Gen eukariotyczny

66  Download (0)

Pełen tekst

(1)

Gen eukariotyczny

Działanie i regulacja – etapy posttranskrypcyjne

(2)

“Definicja” genu

Region DNA, który określa dziedziczoną cechę organizmu; zwykle koduje pojedyncze białko lub RNA.

Zawiera całą funkcjonalną podjednostkę wraz z sekwencją

kodującą, niekodującymi sekwencjami regulatorowymi DNA oraz z intronami.

Definicja niedoskonała, trudno jednoznacznie zdefiniować gen.

Współczesne definicje – centrum jest transkrypt

(3)

Geny eukariotyczne

Procesy transkrypcji i translacji są rozdzielone w przestrzeni i czasie

Każdy gen ma własny promotor, nie występują operony

Proces ekspresji genu składa się z wielu etapów

Na każdym z etapów możliwe działanie regulacyjne

Informacja kierująca syntezą białka może być modyfikowana po transkrypcji (alternatywne składanie, redagowanie) – złożoność proteomu przekracza złożoność genomu

Genom człowieka: ~23 000 genów kodujących białka

Proteom człowieka: co najmniej 500 000 form

(4)

Wszystkie transkrypty mRNA mają niekodujące fragmenty 5’ i 3’ końcowe (UTR)

(5)

Etapy ekspresji/poziomy regulacji

struktura chromatyny

transkrypcja

obróbka i kontrola jakości RNA

transport RNA

degradacja RNA

translacja

modyfikacje post-translacyjne

degradacja białka

(6)

synteza

dojrzewanie

degradacja

Poziom RNA w komórce

Rys. © dr Monika Zakrzewska-Płaczek, IGiB UW

(7)

Rybonukleazy

Egzorybonukleazy - odrywają nukleotydy od końca 3’ lub 5’ RNA

Endorybonukleazy - przecinają cząsteczkę RNA

Różne mechanizmy katalityczne

hydroliza

fosforoliza

(8)

Obróbka transkryptów polI i polIII

Wieloetapowe mechanizmy cięcia

rRNA – jedna jednostka transkrypcyjna, złożona obróbka

tRNA – cięcie prekursora na końcu 3’ (RNaza Z) i 5’ (RNaza P)

(9)

Obróbka prekursora rRNA

Zakrzewska-Płaczek et al., Nucleic Acids Res. 2010

(10)

Obróbka pre-tRNA

Dwie endonukleazy: RNaza P i tRNaza Z

(11)

Obróbka mRNA

Czapeczka na końcu 5’

Poliadenylacja końca 3’

Wycinanie intronów – składanie (splicing)

Transport z jądra do cytoplazmy

Degradacja

(12)

Transkrypcja DNA

Pre-mRNA

Obróbka

mRNA Cap AAAAAAAAAAAA

Pol RNA II

Tradycyjny obraz ekspresji genu

Cap

Transkrypcja i obróbka

Cap AAAAAAAAAAAA

Pol RNA II

Współczesny obraz ekspresji genu

Transkrypcja i obróbka są sprzężone

Rys. © dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill

(13)

Sprzężenie transkrypcji i obróbki RNA

Na poszczególnych etapach tworzą się kompleksy różnych białek z polimerazą RNA

Inicjacja/synteza czapeczki

Elongacja/splicing

Terminacja/poliadenylacja

Kluczowym obszarem jest C-koniec polimerazy II (CTD) – regulacja przez fosforylację

(14)

Transkrypcja i synteza czapeczki/

splicing

Fosforylacja C-końcowej domeny polimerazy (CTD) - reguluje

przejście od kompleksu inicjacji/

przyłączania czapeczki do

kompleksu elongacji/składania

Rys. © dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill

(15)

Czapeczka 5’

Synteza tuż po inicjacji transkrypcji

Istotna dla eksportu i translacji mRNA

Chroni przed degradacją przez egzorybonukleazy Xrn

(16)

Terminacja i poliadenylacja

(17)

Terminacja i poliadenylacja

(18)

Kompleks cięcia i poliadenylacji

Rys. © dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill

(19)

Koniec gdy PAP utraci kontakt z CPSF

Wydłużanie ogona poliA

Rys. © dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill

(20)

Terminacja – mechanizm “torpedy”

Po przecięciu przez CPSF, koniec 5’ niechroniony przez czapeczkę jest degradowany przez egzorybonukleazę Xrn2

(21)

Alternatywne miejsce poliadenylacji

polyA1

AUU

polyA2 polyA3

AUU AUU AUU 3’ UTR

polyA

polyA

polyA

Elementy regulatorowe AAUAAA………..G/U rich

Rys. © dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill

(22)

Alternatywna poliadenylacja

IgM

forma błonowa (limfocyty B – wczesna faza dojrzewania)

forma rozpuszczalna (późna faza dojrzewania limfocyty w osoczu)

Rys. © dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill

(23)

Poliadenylacja

Kontroluje (zwiększa) stabilność mRNA

Dotyczy większości mRNA,

wyjątkiem są mRNA kodujące histony

mRNA histonów stabilne w fazie S, pod koniec szybko degradowane – synchroniczna regulacja

Rys. © dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill

(24)

Składanie (splicing)

Introny – fragmenty pierwotnego transkryptu, które są wycinane i nie występują w dojrzałym transkrypcie

Większość genów wyższych eukariontów zawiera introny, w

przeciętnym genie stanowią przeważającą większość sekwencji transkrybowanej

Alternatywne składanie – różne kombinacje eksonów dają różne ostateczne transkrypty tego samego genu

(25)

Nazwy

Intron - od ang. intervening sequence

Ekson - od ang. expressed sequence - dlatego nie “egzo”!

(26)

Składanie mRNA

(27)

Mechanizm składania u Eukaryota

(28)

Składanie mRNA

W składaniu uczestniczą kompleksy białek i snRNA: snRNP

(29)

snRNP

Rys. © dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill

(30)

Spliceosom

(31)

Nie tylko u Eukaryota

Introny prokariotyczne – inne mechanizmy składania

introny grupy I, II i III

mogą być autokatalityczne

Introny eukariotyczne prawdopodobnie spokrewnione z intronami grupy II

Uwaga: w komórkach eukariotycznych

występują również introny prokariotyczne

w genomach organellarnych (mitochondria, chloroplasty)

(32)

Alternatywne składanie

Wybór różnych miejsc łączenia (tzw. miejsca kryptyczne)

Składanie różnych kombinacji eksonów

Jeden gen – wiele białek

Często tkankowo-specyficzne

Może powodować wstawienie przedwczesnego STOP –

mechanizm regulacji

(33)

Geny wyższych Eukaryota składają się głównie z intronów

Średni transkrypt: 27 000 nt/ 9 eksonów

Eksony średnio stanowią 5%

genu

Średni ekson – 145 nt

Średni intron 3500 nt

(34)

Jak znaleźć ekson?

Rys. © dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill

(35)

Mechanizm “definicji eksonu”

Rys. © dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill

U wyższych eukariontów - rozpoznawany ekson (krótki)

U niższych eukariontów (np. grzyby) - rozpoznawany intron (krótki)

(36)

Sekwencje cis wzmacniające/

hamujące splicing

Rys. © dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill

(37)

Czynniki trans

Białka SR – aktywatory, wiążą ESE

wiązanie powoduje, że fragment jest traktowany jako ekson

Białka hnRNP – represory, wiążą ESS

wiązanie powoduje, że fragment jest traktowany jako część intronu

Rys. © dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill

(38)

Alternatywne składanie - przykłady

Bardzo wiele genów człowieka

może nawet ~94%)

1 gen średnio 3 końcowe transkrypty

Rekordy

Neurexin 3 (człowiek) – 2000 alternatywnych transkryptów

DSCAM (Drosophila) – 40 000 form!!!

(39)

Alternatywne składanie - przykłady

Amylaza śliniankowa i wątrobowa

Tachykininy:

neurotransmitery w narządach zmysłów

neuropeptyd P w układzie nerwowym

neuropeptyd K w tarczycy i jelicie

Determinacja płci Drosophila

(40)

Redagowanie (editing)

Zmiana konkretnego nukleotydu w RNA po transkrypcji

Częste w organellach roślin i niższych eukariontów

Np. apolipoproteina B człowieka

Wątroba, białko 4563 aa

Jelito, białko 2153 aa

(41)

Degradacja RNA

Stała (obrót RNA)

Głównie w cytoplazmie

Regulowana

Przez małe RNA (siRNA, miRNA)

Przez białka

Cytoplazma i jądro

Kontrola jakości

W jądrze (RNA niekodujące)

W jądrze i cytoplazmie (mRNA)

(42)

Degradacja RNA

Czas życia mRNA jest krótki (średnio 10-20 min. drożdże, kilka godzin ssaki)

Różne ścieżki degradacji

3’-> 5’ (egzosom)

pierwszym etapem jest deadenylacja

5’-> 3’ (Xrn)

pierwszym etapem usunięcie czapeczki, egzonukleaza 5’->3’

Na stabilność wpływają sekwencję nie podlegające translacji (UTR) i poliA

Może podlegać regulacji przez czynniki trans

(43)

W CYTOPLAZMIE:

stały rozkład mRNA

Degradacja mRNA

Rys. © dr Monika Zakrzewska-Płaczek, IGiB UW

(44)

Kontrola jakości RNA

Tylko w pełni obrobione (czapeczka, poliadenylacja, składanie) transkrypty są eksportowane z jądra

Transkrypty nieprawidłowo obrobione są degradowane

Degradacja transkryptów z przedwczesnym kodonem STOP (NMD – nonsense mediated decay) – wykrywane nieprawidłowe położenie STOP względem miejsc styku intron/ekson

(45)

Miejsce degradacji RNA

Cytoplazma Jądro

stały rozkład mRNA kontrola jakości pre-mRNA/mRNA systemy kontroli ekspresji genów degradacja wadliwych tRNA i

rRNA

degradacja długich niekodujących RNA Degradacja intermediatów szlaku RNAi

(46)

Mechanizmy kontroli jakości RNA


degradacja mRNA zawierających przedwczesne kodony stop (NMD- nonsense mediated decay)

degradacja mRNA z brakującymi kodonami stop (NSD- non-stop decay)

degradacja jądrowych mRNA i pre-mRNA, które:

nie uległy prawidłowemu dojrzewaniu (tj. składaniu, dojrzewaniu 3’

końca)

nie zostały wyeksportowane do cytoplazmy

degradacja wadliwych stabilnych RNA (np. rRNA) i ich prekursorów

(47)

Długie niekodujące RNA - lncRNA

Niedawno odkryte – funkcje często nieznane

funkcje regulatorowe, poprzez strukturę chromatyny – np. gen FLO11 drożdży

Cryptic Unstable Transcripts

Transkrypcji podlegają długie obszary międzygenowe

Często z promotorów genów, tylko w przeciwnym kierunku

Szybko degradowane przez egzosom (3’->5’ exo)

Rola nieznana, możliwe zaangażowanie w wyciszanie transpozonów, modyfikacje histonów zależne od transkrypcji, regulację (związek z RNAi?)

W jądrze są jeszcze inne tajemnicze niestabilne transkrypty (NUT, PAST, XUT itp.)

(48)

Regulowana degradacja RNA

O stabilności transkryptu

decydują sekwencje 3’ UTR

Wiązanie białek z 3’UTR reguluje stabilność/degradację

Np. IRE-BP - wiąże się z 3’UTR genu receptora transferryny gdy w komórce jest mało jonów

żelaza

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres.

Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc.

(49)

Ciałka P (P-bodies)

Struktury w cytoplazmie, w których zachodzi degradacja mRNA

decapping

przechowywanie nieaktywnych translacyjnie mRNA

miejsce działania miRNA

Marx J (2005), Science 310: 764-5

(50)

Po zakończeniu obróbki

mRNA jest transportowany do cytoplazmy

tam ulega translacji

kluczowe są białka wiążące poliA

(51)

Model pętli

Aktywne translacyjnie mRNA tworzą pętlę

Kluczowe jest białko eIF-4G

Kluczowe dla odróżniania

prawidłowych mRNA i kontroli jakości

(52)

Translacja

Regulowany może być każdy etap translacji

Wybór kodonu AUG (nie ma sekwencji S-D, decydują oddziaływania z białkami wiążącymi 5’ UTR)

Inicjacja

Elongacja

Terminacja

Np. zahamowanie translacji i indukcja GCN4 w odpowiedzi na głodzenie u drożdży

(53)

Białka też podlegają złożonym modyfikacjom

Fałdowanie – wspomagane przez białka opiekuńcze

Modyfikacje chemiczne (fosforylacja, glikozylacja itp.)

Ubikwitynacja i degradacja

Naturalna

Degradacja źle sfałdowanych białek

(54)

Nagroda Nobla w

dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie

mechanizmu interferencji RNA

A. Fire i C. Mello

Nowe role RNA

(55)

Interferencja RNA

Wyciszanie ekspresji genów przez krótkie dwuniciowe RNA homologiczne do sekwencji genu

Może działać na różnych etapach

PTGS – posttranskrypcyjne wyciszanie genów

hamowanie translacji

degradacja RNA

TGS – transkrypcyjne wyciszanie genów

wpływ na strukturę chromatyny

zmiana aktywności czynników transkrypcyjnych

(56)

siRNA, miRNA, stRNA...

siRNA (short interfering RNA) – pochodzą z dwuniciowych cząsteczek, głównie egzogenne (np. wirusy RNA)

miRNA (micro RNA) – pochodzą z cząsteczek o strukturze szpilki do włosów, kodowane w genomie

stRNA (small temporally regulated RNA) – miRNA regulujące rozwój (odkryte u nicieni)

smRNA (small modulatory RNA) – reguluje działanie genów w

neuronach przez zmianę funkcji białka regulującego transkrypcję (represor → aktywator)

(57)

siRNA a miRNA

siRNA – egzogenny dsRNA (np. wirusa) miRNA – endogenny dsRNA

(58)

siRNA - jak to działa?

Hannon G.J.: ‘RNA interference’, Nature 418, July 11, 2002

dsRNA jest egzogenny

Efekt – degradacja mRNA

(59)

miRNA – jak to działa?

dsRNA kodowany w genomie

Efekt:

degradacja mRNA (pełna komplementarność)

lub

hamowanie translacji (częściowa kompl.)

– rozbicie struktury pętli

(60)

Ciałka P (P-bodies)

przechowywanie nieaktywnych translacyjnie mRNA po miRNA

degradacja

niekiedy możliwe “odzyskanie” nieaktywnych mRNA

Marx J (2005), Science 310: 764-5

(61)

miRNA

Powszechny mechanizm regulacyjny

Co najmniej 1000 miRNA kodowanych w genomie człowieka

Co najmniej 10 000 docelowych transkryptów – 1/3 transkryptomu

Nie jest wymagana pełna komplementarność

Ogólna regulacja: dany miRNA działa na wiele docelowych transkryptów

np. procesy rozwojowe

przerzuty nowotworów

(62)

Degradacja po cięciu przez RISC

Rys. © dr Monika Zakrzewska-Płaczek, IGiB UW

(63)

Regulacyjne RNA działają też na transkrypcję

Efekt

– zmiana struktury chromatyny

(64)

RNA też może modyfikować ekspresję chromosomu

Wyciszanie jednej kopii chromosomu X

u kobiet przez RNA XIST

(65)

Zastosowania

Badanie funkcji genów (“odwrotna genetyka”) - szczególnie

skuteczne u nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin

Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania wirusów czy nowotworów)

(66)

RNA a terapia genowa

siRNA skierowane przeciwko:

wirusom (HIV, HCV)

zmutowanym genom (np. choroba Huntingtona)

onkogenom

obniżenie poziomu cholesterolu LDL u myszy przez siRNA przeciwko apolipoproteinie B

Obraz

Updating...

Cytaty

Powiązane tematy :