WSTÊP
W wyniku olbrzymiego postêpu biologii molekularnej i komórkowej, jaki dokona³ siê w 2. po³owie mijaj¹cego stulecia, w zakre- sie nauk medycznych pojawi³y siê nowe, do niedawna niewyobra¿alne mo¿liwoœci dia- gnostyczne i terapeutyczne. Odnosz¹ siê one w szczególnoœci do badañ w zakresie patogenezy chorób o pod³o¿u genetycznym.
Wiadomo, ¿e patogeneza schorzeñ nowo- tworowych i wielu chorób nabytych tkwi w zmutowanych genach. Techniki sekwen- cjonowania genomów oraz skomputeryzowa- na analiza porównawcza otwieraj¹ drogê do usuwania zmutowanych pod wzglêdem ge- netycznym komórek (przeciwcia³a monoklo- nalne), zwiêkszania puli zdrowych komórek o w³aœciwym garniturze genetycznym (tera- pia genowa) b¹dŸ blokowania ekspresji zmutowanego genu (strategia antygenowa i antysensowa). Szczególnie zaawansowane s¹ prace badawcze dotycz¹ce blokowania ekspresji wybranego genu za pomoc¹ an- tysensowych oligonukleotydów.
Wprawdzie z zakresu tej ostatniej strate- gii terapeutycznej w piœmiennictwie polsko- jêzycznym ukaza³o siê w po³owie lat 90. kil- ka prac o charakterze monograficznym, pre- zentuj¹cych podstawy teoretyczne oraz metodologiczne [1, 2], jednak ostatnie 5 lat zaowocowa³o szeregiem doniesieñ w litera- turze œwiatowej, weryfikuj¹cych s³usznoœæ po- czynionych za³o¿eñ [3, 4]. Liczne s¹ tak¿e opracowania monograficzne, w g³ównej mie- rze sumuj¹ce wyniki metodologii i skutecz- noœci strategii antysensowej modulacji eks- presji genów [5]. Oczywiœcie, tematyka ba- dañ w tej dziedzinie jest bardzo szeroka, niemo¿liwe jest dokonanie przegl¹du tak sze- rokiej dziedziny badawczej w jednej pracy.
W niniejszym artykule podjêto próbê za- prezentowania najbardziej zaawansowanych
badañ klinicznych z zastosowaniem anty- sensowych oligonukleotydów.
PODSTAWY TEORETYCZNE I METODOLOGICZNE
Powszechnie wiadomo, ¿e informacja genetyczna zakodowana jest w genach ulo- kowanych w chromosomalnym DNA. W mo- mencie, gdy gen ulega ekspresji, informa- cja zawarta w sekwencji nukleotydów chro- mosomalnego DNA zostaje przepisana na komplementarn¹ pod wzglêdem sekwencji nukleotydów niæ pre-mRNA. Po procesie zwanym sk³adaniem (zostaj¹ wówczas usu- niête niekodowane odcinki nukleotydów, zwane eksonami i ligowane s¹ odcinki ko- duj¹ce, tzw. introny) dojrza³e czynnoœciowo mRNA opuszcza j¹dro komórkowe i w cy- toplazmie sekwencja cz¹steczki mRNA zo- staje t³umaczona z udzia³em rybosomów i szeregu innych biomoleku³, jak tRNA, ATP i czynniki elongacyjne (translacja) na odpo- wiedni¹ sekwencjê aminokwasów ³¹czonych w ³añcuch polipeptydowy bia³ka.
Strategia antysensowych oligonukleotydów zak³ada wybiórcze hamowanie biosyntezy niechcianych bia³ek (np. bia³ek kodowanych w materiale genetycznym wirusa w komór- kach organizmu ludzkiego) na drodze aso- cjacji antysensowego konstruktu do wybra- nych i œciœle okreœlonych sekwencji pre-RNA, zaburzaj¹c jego sk³adanie. Nastêpuje rów- nie¿ hybrydyzacja z wyselekcjonowanym fragmentem cytoplazmatycznego dojrza³ego mRNA (blokuj¹c fizyczny dostêp do ryboso- mu b¹dŸ tworz¹c heterodupleks rozpozna- wany i degradowany przez RNA-zê H – en- zym degraduj¹cy mRNA skompleksowany z DNA). Antysensowe konstrukty oligonukle- otydowe stanowi¹ 12–30-merowe fragmenty DNA b¹dŸ ich analogi. Z obliczeñ statystycz- nych wynika, ¿e wybrana kombinacja 12 nu- Hamowanie ekspresji wybranych ge-
nów za pomoc¹ antysensowych oli- gonukleotydów mo¿e stanowiæ jedn¹ z grup postêpowania terapeutyczne- go, m.in. w schorzeniach nowotworo- wych. Celem niniejszej pracy jest za- rysowanie ogólnej strategii terapeu- tycznej oraz mechanizmu dzia³ania antysensowych oligonukleotydów, zi- lustrowanej wyborem genu bcl-2 jako celu ich dzia³ania. Produkt ekspresji tego genu, bia³ko Bcl-2, hamuje apop- tozê komórki i tym samym ma wp³yw na niekontrolowany rozwój komórek.
W pracy przedstawiono aktualny stan zaawansowania badañ klinicznych w wybranych schorzeniach nowotwo- rowych, w których poziom bia³ka Bcl-2 uznawany jest jako niezale¿ny wskaŸ- nik zaawansowania procesu nowo- tworowego.
S³owa kluczowe: antysensowe oligo- nukleotydy, bia³ko Bcl-2, nowotwory, kliniczna terapia antysensowa.
Modulation of translation process and regulation of protein biosynthesis by means of antisense oligonucleotides lay the foundation for new therapeutic strategies, among others against neo- plastic diseases. The aim of this acco- unt was the presentation of molecular basis of antisense strategy, targeted against Bcl-2 protein. This protein, be- ing expressed by bcl-2 gene, regula- tes the cell apoptosis and influences the uncontrolled cell proliferation. Be- low there is presented the state of art in clinical studies of application of an- tisense oligonucleotide phosphorothio- ates in combating those neoplastic di- seases where the level of Bcl-2 is re- cognised as the independent key-marker of cancer progression.
Key words: antisense oligonucleoti- des, Bcl-2 protein, cancer, clinical an- tisense therapy.
Strategia antysensowych oligonukleotydów
– aktualny stan zaawansowania badañ klinicznych w wybranych schorzeniach nowotworowych
Strategy of antisense oligonucleotides – actual state of art in advanced clinical studies on therapy of selected neoplastic diseases
Krystyna Stec-Michalska
Zak³ad Medycyny Rodzinnej Instytutu Medycyny Wewnêtrznej i Fizjoterapii Wojskowej Akademii Medycznej w £odzi
kleotydów mo¿e wyst¹piæ tylko raz w mRNA.
Komplementarna (antyrównoleg³a, oddzia³ywa- nia poprzez wi¹zania wodorowe typu Watso- na i Cricka) sonda oligonukleotydowa zawiera- j¹ca minimum 12 nukleozasad powinna, na podstawie obliczeñ teoretycznych, rozpozna- waæ wybrany segment RNA ze 100-procento- wym prawdopodobieñstwem.
Idealny antysensowy oligonukleotyd po- winien:
przenikaæ przez b³onê komórkow¹ tak, aby dotrzeæ do wyselekcjonowanej sekwencji,
selektywnie hybrydyzowaæ do sekwencji RNA, by zminimalizowaæ ewentualne nie- specyficzne dzia³anie toksyczne,
byæ opornym na dzia³anie zewn¹trz- i we- wn¹trzkomórkowych enzymów nukleoli- tycznych,
nie oddzia³ywaæ z bia³kami komórkowymi.
Istotne jest tak¿e, aby potencjalne pro- dukty degradacji antysensowych oligonu- kleotydów nie mog³y byæ wykorzystywane do de novo syntezy DNA, co mog³oby po- wodowaæ niepo¿¹dane mutacje.
Trwa³oœæ antysensowego oligonukleoty- du determinowana jest g³ównie odpornoœci¹ na dzia³anie endo- i egzonukleaz, które po- woduj¹ szybk¹ degradacjê obcego DNA poprzez rozszczepianie wi¹zañ fosfodiestro- wych. Cel ten jest realizowany poprzez mo- dyfikacje chemiczne tego wi¹zania, polega- j¹ce np. na zast¹pieniu atomu tlenu w in- ternukleotydowym wi¹zaniu fosforanowym atomem siarki (oligonukleotydotiofosforany, dla uproszczenia – PS-oligonukleotydy) lub grup¹ metylow¹ (oligonukleozydometanofos- foniany). PS-oligonukleotydy stanowi¹ I ge- neracjê antysensowych struktur bêd¹cych izosterycznymi i izoelektronowymi analoga- mi naturalnych oligonukleotydów.
PS-oligonukleotydy wykazuj¹ zadowala- j¹c¹ trwa³oœæ w roztworach fizjologicznych, hybrydyzuj¹ do specyficznie wybranego fragmentu mRNA, s¹ transportowane do komórki i uaktywniaj¹ RNA-zê H. Spe³niaj¹ zatem wszystkie za³o¿one funkcje konstruk- tów antysensowych. Dziêki wczesnemu opracowaniu metody syntezy na fazie sta-
³ej, ich dostêpnoœæ umo¿liwi³a podjêcie prób zastosowania ich pocz¹tkowo in vitro, a nastêpnie in vivo na modelach zwierzê- cych [6, 7, 8], a w ci¹gu ostatnich lat, tak-
¿e na etapie prób klinicznych.
Jakkolwiek pierwsze wyniki badañ by³y bardzo zachêcaj¹ce, opublikowane w ostat- nich 5 latach prace doœwiadczalne doty- cz¹ce zastosowañ PS-oligonukleotydów w warunkach in vivo pokaza³y, ¿e efekt ich dzia³ania nie jest w pe³ni zgodny z ideali- stycznymi za³o¿eniami [9, 10]. Obok proble- mów czêsto sygnalizowanej niepowtarzalno- œci wyników wykazano efekty ich niespecy- ficznego dzia³ania, które mog¹ zale¿eæ od ró¿nej sekwencji antysensowego oligonukle-
otydu b¹dŸ jego 2-rzêdowej struktury, od- dzia³ywania z bia³kami (efekt aptamerycz- ny), jak i ich polianionowej natury.
Przyk³adowo oligonukleotydy bogate w sekwencje.. CpG.. lub zawieraj¹ce motyw..
GGGG... wywo³uj¹ odpowiedŸ immunologicz- n¹ b¹dŸ proliferacjê komórek. Oligonukleoty- dy bogate w reszty G charakteryzuj¹ siê od- miennym przenikaniem do komórki, tkanko- w¹ dystrybucj¹ i farmakokinetyk¹, natomiast zawieraj¹ce powtarzaj¹cy siê motyw CpG wywo³uj¹ efekt immunostymuluj¹cy poprzez indukcjê cytokin Il-12, Il-6, IFNγ, TNFα[11].
Jakkolwiek ten, z za³o¿enia niepo¿¹dany efekt dzia³ania, mo¿e byæ wykorzystany w niektórych przypadkach jako immunomo- dulator przeciwwirusowy b¹dŸ antybakteryj- ny, np. w terapii przeciwzapalnej [9], jest on niekorzystny w odniesieniu do zaplanowane- go dzia³ania jako konstruktu antysensowego.
Ugrupowanie tiofosforanowe w wi¹zaniach internukleotydowych, odpowiedzialne za po- lianionow¹ naturê PS-oligonukleotydu, jak i odpornoœæ na dzia³anie nukleaz, wywo³uje niekorzystne objawy uboczne w warunkach in vivo, np. wyd³u¿enie czasu APTT. Dowie- dziono, ¿e wystêpuje on zale¿nie od d³ugo- œci i dawki podanego antysensu, a nie od jego sekwencji [10]. PS-oligonukleotydy wi¹-
¿¹ siê tak¿e z wieloma bia³kami surowicy krwi. Powinowactwo to jest najsilniejsze w szeregu: fibrynogen > γ-globuliny > albu- miny [9]. W znacznie wy¿szych dawkach ani¿eli wymagane dla aktywnoœci antysenso- wych oligonukleotydów w warunkach in vivo, PS-oligonukleotydy mog¹ hamowaæ wiele en- zymów [12, 13]:
γ-polimerazê,
czynnik wzrostu,
bia³ko kinazy C,
odwrotn¹ transkryptazê,
RNA-zê H,
RNA-zê L,
receptor CD4.
Przyczyny interakcji PS-oligonukleotydów z bia³kami nie zosta³y dostatecznie wyjaœnio- ne. Jeœli oligonukleotydy antysensowe po- siadaj¹ wewnêtrzn¹ komplementarnoœæ albo sekwencje palindromowe, mog¹ formowaæ 2-rzêdowe stabilne struktury, takie jak krót- ka podwójna niæ, szpilka czy decoy, co mo-
¿e z jednej strony wp³ywaæ na dostêpnoœæ konstruktu antysensowego do nici mRNA, z drugiej strony mo¿e wykazywaæ dzia³anie niespecyficzne, objawiaj¹ce siê w postaci niepo¿¹danych efektów ubocznych [14]. Do- stêp antysensowych oligonukleotydów do do- celowego mRNA zale¿y w du¿ej mierze od 2-rzêdowej struktury RNA. Ostatnio wykaza- no np., ¿e miejsca na mRNA o motywie se- kwencji... GGGA... s¹ ³atwiej blokowane przez antysensowy oligonukleotyd [15].
Terapeutyczna przydatnoœæ I generacji antysensowych oligonukleotydów, tj. PS-oli- gonukleotydów, zosta³a udowodniona w le- czeniu CMV (cytomegalovirus), indukuj¹ce- go zapalenie siatkówki [16]. Mimo szeregu
niepowodzeñ innych terapeutycznych zasto- sowañ PS-oligonukleotydów, sukces ten na- dal stwarza nadziejê na mo¿liwoœci szersze- go zastosowania tej nowej metody leczenia.
Ze wzglêdu na powszechnoœæ i ci¹gle nie- zadowalaj¹cy sposób hamowania skutków chorób nowotworowych, najwy¿sz¹ intensyw- noœæ badañ nad skutecznoœci¹ strategii an- tysensowej obserwuje siê zw³aszcza w tej dziedzinie badañ promedycznych.
W celu zachowania integralnoœci konstruk- tów antysensowych wprowadzono ich dalsze modyfikacje, np. za pomoc¹ 2’-O-alkilorybo- nukleozydów wprowadzonych na 3’- i 5’- koñcach oligonukleotydów, uzyskuj¹c zwiêk- szon¹ ich lipofilowoœæ oraz odpornoœæ na dzia³anie egzonukleaz. Podobnie poprzez inkorporacje internukleotydowych wi¹zañ metanofosfonianowych uzyskano:
efekt zmniejszenia ³adunku ujemnego (ob- ni¿enie polianionowoœci),
zwiêkszon¹ lipofilowoœæ (lepszy transport dokomórkowy),
pe³n¹ odpornoœæ na dzia³anie fosfodie- steraz [17].
Efekt immunostymuluj¹cy oligonukleotydów antysensowych zmniejszono poprzez unikanie motywów... CpG... zastêpuj¹c je odpowiednio C2’-OMe i 7-deazaguanozyn¹. Oligonukleotydy zsyntetyzowane z wiêcej ni¿ 1 z ww. modyfi- kacj¹ wi¹zañ chemicznych, zwane MBOs (ang. mixed-backbone oligonucleotides) sta- nowi¹ II generacjê oligonukleotydów antysen- sowych [18]. Ponadto, MBOs zawieraj¹ce w œrodkowej sekwencji PS-oligonukleotydy (minimum 5 nukleozasad) wykazuj¹ wiêksze powinowactwo do docelowego RNA, zwiêk- szaj¹c przy tym aktywnoœæ RNA-zy H.
Sugeruje siê, ¿e koñcowo zmodyfikowa- ne MBOs osi¹gn¹ taki poziom stabilnoœci,
¿e bêdzie mo¿na stosowaæ je w formie do- ustnej lub dojelitowo.
Podsumowuj¹c, MBOs wykazuj¹ popra- wê specyficznoœci, biologicznej aktywnoœci, stabilnoœci in vivo, farmakokinetyki i profilu bezpieczeñstwa [19].
Jak wspomniano powy¿ej, wa¿ne jest wnikanie antysensowych oligonukleotydów do komórki. In vivo transport oligonukleoty- dów zale¿y od czynników, takich jak:
typ komórki,
kinetyka transportu,
warunki hodowli kultury tkankowej,
natura chemiczna antysensowego oligo- nukleotydu
i odbywa siê najczêœciej na zasadzie endo- cytozy, zale¿nej od jego d³ugoœci i sekwen- cji. Ka¿dy z tych czynników mo¿e wp³yn¹æ na biologiczn¹ aktywnoœæ antysensowego oli- gonukleotydu. Jedn¹ z metod u³atwiaj¹cych ich transport dokomórkowy jest zamkniêcie oligonukleotydu w liposomach, uzyskuj¹c tym samym wiêksze ich stê¿enie wewn¹trzkomór- kowe i ochronne dzia³anie przed nukleazami [20]. Jakkolwiek ten sposób u³atwiania trans- portu dokomórkowego jest z powodzeniem
stosowany w doœwiadczeniach na liniach ko- mórkowych, jak i w ludzkiej terapii genowej, to w realizacji strategii antysensowej musi byæ przyjmowany z wielk¹ ostro¿noœci¹, gdy¿
czêste podawanie antysensowych oligonukle- otydów ³¹cznie z liposomami mo¿e prowa- dziæ do akumulacji liposomów w w¹trobie.
PRZYK£ADY PRÓB ZASTOSOWAÑ KLINICZNYCH ANTYSENSOWYCH OLIGONUKLEOTYDÓW
Obecnie sprawdzane mo¿liwoœci zastoso- wania terapii antysensowej dotycz¹ g³ównie:
onkologii klinicznej,
angioplastyki naczyñ wieñcowych,
chorób neurologicznych,
leczenia niektórych chorób wirusowych i paso¿ytniczych.
Wybrane przyk³ady klinicznych prób wpro- wadzenia terapii antysensowej, które uzyska-
³y akceptacjê FDA, przedstawiono w tab. 1.
Ze wzglêdu na restrykcje objêtoœciowe, w tej prezentacji prób klinicznych terapii
z u¿yciem antysensowych oligonukleotydów ograniczono siê do zaprezentowania 1 przyk³adu, budz¹cego wiele nadziei w le- czeniu chorób nowotworowych. Wg szere- gu doniesieñ literaturowych, prezentacji konferencyjnych i internetowych wydaje siê,
¿e wkrótce nale¿y oczekiwaæ rejestracji ko- lejnego antysensowego leku przeciwnowo- tworowego [21]. Jako cel ataku grupa spe- cjalistów z firmy biotechnologicznej Genta Incorporation, New Jersey, wybra³a onco- gen bcl-2.
Dlaczego oncogen bcl-2?
Warunkiem zdrowia ka¿dego organizmu jest zachowanie równowagi pomiêdzy re- plikacj¹ komórek a ich apoptoz¹. Zaburze- nie tej równowagi ma ró¿ne nastêpstwa.
Upoœledzona zdolnoœæ organizmu do apop- tozy mo¿e powodowaæ rozwój raka, chorób autoimunnologicznych, zaœ jej nadmiar wy- stêpuje w udarze mózgu, zawale miêœnia sercowego, chorobie Alzheimera, chorobie Parkinsona.
Najwczeœniej opisanym bia³kiem apoptycz- nym by³ produkt genu bcl-2 [22, 23]. Rolê tego genu najwczeœniej opisano w patofizjo- logii limfocytów B, a jego nazwa pochodzi od B-cell leukemia/lymphoma – Bcl-2 [24].
Obecnie uwa¿a siê, ¿e bia³kami regulu- j¹cymi przepuszczalnoœæ b³on mitochon- drialnych s¹ bia³ka z rodziny Bcl-2 oraz ich homologi. Wiele kluczowych elementów w trakcie apoptozy ma miejsce w mito- chondriach:
zaburzenia transportu elektronów,
produkcja ATP i fosforylacji oksydatywnej,
uwalnianie protein aktywuj¹cych kaspazy,
zmiany potencja³u oksydacyjno-redukuj¹- cego.
Wa¿nym ogniwem ³¹cz¹cym apoptozê i mitochondria jest obecnoœæ protein z ro- dziny Bcl-2 w b³onie komórkowej mitochon- driów. Nale¿¹ do nich zarówno bia³ka sty- muluj¹ce proces apoptozy (Bax, Bad, Bcl- Xs, Bak, Bid, Bik, Hrk), jak i ten proces hamuj¹ce (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Brag-1,
Tab. 1. Wybrane przyk³ady klinicznych prób wprowadzenia terapii antysensowej, które uzyska³y akceptacjê FDA
G
Geenn ddoocceelloowwyy SSeekkwweennccjjaa oolliiggoonnuukklleeoottyydduu CChhoorroobbaa SSppoossóóbb SSttaann bbaaddaaññ p
pooddaanniiaa
bcl-2 5’-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3’ rak stercza, podskórnie faza II/III
nieziarniczy ch³oniak z³oœliwy do¿ylnie
bcr-abl 5’-CGCTGAAGGGCTTCTTCCTTATTGAT-3’ CML* ex vivo badania
stadium zawansowane przedkliniczne
5’-CGCTGAAGGGCTTTTGAACTGTGCT-3’ CML* do¿ylnie
prze³om blastyczny
c-myb 5’-TATGCTGTGCCGGGGTCTTCGGGC-3’ CML* do¿ylnie faza I
prze³om blastyczny albo wstêpne
ex vivo CML*
chroniczna/zaostrzona faza
c-raf 5’-TCCCGCCTGTGACATGCATT-3’ rak stercza, piersi, jajnika, do¿ylnie faza II jelita grubego, p³uc
metylo-transfe- Sekwencja nieznana guz lity do¿ylnie faza I
raza DNA
Ha-ras 5’-GGGACTCCTCGCTACTGCCT-3’ guz lity do¿ylnie faza I
P53 5’- CCCTGCTCCCCCCTGGCTCC-3’ ostra bia³aczka szpikowa do¿ylnie faza I
Podjednostka Iα 5’-GCGUGCCTCCTCACUGGC-3’ guz lity do¿ylnie faza III
kinazy bia³kowej (PKA-RIα)
kinaza bia³kowa 5’-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3’ rak jajnika, stercza, piersi, do¿ylnie faza II mózgu, p³uc, jelita grubego,
czerniak C
Chhoorroobbyy wwiirruussoowwee
wirus 5’-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3’ œlepota wywo³ana przez CMV miejscowo zatwierdzony
cytomegalii do ga³ki
(CMV) ocznej
wirus 5’-UGGGGCTTACCTTGCGAACA-3’ # œlepota wywo³ana przez CMV do¿ylnie faza II cytomegalii
(CMV)
* CML (ang. chronic myeoloid leucemia) – przewlek³a bia³aczka szpikowa
# 2’-O-metylorybonukleozydy bez funkcji tiofosforanowych
Mcl-1, BHRF1, E1B 9 kDa) [25]. Bia³ka te wystêpuj¹ jako integralne sk³adniki b³on, tak¿e w siateczce œródplazmatycznej i oko-
³oj¹drowej. Tworz¹ homo- i heterodimery, np. Bcl-2/Bcl-2, Bax/Bcl-2, Bax/Bax [26].
Stwierdzono, ¿e przewaga homodimerów Bcl-2 decyduje o prze¿yciu, podczas gdy przewaga Bax – o œmierci komórki. Ich wzajemne oddzia³ywania nie wynikaj¹ z bezwzglêdnej ich zawartoœci w komórce, lecz z wzajemnych relacji. Strukturalne po- dobieñstwo bia³ek rodziny Bcl-2 z tworz¹- c¹ pory domen¹ b³onow¹ toksyny b³oniczej sugeruje, ¿e bia³ka te tworz¹ kana³y b³ono- we regulowane przez sygna³y zale¿ne od napiêcia i pH [27]. Badania Grossa i wsp.
[28] wykaza³y, ¿e zarówno Bcl-2, jak i Bax tworzy kana³y jonowe w b³onach komórko-
wych o odmiennej przepuszczalnoœci dla poszczególnych jonów; Bcl-2 jest specy- ficzny dla K+, natomiast Bax dla Cl–.
Nie wiadomo jednak, w jaki sposób zmiany przewodzenia dla tych jonów mog¹ zmieniaæ ∆ϕ(mitochondrialny potencja³ b³o- nowy) oraz uwalnianie AIF (apoptosis indu- cing factor), Apaf-2 (cytochrom c). Prawdo- podobnie antyapoptyczny mechanizm dzia-
³ania Bcl-2 wynika z hamowania uwalniania AIF i cytochromu c (Apaf-2) z mitochon- driów oraz z bezpoœredniej integracji z Apaf-1 (apoptosis protease activating fac- tor) blokuj¹c aktywacjê kaspazy 9 [29, 30].
Kaspazy (caspases: cysteine-dependent- -aspartate-directed protease) s¹ rodzin¹
proteolitycznych enzymów cysteinowych, uczestnicz¹cych w kaskadzie wzbudzania œmierci komórki [31]. Znanych jest ponad 10 bia³ek rodziny kaspaz. Kaspazy wystê- puj¹ w komórce w stanie latentnym, gdy¿
w niskich stê¿eniach wystêpuj¹ jako mono- mery, a do ich aktywacji wymagana jest polimeryzacja. Kofaktory s³u¿¹ do przybli-
¿enia do siebie 2 lub wiêcej prekursorów, pozwalaj¹c na autoproteolityczn¹ aktywa- cjê. Wykazano, ¿e kluczowa prokaspaza 9, BCL-xL i Apaf-1 tworzy 3-sk³adnikowy kom- pleks z mo¿liwoœci¹ inaktywacji tej kaspa- zy [32]. Kaspaza 9 uwa¿ana jest za prote- azê o roli inicjuj¹cej w rodzinie kaspaz, spe³niaj¹cych funkcjê nadrzêdn¹ w stosun- ku do tzw. kaspaz wykonawczych. Ponad- to s¹dzi siê, ¿e Bcl-2 nale¿y równie¿ do
Tab. 2. Stan zaawansowania prób klinicznych z u¿yciem oligonukleotydu antysensowego G 3139 redukuj¹cego poziom bia³ka Bcl-2 w wybranych chorobach nowotworowych
M
Miieejjssccee WWsskkaazzaanniiee FFaazzaa pprróóbb kklliinniicczznnyycchh,, WWyynniikkii ii oobbsseerrwwaaccjjee GGLLPP//GGCCPP ii ookkrreess ttrrwwaanniiaa ooppiiss tteerraappiiii
p
prróóbb kklliinniicczznnyycchh
Royal Marsden nieziarniczy I faza w dawkachgrupa 21 pacjentów; dawki maks. badania Hospital ch³oniak narastaj¹cych do 5,3 mg/kg/dobê, limitowane objawami prowadzone (Londyn), z³oœliwy droga podania – toksycznymi; nie zanotowano powik³añ pod nadzorem protokó³ G 101; wlew podskórny koñcz¹cych siê zgonem; objawy uboczne: GCP i ICH
paŸdziernik 1995– przez 14 dni gor¹czka, obni¿ona liczba p³ytek, z niezale¿nym
–styczeñ 1999 os³abienie – objawy czêsto towarzysz¹ce monitorowaniem
chorobie podstawowej sponsorowanym
przez Genta Inc.
Memorial rak prostaty, I faza w dawkach grupa 35 pacjentów; dawki maks. badania
Sloan Kettering nerki, narastaj¹cychdo 6,9 mg/kg/dobê, prowadzone
Cancer Center inne lite podawanych drog¹ limitowane objawami toksycznymi;. pod nadzorem
(Nowy Jork); guzy do¿yln¹ przez 14 dni; nie zanotowano powik³añ GCP i ICH
protokó³ G 102; wyniki badañ koñcz¹cych siê zgonem z niezale¿nym
marzec 1998 przeprowadzonych monitorowaniem
– w toku w 1999 r. sponsorowanym
pozwoli³y na przejœcie przez Genta Inc.
do nastêpnego etapu prób skojarzonej terapii G3139 – ppaacclliittaaxxeell
British Columbia rak prostaty I faza w dawkachgrupa 20 pacjentów; do tej pory badania Cancer Center, narastaj¹cych podawanych nie odnotowano objawów toksycznych prowadzone Vancouver General drog¹ do¿yln¹ przez 14 dni; przy dawkach wy¿szych pod nadzorem
Hospital; terapia skojarzona ni¿ G3139 3,1 mg/kg/dobê GCP i ICH,
protokó³ GP 104 z wzrastaj¹cymi dawkami i mmiittooxxaannttrroonnuu 12 mg/m2 p.c. z niezale¿nym m
miittooxxaannttrroonnuu co 3–4 tyg. monitorowaniem sponsorowanym przez Genta Inc.
Univ. Vienna czerniak I faza w dawkachgrupa 14 pacjentów; do tej pory badania Cancer Center, z przerzutami zwiêkszaj¹cych podawanych niewielkie i odwracalne objawy toksyczne prowadzone (Wiedeñ); drog¹ do¿yln¹ przez 14 dni; wystêpowa³y w próbach terapii skojarzonej pod nadzorem protokó³ GM 103 kombinowana ze standartowymi przy dawkach G 3139 wy¿szych GCP i ICH
dawkami dacarbazine ni¿ 7,7 mg/kg/dobê z niezale¿nym
i dacarbazine 500 mg/m2 p.c. monitorowaniem co 2 tyg. w 2 cyklach sponsorowanym przez Genta Inc.
Georgetown Univ. raki gruczo³u I–II faza w dawkach grupa 10 pacjentów; do tej pory badania Lombardi piersiowego narastaj¹cych podawanych nie stwierdzono objawów toksycznych prowadzone Cancer Center, i inne drog¹ do¿yln¹ przez 21 dni; przy dawkach G 3139 nie wy¿szych pod nadzorem (Waszyngton, DC); guzy lite terapia skojarzona z niskimi ni¿ 3,1 mg/kg/dzieñ i docetaxelu 35 mg/m2 GCP i ICH
protokó³ GM 105 tygodniowymi dawkami podawanych ka¿dego tygodnia z niezale¿nym
docetaxelu monitorowaniem
sponsorowanym przez Genta Inc.
GLP – ang. good laboratory practice; GCP – ang. good clinical practice
silnych przeciwutleniaczy, funkcjonuj¹cych jako zmiatacze wolnych rodników, zabez- pieczaj¹c b³ony lipidowe przed utlenianiem, a tak¿e pe³ni rolê bia³ka reguluj¹cego ak- tywnoœæ enzymów zapobiegaj¹cych proce- som utleniania. Wykazano, ¿e spoœród wszystkich znanych dotychczas bia³ek ko- mórkowych, Bcl-2 jest najsilniejszym inhibi- torem apoptozy wywo³anej przez ró¿ne czynniki stresogenne, np. promieniowanie jonizuj¹ce, hipertermiê, chemioterapeutyki, defekt czynników wzrostowych, glikoprote- idy. Potwierdza to fakt, ¿e nadekspresja bcl-2 chroni komórkê przed apoptoz¹ wy- wo³an¹ przez ROS (reactive oxygen spe- cies) [33, 34]. Bia³ko Bcl-2 blokuje jeden z krytycznych stopni w przekaŸnictwie sy- gna³u apoptozy (wyp³yw Ca2+ z mobilnej puli zlokalizowanej w œwietle siateczki œród- plazmatycznej [35]. Wspó³zale¿noœæ miê- dzy stê¿eniem ROS a uwalnianiem Ca2+
z siateczki œródplazmatycznej i mitochon- driów mog³aby t³umaczyæ ten mechanizm.
Warto podkreœliæ, i¿ interakcje pomiêdzy Bcl-2 i bia³kami prionowymi (PrP) mog¹ mieæ znaczenie w patogenezie neurozwy- rodnieniowych chorób prionowych, takich jak syndrom Gerstmanna-Stausslera czy choro- ba Creutzfeldta-Jacoba. Bia³ko Bcl-2 jest rozpatrywane m.in. jako bli¿ej nieznane bia³- ko X, które uczestniczy w przekszta³ceniu PrP w jego patogenn¹ izoformê PrPsc [36].
Du¿a liczba leków stosowanych obecnie w chemioterapii oraz kojarzonych z radiote- rapi¹ ma na celu apoptozê komórek nowo- tworowych. Przez uszkodzenie DNA w tych komórkach dochodzi do aktywacji genu p53 nazywanego stra¿nikiem genomu, którego produkt blokuje komórki w fazie G1cyklu ko- mórkowego do czasu naprawy DNA.
W przypadku, gdy komórka nie zdo³a napra- wiæ DNA, p53 w³¹cza program œmierci za poœrednictwem bia³ek z rodziny Bcl-2, z któ- rymi pozostaje we wzajemnych zwrotnych zale¿noœciach [37]. Brak bia³ka p53 lub utra- ta jego apoptycznych w³aœciwoœci, a tak¿e wysoki poziom Bcl-2 w komórkach nowotwo- rowych, decyduj¹ czêsto o jego niewra¿liwo- œci na stosowan¹ terapiê.
Ostatnio zastosowano oligonukleotyd an- tysensowy do modyfikowania ekspresji ge- nu bcl-x poprzez zahamowanie produkcji bia³ka Bcl-xL, uzyskuj¹c tym samym wy¿- sze poziomy bia³ka Bcl-xS maj¹cego prze- ciwstawne, proapoptyczne dzia³anie [38].
Powy¿sze wyniki badañ sta³y siê podsta- w¹ w³¹czenia do terapii antysensowych oli- gonukleotydów blokuj¹cych ekspresjê onko- genów maj¹cych znaczenie w procesach niekontrolowanego rozrostu komórek nowo- tworowych. Na obecnym etapie prób klinicz- nych (I, II st.) oligonukleotydy antysensowe zastosowano do zablokowania ekspresji on- kogenów: bcl-2, NF-KB (p65), c-myb, c-myc, erbB-2, jun, fos, Ha-ras, Ki-ras, DNA-mety- lotransferazy, PKA, c-raf kinazy, mdm 2, and PKC-α [39, 40, 41, 42, 43, 44]. Wykazano,
¿e bia³ko Bcl-2 wystêpuje obficie w komór-
kach nowotworowych gruczolaków p³uc, trzustki, jelita grubego, sutka, gruczo³u kro- kowego i z³oœliwych ch³oniaków, a nie zaob- serwowano jego wystêpowania w dojrza³ych komórkach, z wyj¹tkiem grasicy i ³o¿yska.
Podwy¿szony poziom bia³ka Bcl-2 blokuj¹- cego zaprogramowan¹ œmieræ komórki wi¹-
¿e siê ze z³¹ prognoz¹ procesu nowotworo- wego. Szczegó³owa analiza dotychczaso- wych badañ potwierdzi³a wa¿ne znaczenie bia³ka Bcl-2 jako niezale¿nego markera no- wotworowego [45, 46].
Najwczeœniejsze i obecnie najbardziej za- awansowane kliniczne badania zastosowa- nia terapii oligonukleotydem antysensowym dotycz¹ nieziarniczego ch³oniaka z³oœliwego, gdzie obserwuje siê wysok¹ ekspresjê genu bcl-2 we wszystkich komórkach nowotworu.
W pocz¹tkowej fazie prób przedklinicz- nych zsyntetyzowano szereg oligonucleoty- dów komplementarnych do ró¿nych regio- nów tego genu i drog¹ selekcji wytypowa- no 2 antysensowe PS-oligonukleotydy:
G 3139 (18-nukleotydowy) i G 3854 (20-nu- kleotydowy). W kolejnej fazie badañ wybra- no oligonukleotyd G 3139 o sekwencji 5’-TCTCCCCAGCGTGCGCCAT-3’, gdzie wszystkie internukleotydowe wi¹zania s¹ tiofosforanami. Stwierdzono, ¿e po podaniu (do¿ylnym lub podskórnym) zwi¹zek G 3139 kumuluje siê g³ównie w szpiku kost- nym, w¹trobie, œledzionie, nerkach, uk³a- dzie limfatycznym, w mniejszych iloœciach w innych tkankach, œladowo w OUN [47], gdy¿ nie przenika przez barierê krew–mózg cz³owieka. Podskórne powolne podanie G 3139 wyd³u¿a³o okres jego bioaktywnoœci, stabilnoœæ wysycenia [47], ale wi¹za³o siê z wystêpowaniem odczynu zapalnego w miejscu wk³ucia. Terapia stosowana we wlewach do¿ylnych by³a najmniej toksycz- na, z wy³¹czeniem bolusa, który powodo- wa³ gwa³towne obkurczenie naczyñ obwo- dowych i przyspiesza³ efekt antykoagulacyj- ny [47]. Pacjenci choruj¹cy na nieziarniczy ch³oniak z³oœliwy zakwalifikowani do terapii za pomoc¹ G 3139 prezentowali ró¿ne eta- py zaawansowania choroby, ale u wszyst- kich wykonano badanie immunohistoche- miczne na obecnoœæ bia³ka Bcl-2 w opar- ciu o biopsjê z wêz³a ch³onnego.
Obecny stan zaawansowania prac kli- nicznych z u¿yciem G 3139 przedstawiono w tab. 2. (w oparciu o udostêpnione pry- watne informacje dr. B. Klema, Genta Incor- poration). Odnosz¹c siê do wyników tych badañ, nale¿y podkreœliæ, i¿ u wszystkich pacjentów zakwalifikowanych do tych pro- gramów badañ, niezale¿nie od stopnia za- awansowania zmian, kieruj¹c siê wzglêda- mi etycznymi zastosowano pocz¹tkowo po- wszechnie stosowan¹ chemioterapiê, a nastêpnie, przy braku poprawy klinicznej, podawano G 3139. Badania w serii GL 101 dotycz¹ce pacjentów z nieziarniczym ch³o- niakiem z³oœliwym wykaza³y dobr¹ toleran- cjê tego PS-oligonukleotydu. Limitowane po- dawanie preparatu by³o czêœciowo zwi¹za- ne z wystêpowaniem takich objawów, jak:
gor¹czka,
os³abienie,
spadek p³ytek krwi,
jakkolwiek towarzysz¹ one równie¿ choro- bie podstawowej. Przemijaj¹ca hiperglike- mia maks. do 12 mmol/l nie by³a zale¿na od stosowanej dawki, nie wymaga³a dodat- kowego podawania leków i normalizowa³a siê po zakoñczeniu podawania preparatu.
Niektórzy pacjenci byli poddani dalszej ob- serwacji, trwaj¹cej ponad 3 lata po zakoñ- czeniu terapii i nie zaobserwowano u nich póŸniejszych objawów ubocznych ani in- nych procesów rozrostowych.
Podobne obserwacje dotyczy³y pacjentów objêtych programem badañ G 102, w któ- rych stosowano wy¿sze dawki G 3139. Ru- tynowe monitorowanie czynnoœci serca nie wykaza³o objawów kardiotoksycznych, które wczeœniej obserwowano u ma³p stosowanych w badaniach doœwiadczalnych (podawano wy¿sze dawki). Wyd³u¿ony okres obserwacji, do ponad 15 mies. od zakoñczonej terapii, nie ujawni³ u tych pacjentów wyst¹pienia nie- korzystnych objawów ubocznych. W obydwu programach badañ G 101 i G 102 farmako- kinetyka podanego preparatu by³a podobna i wykaza³a, ¿e osi¹gniêty poziom terapeu- tyczny przy stê¿eniu G 3139 w surowicy w granicach 1–8 µmol/ml wykazywa³ dobr¹ korelacjê miêdzy podan¹ dawk¹ a stê¿eniem w surowicy krwi. Ró¿norodnoœæ podawanych dawek preparatu by³a podyktowana ró¿nym stopniem zaawansowania procesu chorobo- wego. Sta³e wysycenie leku w surowicy krwi osi¹gniêto po 24-godzinnym podawaniu pre- paratu we wlewie do¿ylnym. Pó³okres elimi- nacji leku by³ krótki i wynosi³ 2 godz. po za- koñczeniu wlewu do¿ylnego, dlatego te¿
efekty dzia³añ ubocznych preparatu by³y krótkotrwa³e. Obydwa badania potwierdzi³y oczekiwan¹ aktywnoœæ G 3139 objawiaj¹c¹ siê obni¿eniem poziomu bia³ka Bcl-2 w po- branych bioptatach z wêz³ów ch³onnych, przy nik³ych objawach ubocznych.
Dwie kolejne serie badañ (GM 103, GM 105) potwierdzi³y, ¿e podana dawka i osi¹- gniêty poziom stê¿enia G 3139 w surowicy krwi zredukowa³ poziom bia³ka Bcl-2, co wi¹- za³o siê z kliniczn¹ popraw¹ stanu pacjen- tów z czerniakiem i rakiem piersi. Terapia G 3139 zastosowana u pacjentów z rozpozna- nym czerniakiem wyd³u¿y³a ich ¿ycie po- przez stabilizacjê procesu chorobowego.
Warto przy tym zaznaczyæ, ¿e ze wzglêdu na stopieñ zaawansowania zmian chorobo- wych, u pacjentów tych zastosowano nawet 10 cykli do¿ylnego wlewu preparatu w ci¹- gu roku, bez nasilenia objawów toksycznych.
Nie mia³o to wp³ywu na farmakokinetykê le- ku, a dawki te by³y nawet dobrze tolerowa- ne przez pacjentów poni¿ej 90. roku ¿ycia.
W 1. fazie prób klinicznych zastosowa- no wyd³u¿ony do¿ylny wlew kroplowy przez pompê infuzyjn¹ G 3139 w cyklu 14–21- dniowym, uzyskuj¹c, jak wczeœniej wspo- minano, dobr¹ tolerancjê i farmakokinetykê preparatu. W 2. i 3. fazie prób klinicznych planuje siê zastosowanie krótkich wlewów
do¿ylnych, które powinny wykazaæ lepsz¹ tolerancjê stosowanego preparatu i by³yby wygodniejsze dla pacjentów. Mo¿liwe jest podawanie podskórne G 3139 w 2 daw- kach podzielonych dziennie.
Obok rezultatów badañ klinicznych za- prezentowanych w tab. 2., w innych bada- niach próbuje siê zastosowaæ, np. u cho- rych z rakiem prostaty, terapiê skojarzon¹ (G3139 + chemioterapia, choæ s¹ to jesz- cze zbyt ma³e grupy pacjentów (poni¿ej 6 w ka¿dej grupie), aby uzyskiwane wyni- ki mog³yby byæ uznane jako statystycznie znamienne. Rozpoczynaj¹ce siê 3 inne ba- dania pod nadzorem Narodowego Instytu- tu Raka USA dotycz¹ 1. i 2. fazy klinicz- nej z zastosowaniem antysensu G 3139 w terapii skojarzonej z chemioterapeutyka- mi w leczeniu raka jelita grubego, p³uc, ostrych bia³aczek, czerniaka.
Doniesienia naukowe badaczy z USA, Kanady i Wielkiej Brytanii dotycz¹ce wyni- ków badañ z zastosowaniem G 3139 za- równo w monoterapii, jak w terapii kombi- nowanej z chemioterapeutykami [48] suge- ruj¹, ¿e preparat ten jest skuteczny i mo¿e byæ bezpiecznie stosowany. Na ostateczne wyniki badañ, aby uznaæ G 3139 za lek mog¹cy wejœæ do powszechnie stosowanej terapii, poza oœrodkami prowadz¹cymi ba- dania doœwiadczalne, nale¿y poczekaæ.
Jakkolwiek przeœledzenie historii rozwoju strategii antysensowej odnotowuje finalne niepowodzenie antysensowej terapii w przy- padkach AIDS oraz choroby Crohna [49], próby terapeutyczne wy³¹czaj¹ce ekspresjê genów odpowiedzialnych za etiopatogene- zê i przebieg ró¿nych chorób za pomoc¹ antysensowych oligonukleotydów nadal stwarzaj¹ nadzieje, i¿ wkrótce klinicyœci bê- d¹ dysponowaæ now¹ generacj¹ leków in- formatycznych, tj. konstruowanych na pod- stawie informacji o zmianach genetycznych.
PIŒMIENNICTWO
1. Ratajczak M, Skórski T. Perspektywy wykorzy- stania strategii antysensów w medycynie do- œwiadczalnej i klinicznej. Postêpy Biologii Ko- mórki 1994; 21: 177-96.
2. Stec WJ. Strategia antysensowych oligonukleoty- dów. Biotechnologia 1994; 4: 5-15.
3. Barton CM, Lemoine NR. Antisense oligonucle- otides directed against p53 have antiproliferative effects unrelated to effects on p53 expression.
Brit J Cancer 1995; 71: 429-37.
4. Smetsers TFCM, Linders EHP, van de Locht TF, de Witte TM, Mensink EJBM. An antisense Bcr- Abl phosphodiester-tailed methylphosphonate oli- gonucleotide reduces the growth of chronic my- eloid leukaemia patient cells by a non-antisense mechanism. Brit J Haematol 1997; 96: 377-81.
5. Antisense Technology. vol. 313 of Methods in Enzymology 1999; Ed MI Phillips Academic Press, Inc., NY.
6. Agrawal S, Kandimalla ER. Medicinal chemistry of antisense oligonucleotides. In: Antisense Technolo- gy in the Central Nervous System. Leslie R, et al.
(eds). Oxford University Press 1999; 108-36.
7. Morishita R, Gibbson GH, Ellison KE, et al. Sin- gle intraluminal delivery of antisense cdc 2 kinase and proliferating-cell nuclear antigen oligonucleoti- des results in chronic inhibition of neointimal hyper- plasia. Proc Natl Acad Sci 1993; 90: 8474-78.
8. Ratajczak MZ, Kant JA, Luger SM, Huiya N, Zhang J, Gewirtz AM. In vivo treatment of hu- man leukemia in a scid mouse model with c-myb antisense oligodeoxynucleotides. Proc Natl Acad Sci 1992; 89: 11823-27.
9. Agrawal S, Kandimalla ER. Antisense Therapeu- tics: is it assimple as complementary base reco- gnition? Current Trends in Molecular Medicine Today 2000; 6: 72-81.
10. Shaw DR. Effects of synthetic oligonucleotides on human complement and coagulation. Bio- chem Pharmacol 1997; 53: 1123-32.
11. Rando RF, Hogan ME. Biological activity of guanosi- ne quartet-forming oligonucleotides. In: Applied An- tisense Oligonucleotide Technology. Stein CA, Krieg AM (eds). Wiley-Liss, New York 1998; 335-52.
12. Benimetskaya L, Tonkinson JL, Kozio³kiewicz M, Karwowski B, Guga P, Zelser R, Stec WJ, Stein CA. Binding of Phosphorothioate Oligonucleotides to Basic Fibroblast Growth Factor, Recombinant So- luble CD4, Laminin and Fibronectin is P-Chirality In- dependent. Nucleic Acids Res 1995; 23: 4239-45.
13. Gao WY, Han FS, Storm C, Egan W, Cheng YC. Phosphorothioate oligonucleotides are inhibi- tors of human DNA polymerases and RNase H:
implications for antisense technology. Mol Phar- macol 1992; 41: 223-29.
14. Hartman G, Krug A, Waller-Fontaine K, Endres S.
Oligodeoxynucleotides enhance lipopolysacchari- de stimulated synthesis of tumor necrosis factor:
dependence on phosphorothioate modification and reversal by heparin. Mol Med 1996; 2: 429-38.
15. Tu GC, Cao GN, Zhou F, Israel Y. Tetranucleoti- de GGGA motif in primary RNA transcripts. Novel target site for antisense design. J Biol Chem 1998; 273: 25125-131.
16. Crooke ST. Vitravene – another piece in the mosaic.
Antisense Nucleic Acid Drug Dev 1998; 8: vii-viii.
17. Agrawal, S, Zhao Q. Mixed Backbone Oligonuc- leotides: Improvement in Oligonucleotide-Indu- ced Toxicity in vivo. Antisense & Nucleic Acid Drug Dev 1998; 8: 135-39.
18. Dean NM, Griffey RH. Identification and charac- terization of second-generation antisense oligo- nucleotides. Antisense Nucleic Acid Drug Der 1997; 7: 229-33.
19. Kuss B, Cotter F. Antisense: Time to shoot the messenger. Ann Oncol 1999; 10: 495-503.
20. Lasic DD, Templeton NS. Liposome in gene the- rapy. Adv Drug Delivery Rev 1996; 20: 221-28.
21. Finbarr E, Cotter MD. Antisence therapy for ma- ligancy. American Society of Clinical Oncology 2000; 338-348.
22. Yang E, Korsmeyer SJ. Molecular thanathopsis:
a discourse on the Bcl-2 Family and cell death.
Blood 1996; 88: 384-401.
23. Reed JC. Bcl-2 and the regulation of program- med cell death. J Cell Biol 1994; 124: 1-26.
24. Kocki J, Ró¿ynkowa D. Gen Bcl-2 w patofizjologii limfocytów B. Post Biol Kom 1991; 18: 169-82.
25. Adams JA, Cory S. The Bcl protein family: arbi- ters of cellsurvival. Science 1998; 281: 1322-26.
26. Conus S, Kaufmann T, Fellaly I, Otter I, Rosse T, Borne C. Bcl-2 is a monomeric protein: pre- vention of homodimerization by structural con- straints. The EMBO Journal 2000; 19: 1534-44.
27. Schendler SL, Xie Z, Montal MO, Matsuyama S, Montal M, Reed JC. Channel formation by antiaptotic protein Bcl-2. Proc Natl Acad Sci 1997; 94: 5113-18.
28. Gross A, Xiang J, Zha J, Yin XM, Schlesinger PHh, Korsmeyer SJ. Regulation of apoptosis by the Bcl-2 family mamebers. In: Oxidate stress and apoptosis. 3rd Winter Resarcher Conferen- ce, Les Arcs, Francja 1997.
29. Hu Y, Benedict MA, Wu D, Inohara N, Nunez G. Bcl-2 interacts with Apaf-1 and inhibits Apaf- 1- dependent caspase 9 activation. Proc Natl Acad Sci 1998; 95: 4386-91.
30. Rao L, White E. Bcl-2 and the ICE family of apop- totic regulators: making a connection. Current Opi- nion in Genetics & Development 1997; &:, 52-58.
31. Ernshaw WC, Martins LM, Kaufmann SH. Mam- malian caspases: structure, Activation, substra- tes and functions during apoptosis. Annu Rev Biochem 1999; 68: 383-424.
32. Pan G, Orouke K, Dixit VM. Caspase-9 BCL-xL and Apaf-1 from a tertiary complex. J Biol Chem 1998; 273: 5841-45.
33. Hockenbery DM, Oltavai ZN, Yin XM, Milliman Cl, Korsmeyer SJ. Bcl-2 functions in an antioxidant pa- thway to prevent apoptosis. Cell 1993; 75: 241-51.
34. Baker AM, Briehl MM, Dorr R, Powis G. Decre- ased antioxidant defence and increased oxidant stress during dexamenthasone-induced apopto- sis: bcl-2 prevents the loss of antioxidant enzyme activity. Cell Death & Differ 1996; 3: 207-13.
35. Lam M, Dubayk G, Chen L, Nunez G, Miesfeld RL, Distelhorst CW. Evidence that Bcl-2 represses apoptosis by regulating endoplasmic reticulum-ass- ociated Ca2+fluxes. Med Sci 1994; 92: 6569-73.
36. Kurschner C, Morgan JI. Analysis of interaciton si- tes in homo- and heteromeric complexes containing Bcl-2 family members and the cellular prion protein.
Molecular Brain Resarch 1996; 37: 249-58.
37. Chiou SK, Rao L, White E. Bcl- blocks p-53 depen- dent apoptosis. Mol Cell Biol 1994; 14: 2556-63.
38. Taylor JK, Zhang QQ, Wyatt JR, Dean NM. In- duction of endogenous Bcl-xS trough the control of Bcl-x pre-mRNA splicing by antisense oligonukleoti- des. Nature Biotechnology 1999; 17: 1097-1100.
39. Cowsert LM. In vitro and in vivo activity of antisen- se inhibitors of ras: Potential for clinical develop- ment. Anticancer Drug Res 1997; 12: 359-71.
40. Vaughan JP, Iglehart JD, Demirdji S, et al. An- tisense DNA down-regulation of the ERBB2 onco- gene measured by a flow cytometric assay. Proc Natl Acad Sci 1995; 92: 8338-42.
41. Citro G, Caputo R, Damiano V, et al. Inhibition of leukemia cell poliferation by folic acid-polylysi- ne-mediated introduction of c-myb antisense oli- godeoxy ucleotides into HL-60 cells. Br J Can- cer 1994; 69: 463-67.
42. Tortora G, Caputo R, Damiano V, et al. Coope- rative antitumor effect of mixed backbone oligo- nucleotides targeting protein kinase A in combina- tion with cytotoxic drugs or biologic agents. Anti- sense Nucleic Acid Drug Dev 1998; 2: 141-45.
43. Crooke ST, Bennet CF. Progress in antisense oli- gonucleotide therapeutics. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1996; 36: 107-29.
44. Crooke ST. Progress in antisense therapeutics.
Med Res Rev 1996: 16: 319-44.
45. Hermine O, Haioun C, Lepage E, et al. Pro- gnostic significance of bcl-2 protein expression in agressive non-Hodgkin’s lymphoma: Groupe d (Etude des Lymphomes de I’Adulte (GELA). Blo- od 1996; 87: 265-72.
46. Hill ME, MacLennan KA, Cunningham DC, et al.
Prognostic significance of Bcl-2 expression and Bcl-2 major breakpoint region rearrangement in diffuse large cell non-Hodgkin lymphoma. A Bri- tish National Lymphoma Investigation study. Blo- od 1996; 88: 1046-51.
47. Cotter FE, Corbo M, Raynauld F, et al. Bcl-2 antisensetheraphy in lymphoma: In vitro and in vi- vo mechanisms, efficacy, pharmacokinetics and toxity studies. Ann Oncol 1996; 9: 7, 32-36.
48. Zamecnik P. Background of the antisense oligo- nucleotide approach to chemotherapy. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 1997; 7: 199-202.
49. Stein CA. Keeping the biotechnology of antisense in context. Nature Biotechnology 1999; 17: 209.
ADRES DO KORESPONDENCJI dr n. med. KKrryyssttyynnaa SStteecc--MMiicchhaallsskkaa
Klinika Chorób Infekcyjnych i Gastroenterologii Instytutu Medycyny Wewnêtrznej
i Fizjoterapii
Wojskowej Akademii Medycznej ul. Kniaziewicza 1/5
91-347 £ódŸ
