Podstawy genetyki III

(1)

Podstawy genetyki III

Biologia molekularna genu, replikacja, mutageneza, naprawa DNA

(2)

Zarys biologii molekularnej

genu

(3)

Funkcje informacji genetycznej

•

Replikacja

• powielanie genomu, utrzymywanie stabilności genomu

•

Ekspresja

• Odczytywanie informacji, niezbędne do funkcjonowania komórki

• Regulowana

(4)

Materiał genetyczny

Bakterie zawierają

„czynnik

transformujący, zdolny do

przekazania

informacji z martwych bakterii do żywych

Frederick Griffiths, 1928

(5)

DNA

Czynnikiem

transformującym jest DNA

Oswald Avery, Colin MacLeod, Maclyn McCarty, 1943

(6)

Materiał genetyczny

• Materiałem genetycznym są kwasy nukleinowe

• Materiałem genetycznym

organizmów komórkowych jest

kwas deoksyrybonukleinowy (DNA)

(7)

Budowa DNA

• DNA zbudowany jest z nukleotydów

(8)

Zasada komplementarności

Na podstawie sekwencji jednej nici można jednoznacznie odtworzyć sekwencję nici

komplementarnej

5’GATGTACTGATGACATA3’

3’CTACATGACTACTGTAT5’

5’GATGTACTGATGACATA3’

(9)

Model semikonserwatywny replikacji

(10)

Centralna hipoteza (“dogmat”)

DNA

RNA

BIAŁKO

(11)

DNA

RNA

BIAŁKO

Centralna hipoteza („dogmat”)

(12)

Droga od DNA do białka

(13)

Ekspresja genów prokariotycznych

•

dominuje regulacja na poziomie transkrypcji

•

policistronowe jednostki

transkrypcyjne o wspólnej regulacji transkrypcyjnej – operony

•

mRNA szybko degradowane,

translacja zachodzi zasadniczo

równocześnie z transkrypcją

(14)

Ekspresja genów prokariotycznych i eukariotycznych

•

Eukaryota

• Procesy transkrypcji i translacji są rozdzielone w przestrzeni i czasie

• Każdy gen ma własny promotor, nie występują operony

• Proces ekspresji genu składa się z wielu etapów

• Na każdym z etapów możliwe działanie regulacyjne

• Informacja kierująca syntezą białka może być modyfikowana po transkrypcji (alternatywne składanie, redagowanie) – złożoność proteomu przekracza złożoność genomu

(15)

Transkrypcja

• U eukariontów występują 3 wyspecjalizowane polimerazy RNA.

• Za transkrypcję genów kodujących białka odpowiada polII

(16)

Losy mRNA w komórce eukariotycznej

•

Transkrypcja

•

Dodanie „czapeczki” na końcu 5’

•

Składanie (splicing)

•

Poliadenylacja na końcu 3’

•

Transport do cytoplazmy

•

Translacja

•

Degradacja

(17)

Etapy ekspresji/poziomy regulacji u Eukaryota

•

struktura chromatyny

•

transkrypcja

•

obróbka i kontrola jakości RNA

•

transport RNA

•

degradacja RNA

•

translacja

•

modyfikacje post-translacyjne

•

degradacja białka

(18)

Elementy systemów regulacji

•

Elementy cis

• Znajdują się w obrębie tej samej cząsteczki, co element podlegający regulacji

• Elementy cis w obrębie DNA

• np. promotory, operatory, enhancery

• Elementy cis w obrębie RNA

• sekwencje wiążące białka regulujące translację, splicing, degradację itp.

(19)

Elementy systemów regulacji

•

Elementy trans

• Odrębne cząsteczki oddziałujące z elementami cis i modulujące ekspresję

• Białka regulujące transkrypcję (czynniki transkrypcyjne), aktywatory, represory itp.

• Białka regulujące inne etapy ekspresji (aktywatory/represory translacji, splicingu itp.)

• RNA regulatorowe (siRNA, miRNA itp.)

(20)

Podstawy regulacji genu

•

Regulacja pozytywna

• czynnik trans jest aktywatorem – zwiększa ekspresję

•

Regulacja negatywna

• czynnik trans jest represorem – osłabia ekspresję

(21)

Podstawy regulacji genu

•

Regulacja indukowalna

• Sygnał zwiększa (indukuje) ekspresję

•

Regulacja reprymowalna

• Sygnał zmniejsza (reprymuje) ekspresję

•

Możliwe są różne układy, np. regulacja negatywna indukowalna

• Nie należy mylić pojęć: pozytywna/negatywna dotyczy aktywności

czynnika trans a indukowalna/reprymowalna – odpowiedzi na sygnał

(22)

Przykład – operon lac

W. S Klug, M.R Cummings “Concepts of Genetics” 8th edition, Prentice Hall, 2005

(23)

Operony

•

Typowy dla bakteri i archeonów system ekspresji

•

Policistronowy transkrypt –

wspólna ekspresja wielu genów z jednego promotora

•

Przeważnie geny związane funkcją, ale są wyjątki

Figure 8.8 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

(24)

Kod genetyczny

•

Trójkowy

• 20 aminokwasów

• kodony po 3 nukleotydy: 4³=64 możliwości

• Dowody: badanie mutantów insercyjnych i delecyjnych (3 kolejne insercje lub delecje przywracały funkcje)

(25)

Kod genetyczny

•

Nienakładający się

• Dowody:

• załóżmy sekwencję GTACA: jeden kodon: TAC, pozostałe: GTA i ACA

(nakładanie 2 nukleotydów). Przy danym kodonie “centralnym”, możliwe tylko 4² = 16 różnych kombinacji trzyaminokwasowych. W naturze

natomiast występują wszystkie możliwe kombinacje (20²=400).

• Pojedyncza zmiana nukleotydowa w sekwencji kodującej zmienia tylko jeden aminokwas, a nie dwa sąsiednie

(26)

Kod genetyczny

•

Bezprzecinkowy

•

Zdegenerowany

• 3 kodony STOP, pozostałe 61 kodonów koduje 20 aminokwasów

(27)

Kod genetyczny

•

Kod jest jednoznaczny

•

Dany kodon zawsze koduje jeden i tylko jeden aminokwas

• Degeneracja oznacza, że jeden aminokwas może być kodowany przez więcej kodonów

(28)

Kod genetyczny

(29)

Uniwersalność kodu

•

Kod genetyczny jest zasadniczo taki sam u wszystkich organizmów na Ziemi

•

Nieznaczne odstępstwa przez ewolujcję pojedynczych tRNA

• kody organellarne (np. UGA - Trp a nie stop w mitochondriach)

• niektore orzęski

• nieliczne grzyby (CUG Ser a nie Leu u Candida)

(30)

Regularności w kodzie

•

Trzecia pozycja kodonu najmniej znacząca

• (np. UCx – Ser)

•

Aminokwasy o podobnych właściwościach często z podobnymi kodonami

• Np.

• AAA, AAG: lizyna; AGA, AGG: arginina

• UCx: seryna; ACx: treonina

(31)

Parowanie wobble

W 3 pozycji kodonu (1 antykodonu) dozwolone parowanie G-U oraz I-U/A/A (I – inozyna)

tzw. zasada tolerancji Cricka

(32)

Translacja

(33)

Nobel 2009 - chemia

(34)

(35)

Sekwencja białka zawiera sygnały sortowania do przedziałów komórki

Kierowanie do ER i szlaku wydzielniczego zachodzi równocześnie z translacją

Kierowanie do mitochondrium zachodzi po translacji

(36)

Białka podlegają złożonym modyfikacjom

•

Fałdowanie – wspomagane przez białka opiekuńcze

• Białka opiekuńcze odgrywają ważną rolę w patogenezie wielu chorób

(nowotwory, choroba Huntingtona i inne choroby agregacyjne, choroba Parkinsona i Alzheimera, mukowiscydoza)

•

Modyfikacje chemiczne (fosforylacja, glikozylacja itp.)

•

Ubikwitynacja i degradacja

• Zaburzenia w ubikwitynacji i degradacji białek stwierdzono w rodzinnej postaci choroby Parkinsona, zespole Angelmana, anemiach

Fanconiego, zespole von Hippel-Landau i innych

(37)

Replikacja DNA

(38)

Replikacja

Model semikonserwatywny:

w każdej cząsteczce potomnej jedna nić rodzicielska i jedna nowa

(39)

Teoretycznie możliwe modele replikacji

Rozproszony

Semikonserwatywny

Konserwatywny

(40)

Doświadczenie Meselsona i Stahla

(41)

Doświadczenie Meselsona i Stahla

(42)

Etapy replikacji

•

Inicjacja

•

Elongacja

•

Terminacja

(43)

Inicjacja u bakterii

•

Replikacja rozpoczyna się w miejscu ori

•

Rozplecenie (topnienie)

podwójnej helisy DNA

(44)

Inicjacja u Eukaryota

(45)

Elongacja

(46)

Replikacja małego genomu kolistego –

pętla D

(47)

Replikacja małego genomu kolistego –

rolling circle

(48)

Problem topologiczny

•

Replikacja DNA postępując będzie generować naprężenia (superskręty)

•

W DNA liniowym praktycznie nierozwiązywalne ze względu na upakowanie w komórce

•

W DNA kolistym absolutnie nierozwiązywalne ze

względu na brak wolnych końców

(49)

Problem topologiczny - topoizomerazy

Topoizomeraza typu I wprowadza nacięcie w jednej z nici, przesuwa drugą nić przez przerwę i łączy końce

Topoizomerazy typu II nacinają obie nici

(50)

Synteza DNA - polimeraza

• Synteza DNA (i RNA też) zawsze zachodzi przez dołączanie nowych nukleotydów do grupy –OH na końcu 3’ syntetyzowanej

cząsteczki

• Substratem są trójfosforany nukleotydów, enzymem polimeraza (zależna od DNA polimeraza DNA)

• Polimeraza DNA potrafi dobudowywać

nukleotydy do istniejącego łańcucha, nie potrafi rozpocząć syntezy

(51)

Startery

(52)

Prymaza

Prymaza (polimeraza RNA zależna od DNA) syntetyzuje starter (RNA) dla polimerazy DNA, która go wydłuża.

U Eukaryota:

kompleks pol α:

podjednostki prymazy

i polimerazy DNA

(53)

Aktywności polimeraz DNA

Synteza DNA

Egzonukleaza 3’-5’ – korekcja błędów

Egzonukleaza 5’-3’ – naprawa uszkodzeń, usuwanie starterów

(54)

Problem nici nieciągłej

Na nici nieciągłej trzeba co pewien odcinek ponawiać

syntezę startera – fragmenty Okazaki

(55)

Maszyneria replikacyjna

(56)

Maszyneria replikacyjna

• Topoizomeraza - usuwa naprężenia

• Helikaza (DnaB) - rozdziela nici

• SSB – stabilizuje jednoniciowy DNA

• Prymaza – syntetyzuje startery

• Polimeraza (-y)

• Ligaza – skleja fragmenty

(57)

Widełki replikacyjne - topologia

(58)

(59)

PCNA (Eukaryota)

•

Proliferating Cell Nuclear Antigen

•

Kompleks białkowy w formie

pierścienia przesuwającego się po nici DNA w czasie replikacji

•

Koordynuje różne etapy replikacji

i syntezy DNA

(60)

Inne kompleksy białkowe

•

MCM – Mini Chromosome Maintenance – pierścień przesuwający się razem z widełkami replikacyjnymi

•

GINS – (Go, Ichi, Ni, San; 5,1,2,3) – pierścień współdziałający z

MCM, przejście z fazy inicjacji do elongacji i utrzymanie elongacji

GINS

(61)

Polimerazy bakteryjne

PolIII (PolC)– główny enzym replikacyjny, ma aktywność Exo 3’-5’ (korekta błędów), synteza do 1000 nt/s

PolIII nie ma aktywności Exo5’-3’

PolI (PolA) – ma dodatkowo aktywność Exo 5’-3’, usuwa startery i dokańcza syntezę, do 20 nt/s

Ligaza łączy zsyntetyzowane fragmenty (nie jest polimerazą)

(62)

Polimerazy bakteryjne c.d.

•

PolII (PolB)– naprawa uszkodzonego DNA w fazie stacjonarnej

•

PolIV i polV – synteza DNA w fazie stacjonarnej (polIV) i przy

znacznych uszkodzeniach genomu (polV)

(63)

Polimerazy Eukaryota

• Pol α – prymaza, wydłuża startery

• Pol β – naprawa DNA

• Pol δ – główny enzym replikacyjny

• Pol ε – replikacja, kontrola cyklu kom., naprawa DNA

• Pol γ – replikacja DNA w mitochondriach

Polimerazy eukariotyczne nie mają aktywności Exo 5’-3’, startery RNA

usuwają nukleazy FEN1, RnazaH i inne białka

(64)

Dwie klasy polimeraz

•

O dużej wierności – mało błędów, ale wrażliwe na uszkodzenia w matrycy

• zatrzymują się w miejscu uszkodzenia

• standardowe enzymy replikacyjne

•

O niskiej wierności – więcej błędów, ale mniej wrażliwe na uszkodzenia matrycy

• są w stanie kontynuować syntezę mimo uszkodzeń matrycy – TLS (trans-lesion synthesis)

• mechanizm umożliwiający dokończenie replikacji uszkodzonego DNA (zapobiega rearanżacjom genomu)

(65)

Rola PCNA

•

Ubikwitynacja i deubikwitynacja

PCNA przełącza między replikacją TLS i wierną

http://www.acsu.buffalo.edu/~kowalsk/dnarepair/

(66)

Więcej o replikacji (u Eukaryota)

http://www.dnareplication.net/

(67)

Trochę zamieszania

•

Synteza DNA rozpoczyna się zawsze od startera RNA

•

Replikacja DNA rozpoczyna się od miejsca ori

(68)

Synteza DNA rozpoczyna się zawsze od startera RNA?

• Odkryty w 2013 enzym PrimPol,

aktywny w mitochondriach ssaków

• Jest polimerazą DNA typu TLS

• Jest w stanie zainicjować syntezę DNA od startera z DNA!!

(69)

Replikacja DNA rozpoczyna się od miejsca ori?

• Szczep Haloferax volcanii (Archaea) pozbawiony wszystkich miejsc ori

• Rośnie nawet szybciej od dzikiego

• Inicjacja replikacji przez rekombinację

(70)

Problem nici nieciągłej

Na nici nieciągłej trzeba co pewien odcinek ponawiać syntezę startera –

fragmenty Okazaki

(71)

Problem zakończenia replikacji DNA liniowego

• Na końcu cząsteczki nie ma skąd zacząc nowego fragmentu

Okazaki na nici opóźnionej

• Cząsteczka potomna będzie skrócona

(72)

Telomery

• Końce chromosomów

• Sekwencje powtórzone (TTAGGG)

• Skracają się przy każdym podziale komórki

• W niektórych komórkach mogą jednak być odtwarzane

Aubert & Lansdorp, Physiol Rev • vol 88

(73)

Telomery i telomeraza

• Telomeraza może wydłużać

telomery wykorzystując fragment RNA

• Skracanie telomerów ogranicza liczbę podziałów niektórych

komórek

• Aktywacja telomerazy związana jest z unieśmiertelnianiem

komórek nowotworowych

(74)

Kompleks chroniący końce chromosomów

•

Shelterin (ang. shelter = schronienie)

•

Pozbawienie telomerów białek indukuje odpowiedź naprawy uszkodzeń DNA

Denchi, DNA Repair 8 (2009) 1118–1126

(75)

Telomery a starzenie

•

Komórki somatyczne mają ograniczoną liczbę możliwych podziałów – granica Hayflicka

•

Komórki linii płciowej (i macierzyste) dzielą się bez orgraniczeń

•

Granica Hayflicka związana jest ze skracaniem się telomerów

• Aktywacja telomerazy wystarcza do unieśmiertelnienia i umożliwienia nieograniczonych podziałów

(76)

Los komórki, która utraciła telomery

•

Aktywacja szlaków odpowiedzi na uszkodzenia DNA

•

Sygnał uszkodzeń genomowych – zastopowanie cyklu komórkowego (tzw. kryzys replikacyjny)

•

Ograniczenie zdolności podziałowej jest ważnym mechanizmem ochronnym

• Zapobieganie nowotworom

• Utrzymywanie zróżnicowania klonalnego populacji komórek macierzystych

(77)

Telomery a odpowiedź na uszkodzenia DNA

(78)

Telomery a nowotwory

• W komórkach z defektywnym szlakiem odpowiedzi na

uszkodzenia DNA (np. defekty p53) komórki ze skróconymi (lub

uszkodzonymi) telomerami wciąż się dzielą

• Efektem są rearanżacje

chromosomów (fuzje, translokacje)

• W komórkach nowotworowych ponowna aktywacja telomerazy

(79)

Dwa oblicza telomerów

•

Telomery chronią przed uszkodzeniami DNA i zaburzeniami

chromosomów, które mogą prowadzić do nowotworzenia, ale...

•

Aktywność telomerazy unieśmiertelnia komórki (aktywna w 90%

nowotworów)

(80)

Telomery a starzenie

•

U drożdży defekt telomerazy – ustanie podziałów po kilku pokoleniach

•

U roślin, bezkręgowców i myszy –

podobnie (defekt po kilku pokoleniach)

•

U człowieka – nawet częściowa utrata telomerazy (heterozygota) powoduje poważne defekty:

•

niedokrwistość

•

defekty układu odpornościowego

•

zwłóknienie płuc

Aubert & Lansdorp, Physiol Rev • vol 88

(81)

Co nam może dać telomeraza

• Wieczna młodość??

• Leki

przeciwnowotworowe?

(82)

Wieczna młodość?

• Starzenie się komórek somatycznych, nie dzielących się (np. układ nerwowy) – nie zależy od telomerów

• Telomery odgrywają rolę w starzeniu się komórek macierzystych i komórek układu odpornościowego

• Skracenie telomerów jest ważnym mechanizmem przeciwnowotworowym

• Systemy podtrzymujące stabilność DNA komórek somatycznych nie są lepsze, niż jest to absolutnie niezbędne (“disposable soma”)

(83)

“Magiczna moc telomerazy”

(84)

“Magiczna moc telomerazy” c.d.

(85)

Terapie przeciwnowotworowe

•

Telomeraza jest aktywna w >90% nowotworów

•

Inhibitory telomerazy

• chemiczne

• siRNA

• przeciwciała (szczepienia)

(86)

(87)

Mutageneza i naprawa DNA

(88)

Zmiany genomu

•

Wielkoskalowe

•

Zmiany liczby i formy chromosomów, duplikacje całych genomów

•

Rearanżacje chromosomowe

•

Dotyczą dużej liczby genów, fenotyp plejotropowy

•

Mutacje

•

Dotyczą jednego, bądź niewielkiej liczby genów

(89)

Mutacja

•

Trwała, przekazywana przy replikacji zmiana sekwencji nukleotydowej w materiale genetycznym

• Nie każde uszkodzenie DNA jest mutacją – staje się nią dopiero po utrwaleniu i przekazaniu do cząsteczki (lub cząsteczek) potomnych

(90)

Mutacja i naprawa

(91)

Replikacja utrwala zmianę

(92)

Przyczyny mutacji

•

Mutacje spontaniczne

• Nieuniknione błędy podczas replikacji

•

Mutacje indukowane

• Błędy w wyniku działania czynników uszkadzających DNA lub zaburzających replikację – mutagenów

•

Podział nie jest ścisły – mechanizmy nieraz są podobne, wiele

mutagenów zwiększa częstość błędów o mechanizmie takim, jak

przy mutacjach spontanicznych

(93)

Dokładność replikacji

• Specyficzność parowania nukleotydów nie jest zbyt wysoka (~5%)

• Mechanizm selekcji nukleotydów polimerazy: na 3 etapach:

• wiązanie nukleotydu z polimerazą

• przenoszenie do centrum aktywnego

• dołączanie do 3’ końca syntetyzowanego łańcucha

• Mechanizm korekcji błędów:

• Aktywność egzonukleazy 3’-5’

• Usuwanie niewłaściwie wstawionego nukleotydu

• Zasada konkurencji między aktywnością polimerazy a egzonukleazy

(94)

Dokładność replikacji

•

Ostatecznie polimeraza jest bardzo dokładnym enzymem

•

U E. coli częstość błędów 1:10

⁷

wstawianych nukleotydów

•

Częstość błędów na nici opóźnionej 20x wyższa niż na wiodącej

• PolI mniej dokładna niż PolIII

(95)

Mutacje spontaniczne – tautomeria zasad

• Zasady azotowe występują w fomach tautomerycznych keto i enol (T, G, U) oraz amino i imino (A, C)

• Dominuje forma ketonowa (lub aminowa) i ona daje właściwe parowanie

• Rzadszy tautomer enolowy/iminowy może dać niewłaściwe parowanie

(96)

Poślizg replikacji

•

Częsty w sekwencjach powtórzonych, powoduje insercje i delecje

•

Zmienne sekwencje mikrosatelitarne

• Wykorzystywane jako markery w badaniach populacyjnych, kryminalistycznych itp.

• Niestabilność mikrosatelitów jest jednym z fenotypów komórek nowotworowych

•

Ekspansje powtórzeń trójnukleotydowych – mutacje dynamiczne

(97)

Poślizg replikacji

• Przesunięcie nici matrycowej i potomnej o jedną (lub więcej)

jednostkę (zachowane parowanie)

(98)

Ekspansje trójkowe

•

Wydłużanie serii powtórzeń trójnukleotydowych

•

Mechanizm złożony: możliwe zaburzenia syntezy nici opóźnionej, efekt struktury DNA

•

Przyczyna szeregu chorób genetycznych

•

Niekiedy efekt antycypacji:

• liczba powtórzeń rośnie z pokolenia na pokolenie, aż osiągnie wartość krytyczną

• fenotyp w każdym kolejnym pokoleniu coraz cięższy

(99)

Przykłady chorób

• Zespół kruchego chromosomu X

• norma (CAG)_6-35, chorzy (CAG)_>60

• w sekwencji liderowej genu

• Choroba Huntingtona

• norma (CAG_)6-35, chorzy (CAG)_36-121

• w sekwencji kodującej, trakt poliglutaminowy

• cecha dominująca, agregacja białka

• Ataksja Friedreicha

• norma (CTG_)5-37, chorzy (CTG)_40-200

• w intronie, zaburza splicing, obniżony poziom białka

(100)

Mutageny

• Chemiczne

• analogi zasad – błędnie wykorzystywane jako substraty

• reagujące bezpośrednio z DNA – np. czynniki alkilujące, deaminujące, interkalujące, tworzące addukty

• działające pośrednio – np. zwiększające produkcję reaktywnych form tlenu (nadtlenki, rodniki) w komórce

• działające na polimerazę – np. jony Mn2+ (zamiast Mg2+) jako kofaktory polimerazy γ powodują wzrost częstości błędów

• Fizyczne

• Np. UV, promieniowanie jonizujące, temperatura

• Biologiczne

• Wirusy i ruchome elementy genetyczne integrujące się do genomu

(101)

Mutagen chemiczny - przykład

•

5-bromouracyl

• analog tyminy, ale

równowaga przesunięta w stronę formy enolowej, tworzącej pary z G

(102)

Mutageny chemiczne

•

EMS (metanosulfonian etylu)

• alkiluje zasady azotowe

•

Czynniki deaminujące (kwas azotawy, dwusiarczyn sodowy)

• Deaminacja adeniny daje hipoksantynę: paruje z C zamiast T

(103)

Czynniki interkalujące

•

Płaskie cząsteczki, wciskają się między pary zasad, zmieniają

skok helisy – najczęściej insercje

•

np. bromek etydyny, akryflawiny

•

silniejsze działanie na

niewielkie cząsteczki koliste

(104)

Działanie temperatury

•

Hydroliza wiązania β-N-glikozydowego, powstaje miejsce AP (apurynowe/apirymidynowe) i luka

•

Zwykle wydajnie naprawiane, ale w sytuacjach przeciążenia systemów naprawczych może być mutagenne

• W ludzkich komórkach powstaje 10 000 miejsc AP dziennie

(105)

Działanie UV

•

Powstają fotoprodukty – np. dimery

cyklobutylowe sąsiadujących zasad

(najczęściej T-T), uszkodzenia 6-4

(106)

Naprawa DNA

•

U E. coli częstość błędów polimerazy 1:10

⁷

wstawianych nukleotydów

•

Ogólna częstość błędów przy replikacji: 1:10

¹⁰

– 1:10

¹¹

wstawianych nukleotydów

• genom ~4,6⋅10⁶ bp, czyli błąd raz na ~2000 – 20 000 podziałów

•