View metadata, citation and similar papers at core.ac.uk

(1)

PRACA ORYGINALNA

Adres do korespondencji:

Adres do korespondencji: dr n. med. A. Safianowska, Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii WUM, ul. Banacha 1a, 02–097 Warszawa, tel.: 22 599 28 56, faks: 22 599 15 60, e-mail: asafianowska@wum.edu.pl

Praca wpłynęła do Redakcji: 04.01.2010 r.

Aleksandra Safianowska, Renata Walkiewicz, Patrycja Nejman-Gryz, Ryszarda Chazan, Hanna Grubek-Jaworska

Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Uniwersytetu Medycznego w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. n. med. R. Chazan

Porównanie dwóch technik typowania prątków niegruźliczych:

cieczowej chromatografii wysokociśnieniowej i molekularnego systemu GenoType Mycobacterium CM/AS

The comparison between two methods for typing of nontuberculous mycobacteria: high pressure liquid chromatography and molecular assay GenoType Mycobacterium CM/AS

Praca finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego, grant nr R1301002

Abstract

Introduction: The GenoType Mycobacterium CM and the GenoType Mycobacterium AS (HAIN Lifescience, Germany) were evaluated for the ability to differentiate mycobacterial species of clinical isolates. Serial use of the both assays is aimed to identify 38 different molecular patterns, of which 24 patterns can be assigned to single species, 10 patterns are allocated to two or more Mycobacterium species, and 4 patterns correspond to Mycobacterium species and gram-positive bacteria with a high G + C content. The analysis of mycolic acids by high pressure liquid chromatography (HPLC) was the reference method.

Material and methods: A set of 127 nontuberculous mycobacterial isolates on Loewenstein-Jensen slants, derived from different patients between 1999 and 2007, was analyzed. The strains were primary classified by HPLC following the diagnostic procedure, and retyped by GenoType Mycobacterium CM/AS.

Results: In total, results obtained by both methods were interpretable for 113 strains. Concordant results were obtained for 105 (93%) mycobacterial strains. One out of 8 inconcordant classified strains, which was classified as M. abscessus/M.

chelonae by HPLC, displayed a pattern of M. tuberculosis complex by a molecular method. Eleven clinical strains were differentiated only by one of used methods, either by HPLC (6 strains) or by GenoType CM/ AS (5 strains). Three strains were not classified at all.

Conclusions: Our results show that the GenoType Mycobacterium CM/AS system represents a useful tool to identify mycobacterial clinical isolates. The molecular system is as rapid and reliable as the HPLC, but much easier to perform and more friendly for the environment.

Key words: GenoType Mycobacterium CM/AS, high pressure liquid chromatography (HPLC), nontuberculous mykobacteria (NTM) Pneumonol. Alergol. Pol. 2010; 78, 5: 363–368

Streszczenie

Wstęp: W pracy oceniano przydatność diagnostyczną molekularnego systemu GenoType Mycobacterium CM/AS (HAIN Lifescience, Niemcy) w różnicowaniu izolatów klinicznych mykobakterii w porównaniu z analizą kwasów mykolowych z zastosowaniem cieczowej chromatografii wysokociśnieniowej. Zastosowanie obydwu testów umożliwia wyróżnienie 38 wzorów molekularnych, z których 24 można przypisać do poszczególnych gatunków mykobakterii, 10 wzorów odpowiada

(2)

Wstęp

W ostatnim dziesięcioleciu, równolegle z rozwojem technik molekularnych, jesteśmy świad- kami znaczącego postępu w dziedzinie taksonomii mykobakterii. Rodzaj Mycobacterium obejmuje już obecnie 148 gatunków i 11 podgatunków, a liczby te stale rosną. Na bieżąco aktualizowana lista opi- sanych taksonów jest dostępna w Internecie [1].

Spośród nich M. leprae i M. tuberculosis to obliga- toryjne patogeny, zaś pozostałe, zwane prątkami niegruźliczymi (NTM, nontuberculous mycobacte- ria), to saprofity powszechnie występujące w śro- dowisku. Jednak około 1/3 gatunków NTM może powodować zakażenia oportunistyczne, najczę- ściej wiążące się z dysfunkcją układu odpornościo- wego. Do rozwoju zakażeń NTM predysponuje leczenie immunosupresyjne, podeszły wiek, przeby- te lub współwystępujące inne choroby; w przypadku płucnej manifestacji mykobakteriozy może to być gruźlica, przewlekła obturacyjna choroba płuc lub mukowiscydoza, a w przypadku mykobakte- ryjnego zakażenia skóry — uszkodzenia skóry lub błon śluzowych [2–4]. Jednak najczęstszą kliniczną manifestacją mykobakteriozy jest przewlekła choroba płuc [4–7]. W Polsce wśród gatunków najczę- ściej izolowanych z próbek od chorych na myko- bakteriozę płuc wymienić należy: M. kansasii, M. avium/M. intracellulare i M. xenopi. W odróż- nieniu od gruźlicy mykobakterioza nie transmitu- je się na osoby zdrowe, zatem nie podlega obowiąz- kowi rejestracji, a dane epidemiologiczne są jedynie orientacyjne i najczęściej dotyczą określonych regionów kraju lub jedynie wybranego gatunku NTM. Trzeba przy tym podkreślić, że mykobakte-

dwóm, czasem kilku gatunkom, a 4 wzory odpowiadają Mycobacterium sp. lub Gram-dodatnim bakteriom z dużą zawarto- ścią par G-C w genomie.

Materiał i metody: Badanie miało charakter retrospektywny i obejmowało 127 szczepów mykobakterii wyizolowanych na podłożu stałym Loewensteina-Jensena od pacjentów szpitala klinicznego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w latach 1999–2007. Prątki identyfikowano metodą analizy kwasów mykolowych cieczową chromatografią wysokociśnie- niową (HPLC) w ramach rutynowego postępowania diagnostycznego. Szczepy typowano powtórnie testami molekularnymi, najpierw GenoType Mycobacterium CM, a następnie — jeśli uzyskanego wzoru molekularnego nie można było przypisać do żadnego z wzorców — testem GenoType Mycobacterium AS.

Wyniki: Spośród 127 badanych szczepów porównanie obu technik było możliwe dla 113 izolatów. Dla 105 ze 113 (93%) szczepów uzyskano wyniki zgodne. Należy podkreślić, że spośród 8 izolatów rozbieżnie typowanych w jednym przypadku w systemie GenoType Mycobacterium CM/AS stwierdzono obecność genomu M. tuberculosis complex. Szczep ten w typowaniu HPLC określono jako szybkorosnący gatunek M. abscessus/M. chelonae. Spośród pozostałych 14 ze 127 izolatów klinicznych 11 wytypowano tylko jedną z metod: 6 szczepów — techniką HPLC i 5 szczepów — w systemie molekularnym.

W przypadku 3 szczepów identyfikacja nie powiodła się żadną z metod.

Wnioski: System GenoType Mycobacterium CM/AS pozwala na szybką i rzetelną identyfikację gatunkową izolatów klinicz- nych mykobakterii. W porównaniu z obecnie stosowaną metodą HPLC system molekularny jest przyjazny dla środowiska i prostszy w wykonaniu.

Słowa kluczowe: cieczowa chromatografia wysokociśnieniowa, GenoType Mycobacterium CM/ AS, mykobakteria Pneumonol. Alergol. Pol. 2010; 78, 5: 363–368

rioza jest chorobą występującą rzadko, aczkolwiek nieco częściej niż można się było spodziewać przed kilkunastoma laty. Autorki niniejszej pracy na pod- stawie własnych doświadczeń sądzą, że choroby płuc, w których czynnikiem etiologicznym są NTM, stanowią do kilkunastu procent wszystkich zakażeń prątkowych [8]. Podobne dane dotyczą wielu regionów świata [9–12]. Zauważalny jest tak- że wzrost notowanych przypadków mykobakteriozy w krajach rozwiniętych, czemu jednocześnie to- warzyszy spadek zachorowań na gruźlicę. Trudno ocenić, w jakim stopniu wiąże się to ze wzrostem liczebności populacji z predyspozycjami do rozwoju zakażeń NTM, a w jakim wynika z postępu w technikach różnicowania prątków, który z natu- ry rzeczy jest szybszy w krajach rozwiniętych [11].

Ze względu na konieczność rozróżnienia prątków NTM etiologicznie istotnych od przypadkowych zanieczyszczeń próbek klinicznych, potwierdze- niem mikrobiologicznym mykobakteriozy u obja- wowych chorych z wykluczoną gruźlicą jest co najmniej 2-krotne wyhodowanie prątków niegruź- liczych tego samego gatunku [4]. Wymaga to nie- kiedy badania więcej niż trzech próbek klinicznych od pacjenta, co jest standardem w diagnostyce gruźlicy [8]. Jednak podstawowe trudności diagno- styczne w przypadku mykobakteriozy wynikają z faktu, że objawy kliniczne nie pozwalają na róż- nicowanie jej z gruźlicą, zaś metody mikrobiolo- giczne, nawet najczulsze — molekularne — nie wy- krywają zakażenia M. tuberculosis u wszystkich osób chorych na gruźlicę. Zdarza się, że u objawo- wych chorych, uznanych za chorych na gruźlicę bez potwierdzenia mikrobiologicznego, podejmo- wane jest leczenie przeciwgruźlicze i dopiero nie-

(3)

powodzenie takiej terapii skłania do poszukiwania innych niż M. tuberculosis etiologicznych czynników choroby. Wydaje się, że ze strony laboratoryjnej nierozpoznanie mykobakteriozy jest wynikiem w równej mierze arbitralnego uznawania izolatów NTM, bez określania gatunku, za zanieczyszcze- nia środowiskowe, jak również braku możliwości technicznych typowania. Autorki sądzą, że waż- nym postępem w diagnostyce mykobakterioz bę- dzie upowszechnienie szybkich i niekosztownych molekularnych metod różnicowania gatunków mykobakterii.

Do niedawna metodą referencyjną w typowaniu prątków, stosowaną również w Polsce, była analiza kwasów mykolowych techniką cieczowej chromatografii wysokociśnieniowej (HPLC, high performance liquid chromatography) [13–15]. Ze- staw kwasów mykolowych, a właściwie ich profil elucyjny w analizie HPLC różnicuje wiele ga- tunków mykobakterii, choć nie wszystkie. Wydaje się, że technika ta, chociaż znakomita w swoim czasie, odchodzi już do przeszłości, głównie ze względu na koszty aparaturowe i obciążenie śro- dowiska rozpuszczalnikami organicznymi. Obec- nie złotym standardem w pracach doświadczal- nych jest sekwencjonowanie 16S rDNA [16], ale nie jest to metoda dostępna dla diagnostyki rutynowej. Jednocześnie do diagnostyki wprowadza- ne są testy molekularne, certyfikowane dla po- trzeb klinicznych. Jedną z propozycji są certyfikowane w Unii Europejskiej, wzajemnie uzupeł- niające się testy: GenoType Mycobacterium CM oraz GenoType Mycobacterium AS (HAIN Life- science, Niemcy).

W teście GenoType Mycobacterium CM (Com- mon Mycobacteria) uzyskuje się 15 wzorów mole- kularnych różnicujących gatunki: M. avium, M. chelonae/M. immunogenum, M. abscessus/M.

immunogenum, M. fortuitum 1, M. fortuitum 2/M.

mageritense, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum/M. paraffinicum/M. parascrofula- ceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense/

/M. haemophilum/M. palustre, M. marinum/M. ulce- rans, M. tuberculosis complex, M. peregrinum/M.

alvei/M. septicum oraz M. xenopi. W teście Geno- Type Mycobacterium AS (Additional Species) 19 wzorów molekularnych różnicuje gatunki: M. si- miae, M. mucogenicum, M. goodii, M. celatum, M. smegmatis, M. genavense/M. triplex, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai/M. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kansasii (4 subtypy), M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum, M. shimoidei.

Ponadto w każdym teście możliwe jest uzyskanie wzoru molekularnego dla Mycobacterium sp. (Ge- nus Control).

Celem niniejszej pracy było porównanie pre- cyzji w identyfikowaniu gatunku prątków przez system molekularny GenoType Mycobacterium CM/AS (HAIN Lifescience, Niemcy) ze stosowaną w rutynowej diagnostyce analizą kwasów mykolowych z użyciem HPLC.

Materiał i metody Badane szczepy

Badanie miało charakter retrospektywny i obejmowało szczepy NTM wyizolowane z mate- riałów klinicznych od 127 chorych w latach 1999–

–2007 w szpitalu klinicznym Warszawskiego Uni- wersytetu Medycznego. Szczepy wyhodowano z 64 plwocin, 38 popłuczyn oskrzelowych, 19 pły- nów oskrzelikowo-pęcherzykowych, 2 płynów opłucnowych oraz 4 innych próbek klinicznych.

Próbki kliniczne upłynniano i dekontaminowano, stosując ług sodowy z N-acetylocysteiną i cytrynia- nem sodu (stężenie końcowe: 2% NaOH, 0,5%

NAC, 1,3% C6H5O7Na3) [17]. Następnie próby za- gęszczano i posiewano na podłożu Loewensteina- Jensena (L-J). Do badania zakwalifikowano wyłącz- nie szczepy bakterii kwasoopornych w barwieniu Ziehla-Neelsena, których wzór elucyjny w meto- dzie HPLC potwierdzał przynależność do Mycobac- terium sp. i był różny od M. tuberculosis complex.

Typowanie gatunku metodą HPLC

Typowanie wyizolowanych szczepów mykobakterii przeprowadzono zgodnie z wytycznymi CDC (Centers for Disease Control and Prevention) [18] metodą analizy kwasów mykolowych z zastosowaniem HPLC, którą rutynowo stosuje się w diagnostyce mikrobiologicznej gruźlicy i mykobakterioz w pracowni WUM [14, 15].

Typowanie molekularne

Typowanie gatunku na poziomie molekularnym wykonano testami GenoType Mycobacterium CM/AS (HAIN Lifescience, Niemcy), w których przeprowadza się specyficzną hybrydyzację pro- duktu amplifikacji w multiplex PCR (polymerase chain reaction) ze swoistymi sondami oligonukle- otydowymi na pasku nitrocelulozowym. System ten nie obejmuje izolacji DNA prątkowego, które należy izolować dowolną techniką przewidzianą dla tego typu izolacji. Producent zestawów nie dostarcza także polimerazy DNA. W niniejszym badaniu matrycę DNA otrzymywano, stosując zestaw AMPLICOR Respiratory Specimen Prepara- tion Kit (Roche Diagnostics, Stany Zjednoczone) i dalej amplifikację przeprowadzono tak, jak opi- sano w poprzedniej pracy [19]. Hybrydyzację i de-

(4)

tekcję prowadzono w automatycznym urządzeniu (TwinCubator, HAIN Lifescience, Niemcy) zgodnie z instrukcją producenta, przedstawioną dalej w skrócie: 20 µl produktu amplifikacji inkubowano przez 5 min w temperaturze pokojowej z 20 µl odczynnika do denaturacji (wszystkie odczynniki i paski dostępne w zestawie). Następnie dodano 1 ml buforu do hybrydyzacji o temperaturze 37°C i po włożeniu paska nitrocelulozowego z sondami prowadzono hybrydyzację przez 30 min w temperaturze 45°C. Po 2-krotnym płukaniu, 1 ml Stringent Wash Solution 45°C przez 15 min, a następnie 1 ml Rinse Solution (RIN) w temperaturze pokojowej przez 1 min, pasek inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej z 1 ml rozcieńczonej odpowiednim buforem fosfatazy alkalicznej sprzężonej ze strepta- widyną. Pasek płukano 3-krotnie w temperaturze pokojowej: 2-krotnie 1 ml RIN przez 1 min, a następ- nie, również przez 1 min, 1 ml wody. Odpłukany pasek inkubowano w 1 ml substratu w temperaturze pokojowej, bez dostępu światła, przez 3 do 20 min, do wybarwienia prążka CC (Conjugate Con- trol). Reakcję barwną hamowano, 2-krotnie przepłuku- jąc pasek wodą. Po wysuszeniu paska oceniano wzór wybarwionych prążków, odpowiadających swoistym sondom DNA, przez porównanie z wzorcem dostar- czonym przez producenta. Ocenie podlegały tylko paski, w których wybarwione były prążki kontrolne.

Wyniki

Dla 113 szczepów mykobakterii spośród 127 badanych izolatów klinicznych uzyskano wia- rygodne wyniki zarówno w systemie molekularnym GenoType Mycobacterium CM/AS, jak i w analizie HPLC. W 105 (93%) przypadkach wyniki typowania obydwiema metodami były zgodne.

Dotyczyło to 35 szczepów M. kansasii, 22 M. xeno- pi, 16 M. avium/M. intracellulare, 11 M. gordonae, 10 M. fortuitum, 10 M. abscessus/M. chelonae oraz jednego izolatu mieszanego — M. fortuitum + + M. kansasii. Metoda molekularna pozwoliła do- precyzować typowanie 16 szczepów rozpoznanych w HPLC jako M. avium/M. intracellulare, wśród których 15 izolatów okazało się M. avium i jeden M. intracellulare. Podobnie w przypadku 10 izola- tów M. abscessus/M. chelonae (HPLC) było 9 szcze- pów M. chelonae i jeden M. abscesus (GenoType Mycobacterium CM) (tab. 1). Niezgodne wyniki ty- powania dotyczyły 8 szczepów (7%) (tab. 2).

Oprócz omówionych powyżej 113 szczepów były też takie, których identyfikacja powiodła się tylko jedną z metod — 6 chromatograficznie i 5 molekularnie (tab. 3) oraz 3 izolaty kliniczne, zgodnie zakwalifikowane jako NTM, których peł- na identyfikacja nie powiodła się żadną ze stoso- wanych metod.

Dyskusja

Komentarza wymagają przede wszystkim przypadki rozbieżnego typowania prątków porów- nywanymi metodami. W niniejszym badaniu zda- rzyło się tak w ośmiu przypadkach.

W dwóch przypadkach szczepy ocenione tech- niką HPLC jako NTM według genotypowania były mikroorganizmami spoza rodzaju Mycobacterium.

Wyjaśnieniem może być obecność kwasów mykolowych w ścianie komórkowej mikroorganizmów należących do innych niż Mycobacteria rodzajów systematycznych, na przykład Nocardia [20], któ- re incydentalnie mogą wyrosnąć na pożywce L-J, a biblioteka wzorów elucyjnych obejmuje jedynie profile dla 29 gatunków prątków.

Tabela 1. Szczepy, dla których wyniki identyfikacji gatunkowej były zgodne w obu metodach Table 1. Mycobacterial strains concordant when typed by both methods

Liczba szczepów/Number of strains HPLC GenoType Mycobacterium CM/AS

35 M. kansasii M. kansasii

22 M. xenopi M. xenopi

16 M. avium/M. intracellulare 15 M. avium

1 M. intracellulare

11 M. gordonae M. gordonae

10 M. fortuitum M. fortuitum

10 M. abscessus/M. chelonae 9 M. chelonae

1 M. abscessus

1 M. fortuitum + M. kansasii M. fortuitum + M. kansasii

(5)

Przy identyfikacji M. interjectum w HPLC ty- powanie molekularne dało w jednym przypadku wynik M. avium, a w drugim — M. xenopi. Bez wykonania genotypowania metodą odniesienia, na przykład sekwencjonowania 16S rDNA, przypadki te nie znajdują jednoznacznego uzasadnienia.

Można jedynie przypuszczać, że profil elucyjny kwasów mykolowych w HPLC określony jako cha- rakterystyczny dla M. interjectum mógł w rzeczy- wistości wynikać z obecności innych niż prątki mikroorganizmów dominujących w hodowli, z jed- noczesną obecnością prątków M. avium za pierw- szym i M. xenopi za drugim razem.

W przypadku rozbieżności w identyfikacji M. scrofulaceum v. M. gordonae (odpowiednio chromatograficznie i molekularnie) wyjaśnienia można doszukiwać się w różnorodności profili elu- cyjnych M. gordonae w HPLC. W bibliotece wzo- rów elucyjnych, M. gordonae charakteryzuje się jedną grupą pików. Wykazano, że w obrębie gatunku

M. gordonae istnieje inny podtyp, którego nie po- siadamy w bazie wzorów elucyjnych, charaktery- zujący się dwoma grupami pików [21], podobnie jak M. scrofulaceum [13]. W tym właśnie autorki upa- trują możliwości pomyłki w typowaniu HPLC i, mimo że nie dysponują wynikami z innej metody genotypowania, skłaniają się jednak do uznania prawdziwości typowania metodą molekularną.

W dwóch przypadkach analiza HPLC wykaza- ła wzór elucyjny dla jednego gatunku, zaś analiza molekularna wykazała obecność genomów tego i jeszcze dodatkowych gatunków mykobakterii (tab. 2). Taka precyzja typowania molekularnego jest najistotniejszą przewagą systemu GenoType Mycobacterium CM/AS w porównaniu z techniką HPLC. Tę ważną zaletę testu podkreślają również inni autorzy [22].

Ważne, że test GenoType stwarza możliwość wykrycia prątków gruźlicy w hodowlach gatunko- wo niejednorodnych, w których przeważają szyb- Tabela 3. Szczepy zidentyfikowane tylko jedną z metod

Table 3. Mycobacterial strains typed only by one from two used methods

1 M. flavescens NTM

1 M. neoaurum NTM

1 M. nonchromogenicum NTM

1 M. avium Inhibicja polimerazy

1 M. fortuitum Inhibicja polimerazy

1 M. kansasii Inhibicja polimerazy

1 NTM M. fortuitum 2/M. mageritense

1 NTM M. intermedium

1 NTM M. lentiflavum

1 NTM M. mucogenicum

1 NTM M. smegmatis

Tabela 2. Szczepy, dla których wyniki identyfikacji gatunkowej nie były zgodne w obu metodach

Table 2. Mycobacterial strains non-concordant when typed by HPLC and GenoType Mycobacterium CM/AS

2 NTM Bakterie nienależące do Mycobacterium sp.

1 M. interjectum M. avium

1 M. interjectum M. xenopi

1 M. scrofulaceum M. gordonae

1 M. xenopi M. xenopi + M. intracellulare + M. scrofulaceum

1 M. gordonae M. gordonae + M. xenopi

1 M. abscessus/M. chelonae M. tuberculosis complex

(6)

korosnące prątki środowiskowe maskujące obec- ność wolno replikujących prątków gruźlicy. W niniejszym badaniu miało to miejsce w jednym przypadku, potwierdzonym w innym teście molekularnym (AMPLICOR MTB, Roche Diagnostics, Stany Zjednoczone), w którym obecność prątków gruź- licy była maskowana przez prątki szybkorosnące (M. chelonae/M. abscessus).

System GenoType Mycobacterium CM/AS pozwala na szybką i rzetelną identyfikację gatun- kową izolatów klinicznych mykobakterii. Procedu- ra testów GenoType jest stosunkowo prosta, wymaga jednak pewnego przygotowania w posługi- waniu się metodami molekularnymi, bowiem nie przewidziano w nich izolacji DNA i każda pracow- nia winna przeprowadzać to we własnym zakre- sie, jedną z ogólnie przyjętych technik. W przeci- wieństwie do obecnie stosowanej metody HPLC system molekularny jest przyjazny dla środowiska.

Uzyskane wyniki w pełni potwierdzają pozy- tywną ocenę innych autorów o przydatności dla diagnostyki rutynowej systemu GenoType Myco- bacterium CM/AS [22–24]. Ta prosta metodyka molekularna może w znacznym stopniu uspraw- nić diagnostykę zakażeń prątkowych.

Piśmiennictwo

1. Euzéby J.P. List of Prokaryotic names with Standing in Nomen- clature — Genus Mycobacterium. Last full update: 08. 07. 2010.

http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.html

2. Falkinham J.O. III. Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. Clin. Microbiol. Rev. 1996; 9: 177–215.

3. Katoch V.M. Infections due to non-tuberculous mycobacteria (NTM). Indian J. Med. Res. 2004; 120: 290–304.

4. American Thoracic Society Documents. Diagnosis, Treatment and Prevention of Nontuberculous Mycobacterial Diseases. Am.

J. Respir. Crit. Care Med. 2007; 175: 367–416.

5. Management of opportunist mycobacterial infection. Joint Tu- berculosis Committee guidelines 1999. Thorax 2000; 55: 210–

218.

6. Shitrit D., Priess R., Peled N. i wsp. Differentiation of Mycobac- terium kansasii infection from Mycobacterium tuberculosis infection: comparison of clinical features, radiological appear- ance, and outcome. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2007; 26:

679–684.

7. d’Arminio Monforte A., Vago L., Gori A. i wsp. Clinical diagnosis of mycobacterial diseases versus autopsy findings in 350

patients with AIDS. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996;

15: 453–458.

8. Grubek-Jaworska H., Walkiewicz R., Safianowska A. i wsp.

Nontuberculous mycobacterial infections among patients sus- pected of pulmonary tuberculosis. Eur. J. Clin. Microbiol. In- fect. Dis. 2009; 28: 739–744.

9. Debrunner M., Salfinger M., Brandli O., von Graevenitz A. Epi- demiology and clinical significance of nontuberculous mycobacteria in patients negative for human immunodeficiency vi- rus in Switzerland. Clin. Inf. Dis. 1992; 15: 330–345.

10. Henry M.T., Inamdar L., O’Riordain D. i wsp. Nontuberculous mycobacteria in non-HIV patients: epidemiology, treatment and response. Eur. Respir. J. 2004; 23: 741–746.

11. Marras T.K., Daley C.L. Epidemiology of human pulmonary infection with nontuberculous mycobacteria. Clin. Chest Med.

2002; 23: 553–567.

12. Adle-Biassette H., Huerre M., Breton G. i wsp. Non tuberculous mycobacterial diseases. Ann. Pathol. 2003; 23: 216–235.

13. Butler W.R. i Guthertz L.S. Mycolic Acid Analysis by High- Performance Liquid Chromatography for Identification of My- cobacterium Species. Clin. Microbiol. Rev. 2001; 14: 704–726.

14. Safianowska A., Walkiewicz R., Grubek-Jaworska H. i wsp. My- colic acids analysis from various species mycobacterium by high pressure liquid chromatography (HPLC). Pneumonol. Al- ergol. Pol. 2002; 70: 130–138.

15. Walkiewicz R., Safianowska A., Grubek-Jaworska H. i wsp. Zas- tosowanie analizy kwasów mikolowych w diagnostyce gruźlicy i mikobakterioz — 3 lata doświadczeń. Pneumonol. Alergol.

Pol. 2002; 70: 444–449.

16. Daley P., Petrich A., May K. i wsp. Comparison of in-house and commercial 16S rRNA sequencing with high-performance liquid chromatography and Genotype AS and CM for identification of nontuberculous mycobacteria. Diagn. Microbiol. Infect.

Dis. 2008; 61: 284–293.

17. Przondo-Mordarska A. Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej. Wyd. Lek. PZWL, Warszawa 2005; 86–87.

18. Standarized Method for HPLC Identification of Mycobacteria.

U.S. Departament of Heath and Human Services, CDC 1996;

http://www.cdc.gov/ncidod/publications/hplc.pdf

19. Safianowska A., Walkiewicz R., Nejman-Gryz P. i wsp. Przy- datność diagnostyczna molekularnego testu GenoType MTBC (HAIN Lifescience, Niemcy) w identyfikacji prątków gruźlicy.

Pneumonol. Alergol. Pol. 2009; 77: 517–520.

20. Butler W.R., Ahearn D.G. i Kilburn J.O. High-Performance Liq- uid Chromatography of Mycolic Acids as a Tool in the Identifi- cation of Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, and Myco- bacterium Species. J. Clin. Microbiol. 1986; 23: 182–185.

21. Astola J., Muńoz M., Sempere M. i wsp. The HPLC-double-cluster pattern of some Mycobacterium gordonae strains is due to their dicarboxy-mycolate content. Microbiology 2002; 148: 3119–3127.

22. Gitti Z., Neonakis I., Fanti G. i wsp. Use of the GenoType Myco- bacterium CM and AS Assays to Analyze 76 Nontuberculous Mycobacterial Isolates from Greece. Journal of Clin. Microbiol.

2006; 44: 2244–2246.

23. Richter E., Rüsch-Gerdes S., Hillemann D. Evaluation of the GenoType assay for Identification of mycobacterial Species from Cultures. J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 1769–1775.

24. Sarkola A., Mäkinen J., Marjamäki M. i wsp. Prospective evaluation of the GenoType assay for routine identification of mycobacteria. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2004; 23: 642–645.