BYDGOSZCZ – 2008
ROZPRAWY NR 131
WP£YW ¯EROWANIA LARW I CHRZ¥SZCZY SKRZYPIONKI ZBO¯OWEJ (Oulema melanopus L.,
COLEOPTERA: CHRYSOMELIDAE) NA WYDZIELANIE LOTNYCH
ZWI¥ZKÓW ORGANICZNYCH PRZEZ PSZENICÊ (Triticum aestivum L. emend. Fiori et Paol.)
ORAZ REAKCJA IMAGINES NA TE KOMPONENTY
Dariusz Piesik
IM. JANA I JÊDRZEJA ŒNIADECKICH W BYDGOSZCZY
prof. dr hab. in¿. Janusz Prusiñski
REDAKTOR DZIA£OWY dr hab. Ewa Spychaj-Fabisiak, prof. UTP
OPINIODAWCY
prof. zw. dr hab. Bogus³aw Buszewski prof. dr hab. Jan Nawrot
OPRACOWANIE REDAKCYJNE I TECHNICZNE mgr Micha³ Górecki, mgr in¿. Daniel Morzyñski
© Copyright
Wydawnictwa Uczelniane Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego Bydgoszcz 2008
ISSN 0209-0597
Wydawnictwa Uczelniane Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego ul. Ks. A. Kordeckiego 20, 85-225 Bydgoszcz, tel. (052) 3749482, 3749426
e-mail: wydawucz@utp.edu.pl http://www.utp.edu.pl/~wyd Wyd. I. Nak³ad 120 egz. Ark. aut. 5,5. Ark. druk. 5,5.
Oddano do druku i druk ukoñczono w czerwcu 2008 r.
Zak³ad Poligraficzny ARGONEX Bydgoszcz, ul. Przemys³owa 30
1. WSTĉP I CEL PRACY ... 5
2. PRZEGLĄD LITERATURY ... 6
2.1. ĝwiatowa produkcja pszenicy ... 6
2.2. Uszkodzenia pszenicy przez skrzypionkĊ zboĪową ... 7
2.3. NiepoĪądane efekty chemicznej metody ochrony roĞlin ... 8
2.4. System obronny roĞlin ... 10
2.5. Rozwój metod zbierania VOC i technik chromatograficznych ... 10
2.6. Lotne związki organiczne (VOC) ... 11
3. MATERIAà I METODY BADAē ... 15
3.1. Laboratoryjna uprawa roĞlin ... 15
3.2. Hodowla owadów ... 15
3.3. ĩerowanie owadów ... 15
3.4. Zbieranie VOC ... 16
3.5. Analiza chromatograficzna VOC ... 17
3.6. Obserwacje zachowania siĊ owadów ... 17
3.7. Syntetyczne VOC ... 20
3.8. Wpáyw syntetycznych GLV na zachowanie chrząszczy ... 20
3.9. VOC uwalniane z uszkodzonych roĞlin ... 22
3.10. Analiza statystyczna - walidacja ... 23
4. WYNIKI ... 27
4.1. Analiza chromatograficzna ... 27
4.2. Reakcja chrząszczy na obecnoĞü GLV ... 30
4.3. Analiza niektórych parametrów uzyskanych z TSLC dla GLV ... 32
4.4. Reakcja chrząszczy na obecnoĞü pozostaáych VOC z wykorzystaniem TSLC ... 32
4.5. Reakcja chrząszczy na obecnoĞü VOC z roĞlin uszkadzanych ... 33
4.6. Analiza skupieĔ dla VOC... 33
5. DYSKUSJA ... 35
6. WNIOSKI ... 39
LITERATURA ... 40
RYSUNKI ... 51
TABELE ... 75
STRESZCZENIA ... 87
RoĞliny wáączyáy w swój mechanizm obronny wiele sposobów chroniących je przed atakiem roĞlinoĪerców i patogenów. Produkują szereg lotnych metabolitów, które pozwalają na specyficzny jĊzyk komunikacyjny w Ğrodowisku z przedstawicielami tego samego gatunku, a takĪe z innymi organizmami. Lotne związki mogą byü uwalniane przez kwiaty i są wtedy rozpatrywane jako atraktanty dla zapylaczy. Z drugiej strony są równieĪ emitowane z czĊĞci wegetatywnych roĞlin jako reakcja na atak roĞlinoĪerców, peániąc rolĊ informacji chemicznej dla wrogów naturalnych agresora. Chemiczna ko- munikacja miĊdzy roĞlinoĪercą a roĞliną przez dáugi czas byáa przyjmowana ze scepty- cyzmem. Obecnie wiadomo, Īe GLV1, powszechnie wystĊpujące C6 alkohole, aldehydy czy octany odgrywają zasadniczą rolĊ w systemie obronnym roĞlin.
W odniesieniu do wiĊkszoĞci analizowanych roĞlin moĪna zauwaĪyü pewne podo- bieĔstwa w wydzielaniu lotnych związków jako nastĊpstwo ataku ze strony roĞlinoĪer- cy, a dotyczą one ich biosyntetycznej ĞcieĪki wytwarzania. Informacja chemiczna moĪe zawieraü wskazówki, Īe roĞliny produkują toksyczne komponenty równoczeĞnie z wydzielaniem lotnych związków.
Zaobserwowano zdolnoĞü owadów do rozróĪniania VOC2 i lokalizowania gospo- darza. MiĊsoĪerne stawonogi, uĪywając sygnaáów chemicznych wydzielanych przez za- atakowane roĞliny, lokalizują swoją ofiarĊ.Podobnie wiele owadów drapieĪnych i para- zytoidów wĊdruje w kierunku VOC wydzielanych przez roĞliny. Komponenty te, któ- rymi są monoterpeny, seskwiterpeny, homoterpeny i związki aromatyczne są skáado- wymi mechanizmu obronnego roĞlin.
Ostatnie odkrycia w zakresie roĞlinnych lotnych terpenów, które zwabiają natural- nych wrogów mogą stanowiü cenny potencjaá dla biologicznego zwalczania szkodni- ków w agroekosystemach, a to moĪe prowadziü do powstania nowych strategii w nowoczesnej ochronie roĞlin. Mogą one byü osiągniĊte w konwencjonalny sposób lub w wyniku genetycznych modyfikacji. Szeroko rozumiane metody biologiczne ochrony roĞlin proponują alternatywny sposób walki ze szkodnikami w porównaniu z syntetycz- nymi insektycydami. W konsekwencji mniejsza iloĞü substancji aktywnej moĪe byü wprowadzana do Ğrodowiska, co jest zgodne z jednym z priorytetów Unii Europejskiej, dotyczącym poszukiwania Ğrodowiskowo-przyjaznych metod walki z agrofagami.
Celem pracy byáo okreĞlenie wpáywu Īerowania skrzypionki zboĪowej (Oulema melanopus L., Coleoptera: Chrysomelidae) na emisjĊ VOC wydzielanych przez uszka- dzane roĞliny pszenicy (Triticum aestivum L. emend. Fiori et Paol.) odmiany Tonacja.
Szczegóáowe badania obejmowaáy:
– okreĞlenie wpáywu Īerowania larw i imagines skrzypionki zboĪowej na wydzielanie VOC przez pszenicĊ,
– reakcjĊ skrzypionki zboĪowej na wydzielanie VOC przez roĞliny nieuszkadzane oraz poddane Īerowaniu owadów,
– reakcjĊ skrzypionki zboĪowej na syntetyczne VOC bĊdące odpowiednikami w sto- sunku do tych, które oznaczono z wykorzystaniem chromatografii gazowej.
1GLV – Green Leaf Volatiles; lotne związki organiczne z zielonego liĞcia
2VOC – Volatile Organic Compounds; lotne związki organiczne
2.1.ĝWIATOWA PRODUKCJA PSZENICY
Produkcja pszenicy (Triticum aestivum L. emend. Fiori et Paol.) dostarcza Īywno- Ğci dla milionów ludzi na caáym Ğwiecie. Zajmuje ona 17% Ğwiatowej powierzchni upraw i dostarcza 35% poĪywienia oraz 20% kalorii [7]. Obok kukurydzy i ryĪu jest jedną z trzech gáównych upraw na Ğwiecie. W latach 2000/01 powierzchnia uprawy pszenicy wynosiáa 215,6 milionów hektarów, a miĊdzynarodowy handel tym zboĪem siĊgnąá 40 milionów ton [10]. ĝwiatowa produkcja pszenicy wynosi okoáo 581,3 milio- nów ton przy Ğrednim plonie na poziomie 2,7 t·ha-1 [144]. Powierzchnia uprawy, plon i znaczenie gospodarcze tej roĞliny nie ulegáo do dzisiaj istotnym zmianom. W latach 2007/08 Ğwiatowa produkcja pszenicy wyniesie okoáo 601 milionów ton. Globalna produkcja zbóĪ w latach 2004/05 wyniosáa 1635 milionów ton, jednoczeĞnie przekraczając zapotrzebowanie konsumpcyjne o 11% w porównaniu z 2003/04 [154]. Stanowi to o 219,6 milionów ton mniej niĪ w latach 1997/98 [145]. W krajach Unii Europejskiej caákowite zbiory ziarna w 2004 roku wyniosáy okoáo 285 milionów ton i byáy rekordowe [154].
Na przestrzeni nastĊpnych 50 lat zaistnieje potrzeba zwiĊkszenia plonowania, aby zapobiec niekontrolowanemu wzrostowi cen lub zwiĊkszaniu powierzchni upraw [93, 133, 147]. Podczas zielonej rewolucji (1960-1980) miaáo miejsce podwojenie plonu ziarna dziĊki zastosowaniu nawadniania, nawoĪenia i wprowadzeniu chemicznych Ğrod- ków ochrony roĞlin [93, 133]. Po zakoĔczeniu zielonej rewolucji (od 1980) Ğredni plon pszenicy np. w Meksyku wynosiá 4 t·ha-1, a pod koniec stulecia osiągnąá 5 t·ha-1 [93, 107]. W związku ze zmianami klimatycznymi wysiáki naukowców skupiają siĊ na ana- lizach plonu w czasie [112, 163], symulowaniu plonowania pszenicy (modelowanie) [6, 14, 120], a takĪe na przestrzennej analizie warunków wzrostu [92]. Techniki empirycz- ne nie zawsze są pomocne dla zobrazowania problemu badawczego. Wad tych nie po- siada natomiast system modelowania [93].
Utrzymujący siĊ w Europie Zachodniej znaczny spadek liczby gospodarstw, szcze- gólnie wĞród tych nieprofesjonalnych (poniĪej 12 ha uprawy pszenicy i mniej niĪ 75% za- trudnionych na staáe pracowników), jest zdecydowanie wiĊkszy niĪ w porównaniu z tymi profesjonalnymi (2,3%). Dla przykáadu caákowite subsydia do francuskich gospodarstw w 2004 roku siĊgnĊáy 9,25 miliarda €, co stanowiáo 15,9% rolniczej wartoĞci produkcyjnej i 73% przychodu netto. Reprezentowaáo to okoáo 40% publicznych dotacji przekazanych dla sektora rolniczego, które osiągnĊáy w efekcie 28,8 miliarda € uwzglĊdniając dodatkowe 44%
dla osáony socjalnej, 6,6% dla szkóá i sfery badawczej oraz 5% kosztów administracyjnych.
Wspomniane subwencje nie są tylko skierowane do rolników, ale takĪe do ich rodzin i caáej spoáecznoĞci wiejskiej, która reprezentuje 25% francuskiej populacji [8].
ĝwiatowe prognozy dla produkcji pszenicy (2004-2013), zgodnie z globalnym modelem symulacyjnym (Global Wheat Policy Simulation Model), przewidują wzrost gospodarczy na nastĊpne 9 lat. ĝwiatowy handel i zapotrzebowanie na pszenicĊ twardą bĊdzie wiĊksze niĪ dla odmian pozostaáych [86]. Nowoczesne technologie, jak inĪynie- ria genetyczna, szybko tworzą nowe odmiany dla wielu roĞlin uprawnych. Aktualnie biotechnologicznie wzbogacone (GMO - Genetically Modified Objects) odmiany kuku- rydzy, soi, baweány i rzepaku są uprawiane na milionach hektarów na caáym Ğwiecie.
Pszenica nie byáa dotychczas w sferze zainteresowaĔ badaczy zajmujących siĊ inĪynie- rią genetyczną, lecz obecnie ulega to znacznej zmianie. W związku z tym káadzie siĊ
duĪe wysiáki na badania związane z wpáywem nowych odmian na stan zdrowia ludzi, ekologiĊ i Īywienie zwierząt [124].
2.2. USZKODZENIA PSZENICY PRZEZ SKRZYPIONKĉ ZBOĩOWĄ Produkcja ĪywnoĞci dla ludzi jest naraĪona na straty spowodowane atakiem agro- fagów, takich jak chwasty, patogeny i owady. RoĞliny moĪna chroniü przed chwastami stosując metody mechaniczne i chemiczne. Ich efektywnoĞü jest wiĊksza w porównaniu ze zwalczaniem patogenów i owadów, których redukcja jest związana gáównie z wykorzystaniem syntetycznych Ğrodków ochrony roĞlin. Aczkolwiek straty plonów nie zmniejszyáy siĊ istotnie przez ponad 40 lat stosowania pestycydów [113]. Skrzy- pionka zboĪowa (Oulema melanopus L., Coleoptera: Chrysomelidae) jest w wielu kra- jach najwaĪniejszym szkodnikiem pszenicy [49, 81]. Zarówno larwy, jak i imagines wyrządzają znaczne szkody, Īerując na liĞciach zbóĪ powodując ograniczenie ich po- wierzchni asymilacyjnej, zmniejszenie masy tysiąca nasion, skrócenie káosów oraz zmniejszenie liczby nasion w káosie (fot. 1).
Fot. 1. Uszkodzenia liĞci przez skrzypionkĊ zboĪową (Janusz Nowacki, Marek Bunalski) Photo 1. Leaves damaged by leaf beetles (Janusz Nowacki, Marek Bunalski)
O. melanopus ma zwykle jedną generacjĊ w roku. W krajach o cháodniejszym kli- macie sporadycznie dwa lata są konieczne dla zakoĔczenia caáego rozwoju. Osobniki dorosáe zimują w Ğciernisku, korze drzew i zaczynają byü aktywne przez okoáo 6 tygo- dni (Īerowanie, kopulacja i skáadanie jaj), gdy temperatura powietrza osiągnie okoáo 10oC. Ma ona zasadnicze znaczenie dla jaj i pierwszego stadium larwalnego O. melano- pus, nie pozostając bez znaczenia dla imagines (temperatura poniĪej 10oC istotnie ha- muje przeĪywalnoĞü chrząszczy). Larwy we wszystkich stadiach pokrywają swoje ciaáa
ekskrementami, co ma zapewniü ochronĊ przez wrogami (kaáowe osáony powodują, Īe wyglądem przypominają Ğlimaki). Osobniki dorosáe Īerują na roĞlinach zboĪowych i chwastach. Skrzypionka zboĪowa jest szeroko rozpowszechniona w Polsce (próg szkodliwoĞci dla zbóĪ ozimych od 1 do 1,5 larwy na ĨdĨbáo), ale takĪe w Rumunii, gdzie okoáo 200 tysiĊcy hektarów jest naraĪonych na atak tego szkodnika [134].
W Transylwanii Īerowanie larw i dorosáych powoduje od 14% do 62% strat w plonie [95]. Wybiórcze badania nad wystĊpowaniem O. melanopus w Serbii w 2003 r. dowio- dáy liczniejszą populacjĊ tych szkodników niĪ oczekiwano [158]. Badania prowadzone na terytorium Krasnodaru w Rosji potwierdziáy, Īe najbardziej niebezpieczny jest wcze- sny atak skrzypionki, a straty zaleĪą równieĪ od kondycji roĞlin. Aczkolwiek udowod- niono, Īe wzmoĪone nawoĪenie mineralne moĪe rekompensowaü straty masy wegeta- tywnej (od 20% do 30% uszkodzenia liĞcia flagowego) [157]. Skrzypionki są równieĪ szeroko rozpowszechnione w Republice Czeskiej, gdzie takĪe po raz pierwszy zostaá odnotowany gatunek O. rufocyanea [16]. W Buágarii, w wyniku znaczących strat plonu, rozpoczĊto intensywne badania nad uzyskaniem pszenicy genetycznie odpornej na skrzypionki [87]. Badania prowadzone przez Hausammanna [65] w Szwajcarii wykaza- áy, Īe skrzypionka zboĪowa jest powszechnym szkodnikiem. W latach 1980-1986 w Holandii 95% pól byáo zaatakowane przez skrzypionkĊ zboĪową [37]. W Polsce straty plonu ziarna spowodowane Īerowaniem skrzypionek szacuje siĊ na poziomie 30-60% [175, 176, 177]. Doniesienia o stratach w plonie pszenicy spowodowanych Īerowaniem skrzypionek pochodzą teĪ z WĊgier [117]. Pierwszy raport opisujący skrzypionkĊ zboĪową w Ameryce Póánocnej pochodzi z 1962 roku. Obecnie owady te wystĊpują od Ontario do Alabamy i od Utah do Kolumbii Brytyjskiej. W związku z ustabilizowaniem siĊ populacji O. melanopus w Ameryce Póánocnej zagroĪone zosta- áy takĪe tereny Kanady bezpoĞrednio graniczące z USA, gdzie obsiewa siĊ zboĪami 10 milionów hektarów rocznie [75, 115].
Oprócz skrzypionek gospodarczo waĪnym szkodnikiem pszenicy jest Sitobion avenae F. (Homoptera: Aphididae), jedna z najbardziej szkodliwych mszyc w zachod- niej Europie. Najbardziej atakowana jest pszenica, lecz takĪe jĊczmieĔ i owies [123].
W ostatnich latach w niektórych regionach globu odnotowano szczególnie wysokie straty plonu pszenicy oraz záą jakoĞü ziarna spowodowane Īerowaniem Ĩdzieblarza pszenicznego (Cephus cinctus Norton) [73]. ĩerowanie wciornastków, mimo iĪ nie po- woduje ograniczenia zdolnoĞci kieákowania pszenicy, ma istotny wpáyw na zawartoĞü biaáek w ziarnie [82].
2.3. NIEPOĩĄDANE EFEKTY CHEMICZNEJ METODY OCHRONY ROĝLIN
RoĞliny są czĊsto uszkadzane przez kompleks agrofagów (patogeny, owady, nicie- nie, chwasty), które wspóázawodniczą o pokarm [88]. Produkcja rolnicza w związku z powiĊkszającą siĊ populacją ludzi i rosnącą produkcją bydáa powinna wzrosnąü w niedalekiej przyszáoĞci. Ochrona roĞlin stanowi klucz do rozwiązania problemów strat plonu spowodowanego przez agrofagi. W skali Ğwiata wĞród roĞlin uprawnych straty wahają siĊ od 50% do 80% (w 2006 r. dla pszenicy wyniosáy od 25% do 30%
[113]). Biorąc pod uwagĊ wszystkie agrofagi, chwasty wywierają najwiĊkszy negatyw- ny wpáyw na roĞliny (34%), a nastĊpnie patogeny (18%) i owady (16%). Z drugiej stro- ny ochrona roĞlin przed chwastami jest najbardziej skuteczna i wynosi 68% w porów-
naniu z ochroną przed szkodnikami (39%) i patogenami (32%) [114]. W skali Ğwiata okoáo 35,8 miliona hektarów gáównych upraw jest szczególnie naraĪona na zachwasz- czenie, co powoduje istotne straty plonu (do 16,5%). W efekcie dla przykáadu w 1996 r. straty te wyniosáy 16,5 miliona ton ziarna [184].
Ochrona roĞlin przed agrofagami na Ğwiecie jest ciągle zdominowana przez pesty- cydy, jednakĪe w tej kwestii spodziewane są waĪne zmiany. Są one najczĊĞciej stoso- wane, gdyĪ po pierwsze są efektywne i jako nowoczesne Ğrodki regulują rozwój szero- kiej gamy organizmów z jednoczesnym niewielkim wpáywem na plon roĞlin. Po drugie, pozwalają rolnikom na wybór, jak i kiedy je stosowaü [35]. Jednak ciągáe uĪycie pesty- cydów w ochronie roĞlin przez wiele lat spowodowaáo wzrost odpornoĞci szkodników.
Rosnące wykorzystywanie szkodliwych pestycydów wraz z obawą spoáeczeĔstwa o ich wpáyw na zdrowie powodują zwiĊkszony ‘nacisk’ na rolników, co ma na celu redukcjĊ iloĞci syntetycznych Ğrodków ochrony roĞlin [99]. ĝrodki chemiczne nie tylko czĊsto zawodzą, ale stwarzają nowe zagroĪenie, a mianowicie uaktywniają dotąd nieznane ze swej szkodliwoĞci organizmy. Agrofagi, niemające kilka lat temu Īadnego znaczenia gospodarczego, dzisiaj bywają duĪym problemem [97]. Niektóre organizmy niepoĪąda- ne są redukowane, lecz inne pozostają odporne na pestycydy i w ten sposób mogą staü siĊ nowym groĨnym gatunkiem [183]. Stosowanie wiĊc tylko i wyáącznie pestycydów jest jednak z wielu powodów krótkowzroczne. Metoda ta, obok wysokiej skutecznoĞci, ma jednak powaĪne wady, np. drogą selekcji tworzą siĊ odporne biotypy, które póĨniej trudno zwalczyü [21], Ğrodki chemiczne zmieniają metabolizm roĞlin uprawnych [21], zanieczyszczają Ğrodowisko [188] i nierzadko niszczą wrogów naturalnych. Zjawisko uzyskiwania odpornoĞci szkodników na stosowane Ğrodki chemiczne jest obserwowane na caáym Ğwiecie, a szczególnie w tych krajach, gdzie zuĪywa siĊ ich bardzo duĪo.
Dzieje siĊ tak wskutek jednostronnego ich stosowania kilka lat pod rząd w tym samym miejscu [105]. Dotyczy to miĊdzy innymi endotoksyn Bt (Bacillus thuringiensis) [137]
czy pyretroidów [138], na które uodporniáo siĊ wiele gatunków owadów. Na Ğwiecie zaobserwowano odpornoĞü szkodników na pestycydy z wszystkich tzw. konwencjonal- nych grup insektycydów [17, 143]. Stosowanie Bt czy disulfotonu w pewnych rejonach USA przeciwko skrzypionkom okazaáo siĊ maáo efektywne [24]. Ponadto chemiczne metody zwalczania agrofagów prowadzą równieĪ do zanieczyszczania wód powierzch- niowych, wód gruntowych oraz powietrza [74].
Negatywne nastawienie opinii publicznej przeciwko masowemu stosowaniu pesty- cydów w rolnictwie spowodowaáo wzrost nacisku na rozwój metod alternatywnych, które są przyjazne Ğrodowisku. Spowodowaáo to zwiĊkszenie zainteresowania naukow- ców biologią i ekologią agrofagów po to, aby zlikwidowaü „technologiczną kulĊ”, jaką coraz czĊĞciej stają siĊ pestycydy dla Ğrodowiska. Biologiczne metody zwalczania mogą stanowiü dáugoterminową alternatywĊ dla rozwoju agrofagów [142]. Poszukiwanie alternatywnego w stosunku do metody chemicznej sposobu walki z agrofagami jest jednym z priorytetów Unii Europejskiej zmierzającym do zmniejszenia uĪycia pestycy- dów, aby zapewniü bardziej przyjazny Ğrodowisku sposób pozyskiwania plonów. Nowe strategie walki z agrofagami są opracowywane w laboratoriach zajmujących siĊ rela- cjami owad-roĞlina. W przypadku owadów moĪna zastosowaü puáapki z atraktantami lub repelentami w celu ograniczenia ich populacji. Mogą one polegaü na wykorzystaniu roĞlin, które zawierają wytworzone na drodze ewolucji związki ingerujące w rozwój owadów. ZwiĊkszenie atrakcyjnoĞci niektórych chwastów wydzielających lotne związki moĪe prowadziü do rozrostu populacji wyspecjalizowanych roĞlinoĪerców, a w konse- kwencji do redukcji zachwaszczenia.
2.4. SYSTEM OBRONNY ROĝLIN
RoĞliny nie są pasywnymi ofiarami ataku roĞlinoĪerców, gdyĪ posiadają specyficzny arsenaá chemiczny dla swojej obrony [136, 171]. Nie mając moĪliwoĞci „ucieczki”, wy- ksztaáciáy szereg mechanizmów obronnych, wĞród których moĪna wymieniü toksyny, ekdysteroidy czy lotne związki. Wszystkie gatunki roĞlin są podatne na uszkodzenia przez liczne organizmy, a takĪe są naraĪone na uszkodzenia mechaniczne. RoĞliny wysyáają zatem sygnaáy chemiczne do wrogów naturalnych [26, 27, 42], jak i do roĞlinoĪerców [5, 80]. Zrozumienie tych sygnaáów moĪe spowodowaü wzrost efektywnoĞci naturalnych wrogów [41, 83, 139, 159]. Z kolei inne lotne związki mogą mieü repelentny (odstraszają- cy) wpáyw na roĞlinoĪerców [27, 42]. Analizy biochemiczne wykazaáy, Īe w wielu przy- padkach zwiĊkszona produkcja takich związków, jak ocimen, farnezen czy salicylan me- tylu powoduje przywabianie owadów [4]. Niestety, pomimo badaĔ przeprowadzonych nad ich funkcją w naturalnym systemie obronnym roĞlin, ich mechanizm sygnalizacyjny nie jest caákowicie poznany [58, 156]. Komponenty C6 są bezpoĞrednimi induktorami VOC, co potwierdzają badania prowadzone przez Farag i Paré [58].
2.5. ROZWÓJ METOD ZBIERANIA VOC I TECHNIK CHROMATOGRAFICZNYCH
Obecnie, dziĊki nowoczesnym metodom separacyjnym, a zwáaszcza chromatogra- ficznym moĪna odszyfrowaü czĊĞü informacji chemicznej wysyáanej przez roĞliny do Ğrodowiska [126]. Znaczący postĊp w identyfikacji ĞcieĪki wytwarzania VOC pozwala na poznanie ich molekularnej natury. Wzrost zainteresowania biochemią lotnych związków spowodowaá rozwój technik odpowiedzialnych za zbieranie i analizowanie tych komponentów [103]. W ostatniej dekadzie odnotowano zdecydowany wzrost efek- tywnoĞci analiz biochemicznych przez wykorzystanie technik chromatografii gazowej.
Metody te są zdecydowanie bardziej efektywne niĪ tradycyjne wykorzystujące proces destylacji. Lotne związki mogą byü zbierane z caáych roĞlin, ale takĪe z ich fragmentów, np. z czĊĞci zielonych lub organów generatywnych [161]. Szczególną wagĊ przywiązuje siĊ do moĪliwoĞci zbierania lotnych związków z roĞlin bez koniecznoĞci ich uszkadza- nia. Generalnie wykorzystuje siĊ worki foliowe (np. Nalophan), szczelnie otaczające roĞlinĊ, szklane tuby, metalowe poáączenia i teflon. Posiadają one wspólną cechĊ, gdyĪ nie wydzielają lotnych związków [103]. Szczególnym osiągniĊciem byáo wprowadzenie do praktyki laboratoryjnej zminiaturyzowanej odmiany ekstrakcji (Solid Phase Microextraction – SPME), która jest stosunkowo prostą metodą, dającą moĪliwoĞü zbierania maáych iloĞci lotnych związków. SPME bazuje na zjawisku sorpcji lotnych związków przez inercyjne wáókno pokryte róĪnymi typami adsorbentów. Wáókno jest poáączone z igáą/táokiem, które umieszcza siĊ w szklanej tubie okalającej roĞlinĊ. Po odpowiednim czasie zbierania VOC wáókno wprowadza siĊ bezpoĞrednio do dozowni- ka. Zaleta tej metody to wielokrotna moĪliwoĞü uĪycia wáókna SPME (okoáo 100 razy) oraz fakt, Īe nie potrzeba wykorzystywaü rozpuszczalników, które mogáyby spowodo- waü zanieczyszczenia. Z drugiej jednak strony po umieszczeniu caáej próby w chroma- tografie nie ma moĪliwoĞci powtórzenia analizy [161]. Adsorbent, przez który podczas zbierania lotnych związków przepáywa powietrze, jest zwykle umieszczany w wąskiej, szklanej lub metalowej tubie. Zebrane związki są wymywane do odpowiednich szkla- nych fiolek przy uĪyciu rozpuszczalnika. Dla celów analiz iloĞciowych dodaje siĊ wzo-
rzec. NajczĊĞciej stosowanymi adsorbentami są Tenax, Super-Q czy Poropak. Szcze- gólną zaletą Super-Q jest moĪliwoĞü jego wielokrotnego uĪycia [161].
Istnieje kilka metod zbierania lotnych związków. Jedną z nich jest system „za- mkniĊtej pĊtli” [162]. Zbudowany po raz pierwszy przez Bolanda i innych [22], a na- stĊpnie rozwiniĊty przez Donatha i Bolanda [51] skáada siĊ z 1 lub 3 eksykatorów poáą- czonych z pompami. RoĞliny, lub ich czĊĞci są umieszczane we wnĊtrzu szklanych komór, przez które przepáywa ciągáy strumieĔ powietrza. System „zamkniĊtej pĊtli”
chroni przed zanieczyszczeniami i nadaje siĊ doskonale do zbierania lotnych związków z roĞlin maáo aromatycznych [30]. Inną metodą zbierania VOC jest system, który okre- Ğla siĊ jako „ssąco-táoczący”. RóĪni siĊ od poprzedniego tym, Īe pobiera powietrze z zewnątrz. Powietrze uprzednio oczyszczone za pomocą filtra „obmywa” roĞlinĊ i transportuje uwalniane lotne związki bezpoĞrednio do adsorbenta [25]. System ten doskonale nadaje siĊ dla roĞlin, które uwalniają duĪe iloĞci związków. ZamkniĊcie ro- Ğlin w szklanych tubach lub wolnych od lotnych związków workach redukuje ryzyko zanieczyszczeĔ [50]. Przepáyw powietrza musi byü precyzyjnie nastawiony (przyrząd do pomiaru przepáywu powietrza), gdyĪ zbyt duĪy moĪe spowodowaü utratĊ adsorben- ta, a zbyt maáy bĊdzie niewystarczający do zbierania VOC [53]. Podobnie zasysanie powietrza jest regulowane przez przyrządy. W niektórych przypadkach istnieje ko- niecznoĞü zbierania VOC z czĊĞci nieuszkodzonych roĞliny, aby zbadaü reakcjĊ zdro- wych liĞci na uszkodzenia spowodowane Īerowaniem owadów na tej samej roĞlinie [148]. System pozwala np. na odizolowanie nieuszkodzonej górnej czĊĞci roĞliny od dolnej [66, 67, 96, 148]. VOC są analizowane przy uĪyciu chromatografów gazowych z wykorzystaniem kolumn o róĪnym stopniu polarnoĞci (DB-1, DB-5, CPSil-5, Carbo- wax-20M, DB-Wax, HP-20M). Identyfikacja lotnych związków odbywa siĊ za pomocą odpowiednich bibliotek (Wiley i NIST MS, indeksy Kovatsa). Poleganie tylko na cza- sach retencji bywa jednak zawodne, dlatego zasadnym jest analizowanie odpowiednie- go materiaáu odniesienia [162].
2.6. LOTNE ZWIĄZKI ORGANICZNE (VOC)
Lotne związki organiczne są to wtórne metabolity roĞlin, które mogą peániü rolĊ atraktantów, repelentów, bądĨ komunikatorów chemicznych. Badania nad VOC uwal- nianymi na drodze reakcji na Īerowanie owadów są stosunkowo nowe. Po raz pierwszy identyfikacji lotnych związków dokonali badacze z Holandii i USA pod koniec ubiegáe- go wieku [47, 170]. Dla roĞlin ukorzenionych jedynie wymiana informacji chemicznej dostarcza sposobu komunikowania siĊ z roĞlinami sąsiednimi tego samego gatunku, a takĪe z innymi Īywymi organizmami [57]. Zrozumienie relacji miĊdzy strukturą a funkcją „wĊchowego” systemu drapieĪników moĪe dostarczyü informacji dla techno- logii bazującej na wykorzystaniu VOC, aby wzmóc efektywnoĞü biologicznej metody ochrony roĞlin w rolnictwie zrównowaĪonym [186]. W związku z tym alternatywą dla stosowania syntetycznych insektycydów jest rozwój i zrozumienie funkcji VOC wyko- rzystywanych przez roĞlinoĪerców w celu lokalizacji gospodarza [98]. Taktyka bazująca na lotnych związkach ma wystarczający potencjaá, aby przerwaü cykl rozwojowy owa- dów bez niebezpieczeĔstwa skaĪania Ğrodowiska [1]. RoĞlinny mechanizm obronny zawiera zarówno chemiczne, jak i fizyczne czynniki wpáywające na zachowanie siĊ roĞlinoĪercy [43, 44] lub rozwój patogenów [58] po to, aby stawiaü opór uszkodzeniom i stresom [19]. Zapach produkowany przez roĞliny podczas ataku roĞlinoĪercy jest czĊ-
sto wykorzystywany przez parazytoidy do lokalizacji gospodarza. Z reguáy uszkadzanie roĞlin ma swoje odzwierciedlenie w zwiĊkszonym wydzielaniu GLV, podczas gdy inne lotne związki (terpeny, seskwiterpeny) wydzielane przez roĞliny są specyficzne jako reakcja na okreĞlony gatunek roĞlinoĪercy, a nawet sposób Īerowania [71]. Oznacza to swoistą trójpoziomową relacjĊ, która wytworzyáa siĊ w wyniku koewolucyjnego wspóá- Īycia gospodarza, agrofaga i wroga naturalnego. Mechanizmy obronne są skierowane przeciwko jednemu roĞlinoĪercy lub ich grupie. Strategia ta oferuje nową, przyjazną Ğrodowisku metodĊ ochrony roĞlin [40]. Odpowiednie sygnaáy chemiczne mogáyby byü emitowane wĞród roĞlin nieposiadających tej zdolnoĞci, zapewniając odpowiednią licz- bĊ wrogów naturalnych oraz odstraszając innych potencjalnych roĞlinoĪerców. Dalsze badania nad relacją miĊdzy owadami a roĞlinami oraz wrogami naturalnymi powinny dostarczyü informacji na temat praktycznej aplikacji poĞrednich mechanizmów obron- nych [40]. Warto wspomnieü, Īe takĪe uszkodzenia mechaniczne wpáywają na uwalnia- nie VOC, czego przykáadem moĪe byü Minthostachys mollis (aromatyczna roĞlina wy- korzystywana do celów medycznych); sztucznie uszkadzana wydziela intensywnie niektóre monoterpeny (pulegon i menton) [13].
Sterowanie emisją VOC w uprawie polowej moĪe byü wartoĞciową strategią (przywabianie naturalnych wrogów roĞlinoĪerców), prowadzącą do minimalizowania problemu walki ze szkodnikami [40]. GLV skáadają siĊ gáównie ze zdegradowanych produktów C18 kwasów táuszczowych, które są transformowane do C12 i C6. W zaleĪno- Ğci od substratu C18 tworzą siĊ w efekcie (Z)-3-heksenal lub heksanal [64]. Dalsze procesy acetylacji i izomeryzacji prowadzą do powstania komponentów C6, jak (Z)-3-heksenol, octan (Z)-3-hexenylu i ich odpowiednich izomerów (E) [64].
Szacuje siĊ, Īe przynajmniej 12 rodzin spoĞród roĞlin produkuje VOC w rezultacie Īerowania owadów [46, 108, 155]. Gáównymi VOC uwalnianymi przez uszkadzane roĞliny są monoterpeny i seskwiterpeny. Przedstawiciele terpenów powodują charakte- rystyczne zapachy olejków roĞlinnych, kwiatów czy owoców, ale równieĪ są domi- nującymi skáadnikami wielu lotnych mieszanek przywabiających wrogów naturalnych roĞlinoĪerców [118]. Wiele monoterpenów i seskwiterpenów jest uwalnianych nie po zwykáym uszkodzeniu mechanicznym, lecz w odpowiedzi na Īerowanie owadów [166].
RoĞliny są zdolne do syntetyzowania ekdysteroidów (np. hormonów wylinkowych), które to z caáą pewnoĞcią nie są potrzebne do wzrostu czy rozwoju. Ekdysteroidy ingerują w rozwój owada powodując np. przyspieszone procesy linienia, co moĪe powodowaü skró- cenie czasu rozwoju poszczególnych stadiów larwalnych. Imagines stają siĊ niezdolne do Īycia, rozrodu, a nierzadko w ogóle nie nastĊpuje rozwój osobników dorosáych. RoĞlinoĪer- cy nie pozostają bierni w dziaáaniu i wytwarzają mechanizmy pozwalające na dezaktywacjĊ toksyn produkowanych przez roĞliny. Obserwuje siĊ, Īe enzymy zawarte w Ğlinie owadów przerywają mechanizm obronny roĞlin.
Wiadomo, Īe wrogowie naturalni szkodników są przywabiani poprzez lotne związki do roĞlin zaatakowanych przez owady [119, 136, 152, 153, 170]. Te sygnaáy pozwalają naturalnym wrogom na lokalizacjĊ ofiary i w ten sposób pomagają roĞlinom obniĪyü populacjĊ roĞlinoĪercy [72]. Do ich wydzielania dochodzi podczas Īerowania [168] lub skáadania jaj przez roĞlinoĪercĊ [68]. UwzglĊdniając ich poĪyteczną rolĊ dla roĞlin i miĊsoĪerców, okreĞla siĊ je jako sygnaáy indukowane Īerowaniem (SIĩ) [173].
SIĩ wielu badaczy rozpatruje jako poĞredni mechanizm obronny, który kolokwialnie okreĞla siĊ jako „páacz o pomoc”. Fizjologiczne zmiany w roĞlinach, bĊdące nastĊp- stwem uszkodzeĔ lub stresu, okreĞla siĊ jako indukowany mechanizm obronny (IMO) [100]. Badania wskazują, Īe IMO efektywnie wzmacnia bezpoĞredni wpáyw na roĞlino-
ĪercĊ [2, 11] lub poĞrednio poprzez wzmoĪenie intensywnoĞci ataku parazytoidów [159]. Chemiczne mechanizmy obronne skierowane przeciwko roĞlinoĪercom definiuje siĊ jako bezpoĞrednie oddziaáywanie w przypadku, gdy są one powiązane z produkcją toksyn oraz jako dziaáanie poĞrednie, gdy wzmagają efektywnoĞü wrogów naturalnych [46]. (Z)-jasmon jest dobrze znanym komponentem lotnych związków, którego uwal- nianie jest związane i indukowane w wyniku uszkodzeĔ spowodowanych Īerowaniem owadów [180]. Związek ten okazaá siĊ byü elektrofizjologicznie aktywny jako repelent dla pewnych mszyc Īerujących na saáacie. Jest on takĪe znanym komponentem peánią- cym zasadniczą rolĊ w reakcji obronnej roĞlin przeciwko szkodnikom. Udowodniono, Īe pszenica spryskiwana tym związkiem byáa mniej podatna na atak mszycy zboĪowej [23]. (Z)-jasmon wystĊpuje jako komponent lotnych związków wydzielanych przez kwiaty, ale takĪe moĪe byü produkowany przez uszkodzone tkanki roĞlinne [19].
Ponadto jest on takĪe sygnaáem wykorzystywanym przez inne sąsiednie nieuszkodzone roĞliny, pozwalając w ten sposób na przygotowanie obrony [29, 128]. Ponadto udowod- niono, Īe fasola spryskana (Z)-jasmonem bardziej przywabiaáa niektóre parazytoidy [19]. Dodany do strumienia przepáywu powietrza moĪe indukowaü u roĞlin nieuszko- dzonych produkcjĊ monoterpenu, (E)-ȕ-ocimenu, który wpáywa na system obronny roĞliny poprzez stymulowanie aktywnoĞci parazytoidów. Kwas jaĞminowy powoduje znaczący bezpoĞredni wzrost systemu obronnego w wyniku produkcji toksyn, antytra- wiennych protein i antyĪywieniowych enzymów [12].
RoĞliny atakowane przez roĞlinoĪercĊ uwalniają wiele lotnych metabolitów [60]
nie tylko z miejsc uszkodzonych, ale takĪe z innych czĊĞci, które nie byáy atakowane przez roĞlinoĪercĊ. W wielu przypadkach lotne związki emitowane z liĞci jako reakcja nastĊpcza na uszkodzenia pozwalają parazytoidom czy owadom miĊsoĪernym na roz- róĪnienie roĞlin uszkodzonych od zdrowych [3]. Czas miĊdzy uszkodzeniem spowodo- wanym Īerowaniem owadów a uwalnianiem VOC jest róĪny w zaleĪnoĞci od specyfiki biosyntezy związku. Niektóre spoĞród nich są uwalniane natychmiast po uszkodzeniu [64], a inne dopiero po kilku dniach [169]. Ponadto VOC są wydzielane jeszcze przez jakiĞ czas po zakoĔczeniu Īerowania owadów. Uwalnianie lotnych związków moĪe byü takĪe osiągniĊte przez wspólne wysiewanie roĞlin intensywnie reagujących na atak roĞlinoĪercy i roĞlin mniej czuáych, jednak zarazem takich, w których indukcja spowo- duje oczekiwaną reakcjĊ obronną [129]. Ponadto ekskrementy larw i owadów dorosáych oraz feromony produkowane przez roĞlinoĪercĊ mogą byü wykorzystywane przez owa- dy miĊsoĪerne lub parazytoidy do lokalizacji ofiary. RoĞliny są atakowane przez wiĊcej niĪ jednego roĞlinoĪercĊ, co stymuluje indukcjĊ ich róĪnych systemów obronnych.
Z drugiej strony atak roĞlinoĪercy moĪe pozostaü bez odpowiedzi ze strony roĞliny.
ĩerowanie Bemisia tabaci Gennadius (Homoptera: Aleyrodidae) nie indukuje poĞred- niego mechanizmu obronnego, natomiast uszkodzenia powodowane przez Spodoptera exigua HĦbner (Lepidoptera: Noctuidae) powodują silną reakcjĊ roĞliny [146]. LiĞcie Nicotiana attenuata Torr. ex S. Wats emitują wiĊksze iloĞci (Z)-3-heksen-1-olu i linalo- lu w nastĊpstwie ataku roĞlinoĪerców. W szczególnoĞci linalol powoduje obniĪenie páodnoĞci u owadów, co w konsekwencji moĪe prowadziü do 90% redukcji populacji owadów na roĞlinie [83]. Dla przykáadu (Z)-3-heksenyl emitowany przez uszkodzone roĞliny tytoniu jest silnym repelentem dla Heliothis virescens Fabricius (Lepidoptera:
Noctuidae), których samice unikają skáadania jaj na roĞlinach zaatakowanych [42].
Z drugiej strony niektóre GLV z kapusty przywabiają Trichogramma chilonis Ishii (Hymenoptera: Trichogrammatidae), Cotesia plutellae Kurdjumov (Hymenoptera: Bra- conidae) i Chrysoperla carnea Stephens (Neuroptera: Chrysopidae) do gąsienic Plutella
xylostella L. (Lepidoptera: Plutellidae) [140]. Wytwarzanie lotnych związków jest związane z elementarnym metabolizmem, ale ich transport, magazynowanie i emisja nie są do koĔca poznane [127]. Ponadto roĞliny takĪe rozróĪniają Īerowanie owadów od uszkodzeĔ mechanicznych, które to zwykle nie indukują mechanizmu obronnego [118].
Interesującym jest fakt, Īe Īerowanie larw prowadzi do wzmoĪonego wydzielania lot- nych związków, natomiast skáadanie jaj przez samice moĪe, chociaĪ nie musi induko- waü emisji. Dla przykáadu skáadanie jaj przez Xanthogaleruca luteola Müll. (Coleopte- ra: Chrysomelidae) indukuje uwalnianie lotnych związków, które przywabiają Oomyzus gallerucae [102]. Związki takie, jak (Z)-3-heksenol czy linalol mogą powodowaü zwiĊkszone niszczenie jaj szkodników poprzez przywabianie odpowiednich parazyto- idów. W niektórych przypadkach redukuje to znacznie potencjaá roĞlinoĪercy (nawet do 90%) [83]. W roĞlinach pomidora (E)-2-heksenal zapoczątkowuje lokalną i systemiczną emisjĊ VOC [58]. U kukurydzy taką funkcjĊ peánią (Z)-3-heksenal, (Z)-3-heksen-1-ol i octan (Z)-3-heksenylu, które indukują emisjĊ seskwiterpenów [57]. ZauwaĪono, Īe octan (Z)-3-heksenylu jest efektywny w przywabianiu wrogów naturalnych roĞlinoĪer- ców, parazytoidów, takich jak Microplitis croceips Cresson [179], Aphidius ervi Hali- day [52], Cotesia flavipes Cameron [109] (Hymenoptera: Braconidae) oraz drapieĪców Deraeocoris brevis Uhler (Hemiptera: Miridae), Orius tristicolor White (Heteroptera:
Anthocoridae) [77]. Mszyce mogą byü szczególnie wraĪliwe na lotne związki wydzie- lane z kukurydzy, gdyĪ jednym z gáównych komponentów emitowanych przez te roĞli- ny jest (E)-ȕ-farnezen, bĊdący jednoczeĞnie feromonem alarmu dla tych owadów [15].
Okazuje siĊ, Īe nie tylko silne uszkodzenie tkanki liĞcia powoduje wzmoĪoną emisjĊ lotnych związków, ale takĪe nakáucia mogą wywoáaü podobną reakcjĊ roĞliny. Wynika stąd, Īe wysysanie soków z roĞlin, np. przez mszyce jest równieĪ wystarczającym po- wodem do indukcji reakcji obronnej roĞliny. Ponadto taki sposób Īerowania, jak drąĪe- nie kanaáów w ĨdĨble, np. przez Ĩdzieblarza pszenicznego takĪe wyzwala mechanizm obronny [167]. Reinecke i inni [141] zidentyfikowali 16 typowych VOC w badaniach elektrofizjologicznych prowadzonych na samcach chrabąszcza majowego. Interesujący jest fakt, Īe alkohole GLV przywabiaáy owady, podczas gdy aldehydy i octany tych związków nie wpáywaáy na ich zachowanie.
Hipotezy badawcze. ZaáoĪono, Īe:
1. IloĞü lotnych związków produkowanych przez roĞliny pszenicy zmienia siĊ wskutek Īerowania larw i chrząszczy skrzypionki zboĪowej.
2. Emitowanie lotnych związków jest zróĪnicowane w zaleĪnoĞci od: stadiów larwal- nych i chrząszczy skrzypionki zboĪowej Īerujących na roĞlinie, czasu który upáynąá od uszkodzenia oraz od dáugoĞci stresu utrzymującego siĊ od momentu uszkodzenia.
3. Reakcja chrząszczy na wydzielanie VOC jest uzaleĪniona od stĊĪenia związku; wy- dzielane przez roĞliny zdrowe mają charakter atraktantów, natomiast zwielokrotnio- ne iloĞci VOC emitowane przez roĞliny uszkodzone dziaáają repelentnie.
Prace doĞwiadczalne prowadzono w latach 2002-2006 w nastĊpujących placów- kach naukowych:
1. Instytut National de la Recherche Agronomique Paris-Grignon (Francja), 2. Montana State University, Department of Entomology (USA),
3. Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy w Bydgoszczy, Katedra Entomologii Sto- sowanej.
3.1. LABORATORYJNA UPRAWA ROĝLIN
Przedmiotem badaĔ byáa ozima pszenica zwyczajna odmiany Tonacja (Triticum aestivum L. emend. Fiori et Paol.). Ziarna wysiewano pojedynczo do doniczek, które umieszczano w szklarni. RoĞliny utrzymywano w temperaturze 22 ± 2°C w ciągu dnia (D) i 18 ± 2°C w ciągu nocy (N) przy dáugoĞci oĞwietlenia 16D : 8N. Wykorzystano podáoĪe przygotowane bezpoĞrednio do siewu (Canadian sphagnum peat moss, perlite, vermiculite, and Dolmitic lime – Sun Gro Horticulture, Inc., Bellevue, Washington, USA). RoĞliny podlewano cztery razy w tygodniu oraz nawoĪono zgodnie z zalecenia- mi (Peters Profesional® 20-10-20 General Purpose Fertilizer) w iloĞci 100 ppm roztwo- ru nawozowego dwa razy w tygodniu jako czĊĞü regularnego nawadniania. NawoĪenie rozpoczĊto, gdy roĞliny osiągnĊáy fazĊ trzech liĞci.
3.2. HODOWLA OWADÓW
Przedmiotem badaĔ byáa skrzypionka zboĪowa (Oulema melanopus L., Coleoptera:
Chrysomelidae). HodowlĊ prowadzono w warunkach laboratoryjnych w temperaturze i przy dáugoĞci dnia takiej jak dla laboratoryjnej uprawy roĞlin przez caáy czas trwania eksperymentów. Celem byáo dostarczenie owadów do doĞwiadczeĔ. Imagines pozyska- no wczesną wiosną oraz na przeáomie maja i czerwca z pól produkcyjnych. Do hodowli wykorzystano páaskie pojemniki plastykowe wyáoĪone lekko zwilĪoną ligniną i uĪywa- ne do przechowywania potraw w lodówce (20 x 12 x 5 cm). Pojemniki wraz z owadami zostaáy umieszczone w laboratorium w miejscu dobrze oĞwietlonym, lecz osáoniĊtym od bezpoĞredniego nasáonecznienia. Owadom podawano ĞwieĪe liĞcie zbóĪ, które dostar- czano kaĪdego dnia. Codziennie zmieniano teĪ ligninĊ, aby zapobiec rozwojowi grzy- bów pleĞniowych. Dorosáe larwy po uwolnieniu siĊ z osáonki kaáowej przepoczwarczaáy siĊ na ligninie, a caáy okres rozwoju trwaá okoáo trzy tygodnie. Owady pozyskane do hodowli z naturalnych warunków siedliskowych w początkowej fazie byáy identyfikowa- ne za pomocą klucza do oznaczania gatunków z rodziny stonkowatych [178].
3.3.ĩEROWANIE OWADÓW
Badania prowadzono w celu okreĞlenia iloĞciowego i jakoĞciowego skáadu lotnych związków, wydzielanych przez roĞliny pszenicy uszkodzone Īerowaniem trzech nastĊ- pujących po sobie stadiów larwalnych (L1, L2, L3) oraz osobników dorosáych. Larwy nakáadano na roĞliny nastĊpnego dnia po linieniu, a dorosáe w kolejnym dniu po prze- poczwarczeniu. Zastosowano dwa modele czasu Īerowania i przebywania owadów na
roĞlinie. Pierwszy to 24-godzinny okres Īerowania, bezpoĞrednio poprzedzający zbiera- nie lotnych związków (model 1). Na gáówne ĨdĨbáo nakáadano po dwie larwy poszcze- gólnych stadiów larwalnych lub jedną parĊ osobników dorosáych rozróĪnianą na pod- stawie stadium „in copula”.
Drugi model Īerowania polegaá na ciągáym przebywaniu na pszenicy poszczegól- nych stadiów larwalnych i dorosáych. Zdejmowano je tylko na czas zbierania VOC (model 2), aby uniknąü zbierania sygnaáów chemicznych wydzielanych przez owady.
3.4. ZBIERANIE VOC
Pozyskiwanie lotnych związków dla pierwszego sposobu Īerowania (model 1; 24 h) obejmowaáo trzy zbierania VOC przez jedną godzinĊ w ciągu jednego dnia po 24 go- dzinach Īerowania owadów: T1: 9.00-10.00, T2: 12.00-13.00, T3: 15.00-16.00. Dla drugiego sposobu Īerowania (model 2; 3-dniowy) zbieranie wykonywano trzy razy przez jedną godzinĊ w ciągu trzech kolejno nastĊpujących po sobie dni: T1, T2, T3:
12.00-13.00.
Do pozyskiwania VOC wykorzystano:
a) aparaturĊ zakupioną w poszczególnych podzespoáach i záoĪoną w caáoĞü (Fisher Scientific Bioblock, VWR Supplier Partnership for Customer Solutions, ETS Charles frères, Inc. Alltech Associates),
b) nowoczesną aparaturĊ (Analytical Research Systems – ARS, Inc. Gainesville, Flori- da, USA) zaprojektowaną specjalnie w celu badawczym, tzw. Volatile Collection System (VCS).
ARS skáadaá siĊ z piĊciu szklanych tub (Ø 40 mm x 800 mm dáugoĞci) otwartych na jednym koĔcu, aby umieĞciü w nich roĞliny. Na kaĪdą tubĊ zakáadano teflonowe rĊkawy szczelnie owiniĊte dookoáa gáównego ĨdĨbáa, aby uniknąü zasysania VOC do tuby spoza systemu. Drugi koniec kaĪdej z tub byá poáączony ze szklaną kulą zawierającą trzy wyloty (moĪliwoĞü zbierania VOC w trzech róĪnych przedziaáach czasowych z jednej roĞliny bez demontaĪu). W kaĪdy z wylotów wkáadano drobną tubĊ (Super-Q, Ø 6,35 mm x 76 mm dáugoĞci) wypeánioną 30 mg materiaáu do zbierania VOC (Alltech Associates, Inc., Deer- field, Illinois, USA). Poáączenia Super-Q dokonano z kaĪdym z wylotów przy wykorzy- staniu otwartych nakrĊtek zaopatrzonych w gumĊ uszczelniającą. Oczyszczone i nawilĪo- ne powietrze byáo dostarczane przez pompĊ w iloĞci 1,0 l·min-1 (regulator przepáywu powietrza) do spodu szklanych tub, w których znajdowaáy siĊ roĞliny. Druga pompa poáą- czona za pomocą giĊtkich przewodów (Tygon) z Super-Q zasysaáa powietrze w iloĞci 0,8 l·min-1 (regulator zasysania powietrza). Zasysanie ustawione na mniejszym poziomie miaáo na celu unikniĊcie zbierania VOC z otoczenia. Aparatura wspóápracowaáa z opro- gramowaniem komputerowym pozwalającym na zaprogramowanie czasu trwania do- Ğwiadczenia. VOC zbierano tylko z gáównego ĨdĨbáa. DoĞwiadczenia prowadzono w dziesiĊciu powtórzeniach w przypadku uszkadzanych roĞlin, zaczynając od fazy 32 wg Zadoksa. Dla roĞlin nieuszkodzonych (kontrola) wykonano trzy powtórzenia. Dodatkowo przeprowadzono dwie próby czyste, w których VOC zbierano z tub niezawierających roĞlin. Reasumując, wykonano trzy niezaleĪne doĞwiadczenia dające w efekcie 10 prób:
a) 3 roĞliny uszkodzone – 1 kontrola – 1 próba czysta, b) 3 roĞliny uszkodzone – 1 kontrola – 1 próba czysta, c) 4 roĞliny uszkodzone – 1 kontrola.
3.5. ANALIZA CHROMATOGRAFICZNA VOC
Przy uĪyciu 225 µl heksanu VOC byáy ekstrahowane z Super-Q do 1 ml fiolek, zawierających szklany wkáad. Fiolki nastĊpnie zakrĊcano szczelnie nakrĊtkami. Dodat- kowo do próby dodawano 7 ng dekanu, aby umoĪliwiü ocenĊ iloĞciową (internal stan- dard). VOC byáy analizowane przy uĪyciu chromatografów gazowych (GC Agilent Technologies 6890 z kolumną 30-m DB-1MS, MS Agilent Technologies 5973 oraz GC Perkin Elmer AutoSystem XL z kolumną 30-m DB-5MS). Do doĞwiadczeĔ przyjĊto schemat (wczeĞniejsze eksperymenty), który powodowaá wzrost temperatury od 40°C do 250°C (2 minuty w 40°C, 5°C na 1 minutĊ do 200°C, 10 minut w 200°C). Caáy pro- ces analizy trwaá 44 min. IloĞü dozowanego materiaáu wynosiáa kaĪdorazowo 1 µl.
IdentyfikacjĊ związków prowadzono wykorzystując bibliotekĊ zawartą w komputerze, a takĪe na podstawie czasów retencji i jonów charakterystycznych (m/z) widm spektral- nych zakupionych w Sigma-Aldrich oraz dostĊpnych w zasobach INRA syntetycznych VOC.
3.6. OBSERWACJE ZACHOWANIA SIĉ OWADÓW
W celu badania zachowaĔ owadów na testowane VOC wykorzystano sferĊ TSLC – 100 (Track Sphere Locomotion Compensator, SYNTECH, Netherlands) oraz stymula- tor CS – 55 (Stimulus Controller, SYNTECH, Netherlands) (fot. 2).
Fot. 2. Aparatura sáuĪąca do badania prĊdkoĞci poruszania siĊ owadów, dáugoĞci Ğladu oraz orientacji (TSLC – 100, SYNTECH)
Photo 2. Equipment useful for speed control, track length and orientation of insects (TSLC – 100, SYNTECH)
TSLC – 100 (Ø 100 mm) to aparat wykorzystywany do obserwacji wszystkich ak- tywnie poruszających siĊ owadów (fot. 2). Poza tym jest to jedyna aparatura, pozwala- jąca na nieograniczone przestrzenią obserwacje i pomiary prĊdkoĞci poruszania siĊ owadów, dáugoĞci Ğladu i tzw. wyprostowania. Skáada siĊ z mikroskopu (TRINOCULAR MICROSCOPE) i sfery (TOP VIEW), na wierzch której nakáadane byáy testowane owady (INSECT) (zgodnie z powyĪszym schematem). Pod sferą, w celu uáatwienia jej ruchu, umieszczona zostaáa kula (Ø 30 mm) (AEROSTATIC SUPPORT).
SferĊ obracaáy dwa silniki elektryczne w kierunku przeciwnym do wĊdrówki owadów.
Silniki (X MOTOR, Y MOTOR) byáy kierowane przez kamerĊ (VIDEO CAMERA) umieszczoną nad sferą i owadem. Sygnaá odbierany z kamery (VIDEO SIGNAL), oprócz umoĪliwiania kierowania sferą (VIDEO PROCESSOR, X-Y POSITION PROCESSOR, X-Y AMPLIFIER and FILTERS, X-Y MOTOR DRIVER) byá równieĪ
przekazywany do komputera, którego oprogramowanie pozwalaáo na odtworzenie Ğladu na ekranie monitora (X-Y ENCODER, ENCODER SIGNAL PROCESSOR, SERIAL RS232 INTERFACE, SERIAL TRACK DATA to COMPUTER). Pozwalaáo to na okre- Ğlanie dáugoĞci Ğladu, prĊdkoĞci, z jaką poruszaáy siĊ owady oraz kątów wĊdrówki miĊdzy osią x a rzeczywistym Ğladem. Po przetestowaniu 30 owadów powierzchniĊ sfery czysz- czono heksanem, aby uniknąü osiadania molekuá na jej powierzchni.
Aparat do regulacji przepáywu powietrza (Stimulus Controller CS-55) skáadaá siĊ z dwóch niezaleĪnych pomp dostarczających oczyszczone i nawilĪone powietrze (ciągáy i przerywany strumieĔ powietrza) (fot. 3).
Fot. 3. Aparatura sáuĪąca do regulacji przepáywu powietrza (Stimulus Controller CS – 55, SYNTECH)
Photo 3. Equipment useful for air stream control (Stimulus Controller CS – 55, SYNTECH) WyjĞcie oznaczone literą A (schemat, str. 20) dostarczaáo przerywany strumieĔ powietrza bezpoĞrednio do tuby poprzez szklaną rurkĊ, w której znajdowaáa siĊ bibuáa filtracyjna z rozcieĔczonym analizowanym związkiem. Z tuby powietrze páynĊáo bez- poĞrednio do owada znajdującego siĊ na sferze. UjĞcie C natomiast dostarczaáo oczysz- czony (Activated Charcoal Trap, 400cc, Inc. Alltech Associates) i nawilĪony (nawil- Īacz, szklane naczynie z wodą destylowaną oraz filtrem umoĪliwiającym wytworzenie pĊcherzyków) strumieĔ ciągáego przepáywu powietrza takĪe do tuby. W celu zapewnie- nia niezmiennej iloĞci dostarczanego powietrza (ciągáy i przerywany strumieĔ) zasto- sowano przerywacz. W przypadku, gdy nie dziaáaáo ujĞcie A, dodatkowo automatycznie byáo zaáączane ujĞcie B, dostarczające taką samą iloĞü przerywanego strumienia powie- trza jak ujĞcie A, lecz bez testowanego związku. Wibracje charakterystyczne dla pomp zostaáy zredukowane do minimum. IloĞü uwalnianego powietrza, jak i czas stymulacji byáy regulowane manualnie do poĪądanej wielkoĞci.
3.7. SYNTETYCZNE VOC
W celu analizy poszczególnych związków zidentyfikowanych z wykorzystaniem chromatografu, badaniu poddano ich syntetyczne odpowiedniki. CzystoĞü związków (oprócz (Z)-3-HAL i (Z)-OCI) wynosiáa ~ 98%. CzĊĞü syntetycznych VOC wykorzy- stano z zasobów INRA (Instytut National de la Recherche Agronomique, 78026 Versa- illes). Byáy to nastĊpujące związki: (Z)-3-heksenal = (Z)-3-HAL (50% (Z)-3-HAL + 50% triacetinu), (E)-2-heksenal = (E)-2-HAL, (Z)-3-heksen-1-ol = (Z)-3-HOL, (E)-2- heksen-1-ol = (E)-2-HOL, octan (Z)-3-heksen-1-ylu = (Z)-3-HAC oraz octan 1-heksylu
= 1-HAC. Wymienione wyĪej związki są okreĞlane mianem GLV. Pozostaáe VOC niewystĊpujące w zasobach INRA, a potrzebne do doĞwiadczeĔ zakupiono w Sigma- Aldrich (Francja) i Fluka-Buchs (Szwajcaria). Byáy to nastĊpujące związki: 4-heptanon
= 4-HEP, ß-pinen = ß-PIN, ß-myrcen = ß-MYR, (Z)-ocimen = (Z)-OCI (70% (Z)-OCI + 25% (R)-(+) limonenu), linalol = LIN, tlenek linalolu = LOX, octan benzylu = BAC, salicylan metylu = MAT, indol = IND, ß-kariofilen = ß-CAR, 6,10-dimetylo-5,9- undekadien-2-on = 5,9-UND, (E)-ß-farnezen = (E)-ß-FAR oraz pentadekan = PEN.
Badaniu poddano takĪe obydwa stabilizatory (triacetin i limonen).
3.8. WPàYW SYNTETYCZNYCH GLV NA ZACHOWANIE CHRZĄSZCZY
Dla GLV przy uĪyciu programu komputerowego wspóápracującego z TLC – 100 okreĞlano prĊdkoĞü wĊdrówki owadów, kierunek poruszania siĊ, dáugoĞü Ğladu, wypro- stowanie oraz kąty miĊdzy osią x a wáaĞciwym Ğladem (10 Hz). Program komputerowy analizowaá wyĪej wymienione parametry przez 5 minut, dając 3000 pomiarów. Dla lepszego zobrazowania wyników pomiary uĞredniono, co w efekcie daáo jeden zapis na sekundĊ (300/5 min). Dorosáe owady nakáadano na sferĊ i po upáywie 1 minuty (ako- modacja) dokonywano pomiarów. KaĪdorazowo analizowano 30 owadów obu páci dla
A
tuba/tube
przerywacz/
T-connector
owad/insect
nawilĪacz/
humidifier B
C
szklana rurka/
glass tube
kaĪdego z testowanych związków. Dla porównania wyników testowano 10 owadów obu páci, które poddano dziaáaniu przepáywającego powietrza tylko z heksanem (rozpusz- czalnik), lecz bez GLV. Oczyszczone i nawilĪone powietrze byáo dostarczane owadowi w iloĞci 150 ml·min-1. Analizowany GLV za pomocą automatycznej pipety nakáadano na bibuáĊ filtracyjną. RozcieĔczenia przygotowano, kierując siĊ uprzednio przyjĊtą zasadą, Īe na bibuáĊ filtracyjną zawsze podawano 10 µl roztworu wraz z badanym związkiem w odpowiednim stĊĪeniu. Po 5 minutach rejestrowania kierunku poruszania siĊ owada, zmieniano bibuáĊ filtracyjną i przed kolejnym testem podawano nową dawkĊ w odpowiednim rozcieĔczeniu. W ten sposób analizowano 30 owadów obu páci, którą to páeü oznaczano po zakoĔczeniu eksperymentu. Testowany GLV w odpowiednim stĊĪeniu byá dostarczany w strumieĔ ciągáego przepáywu powietrza w iloĞci 50 ml·min-1 poprzez przerywany strumieĔ powietrza (stymulator) z czĊstotliwoĞcią 2s-2s. Dla synte- tycznych GLV do doĞwiadczeĔ uĪyto takie iloĞci (odpowiedniki), jakie zostaáy odczy- tane z analiz chromatograficznych dla 24 h modelu Īerowania w przeliczeniu na jedną minutĊ (wydzielane powtarzalnie, a nie Ğladowo). Zastosowano tylko model 1 Īerowa- nia, gdyĪ poprzednie doĞwiadczenia wáasne obejmujące GLV wykazaáy, Īe związki te są uwalniane natychmiast po uszkodzeniu roĞlin. Oznacza to, Īe wáaĞnie te iloĞci po- winny wywieraü wpáyw na zachowanie owadów. Obliczono Ğrednią dawkĊ VOC (ng·min-1), biorąc pod uwagĊ wszystkie jednostkowe wyniki dla najwiĊkszego uwalnia- nia i dla kontroli w tym modelu. Do doĞwiadczeĔ wykorzystano nastĊpujące stĊĪenia:
– (Z)-3-HAL (roĞliny nieuszkodzone) – 0,5 ng·min-1, – (Z)-3-HAC (roĞliny nieuszkodzone) – 0,5 ng·min-1,
– (Z)-3-HAL (roĞliny uszkodzone, maksymalne uwalnianie) – 7,1 ng·min-1, – (Z)-3-HAC (roĞliny uszkodzone, maksymalne uwalnianie) – 7,4 ng·min-1.
Stymulator dostarczaá powietrze wraz z testowanym związkiem przez 2 s. Przez kolejne 2 s dostarczane byáo powietrze zawierające rozcieĔczalnik (heksan). Caákowity przepáyw powietrza dostarczany do testowanych owadów byá zawsze taki sam i wynosiá 200 ml·min-1. System umoĪliwiaá unikniĊcie báĊdu nierównomiernego dostarczania powietrza do testowanego owada, co mogáoby spowodowaü np. pozytywną reakcjĊ w kierunku zwiĊkszonego przepáywu powietrza.
Pozostaáe VOC analizowano zarówno dla 24 h, jak i 3-dniowego modelu Īerowa- nia w związku z tym, Īe ich uwalnianie moĪe byü „opóĨnione” w czasie. Obliczono Ğrednią dawkĊ VOC (ng·min-1), biorąc pod uwagĊ wszystkie jednostkowe wyniki dla najmniejszego i najwiĊkszego uwalniania oraz dla kontroli w obu modelach. Do do- ĞwiadczeĔ wykorzystano nastĊpujące stĊĪenia:
Model 24 h:
– LIN (kontrola) – 0,0 ng·min-1,
– LIN (minimalne uwalnianie) – 0,2 ng·min-1, – LIN (maksymalne uwalnianie) – 2,1 ng·min-1, – (E)-ß-FAR (kontrola) – 0,0 ng·min-1,
– (E)-ß-FAR (minimalne uwalnianie) – 0,1 ng·min-1, – (E)-ß-FAR (maksymalne uwalnianie) – 1,2 ng·min-1.
Model 3-dniowy:
– LIN (kontrola) – 0,0 ng·min-1,
– LIN (minimalne uwalnianie) – 0,2 ng·min-1, – LIN (maksymalne uwalnianie) – 2,1 ng·min-1 – (E)-ß-FAR (kontrola) – 0,0 ng·min-1,
– (E)-ß-FAR (minimalne uwalnianie) – 0,1 ng·min-1,
– (E)-ß-FAR (maksymalne uwalnianie) – 1,9 ng·min-1, – (Z)-OCI (kontrola) – 0,0 ng·min-1,
– (Z)-OCI (minimalne uwalnianie) – 0,4 ng·min-1, – (Z)-OCI (maksymalne uwalnianie) – 2,5 ng·min-1.
Z powyĪszego zestawienia wynika, Īe niektóre wyniki z modelu 24 h Īerowania pokrywają siĊ z tymi z modelu 3-dniowego. Mimo to obliczone wartoĞci (ng·min-1) poddano analizie w obydwu modelach, aby potwierdziü istniejącą tendencjĊ.
Badaniu poddano 30 owadów w teĞcie i 10 w kontroli, jednak dla pozostaáych VOC nie okreĞlano prĊdkoĞci i kątów miĊdzy osią x a Ğladem. Obserwowano natomiast kierunek wĊdrówki owadów. Komputerowy obraz sfery (okrąg) podzielono na cztery równe czĊĞci (zgodnie z poniĪszym schematem).
+ –
+ –
Ĩródáo stymulacji/
stimulus source
ħródáo uwalnianego powietrza z testowanym VOC znajdowaáo siĊ zawsze na górze okrĊgu. Jedynie dwie naprzeciwlegáe üwiartki byáy rozpatrywane jako reakcja owada na uwalniany związek (+). Dwie pozostaáe horyzontalne üwiartki (–) nie byáy brane pod uwagĊ. Obserwacji dokonywano w ciągu piĊciu minut.
3.9. VOC UWALNIANE Z USZKODZONYCH ROĝLIN
W celu badania zachowaĔ owadów na VOC uwalniane przez uszkodzone roĞliny takĪe wykorzystano sferĊ TSLC – 100 oraz stymulator CS – 55. KaĪdorazowo analizowano 30 owadów obu páci dla roĞlin uszkodzonych, jak i dla kontroli. W celu uszkodzenia roĞlin nakáadano na nie po 2 larwy i 2 osobniki dorosáe skrzypionki zboĪowej wg schematu:
– dwie larwy L1 na roĞlinĊ, które Īerowaáy przez 24 h (model 1), – dwie larwy L2 na roĞlinĊ, które Īerowaáy przez 24 h (model 1), – dwie larwy L3 na roĞlinĊ, które Īerowaáy przez 24 h (model 1),
– dwa osobniki dorosáe (rozróĪniane na podstawie stadium „in copula”) na roĞlinĊ, które Īerowaáy przez 24 h (model 1),
– dwie larwy L1 na roĞlinĊ, które Īerowaáy przez 3 dni (model 2), – dwie larwy L2 na roĞlinĊ, które Īerowaáy przez 3 dni (model 2), – dwie larwy L3 na roĞlinĊ, które Īerowaáy przez 3 dni (model 2),
– dwa osobniki dorosáe (rozróĪniane na podstawie stadium „in copula”) na roĞlinĊ, które Īerowaáy przez 3 dni (model 2).
Przerywany strumieĔ powietrza (stymulator) z czĊstotliwoĞcią 2 s - 2 s byá dostar- czany do szczelnie owiniĊtej roĞliny przy uĪyciu wolnych od VOC worków (Nalophan, ETS Charles frères), a nastĊpnie transportowany na wierzch sfery, na której znajdowaá siĊ owad. UmoĪliwiáo to testowanie zachowaĔ owadów dorosáych na VOC wydzielane z roĞlin uszkodzonych bez ich jakoĞciowej i iloĞciowej identyfikacji. Dla zobrazowania wyników wykorzystano takĪe model czterech üwiartek.
3.10. ANALIZA STATYSTYCZNA – WALIDACJA
Do obliczeĔ wyników uzyskanych z TSLC – 100 (dla GLV) zastosowano model analizy (poniĪej opisano jego najwaĪniejsze elementy) proponowany przez Li [91].
1. Obliczanie sinus i cosinus dla okrĊgu
r
= X α
cos r
=Y α sin
a, r – punkty i ich bieguny, przekątne prostokątów; X, Y – wartoĞci liczbowe dla poszczegól- nych üwiartek okrĊgu (+ +, + –, – +, – –).
2. Obliczanie Ğredniego kąta miĊdzy osią x a Ğladem (10 Hz)
n a X
n
i¦ i
= =1
cos
n a Y
n
i¦ i
= =1
sin
2
2 Y
X
r= +
n – kąty, a1…..an, Ɨ – Ğredni kąt,
r – dáugoĞü Ğredniego wektora,
Ɨ – Ğredni kąt mający nastĊpujące sinus i cosinus:
r a= X
cos r
a=Y sin
3. Rozproszenie poszczególnych pomiarów ZmiennoĞü koáowa:
r S2=1− ZmiennoĞü kątowa:
) ( r s2 = 12 −
ZmiennoĞü standardowa:
r s02=−2ln Odchylenie kątowe:
180° 2(1 )
= −
s r
π
Koáowe odchylenie standardowe:
0°
0°
0° 0°
0°
0°
90°
90°
90° 90°
90°
90°
180°
180°
180° 180°
180°
180°
270°
270°
270° 270°
270°
270°
a) b)
c) d)
e) f)
r – miara koncentracji, od 0 do 1,
0 – duĪe rozproszenie i Ğredni kąt nie moĪe byü oszacowany,
1,0 – wszystkie wyniki są skoncentrowane w tym samym kierunku (1–r – miara rozpro- szenia),
1 – r = 0 – brak rozproszenia, 1 – r = 1,0 – maksymalne rozproszenie.
