutycznych niezbędne staje się szybkie opracowanie skutecznejmetodyekspansjitychkomórekexvivo.

IndukowanePKM(ind-PKM)

Innym rodzajem PKM, które zaproponowano ostatnio jako alternatywę dla komórek izolowanych z zarodków, są tzw.

indukowane PKM (ind-PKM) (Ryc.2). Komórkite są uzyski- wanewwynikutransformacjihodowlanychinvitrodorosłych komóreksomatycznych zapomocągenówkodującychczyn- niki transkrypcyjne kluczowe dlarozwoju komórek embrio- nalnych(Oct-4,Nanog,Klf4,c-myc).Genytewprowadzanesą dokomórkisomatycznej(np.komórkifibroblastu)zapomocą wektorówretrowirusowych[45].Wwynikupowyższejstrate- gii można uzyskać transformowaną komórkę, która ma szereg właściwości PKM (m.in. różnicuje się w komórki pochodzącezewszystkichtrzechlistkówzarodkowych).

Transformacjatakajestjednakstosunkoworzadka,śred- nio jedna komórka na kilka tysięcy poddanych powyższej manipulacji genetycznej ulega transformacji (indukcji do stanu embrionalnego) izaczyna proliferować, tworzącklon składający się z ind-PKM [45, 46]. Jestto jednaktrudny do kontrolowania proces, a komórki uzyskane w wyniku powyższej strategii, podobnie jak komórki embrionalne izolowane z zarodków, tworzą potworniaki w modelach doświadczalnychuzwierzątlaboratoryjnych.Wprowadzanie do komórek somatycznych genów indukujących powstanie ind-PKM zaburza ponadto strukturę i organizację DNA, co może potencjalnie prowadzić do indukowania mutacji ipowstaniakomóreknowotworowych.

Obecnie próbujesięuzyskaćind-PKM,ograniczającliczbę wprowadzonychgenów(np. transformująckomórkitylkoza pomocą pojedynczego genu Oct-4) oraz próbując zastąpić wprowadzane genypewnymi niskocząsteczkowymi moleku- łami, które bezpośrednio mogą ,,odróżnicowywać’’ DNA w komórkach somatycznych [47]. Wydaje się, że jest to bardziejobiecującastrategiapozyskiwaniaind-PKMwporów- naniu ztransformacją komórekzapomocąwprowadzanych genówwniekontrolowanysposóbdochromosomów.

Przyjmujesię,żeind-PKMsąalternatywąkomórekpozys- kiwanychz zarodków,m.in.tychotrzymywanychnadrodze

klonowania terapeutycznego. Otrzymanie ind-PKM nie wymaga dostępu doludzkich komórek jajowych, a co naj- ważniejsze,komórkipowstające zind-PKM,podobnie jakte otrzymywanedrogąklonowaniaterapeutycznego,będąmiały te same geny kodujące układ zgodności tkankowej jak potencjalnybiorca.Mogłybybyć wykorzystanewklinice bez ryzyka odrzucenia powstających z nich tkanek.Co najważ- niejsze, o ile strategia klonowania terapeutycznego nie

powiodłasięjakdotejporywprzypadkukomórekczłowieka, otrzymanojuższeregludzkichliniikomórekind-PKM.

Należy jednak nadmienić, że ind-PKM niestety również powodująpowstawaniepotworniakówisąodrzucaneprzez organizm biorcy w modelach zwierzęcych [45, 47]. Proble- mem jest również duża niestabilność genetyczna tych komórekiwystępowaniew nichlicznychaberracjichromo- somalnych[48].

Ryc.2–PKMpozyskiwanezeźródełpozazarodkowych.PanelA–PKMmożnapozyskać,transformująckomórkisomatyczne izolowaneztkanekdorosłychosobników(np.fibroblasty)zapomocągenówkodującychembrionalneczynniki

transkrypcyjne(np.Oct-4,Nanog,Klf-4,c-myc).Powstającewwynikutransformacjitzw.ind-PKMmająwielecech podobnychdoPKMpozyskiwanychdrogąklonowaniaterapeutycznego,m.in.zgodnyzdawcąkomórkiukładantygenów zgodnościtkankowej.PanelB–PKMmogąrównieżbyćizolowaneztkanekdojrzałychosobników.Takimikomórkamisąnp.

VSELs,wykazująceszeregcechkomórekembrionalnych.Jakprzypuszczamy,komórkitepochodzązepiblastuizostają zdeponowanewrozwijającychsiępodczasembriogenezynarządach,gdzienastępnieprzebywająwstanie,,uśpienia’’.

Obecnieprowadzonesąintensywnepracenad,,wybudzeniem’’tychkomórek,takabyjewpełniwykorzystaćwmedycynie regeneracyjnej

Fig.2–PKMobtainedfromextraembryonicsources

Komórki pluripotencjalne izolowane z dorosłych tkanek

Szereg grup doświadczalnych opisało występowanie w dorosłychtkankach komóreko charakterze PKM iMKM.

Komórki takie mają różne nazwy (Tab. III). Najprawdopo- dobniej, stosując odmienne techniki izolacji i hodowli, zidentyfikowano komórkio podobnychlub zbliżonych wła- ściwościach. W odpowiednich modelach doświadczalnych komórkite mogąsięróżnicować w komórkitrzech, dwóch lubjednegolistkazarodkowego.

Ciekawąpopulacjąwczesnychrozwojowokomórekzdepo- nowanychwrozwijającychsiętkankachsąm.in.VSELs[49].

CechącharakterystycznąkomórekVSELsjestekspresjamar- kerów typowych dla pluripotencjalnych komórek epiblastu, któreto wewczesnych etapach embriogenezypodczas gas- trulacji uczestniczą w formowaniu listków zarodkowych idająpoczątekróżnymliniomkomórkowym. Badaczeuwa- żają,żekomórkiVSELsdeponowanestopniowowrozwijają- cych się tkankach odgrywają ważną rolę w utrzymywaniu pulitkankowospecyficznychkomórekmacierzystych.Stano- wiąonepierwotneźródłowszystkichkomórekrozwijającego sięorganizmupodczasontogenezy,przeżywająwdojrzałych tkankachitymsamympozostająźródłemukierunkowanych tkankowokomórek macierzystych.W odpowiedzinauszko- dzenietkanekinarządów(np.wzawalemięśniasercowego, udarze mózgu) VSELs mogą być mobilizowane i krążyć we krwiobwodowej[44,50–53].Ponadto, jakwykazano,modyfi- kacjametylacjiniektórychgenówwykazującychpiętnogeno- mowe chroni VSELs przed niekontrolowaną proliferacją itworzeniem potworniaków. Z naszych badań wynika rów- nież, że aby VSELs mogły w pełni wykazać swój potencjał regeneracyjny, muszą być także w pełni funkcjonalne. Nie możnawykluczyćmożliwości,żeVSELsrezydującewszpiku kostnym są funkcjonalnie ,,zablokowane’’, pozostając w stadium swoistego ,,uśpienia’’ iwymagają odpowiednich sygnałówaktywacyjnych,którychnaraziejeszczewpełninie znamy[5,40].

Potencjalnym ograniczeniem ich wykorzystania obecnie dlacelówterapeutycznychjeststosunkowoniskaliczbatych

komórek w dorosłym szpiku kostnym (1 komórka VSELna 10⁴–10⁵komórek jednojądrowychszpiku kostnego). Dlatego tak ważne jest opracowanie protokołów służących do sku- tecznejekspansjitychkomórek.Cowięcej,znaszychobser- wacjiwynika,żeliczbaVSELsjestwyższa umłodychosob- nikówimalejewrazzwiekiem[40].

Wyniki otrzymane w naszym laboratorium [54, 55] oraz winnychniezależnychlaboratoriach[56–59]wskazująjednak, że VSELs mogą stanowić realną alternatywę dla komórek pozyskiwanych np. drogą tzw. klonowania terapeutycznego czy ind-PKM. W czasie kiedy trwa etyczno-religijna debata nad zastosowaniem komórek embrionalnych w klinice, ist- niejeuzasadnionapotrzebazbadaniapotencjałuterapeutycz- nego VSELsjako alternatywnego źródła komórekdo terapii.

Musimywięcjak najszybciejznaleźćodpowiedź napytanie, czyizolowaneztkanekdorosłychosobnikówVSELsmogąbyć efektywnie zastosowane w klinice. Nadchodzące lata z pewnością przyniosą ważne odpowiedzi na postawione pytania.

Wkład autorów/Authors' contributions

Wedługkolejności.

Konflikt interesu/Conflict of interest

Niewystępuje.

Finansowanie/Financial support

Niewystępuje.

Etyka/Ethics

Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej,dyrektywamiEUorazujednoliconymi wymaganiamidlaczasopismbiomedycznych.

TabelaIII–Najważniejszeróżnepotencjalneźródłapluripotencjalnychkomórekmacierzystych(PKM)orazmulti- potencjalnychkomórekmacierzystych(MKM)izolowanychzdorosłychtkanek

TableIII–Themostimportantsourcesofpluripotentandmultipotentstemcellsisolatedfromtheadulttissues Nazwaproponowana

przezodkrywców

Proceduraizolacjiiidentyfikacjikomórki Referenecje

KomórkiELH Izolowanepodczaselutriacji(E),usunięciakomórekliniowopozytywnych(L) orazpohomingudoszpikukostnego(H).Dająpoczątekkomórkomepitelium.

[60–62]

Spore-likestemcells Małekomórkiośrednicy5mmizolowanezróżnychmysichtkanek,Oct-4+, różnicującesięwkomórkiróżnychtkanek.

[63]

VSELs MałekomórkiSca-1+Lin-CD45-umyszyorazCD133+Lin-CD45-uczłowieka.

Mająekspresjęmarkerówtypowychdlapluripotencjalnychkomórek epiblastu,uczestnicząprawdopodobniewformowaniulistkówzarodkowych idająpoczątekróżnymliniomkomórkowym.

[40,64]

Komórkiocharakterzeembrionalnym zludzkiejkrwipępowinowej

MałekomorkiCD45-,CD33-,CD7-,CD235a-mająceekspresjęOct4orazSox2, mogąceróżnicowaćsięwneurony.

[65]

Omnicyty MałeOct-4+KMbiorąceudziałwtworzeniuchimeryzmumatczyno-płodo- wego.

[66]

MultipotencjalneKMizolowane zdorosłychtkanek(MASC)

Komórkiizolowanezdorosłychtkanekpoddającesięekspansjiwkomórki poszczególnychnarządów.

[67]

pi smiennictwo/references

[1] PopielaT.Medycynaklinicznanaprogutrzeciego millenium–refleksjeosobiste.AdvClinExpMed 2003;12:405–408.

[2] O'FarrellPH,StumpffJ,SuTT.Embryoniccleavagecycles:

howisamouselikeafly?CurrBiol2004;14:35–45.

[3] MooreKA,LemischkaIR.Stemcellsandtheirniches.

Science2006;311:1880–1884.

[4] AlisonMR,IslamS.Attributesofadultstemcells.JPathol 2009;217:144–160.

[5] KuciaM,RatajczakJ,RatajczakMZ.Arebonemarrowstem cellsplasticorheterogenous–thatisthequestion.Exp Hematol2005;33:613–623.

[6] RatajczakMZ.Phenotypicandfunctionalcharacterization ofhematopoieticstemcells.CurrentOpinionHematol 2008;15:293–300.

[7] HippJ,AtalaA.Sourcesofstemcellsforregenerative medicine.StemCellRev2008;4:3–11.

[8] LeedhamSJ,BrittanM,McDonaldSAC,WrightNA.

Intestinalstemcells.JCellMol2005;9:11–24.

[9] LoCelsoC,ScaddenD.Isolationandtransplantationof hematopoieticstemcells(HSCs).JVisExp2007;4:157–162.

[10] ProckopDJ.Marrowstromalcellsasstemcellsfor nonhematopoietictissues.Science1997;276:71–74.

[11] StocumDL,ZupancGK.Stretchingthelimits:stemcellsin regenerationscience.DevDyn2008;237:3648–3671.

[12] LoB,KriegsteinA,GradyD.Clinicaltrialsinstemcell transplantation:guidelinesforscientificandethicalreview.

ClinTrials2008;5:517–522.

[13] LoB,ZettlerP,CedarsMI,etal.Aneweraintheethicsof humanembryonicstemcellresearch.StemCells 2005;23:1454–1459.

[14] ZhuWZ,HauchKD,XuC,LaflammeMA.Humanembryonic stemcellsandcardiacrepair.TransplantRev2009;23:53–68.

[15] CabreraCM,CoboF,NietoA,ConchaA.Strategiesfor preventingimmunologicrejectionoftransplantedhuman embryonicstemcells.Cytotherapy2006;8:517–518.

[16] BlumB,BenvenistyN.Thetumorigenicityofhuman embryonicstemcells.AdvCancerRes2008;100:133–158.

[17] AndrewsPW,MatinMM,BahramiAR,etal.Embryonicstem (ES)cellsandembryonalcarcinoma(EC)cells:opposite sidesofthesamecoin.BiochemSocTrans2005;33:

1526–1530.

[18] HwangWS,LeeBC,LeeCK,KangSK.Clonedhuman embryonicstemcellsfortissuerepairandtransplantation.

StemCellRev2005;1:99–109.

[19] YangX,SmithSL,TianXC,etal.Nuclearreprogrammingof clonedembryosanditsimplicationsfortherapeutic cloning.NatGenet2007;39:295–302.

[20] McHughPR.Zygoteand‘‘clonote’’–theethicaluseof embryonicstemcells.NEnglJMed2004;351:209–211.

[21] TachibanaM,AmatoP,SparmanM,etal.Human embryonicstemcellsderivedbysomaticcellnuclear transfer.Cell2013May15.http://dx.doi.org/10.1016/j.

cell.2013.05.006.

[22] GreenRM.Canwedevelopethicallyuniversalembryonic stem-celllines?NatRevGenet2007;8:480–485.

[23] TsunodaY,KatoY.Recentprogressandproblemsinanimal cloning.Differentiation2002;69:158–161.

[24] BreviniTA,GandolfiF.Parthenotesasasourceof embryonicstemcells.CellProlif2008;41:20–30.

[25] MezeyE,ChandrossKJ,HartaG,etal.Turningbloodinto brain:cellsbearingneuronalantigensgeneratedinvivo frombonemarrow.Science2000;290:1779–1782.

[26] QuesenberryPJ,AbediM,AliottaJ,etal.Stemcellplasticity:

anoverview.BloodCellsMolDis2004;32:1–4.

[27] OrlicD,KajsturaJ,ChimentiS,etal.Bonemarrowcells regenerateinfarctedmyocardium.Nature2001;410:701–705.

[28] HessDC,AbeT,HillWD,etal.Hematopoieticoriginof microglialandperivascularcellsinbrain.ExpNeurol 2004;186:134–144.

[29] CortiS,LocatelliF,DonadoniC,etal.Neuroectodermaland microglialdifferentiationofbonemarrowcellsinthe mousespinalcordandsensoryganglia.JNeurosciRes 2002;70:721–733.

[30] PetersenBE,BowenWC,PatreneKD,etal.Bonemarrowas apotentialsourceofhepaticovalcells.Science

1999;284:1168–1170.

[31] OrkinSH,ZonLI.Hematopoiesisandstemcells:plasticity versusdevelopmentalheterogeneity.NatImmunol 2002;3:323–328.

[32] WagersAJ,SherwoodRI,ChristensenJL,WeissmanIL.Little evidencefordevelopmentalplasticityofadult

hematopoieticstemcells.Science2002;297:2256–2259.

[33] MurryCE,SoonpaaMH,ReineckeH,etal.Haematopoietic stemcellsdonottransdifferentiateintocardiacmyocytes inmyocardialinfarcts.Nature2004;428:664–668.

[34] CastroRF,JacksonKA,GoodellMA,etal.Failureofbone marrowcellstotransdifferentiateintoneuralcellsinvivo.

Science2002;297:1299.

[35] LucasJJ,TeradaN.Cellfusionandplasticity.

Cytotechnology2003;41:103–109.

[36] Janowska-WieczorekA,MajkaM,KijowskiJ,etal.Platelet- derivedmicroparticlesbindtohematopoieticstem/

progenitorcellsandenhancetheirengraftment.Blood 2001;98:3143–3149.

[37] RatajczakJ,WysoczynskiM,HayekF,etal.Membrane- derivedmicrovesicles:importantandunderappreciated mediatorsofcell-to-cellcommunication.Leukemia 2006;20:1487–1495.

[38] KuciaM,RatajczakJ,RatajczakMZ.Arebonemarrowstem cellsplasticorheterogenous-thatisthequestion.Exp Hematol2005;33:613–623.

[39] RatajczakMZ,KuciaM,RecaR,etal.Stemcellplasticity revisited:CXCR4-positivecellsexpressingmRNAforearly muscle,liverandneuralcells'hideout'inthebonemarrow.

Leukemia2004;18:29–40.

[40] KuciaM,RecaR,CampbellFR,etal.Apopulationofvery smallembryonic-like(VSEL)CXCR4(+)SSEA-1(+)Oct-4+stem cellsidentifiedinadultbonemarrow.Leukemia

2006;20:857–869.

[41] Zuba-SurmaEK,KuciaM,Abdel-LatifA,etal.Morphological characterizationofVerySmallEmbryonic-Likestemcells (VSELs)byImageStreamsystemanalysis.JCellMolMed 2008;12:292–303.

[42] Zuba-SurmaEK,WuW,RatajczakJ,etal.Verysmall embryonic-likestemcellsinadulttissues-Potential implicationsforaging.MechAgeingDev2009;

130:58–66.

[43] KuciaM,WysoczynskiM,WuW,etal.EvidencethatVery SmallEmbryonicLike(VSEL)StemCellsareMobilizedinto PeripheralBlood.StemCells2008;26:2083–2092.

[44] Zuba-SurmaEK,KuciaM,DawnB,etal.Bonemarrow- derivedpluripotentverysmallembryonic-likestemcells (VSELs)aremobilizedafteracutemyocardialinfarction.J MolCellCardiol2008;44:865–873.

[45] TakahashiK,YamanakaS.Inductionofpluripotentstem cellsfrommouseembryonicandadultfibroblastcultures bydefinedfactors.Cell2006;126:663–676.

[46] KimJB,SebastianoV,WuG,etal.Oct4-induced pluripotencyinadultneuralstemcells.Cell2009;136:

411–419.

[47] OkitaK,NakagawaM,HyenjongH,etal.Generationof mouseinducedpluripotentstemcellswithoutviralvectors.

Science2008;322:949–953.

[48] RonenD,BenvenistyN.Genomicstabilityin

reprogramming.CurrOpinGenetDev2012;22:444–449.

[49] RatajczakMZ,Zuba-SurmaEK,MachalinskiB,etal.Very smallembryonic-like(VSEL)stemcells:purificationfrom adultorgans,characterization,andbiologicalsignificance.

StemCellRev2008;4:89–99.

[50] WojakowskiW,RatajczakMZ,TenderaM.Mobilizationof verysmallembryonic-likestemcellsinacutecoronary syndromesandstroke.Herz2010;35:467–472.

[51] PaczkowskaE,KuciaM,KoziarskaD,etal.Clinicalevidence thatverysmallembryonic-likestemcellsaremobilized intoperipheralbloodinpatientsafterstroke.Stroke 2009;40:1237–1244.

[52] Abdel-LatifA,Zuba-SurmaEK,ZiadaKM,etal.Evidenceof mobilizationofpluripotentstemcellsintoperipheralblood ofpatientswithmyocardialischemia.ExpHematol 2010;38:1131–1142.

[53] DrukałaJ,PaczkowskaE,KuciaM,etal.Stemcells, includingapopulationofverysmallembryonic-likestem cells,aremobilizedintoperipheralbloodinpatientsafter skinburninjury.StemCellRev2012;8:184–194.

[54] WojakowskiW,TenderaM,KuciaM,etal.Cardiomyocyte differentiationofbonemarrow-derivedOct-4+CXCR4 +SSEA-1+verysmallembryonic-likestemcells.IntJOncol 2010;37:237–247.

[55] RatajczakJ,WysoczynskiM,Zuba-SurmaE,etal.Adult murinebonemarrow-derivedverysmallembryonic-like stemcellsdifferentiateintothehematopoieticlineage aftercocultureoverOP9stromalcells.ExpHematol 2011;39:225–237.

[56] Zuba-SurmaEK,GuoY,TaherH,etal.Transplantationof expandedbonemarrow-derivedverysmallembryonic-like stemcells(VSEL-SCs)improvesleftventricularfunction andremodellingaftermyocardialinfarction.JCellMolMed 2011;15:1319–1328.

[57] TaichmanRS,WangZ,ShiozawaY,etal.Prospective identificationandskeletallocalizationofcellscapableof

multilineagedifferentiationinvivo.StemCellsDev 2010;19:1557–1570.

[58] HavensAM,ShiozawaY,JungY,etal.Humanverysmall embryonic-likecellsgenerateskeletalstructures,invivo.

StemCellsDev2013;22:360–622.

[59] KassmerSH,JinH,ZhangPX,etal.VerySmallEmbryonic- LikeStemCellsfromthemurinebonemarrowdifferentiate intoepithelialcellsofthelung.StemCells2013May16.

http://dx.doi.org/10.1002/stem.1413.

[60] JonesRJ,CollectorMI,BarberJP,etal.Characterizationof mouselymphohematopoieticstemcellslackingspleen colony-formingactivity.Blood1996;88:487–491.

[61] JonesRJ,WagnerJE,CelanoP,ZichaMS,SharkisSJ.

Separationofpluripotenthaematopoieticstem cellsfromspleencolony-formingcells.Nature 1990;347:188–189.

[62] KrauseDS.Bonemarrow-derivedcellsandstemcellsin lungrepair.ProcAmThoracSoc2008;5:323–327.

[63] VacantiMP,RoyA,CortiellaJ,etal.Identificationandinitial characterizationofspore-likecellsinadultmammals.JCell Biochem2001;80:455–460.

[64] KuciaM,HalasaM,WysoczynskiM,etal.Morphological andmolecularcharacterizationofnovelpopulationof CXCR4+SSEA-4+Oct-4+verysmallembryonic-likecells purifiedfromhumancordblood:preliminaryreport.

Leukemia2007;21:297–303.

[65] McGuckinC,JurgaM,AliH,StrbadM,ForrazN.Cultureof embryonic-likestemcellsfromhumanumbilicalcord bloodandonwarddifferentiationtoneuralcellsinvitro.

NatProtoc2008;6:1046–1055.

[66] MikhailMA,M'HamdiH,WelshJ,etal.Highfrequencyof fetalcellswithinaprimitivestemcellpopulationin maternalblood.HumReprod2008;23:928–933.

[67] BeltramiAP,CesselliD,BergaminN,etal.Multipotentcells canbegeneratedinvitrofromseveraladulthumanorgans (heart,liverandbonemarrow).Blood2007;110:

3438–3446.