Oznaczanie RNA w materiale roślinnym
Prowadzący: mgr inż. Marta Grec
1. Wstęp teoretyczny
RNA oraz DNA, nazywane kwasami nukleinowymi, są długimi liniowymi polimerami, w których monomery stanowią nukleotydy1. Każdy z tych merów, który złożony jest z jednostki cukrowej – β-D-rybozy (RNA) oraz β-D-deoksyrybozy (DNA) - związanej w pozycji 1’ z zasadą purynową (adenina A, guanina G) lub pirymidynową (cytozyna C, tymina T – w DNA, uracyl U – w RNA), łączy się z kolejnym za pomocą wiązania 3’ → 5’-fosfodiestrowego.
Cząsteczki DNA i RNA są uważane za nośniki informacji genetycznej, która jest przechowywana w sekwencji zasad leżących wzdłuż łańcucha kwasu nukleinowego. Zasady te posiadają szczególną cechę tworzenia za pomocą wiązań wodorowych specyficznych par, a takie ich parowanie jest podstawą mechanizmu kopiowania informacji genetycznej z istniejącego łańcucha na nowo powstały. Cząsteczki RNA zbudowane są z jednej nici ale zawierają rejony typu „spinki do włosów”, powstające w wyniku utworzenia dwuniciowej helisy przez sekwencje komplementarne występujące w jednej nici kwasu.
DNA stanowi materiał genetyczny organizmów komórkowych, który określa jakie białka powstają w komórce, ale to RNA stanowi bezpośrednią matrycę dla ich syntezy. Ekspresja genów jest przekształceniem informacji zawartej w DNA w funkcjonalne cząsteczki, w której kluczową rolę odgrywa kilka rodzajów RNA:
a) Informacyjny RNA (mRNA) – stanowi matrycę do syntezy białek czyli translacji – określa kolejność aminokwasów w syntezowanym białku
b) Transportujący RNA (tRNA) – przenosi zaktywowane aminokwasy do rybosomów, gdzie dochodzi do ich połączenia się wiązaniami peptydowymi w kolejności
określonej przez mRNA
c) Rybosomowy RNA (rRNA) – główny składnik rybosomów, pełni podczas biosyntezy białek funkcje zarówno katalityczne jak i strukturalne
DNA stanowi matrycę do syntezy RNA, a proces ten nazywany jest transkrypcją. Jest on katalizowany przez enzym – polimerazę RNA, która rozpoznając tzw. promotora rozpoczyna syntezę RNA. Polimeraza RNA przemieszcza się wzdłuż matrycy i przepisuje jedną z nici, aż osiągnie miejsce terminacji transkrypcji.
Zawartość RNA w komórce roślinnej zmienia się w zależności od rodzaju tkanki i jej stadium rozwojowego. W dojrzałych liściach całkowite stężenie RNA wynosi 0,1-0,2%. W liściach czy korzeniach starzejących się lub poddanych głodzeniu jego poziom wyraźnie obniża się.
W komórce RNA zwykle połączone jest z białkami, które można odłączyć przez działanie detergentami, chlorkiem guanidyny lub proteazami. Naturalne mieszaniny RNA można rozdzielić metodą chromatografii jonowymiennej, sączenia molekularnego w żelach itd.
Badanie składników RNA można przeprowadzić bez poddania go reakcji hydrolizy (np.
stosując reakcje barwne tj. reakcja Biala na rybozę) lub po hydrolizie enzymatycznej lub chemicznej. W wyniku działania 1M kwasu solnego (1h, 100oC) na cząsteczkę RNA uwalniane są zasady purynowe, fosforany rybozy oraz nukleotydy pirymidynowe.
Ogrzewanie RNA w obecności 0,5M wodorotlenku potasu (40oC) powoduje powstawanie 2’- 3’- cyklicznych diestrów mononukleotydów (nie powstają one z DNA, gdyż nie ma w nim 2’- OH); przedłużenie czasu ogrzewania w wodorotlenku potasu do godziny prowadzi do utworzenia w przybliżeniu równych ilości rozpuszczalnych soli potasowych izomerów 2’- i 3’- nukleotydów: AMP, GMP, CMP i UMP (rys 1), których ilość można oznaczyć spektrofotometrycznie.
N
N N N
NH2
O
OH O
P O
O- HO
O-
NH
N N
O
NH2 N
O
OH O HO
P O
O- O-
N NH2
O N
O
OH O
P O
O- HO
O- NH
O
O N
O
O OH HO
P O
O- O-
Rys. 1
Podczas ćwiczenia będzie wykorzystana adaptowana do materiału roślinnego i uproszczona procedura Schmidta i Thannhausera2. Polega ona na usunięciu z materiału roślinnego barwników, lipidów, białek, wolnych nukleotydów i DNA. Pozostałe RNA hydrolizuje się poprzez łagodne ogrzewanie w roztworze wodorotlenku potasu, a powstające 2’- i 3’-mononukleozydy oznacza się spektrofotometrycznie. Wykazują one maksymalną absorpcję przy około 260 nm. Ponadto mierzy się absorbancję przy 300 nm w celu wprowadzenia poprawki wynikającej z obecności innych związków pochłaniających promieniowanie przy tej długości fali.
2. Wykonanie ćwiczenia
Odczynniki i materiały:
95% etanol 80% etanol eter naftowy
0,2M kwas nadchlorowy (schłodzony) 1M kwas nadchlorowy
0,5M wodorotlenek potasu materiał roślinny
Szkło i inne wyposażenie
Kolba stożkowa 250 ml, moździerz z tłuczkiem, pęseta, lejek szklany z korkiem gumowym, kolbka ssawkowa, sączki, bagietki, probówka wirówkowa, próbówka szklana, termometr, cylinder miarowy 10 ml, pipeta, łaźnia lodowa, łaźnia wodna (100oC), łaźnia wodna (40oC), folia aluminiowa, kuweta, spektrofotometr, wirówka,
Etap 1 – usunięcie większości chlorofilu, lipidów, wolnych puryn i nukleotydów
Naważkę 300 mg (zapisać dokładną wagę naważki!!) liści pociąć na 2-3 milimetrowe fragmenty. Do kolby stożkowej o pojemności 250 ml wlać 100 ml 80% etanolu i zakryć folią aluminiową. Następnie umieścić w wrzącej łaźni wodnej i gdy alkohol zacznie wrzeć dodać stopniowo za pomocą pęsety kawałki liści w taki sposób, aby nie przerwać wrzenia. Kolbę przykryć folią i ogrzewać przez 4 minuty. Nie doprowadzić do zbyt dużego odparowania alkoholu!
Etap 2 – usunięcie chlorofilu, lipidów, karotenoidów
Zawartość kolby schłodzić pod bieżącą wodą, zdekantować alkoholowy roztwór i odrzucić (wylać do specjalnie przygotowanego pojemnika na odpad etanolu!!!). Pozostałość przenieść do moździerza i dokładnie rozetrzeć, dodać 5 ml 95% etanolu i dalej rozcierać. Zawiesinę przenieść na lejek szklany z gumką i przygotowanym sączkiem – odsączyć alkohol pod słabą próżnią. Moździerz przepłukać 10 ml 95% etanolu i roztwór przenieść na sączek. Osad na sączku przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) eterem naftowym i odsączyć pod słabym ciśnienie.
Etap 3 – usunięcie rozpuszczalnych nukleotydów
Osad przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) schłodzonym 0,2M kwasem nadchlorowym. W celu usunięcia kwasu osad przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) 95% etanolem.
Etap 4 – hydroliza RNA do 2’- i 3’-mononukleotydów
Po odsączeniu etanolu wyjąć sączek z osadem, zwinąć, włożyć do probówki wirówkowej, dodać 5 ml 0,5M wodorotlenku potasu i całkowicie zanurzyć sączek w roztworze. Probówkę zamknąć i wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 40oC na godzinę.
Etap 5 – wytrącenie DNA, białek, ścian komórkowych
Po wyjęciu z łaźni wodnej probówkę umieścić w łaźni lodowej na 10 minut (mieszając zawartość bagietką), następnie dodać 5 ml schłodzonego 1M kwasu nadchlorowego i łagodnie wymieszać. Pozostawić w łaźni lodowej przez 15 minut.
Etap 6 – Uzyskanie roztworów oczyszczonych 2’- i 3’-mononukleotydów
Całość wirować 7 minut przy 12 000 obrotach/min, supernant ostrożnie zdekantować do cylindra o pojemności 10 ml (zapisać objętość!).
Etap 7 – pomiary i ilościowe oznaczanie RNA
Do szklanej próbówki pobrać 1 ml roztworu nukleotydów RNA, dodać 3 ml wody, dokładnie wymieszać i przenieść do kuwety pomiarowej. Zmierzyć absorbancję przy 260 i 300 nm w spektrofotometrze wyzerowanym na wodę. Ilość RNA obliczyć ze wzoru:
mg RNA = 0,031(A260-A300)(rozcieńczenie x ml RNA)
gdzie:
0,031 – „średnia wartość” absorbancji dla nukleotydów w RNA A260, A300 – zmierzone wartości absorbancji
rozcieńczenie próbki – w tym przypadku 4 (1 ml + 3 ml) ml RNA – ilość supernantu po wirowaniu
Zawartość RNA wyrazić w procentach.
1. J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, Biochemia, Wydawnictwo PWN, 2005, 117-131 2. J.N. Davidson, Biochemia kwasów nukleinowych, Methuen & Co Ltd., 1969, 111-112
