Intensywność sygnału

(1)

Techniki łączone w analityce chemicznej

dr inż. Andrzej Wasik

Katedra Chemii Analitycznej

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Gdańsk, 2004

(2)

Program

Ograniczenia klasycznej analizy dwuwymiarowej i sposoby ich pokonania.

Definicja technik łączonych.

Rodzaje technik łączonych

Techniki łączone oparte o wykorzystanie:

Podsumowanie

spektrometrii mas - MS

spektroskopii w podczerwieni - IR

spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego - NMR

inne techniki łączone

(3)

Analiza dwuwymiarowa

W typowym przypadku analiza chromatograficzna dostarcza nam informacji dwuwymiarowej.

Najczęściej jest to zależność między wielkością sygnału z detektora (1 wymiar) od czasu retencji (2 wymiar)

Czas

Intensywność sygnału

t_r

i+1

t_r

i

t_r

i+2

GC/FID

(4)

Analiza dwuwymiarowa

Identyfikacja odbywa się na podstawie czasu retencji.

Porównujemy czas retencji analitu z czasem retencji wzorca.

Problem 1

W przypadku analizy skomplikowanych mieszanin nie mamy pewności, że dany pik odpowiada pojedynczej substancji.

Problem 2

Niemożliwa jest identyfikacja nieznanych substancji.

(5)

Analiza dwuwymiarowa

Analiza HPLC-UV ekstraktu z Leuzea carthamoides

2.5 5 7.5 10

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000

?

? ?

?

? ?

?

(6)

Analiza dwuwymiarowa

Problem 1 - nakładanie się pików

Rozwiązanie

Powtórzyć analizę przy użyciu kolumny z innym typem wypełnienia.

Rodzaj oddziaływań pomiędzy analitem a fazą stacjonarną musi być inny niż za pierwszym razem.

Zalety: Wady:

- łatwość wykonania

- niski koszt - wysoka czasochłonność

(7)

Analiza dwuwymiarowa

Problem 2 - identyfikacja nieznanych substancji

Rozwiązanie

Zastosować detektor dostarczający informacji o strukturze analitu.

Innymi słowy zastosować techniki łączone.

Zalety: Wady:

- możliwość identyfikacji nieznanych związków

- informacja o ich masie cząsteczkowej i/lub strukturze

- łatwe wykrywanie faktu nakładania się pików

- szybsze uzyskanie wyniku końcowego

- wysokie koszty inwestycyjne - wysokie wymagania

co do kwalifikacji personelu

(8)

Techniki łączone - definicja

Kombinacja (zestaw) metod badawczych, umożliwiających rozdzielenie badanej

próbki na poszczególne składniki oraz ich jednoznaczną identyfikację.

Rozdzielenie

GC - MS

LC - ICP/MS

Struktura

Skład

pierwiastkowy

(9)

Techniki łączone

Dzięki wykorzystaniu technik łączonych informacja analityczna zyskuje dodatkowy wymiar (struktura).

11

11.5 12

12.5 13

13.5 14

14.5

15 15.516

100 200 300 400 500 600 700 8000 2000 4000 6000 8000

czas m/z

intensywność sygnału

(10)

Przegląd technik łączonych

GC-MS SFC-MS LC-GC-MS LC-DAD CE-DAD

GC-IR SFC-IR LC-GC-IR LC-MS CE-MS

GC-IR-MS SFC-GC-MS LC-ICP-MS

GC-AES SFC-GC-IR LC-IR

GC-ICP-MS LC-NMR

GC-GC-MS LC-MS-MS

LC-LC-MS

Tabela 1 Najpopularniejsze techniki łączone

(11)

Techniki oparte o wykorzystanie Techniki oparte o wykorzystanie

spektrometrii mas (MS)

(12)

Techniki oparte o wykorzystanie spektrometrii mas (X-MS)

Podstawy spektrometrii mas

Spektrometria mas - metoda określania masy (a ściślej stosunku masy do ładunku m/z) cząstek naładowanych elektrycznie (jonów).

Na poruszający się ładunek elektryczny (jon) oddziałuje zarówno pole elektryczne jak i magnetyczne.

W spektrometrach mas wykorzystujemy ten fakt aby z

mieszaniny jonów wybrać te o konkretnym stosunku m/z

i skierować je do detektora, dzięki czemu można określić

ich ilość w mieszaninie.

(13)

Podstawy spektrometrii mas

Wysokorozdzielczy analizator mas z podwójnym ogniskowaniem

(14)

Podstawy spektrometrii mas

Dwa najważniejsze elementy spektrometru mas to:

• komora jonizacyjna, czyli miejsce w którym powstają jony, oraz

• analizator mas

Komora

jonizacyjna jony Analizator mas wlot

próbki

(15)

Podstawy spektrometrii mas

(16)

Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów

Wyróżnić można dwa rodzaje jonizacji:

• „miękka” jonizacja, podczas której tworzy się jedynie jon molekularny (cząsteczkowy) bez fragmentacji cząsteczki,

• „twarda” jonizacja, podczas której cząsteczka rozpada się na fragmenty

Istnieją takie konstrukcje komór jonizacyjnych, które powodują jedynie „miękką” jonizację analitów.

Natomiast podczas jonizacji „twardej” powstaje zawsze

mieszanina jonów cząsteczkowych i fragmentów cząsteczek

analitu.

(17)

Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów

„Miękka” i „twarda” jonizacja cząsteczki analitu

M M

stabilny

kationorodnik

M M

niestabilny kationorodnik

m m

i

j

fragmenty

(18)

Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Od sposobu jonizacji zależy ile informacji o strukturze związku można uzyskać.

„Miękka” jonizacja pozwala jedynie określić masę cząsteczkową analitu.

Jonizacja „twarda” dostarcza informacji o masie

cząsteczkowej i strukturze związku.

(19)

Podstawy spektrometrii mas - metody jonizacji analitów Metody jonizacji

Pole elektryczne o wysokim natężeniu Bombardowanie

strumieniem cząstek

EI FAB

ES/IS FI FD Reakcje

chemiczne

CI PB MALDI APCI/PIS

brak fragmentacji cząsteczek fragmentacja cząsteczek, możliwość określenia struktury

Wysoka temperatura

TS ICP

(20)

Podstawy spektrometrii mas

Wybrane metody jonizacji próbek ciekłych

(21)

Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI)

wysokie napięcie

metalowa kapilara

aerozol

N (~80°C)₂

do pompy próżniowej

analizator dysza mas

separator stożkowy

N (~80°C)₂

Ciśnienie atmosferyczne Próżnia

(22)

wysokie napięcie

metalowa kapilara

aerozol

N (~80°C)₂

do pompy próżniowej

analizator dysza mas

separator stożkowy

N (~80°C)₂

Ciśnienie atmosferyczne Próżnia

Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI)

ODPAROWANIE ROZPUSZCZALNIKA

COULOMBOWSKA EKSPLOZJA KROPLI

AEROLOZU

POWSTANIE JONÓW

[M+nH[M+nH]]ⁿ⁺ⁿ⁺

+ +

+ + +

+

+ +

+

+ +

+++ ++ + +++

+++

+ +++ ++ + +++

+++

+ +++ ++ + +++

+++

+ + ++ + + ++ + +

+ + + +

WYLOT KAPILARY

(23)

2.5 5 7.5 10 0

50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000

Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI)

Widma masowe początku i końca piku są różne.

Oznacza to, że ten pozornie pojedynczy pik powstał z nałożenia dwóch innych.

200 225 250 275 300 325 350 375 400m/z

0 20 40 60 80

100 302.7 316.8

303.8

286.7 399.7

200 225 250 275 300 325 350 375 400m/z

0 20 40 60 80

100 286.8 287.8

(24)

Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI)

• Możliwość pracy w układzie faz odwróconych (faza ruchoma może zawierać wodę).

• Przepływ fazy ruchomej rzędu 1 ml/min.

• Nadaje się do analizy związków wysokocząsteczkowych (peptydy, białka), metaloorganicznych i nieorganicznych.

• „Miękka” metoda jonizacji, niewielka fragmentacja jonów a co za tym idzie trudności w określeniu struktury analitu.

• Wysoka czułość.

• Metoda przydatna do łączenia z kapilarną elektroforezą

(25)

Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

+ + +

+ +

Gaz rozpylający Grzałka

Próbka ciekła

Igła wyładowcza

Wyładowanie koronowe

1. Jonizacja cząstek rozpuszczalnika

2. Reakcje powstałych jonów z cząsteczkami analitu, tworzenie się klastrów. Przeniesienie ładunku.

3. Rozpad klastrów Próżnia Ciśnienie atmosferyczne

Gaz osłonowy

Analizator mas

(26)

Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym -

Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

(27)

Fotojonizacja chemiczna - Photo Ion Spray (PIS)

+ + +

+ +

Gaz rozpylający Grzałka

Próbka ciekła

1. Jonizacja cząstek fotoinicjatora

2. Reakcje powstałych jonów z cząsteczkami analitu, tworzenie się klastrów. Przeniesienie ładunku.

3. Rozpad klastrów Próżnia Ciśnienie atmosferyczne

Gaz osłonowy

Analizator mas

Lampa UV

(28)

Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - (APCI)

Wygląd widma

masowego zależy nie tylko od rodzaju

związku ale także od trybu i parametrów jonizacji, oraz składu fazy ruchomej.

N N N O

SCH₃ NH₂

(H C)3 ₃C Metribuzin C H N_{8 14 4}OS M. cz.: 214.09

50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z

0.0e6 2.5e6 5.0e6 7.5e6 10.0e6 12.5e6 Int.

215

218 237 187

172 395

131 288 469

94107 360 422 451 485

58 79 146 305 322 340

APCI-tryb dodatni

50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z

0 5000 10000 15000 20000 25000 Int.

198 183

168 152

280 407 228

55 69 92 122 141 213 243 258 294 314 339352 368 396 430445 464478 496

APCI-tryb ujemny

N N N O

SCH₃ NH₂

(H C)3 ₃C Metribuzin C H N_{8 14 4}OS M. cz.: 214.09

(29)

Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - (APCI)

• Możliwość pracy w układzie faz odwróconych (faza ruchoma może zawierać wodę).

• Przepływ fazy ruchomej rzędu 2 ml/min.

• Przydatna do analizy związków nielotnych, nietrwałych

termicznie, o małych i średnich masach cząsteczkowych, mało i średnio polarnych.

• Stosunkowo „twarda” metoda jonizacji, odpowiedni dobór parametrów jonizacji pozwala na fragmentację cząsteczek i określenie struktury analitu.

• Wysoka czułość i liniowość odpowiedzi.

(30)

Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB)

Rolą matrycy (rozpuszczalnika) w metodzie FAB jest:

1) absorbcja energii rozpędzonych atomów uderzających w powierzchnię roztworu 2) rozpuszczenie analitu

3) ciągłe odnawianie powierzchni roztworu

4) wspomaganie jonizacji jako donor/akceptor protonów bądź elektronów

Jonizacja strumieniem szybkich atomów zaliczana jest do „miękkich” metod jonizacji. Jonizacja analitów następuje na skutek bombardowania roztworu analitu w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku (matrycy) za pomocą

strumienia szybkich atomów argonu lub ksenonu o energiach rzędu 3-8 keV.

Do jonizacji analitów można też wykorzystać strumień rozpędzonych jonów cezu o energii do 35 keV. Ta modyfikacja FAB znana jest pod nazwą

spektrometrii jonów wtórnych (Secondary Ion Mass Spectrometry - SIMS).

W praktyce różnice pomiędzy obiema metodami są niewielkie.

(31)

Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB)

Działo "atomowe"

Sonda z próbką

Analizator mas

(32)

Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB)

katoda emitująca elektrony

anoda

soczewki jonowe

elektrody odchylające

komora

kolizyjna gaz obojętny (Ar, Xe) źródło jonów

piewotnych (4 - 6 eV)

strumień jonów wtórnych do analizatora mas

sonda z

kroplą próbki ₊ ₊

- "powolne" atomy gazu - gaz zjonizowany - "szybkie" atomy gazu

(33)

Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB)

Sonda do wprowadzania próbki do komory jonizacyjnej FAB.

Na zbliżeniu widoczna jest kropla gliceryny zawierająca rozpuszczony analit.

(34)

Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB)

Dwustronna sonda do wprowadzania próbki do komory jonizacyjnej FAB.

Po jednej stronie umieszcza się próbkę, po drugiej wzorzec. Widoczna na ilustracji dźwignia służy do obracania sondy o 180°.

(35)

Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB)

Modyfikacja sondy FAB umożliwiająca podłączenie chromatografu cieczowego lub kapilarnej elektroforezy.

Obudowa sondy

Ciągły film cieczy Xe /Cs⁰

Strumień jonów wtórnych

Do analizatora mas

Opcjonalny absorbent

eluenta Kwarcowa

kapilara Eluent z LC

z dodatkiem matrycy FAB

Porowaty spiek

(36)

Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB)

Przykład widma masowego uzyskanego metodą FAB

N H

N N NH

C H N_{56 54 4} tetramezytyloporfiryna

(37)

• Zakres przepływów tolerowanych w tej metodzie jest rzędu ułamków mililitra na minutę. Współpraca LC z FAB możliwa jest dzięki zastosowaniu dzielników strumienia eluenta. W przypadku CE dzielniki nie są potrzebne.

• Próbka musi być wymieszana/rozpuszczona w tzw. matrycy np. glicerolu, tioglicerolu bądź alkoholu nitrobenzylowym. Można to zrobić przed kolumną rozdzielczą (możliwe problemy z rozdzieleniem) bądź na jej wylocie (trudności wykonawcze).

• Przydatna do analizy związków nielotnych, nietrwałych termicznie, o dużych masach cząsteczkowych i wysokiej polarności (kwasy nukleinowe, leki, związki powierzchniowo czynne).

• „Miękka” metoda jonizacji.

• Stosunkowo wysoka czułość.

Jonizacja strumieniem szybkich atomów - (FAB)

(38)

Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

Technika MALDI polega na jonizacji składników próbki na skutek naświetlenia silnym i krótkim impulsem lasera UV (3-5 ns, 337 nm).

Mechanizm jonizacji nie jest jeszcze dokładnie zbadany, wiadomo że jest on kilkuetapowy. Pierwszym etapem jest jonizacja specjalnie dobranych składników tzw. matrycy (np. kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy, kwas pikolinowy, 9-

nitroantracen). W kolejnych etapach następuje jonizacja analitów na skutek przekazania ładunku (np. protonu lub kationu sodowego) od jonów matrycy.

MALDI jest unikatową metodą jonizacji analitów. Jej specyficzne cechy można wykorzystać właściwie jedynie w połączeniu z jednym tylko typem analizatora mas jakim jest analizator czasu przelotu (Time Of Flight - TOF).

Dlatego też, mówiąc MALDI najczęściej mamy na myśli połączenie MALDI-TOF.

(39)

Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

Płytki ogniskujące

Obszar przelotu jonów

Repeler

Detektor Laser

Próbka

Schemat analizatora czasu przelotu ze źródłem jonów typu MALDI

(40)

Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

Zasada jonizacji techniką MALDI

(41)

Schemat analizatora czasu przelotu ze źródłem jonów typu MALDI Wspomagana matrycą jonizacja światłem laserowym

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

(42)

Obejrzyj film

(43)

Przykład widma masowego uzyskanego metodą MALDI

N H

N N NH

C H N_{56 54 4} tetramezytyloporfiryna

(44)

Przykład widma masowego uzyskanego metodą MALDI

(45)

• Specyficzna metoda jonizacji. Nie stosuje się do połączeń on-line z technikami rozdzielania substancji.

• Wymaga połączenia z bardzo szybkim analizatorem mas. Dotychczas jedynie analizator TOF spełniał ten warunek. Ostatnio pojawiają się doniesienia o udanych próbach z

użyciem analizatora FT-ICR (Fourier Transform - Ion Cyklotron Resonance).

• Próbka musi być wymieszana/rozpuszczona z tzw. matrycą np. kwasem 2,5- dihydroksybenzoesowym, kwasem pikolinowy lub 9-nitroantracenem.

• Zadaniem matrycy jest pochłonięcie promieniowania laserowego dzięki czemu następuje pośrednia jonizacja analitów.

• Przydatna do analizy związków nielotnych, o dużych masach cząsteczkowych i wysokiej polarności (kwasy nukleinowe, białka, polimery).

• „Miękka” metoda jonizacji.

(46)

Metody jonizacji próbek ciekłych (HPLC, CE)

Jonizacja metodą elektrorozpylania - Electro Spray Ionization (ESI) oraz

Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym - Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

to w chwili obecnej dwie najczęściej stosowane metody jonizacji w chromatografii cieczowej.

Wynika to z ich szerokiego spektrum zastosowań, łatwości użycia, wysokiej czułości oraz możliwości pracy z przepływami fazy ruchomej rutynowo stosowanymi w HPLC.

ESI i APCI to komplementarne metody jonizacji.

(47)

Podstawy spektrometrii mas

Wybrane metody jonizacji próbek gazowych

(48)

Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization

(49)

Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI)

M M

stabilny

kationorodnik

M M

niestabilny kationorodnik

m m

i

j

fragmenty

Podczas jonizacji

strumieniem elektronów (70 eV) zachodzą oba procesy, z przewagą

„twardej” jonizacji.

Uzyskane widmo

masowe jest bogate w jony fragmentacyjne

(50)

Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI)

Przykład widma EI

m/z

0 15 30 45 60 75 90

0 20 40 60 80 100

Pasmo izotopowe (M+1)

Jon molekularny (M) Pasmo główne (największe natężenie)

Jony fragmentacyjne

79 78

77

63 74 51

49 39

2628 15

Benzen, m.cz.=78

(51)

Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI)

Przykład widma EI. Widoczne charakterystyczne piki izotopowe chloru.

m/z

0. 50. 100. 150. 200. 250.

0.

20.

40.

60.

80.

100.

m. cz.:227,69

N N

N

NH NH

Cl

CH₃

CH₃ Cyprazine

227 ( Cl)35 229 ( Cl)37

(52)

Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI)

• Najbardziej popularna metoda jonizacji w chromatografii gazowej.

• „Twarda” metoda jonizacji. Często jon molekularny ma małą intensywność.

• Bogate biblioteki widm masowych - prosta identyfikacja analitów.

• Bardzo szeroki zakres zastosowań.

• Wysoka czułość, liniowość i powtarzalność odpowiedzi.

(53)

Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI)

Zasadniczo konstrukcja komory jonizacyjnej do jonizacji chemicznej jest taka sama jak dla jonizacji strumieniem elektronów.

Różnicę stanowi fakt, iż w przypadku jonizacji chemicznej wraz z próbką do komory jonizacyjnej doprowadza się gaz reakcyjny (metan, amoniak, izobutan) . Cząsteczki gazu reakcyjnego ulegają jonizacji a powstałe jony reagują z

cząsteczkami próbki. Wynikiem tych reakcji jest powstanie zjonizowanych cząsteczek analitów.

Jest to stosunkowo „miękka” metoda jonizacji. Z reguły jon molekularny ma dużą intensywność przy ograniczonej fragmentacji.

(54)

Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI)

(55)

Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI)

0 40 m/z80 120 160 200

Względna intensywność

0 20 40 60 80 100

CI

0 0

ester metylo wy kwasu oktano wego m.cz.=158

[MH]⁺ 159

127 187

199 [M·C H ]₂ ₅⁺

[M·C H ]₃ ₆⁺

0 40 m/z80 120 160

Względna intensywność

0 20 40 60 80 100

EI

0 0

ester metylo wy kwasu oktano wego m.cz.=158

M⁺

Porównanie widm EI oraz CI tego samego związku.

Charakterystyczny brak fragmentacji oraz obecność adduktów w obrazie widma CI.

(56)

Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI)

• Druga pod względem popularności metoda jonizacji w chromatografii gazowej.

• Komora do CI tak niewiele różni się konstrukcją od komory do EI, że wielu producentów wytwarza komory z możliwością przełączenia trybu jonizacji EI-CI

• „Miękka” metoda jonizacji. Ułatwione wyznaczenie masy cząsteczkowej analitu.

• Mała odtwarzalność procesu jonizacji = brak bibliotek widm masowych.

• Metoda komplementarna do EI

(57)

Metody jonizacji próbek gazowych (GC)

Jonizacja strumieniem elektronów - Electron Ionization (EI) oraz

Jonizacja chemiczna - Chemical Ionization (CI)

wraz z ich modyfikacjami to dwie najczęściej stosowane metody jonizacji w chromatografii gazowej.

Wynika to z ich szerokiego spektrum zastosowań, łatwości użycia i wysokiej czułości.

EI oraz CI to komplementarne metody jonizacji.

Największą zaletą jonizacji strumieniem elektronów jest powtarzalność tego procesu czego wynikiem są komercyjnie dostępne biblioteki widm masowych obejmujące tysiące związków chemicznych. Umożliwia to automatyzację procesu identyfikacji nieznanych substancji.

(58)

Podstawy spektrometrii mas

Uniwersalne metody jonizacji próbek

(59)

Jonizacja za pomocą indukcyjnie ogniskowanej plazmy - Inductively Coupled Plasma (ICP) to metoda jonizacji znacząco różniąca się od metod wcześniej omówionych.

Wprowadzenie analitu do indukcyjnie ogniskowanej plazmy powoduje całkowity rozpad cząsteczki i powstanie jednoatomowych jonów.

Metoda ta uniemożliwia określenie struktury cząsteczki ale pozwala na dokładne określenie jej składu pierwiastkowego.

Dzięki wysokiej energii plazmy, efektywności jonizacji i wysokiej czułości, aparaturę ICP/MS można łączyć z praktycznie każdą techniką rozdzielania substancji.

Jonizacja przebiegająca z całkowitym

rozpadem cząsteczki

(60)

Jonizacja za pomocą indukcyjnie ogniskowanej plazmy Inductively Coupled Plasma (ICP)

Kolumna GC lub

wylot rozpylacza

Argon Palnik plazmowy

Do pomp próżniowych Analizator mas

(61)

Przykład wykorzystania techniki ICP-MS

Technika GC-ICP-MS Oznaczanie

organicznych

pochodnych rtęci w tkance dorsza.

0 50 100 150 200

0 5000 10000 15000 20000

Czas retencji [s]

Impulsy [1]

202Hg

200Hg

199Hg

Hg⁰

MeEtHg Et Hg₂

(62)

• Cząsteczka analitu rozpada się na atomy - brak informacji strukturalnej.

• Metoda ta nadaje się do połączeń ze wszystkimi technikami rozdzielania substancji.

• Niezwykle wysoka czułość związana z wysoką efektywnością procesu jonizacji. Niektóre pierwiastki można oznaczać na poziomie fg (!).

• Kosztowna zarówno inwestycyjnie, jak i eksploatacyjnie.

Jonizacja za pomocą indukcyjnie ogniskowanej plazmy

Inductively Coupled Plasma (ICP)

(63)

Podstawy spektrometrii mas

(64)

Podstawy spektrometrii mas - rodzaje analizatorów mas

• Kwadrupolowe (pojedyncze i wielokrotne) (Quadrupole)

• Pułapki jonowe (Ion Trap)

• Analizatory czasu przelotu (Time-Of-Flight TOF)

• Sektory magnetyczne (Magnetic Sector)

• Sektory magnetyczne z podwójnym ogniskowaniem (Double Focusing Magnetic Sector)

• Mieszane np. sektor magnetyczny/pułapka jonowa, kwadrupol/analizator czasu przelotu (Hybrid)

(65)

Podstawy spektrometrii mas

Magnetic Sector Instruments Constant Resolution with mass 10% Valley Definition

Rozdzielczość = m / ∆m

Spektrometry z

sektorem magnetycznym

rozdzielczość nie zależy od masy

(66)

Podstawy spektrometrii mas

Magnetic Sector Instruments Constant Resolution with mass 10% Valley Definition

Rozdzielczość = m / ∆m

Kwadrupole Pułapki jonowe

TOF

rozdzielczość zależy od masy

m/z 500/1, R = 500 m/z 500/0.1, R = 5000

FWHM - Full Width at Half Maximum

Całkowita szerokość w połowie wysokości

(67)

Wpływ rozdzielczości na kształt pików

1.0 FWHM 0.7 FWHM 0.5 FWHM

0.3 FWHM 0.2 FWHM 0.1 FWHM

(68)

Analizator kwadrupolowy - Quadrupole

Źródło jonów

Detektor Pręty kwadrupola

Źródło zasilające pręty

kombinacją napięć, stałego i o częstotliowści radiowej

(69)

Analizator kwadrupolowy - Quadrupole

Wygląd analizatora

kwadrupolowego z prętami o

przekroju hiperbolicznym,

firmy ThermoFinnigan

(70)

Analizator kwadrupolowy - cechy

• Najpowszechniej spotykany typ analizatora

• Typowy zakres m/z: 50 - 2000

• Stosunkowo mała prędkość zbierania pełnych widm (niska czułość w trybie Full Scan)

• Wysoka czułość w trybie SIM

• Relatywnie niska rozdzielczość (siła rozdzielcza)

• Wysoka odtwarzalność (dobrze nadaje się do pomiarów ilościowych)

• Duży zakres dynamiczny (zdolność do pomiaru zarówno dużych jak i małych sygnałów)

(71)

Pułapka jonowa - Ion Trap

(72)

Pułapka jonowa - Ion Trap

(73)

Pułapka jonowa - cechy

• Małe rozmiary, łatwość konserwacji

• Wysoka prędkość zbierania pełnych widm (duża czułość w trybie Full Scan)

• Stosunkowo niska czułość w trybie SIM

• Wysoka rozdzielczość, doskonała do pomiarów jakościowych (identyfikacja)

• Możliwość przeprowadzania wielokrotnych eksperymentów MS-MS

• Mały zakres dynamiczny

• Stosunkowo słaba odtwarzalność

• Jakość widm zależy od wielu parametrów

(74)

Analizator czasu przelotu - Time Of Flight (TOF)

Obszar przelotu jonów

Repeler

Detektor Laser

Próbka

Schemat analizatora czasu przelotu ze źródłem jonów typu MALDI

(75)

Analizator czasu przelotu - Time Of Flight (TOF)

Źródło jonów

Repeler

Detektor

Lustro elektrostatyczne (reflektron)

Niska energia

Wysoka energia

Średnia energia Pierwszy obszar

przelotu jonów

Drugi obszar przelotu jonów

(76)

Analizator czasu przelotu - cechy

• Najszybszy ze znanych analizatorów mas

• Najszerszy praktyczny zakres m/z

• Wysoka czułość

• Wysoka rozdzielczość (siła rozdzielcza)

• Z natury przystosowany do pracy z impulsowymi źródłami jonów jak np.

MALDI, choć istnieją konstrukcje przystosowane do pracy z np. EI

• Wysokie wymagania co do prędkości detektora

(77)

Cyklotron jonowy z transformacją Fouriera

B0

+

RF

wzbudzenie

wzmacniacz

8 MHz 100 kHz

FFT

m/z

(78)

Cyklotron jonowy z transformacją Fouriera

(79)

• Szybkość porównywalna z TOF

• Dokładność wyznaczania masy < 1 ppm

• Bardzo wysoka czułość: 1 attomol = 10^-18 mola

• Wyjątkowo wysoka rozdzielczość >800 000

• Możliwość przeprowadzania wielokrotnych eksperymentów MS-MS

Cyklotron jonowy z transformacją Fouriera - cechy

(80)

Analizatory z sektorem magnetycznym - Magnetic Sector

Analizator mas z sektorem magnetycznym

(81)

Wysokorozdzielczy analizator mas z podwójnym ogniskowaniem

Analizatory z sektorem magnetycznym - Magnetic Sector

(82)

Analizatory z sektorem magnetycznym i podwójnym ogniskowaniem - cechy

• Stanowią wzorzec z którym porównuje się inne typy analizatorów mas

• Bardzo wysoka odtwarzalność

• Najlepszy ze znanych analizatorów pod względem analizy ilościowej

• Wysoka czułość

• Wysoka rozdzielczość (siła rozdzielcza)

• Bardzo szeroki zakres dynamiczny

• Duże rozmiary, wysokie koszty

(83)

Technika MS

ⁿ

Gaz reakcyjny np. argon

Monitorowanie jonów fragmentacyjnych pochodzących od wybranego prekursora

(Product (Fragment) Ion Scan)

CID

(84)

Technika MS

ⁿ

Technika monitorowania jonów fragmentacyjnych pochodzących od wybranego prekursora (Product Ion Monitoring) pozwala na wygodne określenie struktury wybranego analitu (parent ion).

Niektóre opublikowane zastosowania to:

• wczesna diagnoza niektórych chorób genetycznych np. choroby Fabry’ego

• wykrywanie oraz identyfikacja narkotyków i środków farmakologicznych w płynach ustrojowych (bardzo skomplikowana matryca)

• wykrywanie oraz identyfikacja bojowych środków trujących (BST) i potencjalnych BST w warunkach polowych

(85)

Technika MS

ⁿ

Gaz reakcyjny np. argon

Monitorowanie wybranego jonu fragmentacyjnego pochodzącego od wybranego prekursora

(Selected Reaction Monitoring - SRM)

(86)

Technika MS

ⁿ

Technika monitorowania wybranego jonu (jonów) fragmentacyjnego pochodzącego od wybranego prekursora (Selected Reaction Monitoring) pozwala na znaczącą poprawę selektywności i czułości oznaczeń w przypadku analizy próbek o bardzo złożonej matrycy.

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

LC/MS SIM 393

Ekstrakt z moczu konia wyścigowego.

Monitorowanie obecności dexamethazonu.

1.0 2.0 3.0 4.0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

10 0

LC/MS/MS

393 121,147,237

(87)

Techniki oparte o wykorzystanie

spektroskopii w podczerwieni (IR)

(88)

Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni (X-IR)

Podstawy spektroskopii w podczerwieni

Spektroskopia w podczerwieni - metoda badawcza polegająca na pomiarze absorpcji promieniowania z zakresu podczerwieni (IR - Infra Red) przez badane substancje.

Promieniowanie podczerwone (0,78÷1000 µm) pochłaniane jest przez większość substancji chemicznych.

Długość fali pochłanianego promieniowania zależy od rodzaju atomów tworzących wiązanie, jego długości i najbliższego otoczenia atomów.

Wiedząc jakie długości fali promieniowania podczerwonego absorbuje dana substancja możemy określić jej budowę chemiczną.

Można tego dokonać albo przez analizę poszczególnych pasm absorpcji albo przez porównanie widma nieznanej substancji z widmami zawartymi w bibliotekach.

(89)

Podstawy spektroskopii w podczerwieni

częstotliwości radiowe (0.6·10 do 5·10 cm)² ² 10

10

-12

-10

10^-8 10^-6

10^-2

10 10

2 3

0

długość fali energia

λ

ν ¹

---λ

=

mikrofale (3·10 do 10 cm)^-2 ²

podczerwień (7.8·10 do 3·10 cm)^-5 ^-2

światło widzialne (3.8·10 do 7.8·10 cm)^-5 ^-5 ultrafiolet (2·10 do 3.8·10 cm)^-5 ^-5

daleki ultrafiolet (10 do 2·10 cm)^-6 ^-5 promieniowanie X (10 do 10 cm)^-8 ^-6

promieniowanie gamma (10 do 10 cm)^-10 ^-8 promieniowanie kosmiczne (10 do 10 cm)^-12 ^{-1 0}

E = h·ν

(90)

Podstawy spektroskopii w podczerwieni

widzialne

podczerwień

mikrofale

7.8·10 do 3·10 (0.000078-0.0003)

-5 -4

3·10 do 3·10 (0.0003-0.003)

-4 -3

3·10 do 3·10 (0.003-0.03)

-3 -2

0.78 do 3

3 do 30

30 do 300

12820 do 4000

4000 do 400

400 do 33

λ, cm λ, µm λ, cm^-1

(liczba falowa)

cm = 10 m^-2 mm = 10 m^-3 µm = 10^-6 m 42 - 155 kJ/mol

4 - 42 kJ/mol

0.4 - 4 kJ/mol

energia (E)

BLISKA (NEAR)

ŚREDNIA (MID)

DALEKA (FAR)

(91)

Podstawy spektroskopii w podczerwieni

Relative Transmittance

Wavenumber (cm )^-1

1000.

2000.

3000.

0.945 0.96 0.975 0.99

4-Acetamidophenol (paracetamol)

OH N

H CH₃ O

region "fingerprint"

(92)

Podstawy spektroskopii w podczerwieni

Spektroskopia w podczerwieni (IR) jest nieniszczącą metodą badawczą. Dzięki temu aparaturę do IR można łączyć szeregowo z innymi technikami pomiarowymi.

Znane są np. takie połączenia jak GC-IR-MS, LC-IR-MS czy CE-IR-UV.

Dzięki spektroskopii IR możliwe jest rozróżnienie izomerów strukturalnych o bardzo podobnych widmach masowych (!).

Spektroskopię w podczerwieni w połączeniu z chromatografią gazową lub

cieczową wykorzystuje się głównie jako metodę identyfikacji analitów, często jako metodę uzupełniającą (komplementarną) do MS.

(93)

Rel. Abundance

0.

20.

40.

60.

80.

100.

Naftalen C H_{10 8}

Rel. Abundance

0.

20.

40.

60.

80.

100.

m/z

0. 40. 80. 120. 160.

Azulen C H_{10 8}

MS kontra IR

W niektórych przypadkach trudno zidentyfikować pewne substancje jedynie na podstawie prostego widma MS.

Wtedy z pomocą może przyjść IR.

0.2 0.4 0.6 0.8 1.

Naftalen C H_{10 8}

Wavenumber (cm )^-1

1000.

2000.

3000.

0.2 0.4 0.6 0.8 1.

Azulen C H_{10 8}

(94)

Połączenie GC-IR

Obecnie stosowane spektrometry IR to praktycznie wyłącznie aparaty FT-IR (Fourier Transform Infra Red), cechują się one dużą prędkością zbierania widm (kilka sekund na widmo), mniejszym kosztem, wyższą stabilnością oraz lepszą czułością w porównaniu do klasycznych spektrometrów dyspersyjnych.

Wiązka IR ze spektrometru Detektor

Wylot kolumny GC Do innych detektorów

np. MS

Ogrzewany termostat Celka pomiarowa wykonana

w technologii Lightpipe

(95)

Połączenie GC-IR

(96)

Połączenie HPLC-IR (SFC-IR)

Wiązka IR

ze spektrometru Gaz ogrzewający kapilarę Eluent z

kolumny HPLC

Kapilara śr. wew. 100 µm

Faza

ruchoma Osad

analitu Grzałka

dyszy

Do detektora

Silnik Germanowy

dysk

Lustro IR

(97)

Spektroskopia w podczerwieni - cechy

• Nieniszcząca metoda badawcza. Możliwość szeregowego łączenia z innymi detektorami.

• Umożliwia rozróżnienie izomerów strukturalnych. Metoda komplementarna do MS.

• Stosunkowo mała czułość.

• Szeroko stosowana do identyfikacji leków, używek, polimerów, barwników.

• Bogate biblioteki widm IR ułatwiają identyfikację nieznanych substancji.

(98)

Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii

magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)

(99)

Techniki oparte o wykorzystanie spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)

Podstawy spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (Nuclear Magnetic Resonance)

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego - metoda badawcza polegająca na pomiarze absorbcji promieniowania

elektromagnetycznego przez jądra atomowe umieszczone w silnym zewnętrznym polu magnetycznym.

Jądra atomowe wykazują właściwość zwaną spinem. O ile liczba protonów i liczba neutronów tworzących jądro nie są jednocześnie parzyste to spin takiego jądra jest różny od zera. Takie jądra atomowe są przedmiotem badań NMR.

W zależności od swojego ułożenia w cząsteczce związku chemicznego, atomy (jądra atomów) danego pierwiastka pochłaniają różne częstotliwości promieniowania co umożliwia określenie ich ilości oraz wzajemnego położenia.

(100)

Podstawy spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

(Nuclear Magnetic Resonance)

(101)

Podstawy spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

(Nuclear Magnetic Resonance)

(102)

Podstawy spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Praktyczne zastosowanie w spektroskopii NMR mają jedynie nieliczne rodzaje jąder atomowych. Największe znaczenie mają: ¹H, ¹³C, ¹⁹F, ³¹P.

Wykonanie widma NMR wymaga pewnego czasu ze względu na konieczność mierzenia bardzo słabych sygnałów co wymaga uśredniania wyników z kilku pomiarów.

Czułość NMR należy zaliczyć do niskich. Dla próbek rzeczywistych wymagana masa substancji poddawanej badaniu to około 500 ng.

(103)

Podstawy spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

(104)

Połączenie LC-NMR

Pompa

Zawór dozujący

Kolumna

chromatograficzna

Detektor

Zawór

przełączający

2 - 2,5 m

Głowica NMR

Kapilara

Ciągły przepływ eluatu przez celkę

(on-flow)

Przepływ eluatu przez celkę wstrzymany

(stopped flow)

(105)

Próbniki NMR

cewka odbiorcza

przepływowa

celka pomiarowa kapilara do CE kolumna do µHPLC

(106)

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego - cechy

• Nieniszcząca metoda badawcza. Możliwość szeregowego łączenia z innymi detektorami.

• Technika dostarczająca wyjątkowo dużo informacji o strukturze analitu.

• Mimo pozornej prostoty widm ich interpretacja wymaga dużej wiedzy i doświadczenia.

• Stosunkowo mała czułość.

• Wysokie koszty, zarówno inwestycyjne jak i eksploatacyjne.

(107)

Inne popularne techniki łączone

(108)

Inne popularne techniki łączone

AED - Atomic Emission Detector (detektor emisji atomowej)

AES - Atomic Emission Spectroscopy (spektroskopia emisji atomowej)

OES - Optical Emission Spectroscopy (spektroskopia emisji optycznej)

DAD - Diode Array Detector (detektor z matrycą diodową) Emisyjna i absorpcyjna spektroskopia optyczna (w zakresie od ultrafioletu do światła widzialnego)

Wszystkie wymienione powyżej akronimy odnoszą się do różnych metod spektroskopowych, których domeną jest badanie emisji bądź absorbcji promieniowania w zakresie od dalekiego ultrafioletu do światła widzialnego (100 - 780 nm).

(109)

Inne popularne techniki łączone

AED AES OES - metody emisyjne, DAD - metoda absorpcyjna Emisyjna i absorpcyjna spektroskopia optyczna

(w zakresie od ultrafioletu do światła widzialnego)

Wszystkie wymienione powyżej akronimy odnoszą się do różnych metod spektroskopowych, których domeną jest badanie emisji bądź absorbcji promieniowania w zakresie od dalekiego ultrafioletu do światła widzialnego (100 - 780 nm).

Metody emisyjne opierają się na pomiarze natężenia promieniowania o określonych długościach fali, charakterystycznych dla danego pierwiastka.

Metody absorpcyjne wykorzystują fakt absorpcji promieniowania, przy czym stopień absorbcji światła o różnych długościach fali jest różny w zależności od rodzaju cząsteczki (analogicznie jak w IR).