• • • -
W SZECHŚW IAT
KWIECIEŃ 1981
Z a le c o n o d o b ib lio t e k n a u c z y c ie ls k ic h i l ic e a ln y c h p is m e m M in is tr a O ś w ia ty n r IV /O c -2 7 3 4 /4 7
W y d a n e z p o m o c ą f in a n s o w ą P o ls k ie j A k a d e m ii N a u k
TRESC ZESZYTU 4 (2208)
S z a b u n i e w i c z B., Próby syntezy interferonów w pałeczce okrężnicy . 77 J a k u b o w s k i J. L., Migawki przyrodnicze z A m eryki Południow ej. P eru . 81 B y c z k o w s k a - S m y k W., Starość k o m ó r k i... 88 D y d u c h - F a l n i o w s k a A., M ikroorganizacja biologicznych stru k tu r m i-
neralno-organicznych u b e z k r ę g o w c ó w ...91 Drobiazgi przyrodnicze
M echanizmy w yzw alania porodu (B. S z a b u n i e w i c z ) ... 93 Sym bolika w interkom unikacji u zw ierząt (B. Szabuniewicz) . . . 94 Węże m orskie (W. B y c z k o w s k a - S m y k ) ...95 Ograniczyć stosowanie hormonów w hodowli zw ierząt (W. Byczkowska- - S m y k ) ...96 Rozmaitości
Recenzje
C. R. A u s t i n , R. V. S h o r t: Rozród ssaków (H. ^Krzanowska) • • 99 D. F r e e m e n: The G reat Apes (A. J a s i ń s k i ) ... ... 99 J. T i b e n s k y : D ejiny vedy a techniky n a Slovensku (Z. Wójcik) . . 100 H. W. F r a n k e : In den H óhlen dieser E rde (A. Rosler) . . . . 101
K ronika naukow a
S karby ziemi naszej (K. R. M a z u r s k i ) ...101 VI Ogólnopolska K onferencja H istoryków K artografii (E. Lew andowska, Z. W ó j c i k ) ... 102 Spraw ozdania
Spraw ozdanie z działalności Oddziału Katowickiego P T P im. K opernika za okres od stycznia 1977 do grudnia 1980 (K. R ostański) . . . . 103
S p i s p l a n s z
I. SASANKA ŁĄKOWA Pulsatilla pratensis L. Fot. A. P rad el
Ila . PISK LĘTA DROZDA ŚPIEW AKA Turdus ericetorum w gnieździe. Fot. W.
S trojny
Ilb. PISK LĘTA TURKAWKI Streptopelia tu rtu r L. Fot. W. S trojny III. DOLINA LINNEUSZA, Spitsbergen. Fot. R. W rona
IV. BIWAK NA ELVENESET, w głębi Isfjord i Tem pelfjellet, Spitsbergen. Fot.
R. W rona
O k ł a d k a : TCHÓRZ ZWYCZAJNY Mustela putorius L., pierw sza wspinaczka.
Fot. W. S trojny
P I S M O P R Z Y R O D N I C Z E
O R G A N P O L S K I E G O T O W A R Z Y S T W A P R Z Y R O D N I K Ó W IM. K O P E R N I K A
(Rok założenia 1875)
KWIECIEŃ 1981 ZESZYT 4 (2208)
BOŻYDAR SZABUNIEWICZ (Gdańsk)
PRÓBY SYNTEZY INTERFERONÓ W W PAŁECZCE OK RĘŻNICY
Infekcje bakteryjne mogą być zwalczane albo powiększaniem immunologicznej odporno
ści organizmu, albo podaw aniem leków baktte- riostatycznych. Oba te sposoby zostały współ
cześnie tak dalece udoskonalone, że zakażenie bakteriam i rzadko byw a groźne dla życia czło
wieka. Inaczej jest z zakażeniami wirusowymi.
Organizm człowieka tru d niej sobie z nimi radzi, znan’e zaś dotąd leki działają tylko na niektóre wirusy. Znaczenie zaś w alki z tym i zakażenia
mi stanie się jasne, gdy weźmiemy pod uwagę, że co najm niej liczne schorzenia nowotworowe są następstw em „egoistycznego” mnożenia się niektórych tkanek nabytego pod w pływ em wi
rusowego zakażenia.
W r. 1957 A. Isaacs i J. Lindem ann w ykryli, że w odpowiedzi na zakażenie w irusem kom ór
ki kręgowców rozpoczynają produkcję białek, które w innych kom órkach w yw ołują wzrost odporności na to zakażenie. Białka te nazwali oni interferonam i. W krótce wykazano, że in
terferony (IFN) ham ują też rozwój wielu gu
zów nowotworowych. F ak ty te w ywołały duże zainteresowanie. W wielu laboratoriach przed
sięwzięto poszukiwania sposobów produkcji IFNów i ich działania na organizm. Dużą prze- l
I
szkodą w badaniach były nikłe tylko ilości do
stępnych IFNów.
Interferony są produkowane przez zainfeko
wane komórki, m. in. kom órki nowotworowe.
Produkcję można badać doświadczalnie na szczepach komórkowych w hodowli tkanko
wej. Białko .IFNów jest specyficzne gatunkowo, więc terapeutyczne wprowadzenie białka ko
m órek zwierzęcych człowiekowi napotkałoby na trudności. IFNy działają zresztą skutecznie tylko na komórki bliskie gatunkowo. W ynika z tego, że leczenie trzeba by przeprowadzać IFNami pochodzącymi od ludzkich komórtek.
Ludzkie IFNy uzyskuje się w hodowli od
powiednio pobudzonych ludzkich tkanek. Po
budzenie może być dokonane dwojako. Można mianowicie hodowlę zakazić wirusem , na p rzy
kład w irusem pęcherzykowego zapalenia jam y ustnej, albo wirusem Sendai (parainfluency).
Stwierdzono jednak doświadczalnie, że pobu
dzenie daje się uzyskać również działaniem niektórych substancji chemicznych, tzw. indu- ktorów. Induktorem jest na przykład synte
tycznie otrzym ywany polinukleotyd zbudowa
ny wyłącznie z inozyny i cytozyny (poli IC).
Do produkcji IFNów ludzkich służą obecnie
trzy rodzaje komórek: leukocyty, łim foblasty (lymphoblastoid cells) i fibroblasty. K ażdy z tych rodzajów produkuje inny rodzaj IFNów.
Białka uzyskiw ane od leukocytów i limfoblas- tów należą do IFNów ty p u alfa, od fibroblas- tów do IFNów ty p u beta. Jakkolw iek białka t’e są różne i m ają inny skład aminokwasów, ich efekt przeciw w irusow y jest podobny.
M echanizmy działania IFNów na komórki, w yrażające się w zrostem ich odporności na w i
rusowe zakażenie i zwolnieniem podziałów, nie są dotąd dokładniej poznane. Wiadomo (A.
Schm idt i wsp., Proc. Nat. Ac. Sci 76, 1979, 4788), że zmi'enia się m etabolizm kom órek i że dochodzi w nich do produkcji uprzednio nie syntetyzow anych enzymów. Odporność na w i
rusy nie tłum aczy się produkcją przeciwciał, a tylko jakim ś nowym stanem m etabolizm u ko
mórki.
Uzyskiwanie IFNów z hodowli ludzkich tk a nek jest kłopotliwe i daje m ałe ilości białka.
Niemniej w zakładach R esearch Laboratories w Bteckenham w K ent zdołano w yprodukować ich tak wiele, że G. A llen i K. H. Fantes do swych doświadczalnych badań (Naturę 287, 1980, 408) zużyli aż 4 mg białka IFNu. Więcej prób przedsięwzięto z hodowlą IFNów w pos
politej ludzkiej bakterii, pałeczce okrężnicy (Escherichia coli). W ykazano bowiem już wcześ
niej, że tym sposobem można produkow ać nie
które horm ony i enzymy.
Kom órki sy ntety zują białka w organellach cytoplazm y zw anych rybosomam i. Rybosomy (także po ich izolacji in vitro) mogą syntetyzo
wać różne rodzaje białek, jednak trzeba im dostarczyć wzorców mRNA, tj. specyficznych m olekuł RNA kodujących odpowiednie białko.
K odujące m olekuły mRNA są w kom órkach syntetyzow ane jako kopie wzorców genetycz
nych, znajdujących się w genomie jąd ra (u eu- kariotów). Genomowe wzorce są odcinkami nici polinukleotydowego DNA. Są one m olekularny
mi odpowiednikami genów.
Rybosomy bakterii są o tyl'e podobne do lu dzkich, że mogą (również in vitro) syntetyzo
wać białko ludzkich komórek, n atu raln ie pod w arunkiem dostarczenia im wzorcowego mRNA.
W omawianym przypadku trzeba by posiadać wzorce mRNA dla białka ludzkiego IFNu. Dos
tarczenie takich wzorców m usiałoby być n a tu ralnie dokonane w odpowiedni sposób, m iano
wicie taki, k tó ry zapewniłby włączenie się mRNA do metabolicznej m aszynerii kom órki b atery jn ej. W p raktyce zastosowano odpowied
nie „w ehikuły”, jakim i są różne plazm idy zdolne do pom nażania się w cytoplazm ie E. coli.
Genom b akterii nie znajduje się w jądrze, jak w kom órkach eukariotów , a tylko w cyto
plazmie. Jest to gigantyczna m olekuła polinu- kleotydow a, m ająca postać nici (podwójnej helisy DNA) zam kniętej w piterścień. Ciężar m olekuły genomu E. coli jest rzędu kilku m iliardów daltonów (ciężarów atom u wodoru).
Jej nić jest zbudowana z ciągu nukleotydów liczącego około 20 milionów p ar (bp). Nić tego genomu m a długość około 7 mm. Oczywiście m usi być ona w ielokrotnie pofałdow ana i zwi-
78 ł
nięta, skoro mieści się w bakterii m ającej parę m ikrom etrów długości.
Ryc. 1. Bardzo uproszczony schem at „autonomicz
nych” jednostek DNA, znajdujących się w cytoplaz
mie bakterii. Łańcuch DNA genomu (podwójna helisa DNA) jesit przedstaw iony jako linia zam knięta w p ier
ścień. M ałe koliste pierścienie ■ — episomy i plazmidy.
Region ograniczony strzałkam i w genomie bakterii m a być odcinkiem, który może ulegać desintegracji n a episom, który w procesie integracji może na powrót włączać się do genomu. Episomy mogą pomnażać się zarów no autonom icznie, jak (po integracji) w raz z genomem bakterii. N iektóre episomy i plazm idy są zdolne do tra n sfe ru z m acierzystej kom órki na inną (w procesie koniugacji). Cechy plazm idów są podobne do tychże w irusów . S. N. Cohen (1976) określił bak
teriofagi jako plazm idy wyposażone w zdolności do tra n sfe ru lub do bytow ania poza cytoplazmą
Wzdłuż pofałdow anej polinukleotydowej nici DNA genom u b ak terii zn ajdują się odcinki bę
dące genow ym i wzorcami dla różnych białek.
Zależnie od fazy życiowej komórki, poszczególne geny ulegają ekspresji na białko. Mianowicie na odcinku DNA genu pow staje kopia polinu- kleotydu RNA. Kopia ta ulega przeistoczeniu na inform acyjny mRNA, k tó ry w cytoplazmie służy rybosomom jako wzorzec do syntezy da
nego rodzaju białka.
Genom nie je st form acją niezmienną. Zawie
ra on szereg odcinków DNA o pew nej samo
dzielności. Odcinki te mogą nie tylko ulegać od
dzielnie ekspresji na białko, ale mogą odrywać się od genomu, niekiedy w raz z sąsiednimi ge
nami, i tw orzyć „autonom iczne” formacje, zdol
ne do replikacji niezależnej i nieraz częstszej od replikacji genom u kom órki (podczas jej po
działów). Plazm idy są rodzajem takich autono
micznych replikujących się jednostek. Można je określić m ianem niekom pletnych mini-ge- nów. Jakkolw iek ulegają one pomnażaniu w ry tm ie innym niż genom bakterii, ale pro
ces ten zachodzi tylko w trybach metabolicznej m aszynerii komórkowego środowiska.
G enetycy nauczyli się izolować niektóre plazm idy i „operow ać” ich nić DNA za pomocą specyficznie działających enzymów. Istnieją mianowicie enzym y, nazyw ane restryktazam i, rozcinające nić DNA w swoistych miejscach.
Inne enzym y dobudow ują nukleotydy do prze
ciętego końca nici DNA. Dalej, enzymy nazy- warie ligazam i „zlepiają”, względnie łączą ze sobą przecięte końce. Tymi sposobami uzyska
no liczne sztuczne plazm idy, m.in. wyposażone w segm enty DNA o charakterze ludzkich ge
nów. Plazm idy te mogą posiadać zdolność do
«
79
transferu z komórki m acierzystej na inną, czyli cechy „zakaźne”. Ich geny mogą ulegać eks
presji na mRNA i białko.
Widać z tego, że przygotow anie plazmidu zdolnego do nogzenia i do ekspresji białka IFNu wymaga posiadania genu dla tego białka.
Geny te znajdują się w jądrow ym genomowym DNA. Wyizolowanie takiego genu z ludzkiego genomu nie jest obecnie niemożliwe, ale tru d ne. Obrano tu inną drogę. Oto, pod wpływem indukcyjnego pobudzenia w kieru n k u produkcji IFNów, w hodowlanych komórkach, w pewnej fazie, masowo pojaw iają się m olekuły mRNA, które stosunkowo łatwo dają się z hodowli w y
ekstrahować. M olekuły mRNA zaw ierają całość informacyjnego kodu niezbędnego do syntezy białka na rybosomach. Molekuła mRNA jest, jak wskazaliśmy, kopią genetycznego wzorca DNA genu. Otóż istnieją enzymy, pozwalające proces kopiowania poprowadzić w kierunku przeciwnym, tj. z polinukleotydowej sekwencji RNA uzyskać kopię DNA. Enzym y te dają się uzyskać od komórek zakażonych niektórym i wirusami. Nazywane są transkryptazam i „od
w rotnym i” (reverse transcriptase). Działając transkryptazą „odw rotną” na mRNA otrzym a
no kom plem entarną kopię DNA, czyli cDNA, albo inaczej „sztuczny gen” .
Tym właśnie sposobem R. Derynck i współ
pracownicy z różnych laboratoriów Belgii (.Naturę 285, 1980, 542 i 287, 1980, 193) otrzy
m ali sztuczny gen dla IFNu beta. Gen ten wszczepili oni do specjalnego plazmidu (ryc. 2) oznaczonego symbolem pPLaH FIF-67-1. Plaz
mid był pierścieniową cząsteczką dwuniciowe- go DNA o długości 4975 bp (par nukleotydów).
W tym łańcuchu około 850 p ar należało do sztucznego genu cDNA. Produkcja białka IFNu okazała się jednak słaba. Celem powiększenia wydajności, gen dla IFNu przeniesiono na inny plazmid, pPLc24, posiadający silny prom otor (PL na ryc. 2), tj. region niezbędny dla ekspresji genów.
Posługując się odpowiednio dobraną restryk- tazą (Bgl II), z plazmidu pPLaHFIF-67-1 De
rynck i wsp. wycięli s’egm ent zaw ierający gen cDNA. Wycinek wyizolowano i oczyszczono.
Z drugiej strony, za pomocą innej specjalnie dobranej restryktazy (BamHI), rozcięli oni pierścień plazmidu pPLc24. Teraz należało po
łączyć wycinek z nicią i zamknąć całość kom
binatu w pierścień. Aby to przeprowadzić, za- markowano końce, które m iały być ze sobą złączońe. Oto, do przeciętego końca łańcucha DNA dosyntetyzowano formację „ogona” (taił) o postaci jednoniciowej krótkiej sekwencji nu-
silnego promotora. Kan, AM — regiony genów w arunkujących oporność na kanamycynę, ampicylinę. MS2 — region genu dla polim erazy MS2. S trzałki B g lll, BamHI — m iejsca rozcinane przez restryktazy. B glH przecina
pierścień plazm idu w dwóch miejscach, co daje segment DNA z genem dla IFN -beta
!•
80
kleotydów. Spraw ę zailustrujem y, posługując się konkretnym przykładem takiej syntezy przeprow adzonej przez A. C. Y. Chang i wsp.
(Naturę, 275, 1978, 617). Należało połączyć ze sobą następujące końce podwójnej nici DNA przeciętej restryktazam i (litery A, T, G, C w yobrażają zasady nukleotydów):
5 ' 3 '
... CTGCAC ... GACGTG
3 ' 5 '
przecięte końce
5 ' 3 '
ATGGTT TACCAA
3 ' 5 '
Za pomocą odpowiedniej syntezy, do końca 5' segm entu A dosyntetyzowano odcinek oligo (C).
W podobny sposób koniec segm entu B zaopa
trzono w kom plem entarny do poprzedniego „o- gon” oligo (G):
5 ' 3 '
. CTGCAC
. GACGTGCCCCCCCCCC
3 ' 5 '
5 ' 3 '
GGGGGGGGGGATGGTT ...
TACCAA ...
3 ' 5 '
Pasujące do siebie kom plem entarnie jednoni- ciowe „ogony” łączą się ze sobą łatwo:
5 ' 3'
... CTGCACGGGGGGGGGGATGGTT ...
A ... GACGTGCCCCCCCCCCTACCTT
3 ' .5'