Praca oryginalna/Original research article
Analiza ekspresji genów odpowiedzialnych za rozwój przewlek łej ma łopłytkowości
immunologicznej u dzieci
Gene expression analysis in the pathogenesis of chronic immune thrombocytopenia in children
Monika Richert-Przygońska
1,*, Bing Zhang
2, James L. Zehnder
2, Mariusz Wysocki
11Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera, Uniwersytet Mikołaja KopernikawToruniu,Bydgoszcz,Polska
2DepartmentofPathology,SchoolofMedicine,StanfordUniversity,Stanford,CA,USA
informacje o artykule
Historiaartykułu:
Otrzymano:26.07.2013 Zaakceptowano:18.11.2013 Dostępneonline:28.11.2013
Słowakluczowe:
małopłytkowośćimmunologiczna
geny
ekspresja
dzieci
Keywords:
Immunethrombocytopenia
Genes
Expression
Children
abstract
Background:Acomplexmultifactorialdysregulationofimmunesystem,includingcyto- kines andautoantibodies production, and also proteins modification underlay thepri- mary mechanism of immune thrombocytopenia (ITP). Specific genetic profile of ITP patientsis presumed,especially thosewith a longandcomplexnatural historyofthe disease.Aimofthestudy: GeneexpressionanalysisofVNN1andPPARginchildrenwith immune thrombocytopenia. Materials and methods: Candidate genes were identified withmicroarraycDNAprocedure.ForthevalidationofVNN1andPPARgexpressionchan- ges we used qRT-PCR performed comparatively in samples of newly diagnosed ITP (ndITP,n=16), chronic ITP(cITP, n=8)and patients without thrombocytopenia (n=5).
Results: We analyzed the data of patients, followed for at least 12 months after ITP diagnosis.NosignificantdifferencesofVNN1expression profilewerefoundin between groups (p>0.05).Lower signatures ofmean PPARgnormalizedexpression values were noticedinchronic ITPpatientsin contrastto newlydiagnosed ITPsubjects(p=0.009).
Differences between VNN1/PPARg ratio values found in ndITP group comparing to subjects with progression to cITP were close to statistical significance (p=0.054).
Conclusions: AnalysisoftheVNN1andPPARgexpressionprofilesutilityinchildrendiag- nosedwithITPrequiresfurtherinvestigation.
©2013PolskieTowarzystwoHematologówiTransfuzjologów,InstytutHematologiii Transfuzjologii.PublishedbyElsevierUrban&PartnerSp.zo.o.Allrightsreserved.
*Adresdokorespondencji:KatedraiKlinikaPediatrii,HematologiiiOnkologiiCMUMK,ul.M.Skłodowskiej-Curie9,85-094Bydgoszcz, Polska.Tel.:+48525854860,fax:+48525854867.
Adresemail:monika_richert@yahoo.com(M.Richert-Przygońska).
ContentslistsavailableatScienceDirect
Acta Haematologica Polonica
journal homepage:www.elsevier.com/locate/achaem
0001-5814/$–seefrontmatter©2013PolskieTowarzystwoHematologówiTransfuzjologów,InstytutHematologiiiTransfuzjologii.PublishedbyElsevierUrban&PartnerSp.zo.o.Allrightsreserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2013.11.004
Wstęp
Małopłytkowość immunologiczna (ITP) jest jedną z chorób, upodstaw którychleżyzłożonadysregulacjaukładu immu- nologicznego. Pomimo istnienia wielu różnorodnych teorii etiopatogenetycznychnieudałosiędotychczasustalićjedno- znacznego czynnika odpowiedzialnego za inicjowanie pro- dukcji autoprzeciwciałoraz nadprodukcjicytokin imolekuł, odgrywającychkluczowąrolęwwewnątrzkomórkowychkas- kadachreakcjiupacjentówzITP.
Biorącpoduwagęmnogośćaktywowanychszlakóworaz opisywaneprzypadkirodzinnegowystępowaniaITP,zakłada się istnienie swoistego profilu genetycznego odpowiedzial- nego za zmienioną syntezębiałek u chorych z ITP. Wśród ponad 170 genów mogących odpowiadać za rozwój mało- płytkowości najistotniejszą rolę przypisujesię genom szla- kówsygnałowychdlaIFNgorazgenomodpowiedzialnymza modyfikacjęwytwarzania białek w warunkachstresu oksy- dacyjnego[1–5].
Spośródprzebadanychgenównajczulszymmarkeremstre- suoksydacyjnego,odgrywającymniepodważalnąrolęwprze- wlekłej,azwłaszczaopornejnaleczenieITP,jestgenvanin-1 (VNN1), którego produkty wykazują aktywność prozapalną, dziękiantagonizmowiwstosunkudoreceptorówaktywowa- nychproliferatoramiperoksysomówtypug(PPARg).Wyraźnie zmienionądystrybucjęekspresjiVNN1orazgenuPPARgobser- wujesięw ludzkich komórkachkrwi obwodowej uchorych zarównoznoworozpoznaną,jakiprzewlekłąpostaciąITP[5].
Cel
CelempracybyłaporównawczaanalizaekspresjigenówVNN1 i PPARg w ludzkich komórkach krwi obwodowej u dzieci z małopłytkowością immunologiczną o różnym klinicznie przebieguorazpacjentówgrupykontrolnej.
Materiał i metody
BadanieekspresjigenówVNN1iPPARgprzeprowadzonoupa- cjentów hospitalizowanych w Klinice Pediatrii, Hematologii i Onkologii CM UMK w latach 2009–2011 z powodu nowo rozpoznanejmałopłytkowościimmunologicznej(ndITP,grupa badana– grupa A), upacjentów spełniających kryteria roz- poznaniaprzewlekłejmałopłytkowości(cITP;grupakontrolna – grupa B) oraz pacjentów hospitalizowanych w Klinice zprzyczynniehematologicznych(grupaporównawcza–grupa N).WśródpacjentówgrupyBwyodrębnionoponadtochorych, uktórych pookresie 12-miesięcznejobserwacji stwierdzono progresjęndITPdocITP(grupaA-C)ichorychzcITP oporną naleczenie,owieloletnimprzebiegu(grupaRC).
Do badania kwalifikowano dzieci po uzyskaniu zgody KomisjiBioetycznej UMK w Toruniu, przyCollegium Medi- cumim.LudwikaRydygieraw Bydgoszczy. Badanieprowa- dzono po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody na udział wbadaniuodprawnegoopiekunadziecka.
GenykandydackieVNN1iPPARgwytypowanonapodsta- wie wyników wcześniejszych analiz, przeprowadzonych
metodą mikromacierzycDNA upacjentów z rozpoznaniem ITP,zgodniezmetodologiąopisanąprzezZhangiwsp.[5].
Odwszystkichpacjentówgrupybadanejpobieranomate- riałw postaci 2,5ml krwipełnej. Pozyskane próbki przesy- łanonastępniewsuchymlodziedoDepartmentofPathology, Stanford University w USA celem przeprowadzenia analizy ekspresji genów VNN1 i PPARg z wykorzystaniem metody ilościowejRT-PCR, przy użyciu zaprojektowanychsond oli- gonukleotydowych TaqMan specyficznych dla wytypowa- nychwcześniejgenów.Znormalizowanewzględemkontrol- nego genu dehydrogenazy fosforanu aldehydu gliceryno- wego (GAPDH) wartości ekspresji badanych genów VNN1 i PPARg, określone upacjentów poszczególnych grup, pod- danoanalizieporównawczejpomiędzygrupami.
UpacjentówzndITPpróbkipobieranowokresiedo3mie- sięcyodrozpoznaniachoroby.Wceluuniknięciainterferencji lubwpływunaekspresjębadanychgenówmateriałpobierano przedwdrożeniemleczenia.Zadopuszczalneuznanorównież pobranie materiału w odstępie co najmniej 4 tygodni od ostatniej dawki stosowanego leku lub w krótszym odstępie przystwierdzanymbrakuodpowiedzinazastosowanelecze- nie.Przezkolejne12miesięcyocenianookresowoliczbępły- tekbadaniemmorfologiikrwiobwodowej,wykonywanymco najmniejrazna3miesiące.Poupływie12-miesięcznejobser- wacji przypisywano pacjentomrozpoznanie ostateczne, od- notowującewentualnąprogresjędopostaciprzewlekłejITP.
Analizęstatystycznąprowadzonoz użyciemoprogramo- wania SPSS Statistics 17.0. Różnice pomiędzy badanymi zmiennymi uznano za istotne statystycznie, gdy wartość p<0,05.
Wyniki
Badaniaprzeprowadzonowgrupie29pacjentów,wtym:19 chorych, których okres obserwacji klinicznej od momentu rozpoznaniaITPwynosiłconajmniej12miesięcy,5pacjen- tów z cITP, pozostających pod wieloletnią opieką Kliniki, oraz 5pacjentówpoddanych hospitalizacji z przyczyn nie- hematologicznych.
Pacjentów podzielononapodgrupy,uwzględniającrozpo- znanieostatecznechoroby(Tab.I).Wewszystkich3podgru- pach przeważali chłopcy (19/29). Średni wiek w chwili roz- poznaniawśródchorychzgrupyAwynosił5,7lat,aśrednia liczba płytek w dniu pobrania materiału 62,56109/l.
WgrupiedziecizprzewlekłąITP(grupaB)podobniekształto- wała się średnia liczba płytek krwi (62,62109/l),a średnia wiekubadanychchorychwynosiła 11,7lat.Wgrupieporów- nawczej N znaleźli się pacjenci z prawidłową liczbą płytek krwi, o zbliżonym rozkładzie cech demograficznych wstosunkudopozostałychgrup.
Wewszystkich29próbkachmetodąreakcjiilościowejRT- PCR ocenionoekspresjęgenów kandydackich VNN1iPPARg i uzyskano znormalizowane względem GAPDH wyniki war- tości ekspresji (Tab. II). Średnia wartość ekspresji w grupie chorych z noworozpoznaną ITPwynosiła 0,84ibyłaniższa w stosunku do średnich wartości uzyskanych w grupie z przewlekłąITP.Niewykazanojednakistotnychstatystycz- nie różnic wartości ekspresji pomiędzy grupami rozpoznań (p>0,05)(Ryc.1).
Wyodrębniwszy wśród pacjentów z cITP grupę chorych o wieloletnim przebiegu, opornych na kilka linii leczenia, wykazano istotnie niższe wartości ekspresji genu PPARg wstosunkudochorychzndITP(Ryc.2).
Ponadto, rozpatrując współczynnik wartości ekspresji VNN1/PPARg,wykazanoznamienniewyższewartościwspół- czynnika w grupie pacjentów bez małopłytkowości wstosunkudochorychzndITP,jakrównieżwstosunkudo grupy chorych z cITP o wieloletnim przebiegu. Różnice wartości współczynnika VNN1/PPARg w grupie chorych z ndITP, w porównaniu z chorymi, u których doszło do rozwojuprzewlekłejmałopłytkowości,byłybliskieistotności statystycznej(p=0,0544)(Tab.III).
Omówienie
Poszukiwania swoistych biomarkerów mogących odpowia- dać za zmienność przebiegu naturalnego ITP, jak również
wyniki wcześniejszych badań profilu genetycznego pacjen- tów z ITP zadecydowały o nieprzypadkowym wyborze genówkandydackichdoniniejszegoopracowania[3,4].
W etiopatogenezie ITP podkreśla się szczególną rolę genów wpływającychnazmianęaktywacjiszlakówsygnało- wych, inicjujących produkcję cytokin ibiałekprozapalnych.
Równoleglepodkreślasięwpływstresuoksydacyjnego,mogą- cego indukować zmiany na poziomie transkrypcyjnym, co prowadzidoprogresjiITP[5,6].WedługZhangiwsp.,mody- fikacjaekspresjigenuVNN1,będącegojednymznajczulszych markerówstresuoksydacyjnegouchorychzITP,możemieć związek z predyspozycjami do rozwoju przewlekłej postaci małopłytkowości. Poza tym sugeruje się hamujący wpływ VNN1naekspresjęgenuPPARgwkomórkachkrwiobwodowej u chorychw różnymstadiumITP[5].Udowodniono, żegen VNN1działa jakswoisty regulatorodpowiedzi tkankowejna stresoksydacyjny,ponieważmodulujeaktywnośćgammaglu- tamylosyntetazy(GCS)imagazynowanieglutationuzreduko- wanego (GSH) w komórkach. Nadmierna ekspresja genu TabelaI–Danedemograficzneiklinicznepacjentówgrupybadanej
TableI–Demographicandclinicaldataofstudygrouppatients
Grupa/Liczebność DGN ID
próbki Wiek [lata]
Płeć [M/K]
PLTwdniu rozpoznania
ITP
Liczba płytekwdniu pobraniamateriału
Czasod rozpoznania
ITP[dni]
Leczenie [T/N]
(A)NoworozpoznanaITP:(n=16) ndITP M2 7 M 4 78 2 N
ndITP M4 2 M 4 154 90 T
ndITP M5 1 K 34 34 0 N
ndITP M6 5 M 4 4 1 N
ndITP M7 6 M 37 41 61 T
ndITP M8 13 M 7 90 60 T
ndITP M9 2 M 4 133 71 T
ndITP M11 3 K 10 10 0 N
ndITP M13 4 M 14 39 1 N
ndITP M14 13 K 19 19 3 N
ndITP M15 12 K 0 3 1 N
ndITP M16 7 M 1 28 14 T
ndITP M17 7 M 22 78 1 N
ndITP M18 1 M 21 14 3 N
ndITP M19 1 K 47 272 16 N
ndITP M20 7 M 4 4 0 N
(B)PrzewlekłaITP:(n=8) cITP M3 6 M 5 5 0 N
cITP M10 5 K 55 11 28 T
A-C(n=3) cITP M12 12 M 14 14 3 T
RC(n=5) cITP C1 14 K 91 3 >365 T
cITP C2 16 M 11 1 >365 T
cITP C3 15 M 17 213 >365 T
cITP C4 10 M 24 57 >365 T
cITP C5 16 K 25 197 >365 T
(N)Grupaporównawcza:(n=5) NF1 Z1 8 K 241 N
RMS* Z2 5 K 313 N
Zap.płuc Z3 3 M 343 N
SIRS Z4 5 M 203 N
NF1 Z5 7 M 272 N
ITP – małopłytkowośćimmunologiczna (immune thrombocytopenia); (A) – pacjenci znowo rozpoznaną ITP (newly diagnosed ITP patients);
(B)–pacjencizprzewlekłąITP(chronicITPpatients);A-C–pacjencizprogresjądoprzewlekłejITP(M3,M10iM12)(patientswithprogressionto chronicITP(M3,M10iM12));RC–pacjencizcITPopornąnaleczenie,owieloletnimprzebiegu(C1-C5)(cITPpatientsresistanttomultipletreatments withlong-termcourseofthedisease(C1–C5));(N)–pacjencibezrozpoznaniamałopłytkowości(patientswithoutthrombocytopenia);ndITP–nowo rozpoznanaITP(newlydiagnosedITP);cITP–przewlekłaITP(chronicITP);ID–numeridentyfikacyjny(identificationnumber);M2-M20/C1-C5/Z1-Z5– nadaneodpowiednionumerypróbek(samplescodes);K–dziewczynki(girls);M–chłopcy(boys);T–tak,zastosowano(yes,treated);N–nie, nieleczono(no,untreated);NF1–neurofibromatozatypu1(neurofibromatosistype1);RMS*–stanpoleczeniumięsakaprążkowanokomórkowego (rhabdomyosarcomastatusposttreatment);zap.płuc– zapaleniepłuc (pneumonia);SIRS –zespół ogólnoustrojowejreakcjizapalnej(systemic inflammatoryresponsesyndrome)
VNN1jestzwiązanaznasilonympowstawaniemcytokinpro- zapalnych, katalizowaniem syntezy prostaglandyn i innych mediatorówzapaleniaoraz aktywacjąszlakówreakcjizależ- nych od cyklooksygenazy-2 (COX-2) [7]. Według Berruyer iwsp.[7,8],wwarunkachstresuoksydacyjnego,wodpowie- dzinapobudzenieukładuodpornościowego,wzrastaekspre- sja genuVNN1, a co za tym idzie, nasilają sięreakcje hy- drolizypantoteiny,uwalniającecząsteczki cysteaminy,która następnie jest przekształcana w cystaminę. Cystamina blo- kujedziałaniegammaglutamylosyntetazybędącejkluczowym enzymemwprocesiesyntezyglutationu.Wyczerpywaniesię zapasów glutationu zredukowanego oraz wzrost stężenia glutationuutlenowanego(GSSG)nasilajązwrotnieprodukcję reaktywnych cząsteczek tlenu. Powstająca pod wpływem zwiększonej ekspresji VNN1 cystamina blokuje ponadto punkty kontrolne w szlakach odpowiedzi przeciwzapalnej iantagonizujedziałanieproduktówgenuPPARg(Ryc.3).
Funkcję przeciwzapalną produktówgenu PPARg, a także możliwość zastosowania agonistów PPARg w terapii scho- rzeń, u podstaw których leżą procesy immunologiczne, opisywano wielokrotnie. Dowiedziono, żePPARgmawpływ nie tylkonaróżnicowanieiproliferacjęmakrofagów,adipo- cytów i limfocytów, ponieważ oddziałuje na metabolizm wewnątrzkomórkowy.Prawidłowalubzwiększonaekspresja PPARg zapewnia również homeostazę metaboliczną na poziomie transkrypcyjnym i bierze udział w hamowaniu procesów zapalnych,odpowiedzialnychzaprogresjęchorób, takich jak cukrzyca, miażdżyca, stwardnienie rozsiane czy mukowiscydoza. Produkty genuPPARg wymienia sięwśród supresorów wzrostu guzów mózgu, raka jelita grubego i wielu innych. Dlatego też oddziaływanie na aktywność i ekspresję PPARg leży w obszarze zainteresowań wielu badaczy[9–14].
Ekspresję genów kandydackich VNN1 i PPARg oceniono w próbkach krwipełnej iuzyskano znormalizowane wzglę- demGAPDHwartościekspresjiobubadanychgenów.Analizę przeprowadzonowreprezentatywnejgrupiechorychznowo zdiagnozowaną ITP, których poddano obserwacji klinicznej TabelaII–Znormalizowanewartościekspresjigenów
VNN1iPPARg
TableII–NormalizedvaluesofVNN1iPPARgexpression
Rozpoznanie ID VNN1 PPARg
GrupaA/ndITP M2 0,349 0,022
M4 3,648 0,071
M5 0,840 0,051
M6 0,156 0,013
M7 0,420 0,035
M8 0,935 0,022
M9 1,054 0,043
M11 0,883 0,049
M13 0,447 0,059
M14 1,602 0,047
M15 0,310 0,043
M16 0,383 0,060
M17 0,517 0,077
M18 0,172 0,028
M19 1,366 0,038
M20 0,350 0,038
GrupaB/cITP C1 0,096 0,008
C2 0,381 0,027
C3 0,583 0,018
C4 0,464 0,023
C5 0,673 0,022
M3 1,276 0,033
M10 4,691 0,048
M12 0,308 0,086
GrupaN Z1 0,719 0,018
Z2 0,541 0,009
Z3 2,885 0,053
Z4 2,960 0,118
Z5 0,775 0,014
ITP–małopłytkowośćimmunologiczna(immunethrombocytopenia);
GrupaA–pacjenciznowo rozpoznanąITP(newlydiagnosedITP patients); Grupa B– grupa kontrolna, pacjenci z przewlekłą ITP (controlgroup,chronicITPpatients);GrupaN–grupaporównawcza, pacjencizprawidłowąliczbąpłytekkrwi(comparativegroup,normal platelet count patients); ndITP – nowo zdiagnozowana ITP (newly diagnosedITP);cITP–przewlekłaITP(chronicITP);VNN1–ekspresja genuVNN1(VNN1expression);PPARg–ekspresjagenuPPARg(PPARg expression);M2-M20/C1-C5/Z1-Z5–numeryidentyfikacyjnepróbek (samplesidentificationnumbers)
N A-C
RC A
Grupy 4,00
2,00
0,00
VNN1/GAPDH
1,06 0,84
1,58
Ryc.1–EkspresjagenuVNN1wbadanychpodgrupach VNN1/GPADH-wartośćekspresjigenuVNN1
znormalizowanawzględemGPADH;A-pacjenciznowo rozpoznanąITP(grupaA,n=16);A-C-pacjencizprogresją doprzewlekłejITP(M3,M10,M12,n=3);RC-pacjencizcITP opornąnaleczenie,owieloletnimprzebiegu(C1-C5,n=5);
N-pacjencibezmałopłytkowości(grupaporównawczaN, n=5)
Fig.1–GeneVNN1expressioninstudysubgroups VNN1/GPADH–VNN1expressionvaluesnormalizedto housekeepinggeneofGPADH;A–newlydiagnosedITPpatients (groupA,n=16);A–C–patientswithprogressiontochronic ITP(M3,M10,M12,n=3);RC–cITPpatientsresistantto multipletreatmentswithlong-termcourseofthedisease (C1–C5,n=5);N–patientswithoutthrombocytopenia (comparativegroupN,n=5)
trwającejconajmniej12miesięcy,zgodniezobowiązującymi kryteriamiIWGdefiniującymihistorięnaturalnąITP.Ekspre- sjęobugenówocenionorównieżwgrupiedziecizprzewlekłą ITP o wieloletnim przebiegu oraz wśród pacjentów
z prawidłową liczbą płytek krwi. Jako odrębną grupę rozpatrywano pacjentów, u których doszło do progresji w kierunkuprzewlekłejITP. Niewykazano istotnychróżnic w zakresie ekspresji VNN1 pomiędzy badanymi grupami.
Potwierdzono natomiast istotnie niższe wartości ekspresji PPARg u chorych z przewlekłą ITPo wieloletnim przebiegu i jednocześnie oporną na leczenie. Wyniki te różnią się od uzyskanych przez Zhangi wsp., którzy w swojej publikacji potwierdzili zwiększoną ekspresję VNN1 u chorych z przewlekłą postacią ITP, nie dokumentując jednocześnie zmienności ekspresji genuPPARg uchorych w różnymsta- diumITP[5].
Wbadanejgrupieuzyskanaśredniaznormalizowanawar- tośćekspresjigenuVNN1byłanajniższaupacjentówznowo zdiagnozowaną ITP. W porównaniu z grupą pacjentów z przewlekłąITPniewykazanoznamiennych różnic,jednak u chorych, u których zanotowano progresję do przewlekłej ITP,wartościśrednieekspresjiVNN1byłyponad dwukrotnie wyższe.Równieżwgrupiechorychzmałopłytkowościąprze- wlekłą wartości ekspresji genu VNN1 różniły się znacząco pomiędzy poszczególnymi pacjentami, co korelowało z po- twierdzonymodmiennymprzebiegiemklinicznymITP.Wgru- piechorychzmałopłytkowościąopornąnaleczenie,owielo- letnim przebiegu, stwierdzono natomiast średnie wartości ekspresji VNN1 prawie pięciokrotnie niższe niż u dzieci z progresją docITP,z mniej nasiloną aktywnością choroby.
Powyższe różnice wynikają najprawdopodobniej ze zmian ekspresji badanych genów, mogących zachodzić w czasie samoistnie,jak równieżpodwpływemczynnikówśrodowis- kowych,doktórychprzedewszystkimnależyzaliczyćstoso- waneleczenie.
NajwyższaśredniawartościekspresjiVNN1paradoksalnie dotyczyła dzieci z grupy kontrolnej N, czyli chorych bez rozpoznaniamałopłytkowości.Fakttennależyprawdopodob- nie powiązać z doborem pacjentów do tej grupy, którego jedynym kryteriumwłączeniabyła prawidłowaliczbapłytek krwii brakschorzeniahematologicznego. Wzwiązkuz tym w grupie porównawczej N znalazły się również dzieci zinfekcjamiociężkimipowikłanymprzebiegu(SIRS,zapale- niepłuc),upodłożaktórychleżynasilenieprodukcjireaktyw- nych form tlenu. Należy zatem domniemać, że z powodu infekcjii/lubzapaleniamogłopośredniodochodzićdozmian N
A-C RC
A
Grupy 0,12
0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00
PPARG/GAPDH 0,04
0,019
0,056
0,042
Ryc.2–EkspresjagenuPPARgwbadanychpodgrupach PPARg/GPADH–wartośćekspresjigenuVNN1
znormalizowanawzględemGPADH;A-pacjenciznowo rozpoznanąITP(grupaA,n=16);A-C-pacjencizprogresją doprzewlekłejITP(M3,M10,M12,n=3);RC-pacjencizcITP opornąnaleczenie,owieloletnimprzebiegu(C1-C5,n=5);
N-pacjencibezmałopłytkowości(grupaporównawczaN, n=5)
Fig.2–GenePPARgexpressioninstudysubgroups PPARg/GPADH–PPARgexpressionvaluesnormalizedto housekeepinggeneofGPADH;A–newlydiagnosedITPpatients (groupA,n=16);A–C–patientswithprogressiontochronic ITP(M3,M10,M12,n=3);RC–cITPpatientsresistantto multipletreatmentswithlong-termcourseofthedisease(C1– C5,n=5);N–patientswithoutthrombocytopenia(comparative groupN,n=5)
TabelaIII–Porównanieekspresjigenówwbadanychpodgrupach TableIII–Comparisonofgenesexpressioninbetweenstudysubgroups
Analiza/Grupabadana VNN1(wartośćp) PPARg(wartośćp) VNN1/PPARg(wartośćp)
AvsA-C 0,0963 0,3258 0,0544
AvsB 0,6520 0,2452 0,1865
AvsRC 0,3243 0,0092 0,6972
AvsN 0,1472 0,9356 0,0013
NvsA-C 0,6867 0,6694 0,9886
NvsB 0,5344 0,6386 0,2898
NvsRC 0,0769 0,3023 0,0112
VNN1–ekspresjagenuVNN1(VNN1expression);PPARg–ekspresjagenuPPARg(PPARgexpression);p–poziomistotnościstatystycznej,zawartość istotnąprzyjętop<0,05(pvalue,statisticalsignificanceatlevelofp<0.05);A–pacjenciznoworozpoznanąITP(grupaA)(newlydiagnosedITP patients(groupA));B–pacjencizprzewlekłąITP(grupaB)(chronicITPpatients(groupB));A-C–pacjencizprogresjądoprzewlekłejITP(patients withprogressiontocITP);RC–pacjencizcITPopornąnaleczenie,owieloletnimprzebiegu(cITPpatientsresistanttomultipletreatmentwithlong-term courseofthedisease(C1–C5));N–pacjencibezmałopłytkowości(grupaporównawczaN)(patientswithoutthrombocytopenia(comparativegroupN))
ekspresji genów, takich jak VNN1, i modyfikacji produkcji białek,zmieniającejsięwwarunkachstresuoksydacyjnego.
Najniższe znormalizowane wartości ekspresji PPARg zanotowanowśródchorychzopornącITP.Byłyoneistotnie niższe niż w grupie dzieci z nowo rozpoznaną ITP i co najmniej dwukrotnie niższe niż u pozostałych chorych z małopłytkowością.Na podstawiedostępnych danychlite- raturowych,dotyczącychroligenuPPARg,można przypusz- czać, że zmniejszenie ekspresji PPARg u pacjentów z ITP wiążesięzhamowaniem potencjału przeciwzapalnegojego produktówbiałkowych iwpływa pośrednio na wzrost syn- tezy cytokinzapalnych, co maw konsekwencjiprzełożenie nahistorięnaturalnąmałopłytkowościi nasilenieobjawów klinicznychuposzczególnychchorychwgrupiebadanej.
Dla wyodrębnienia rzeczywistych biomarkerów ryzyka rozwojucITP,jakiokreśleniaswoistegoprofilugenetycznego chorychwróżnychstadiachITPistotneznaczeniemożemieć zatem kontynuowanie badań genetycznych oraz dokonanie analizywobrębieszerszejgrupy pacjentówzrozpoznaniem ITPikonfrontacjadanychzwynikamiselektywniedobranych grupporównawczych,wtymzupełniezdrowychdzieci.
Wobliczuuzyskanychwyników,świadczącychozmniej- szonej ekspresji PPARg u dzieci z przewlekłą i oporną na leczenieITP,koniecznejestrozważenieroliagonistówPPARg jakoatrakcyjnejopcjiterapeutycznejdlatejgrupychorych.
Podsumowanie
Analiza ekspresji genów VNN1 i PPARg nie potwierdziła zwiększonejekspresjigenuVNN1wbadanejgrupiechorych, wykazano natomiast istotne obniżenie wartości ekspresji PPARg upacjentówzprzewlekłąITPowieloletnim przebie- gu. Ocena użyteczności stwierdzonych zmian ekspresji genówVNN1iPPARg udzieciz rozpoznaniem ITPwymaga dalszychbadań.
Wkład autorów/Authors' contributions
MR-P – koncepcja pracy, zebranie danych, analiza statys- tyczna, interpretacja danych, przygotowanie pracy, przygo- towanie literatury. MBZ, JZ – koncepcja pracy, zebranie iinterpretacjadanych.MW–koncepcjapracy,interpretacja danych,przygotowaniepracy,przygotowanieliteratury
Konflikt interesu/Conflict of interest
Niewystępuje.
Ryc.3–MiejsceVNN1wszlakachsygnałowychkomórekkrwiobwodowejwwarunkachstresuoksydacyjnegowgBerruyeri wsp.[3,4]
Glu–kwasglutaminowy;Cys–cysteina;GCS–enzymg-glutamylosyntetaza;GSH–zredukowanaformaglutationu;GSSG– utlenowanapostaćglutationu
Fig.3–TheroleofVNN1inhumanbloodcellsignalingpathwaysinresponsetooxidativestress[3,4]
Glu–glutaminianacid;Cys–cysteine;GCS–g-glutamylcysteinesynthethase;GSH–reducedformofglutathione;GSSG–oxidized formofglutathione
Finansowanie/Financial support
Niewystępuje.
Etyka/Ethics
Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami DeklaracjiHelsińskiej,dyrektywamiEUorazujednoliconymi wymaganiamidlaczasopismbiomedycznych.
pi smiennictwo/references
[1] BergmannAK,GraceRF,NeufeldEJ.Geneticstudiesin pediatricITP:outlook,feasibility,andrequirements.Ann Hematol2010;89(Suppl1):S95–S103.
[2] NugentDJ.Immunethrombocytopenicpurpuraof childhood.HematologyAmSocHematolEducProgram 2006;97–103.
[3] SoodR,WongW,JengM,ZehnderJL.Geneexpression profileofidiopathicthrombocytopenicpurpura(ITP).
PediatrBloodCancer2006;47(5Suppl):675.
[4] SoodR,WongW,GotlibJ,JengM,ZehnderJL.Gene expressionandpathwayanalysisofimmune
thrombocytopenicpurpura.BrJHaematol2008;140:99–103.
[5] ZhangB,LoC,ShenL,etal.Theroleofvanin-1and oxidativestress-relatedpathwaysindistinguishingacute andchronicpediatricITP.Blood2011;117:4569–4579.
[6] KurienBT,HensleyK,BachmannM,ScofieldRH.
Oxidativelymodifiedautoantigensinautoimmune diseases.FreeRadicBiolMed2006;41:549–556.
[7] BerruyerC,PouyetL,MilletV,etal.Vanin-1licenses inflammatorymediatorproductionbygutepithelialcells andcontrolscolitisbyantagonizingperoxisome
proliferator-activatedreceptorgammaactivity.JExpMed 2006;203:2817–2827.
[8] BerruyerC,MartinFM,CastellanoR,etal.Vanin-1-/-mice exhibitaglutathione-mediatedtissueresistanceto oxidativestress.MolCellBiol2004;24:7214–7224.
[9] CariouB,CharbonnelB,StaelsB.Thiazolidinedionesand PPARgammaagonists:timeforareassessment.Trends EndocrinolMetab2012;23:205–215.
[10] DekkersJF,vanderEntCK,KalkhovenE,BeekmanJM.
PPARgammaasatherapeutictargetincysticfibrosis.
TrendsMolMed2012.
[11] NguyenMT,ChenA,LuWJ,etal.RegulationofChemokine andChemokineReceptorExpressionbyPPARgammain AdipocytesandMacrophages.PLoSOne2012;7:e34976.
[12] Podolak-DawidziakM.Patogenezaimmunologicznej plamicymałopłytkowej.ActHaematolPol2009;40:843–848.
[13] RobbinsGT,NieD.PPARgamma,bioactivelipids,and cancerprogression.FrontBiosci2012;17:1816–1834.
[14] SchneggCI,RobbinsME.NeuroprotectiveMechanismsof PPARdelta:ModulationofOxidativeStressand
InflammatoryProcesses.PPARRes2011;2011:373560.