„Metody analizy związków chemicznych”

Laboratorium z przedmiotu:

„Metody analizy związków chemicznych”

Kierunek: Technologia Chemiczna /studia niestacjonarne/

Sem. 1/II stopnia

Prowadzący:

Dr inż. Tadeusz Bieg

v1@2015

Spektroskopia NMR w analizie jakościowej i ilościowej.

Wstęp:

Początkowo wykorzystanie zjawiska magnetycznego rezonansu jądrowego ( NMR ) w analityce chemicznej sprowadzało się wyłącznie do badań strukturalnych związków organicznych. Stosunkowo mała czułość tych technik w połączeniu z dużym kosztem aparatury były w początkowym okresie hamulcem rozwoju tej techniki. Dopiero znaczny postęp w technologii konstruowania magnesów zdolnych wytwarzać bardzo silne pola magnetyczne ( magnesy nadprzewodzące ) oraz postęp w elektronice i komputeryzacji, spowodował znaczne zwiększenie czułości metody. Obniżenie progu oznaczalności połączone z daleko posuniętą zdolnością specjacyjną, sięgającą poszczególnych elementów struktury cząsteczki oraz zdolność do ilościowego oznaczania parametrów typu wskaźników sumarycznych sprawiły, że metoda spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego stała się atrakcyjną dla chemika analityka. Wysoka selektywność pomiarów, w wielu przypadkach czyniąca zbędnym etap separacji, predysponuje tę technikę do zastosowań w analityce środowiska.

Można przypuszczać, że zastosowanie NMR w analizie środowiska będzie przebiegać dwutorowo. Po pierwsze rezonans jąder ¹H, ¹³C, ¹⁴N, ¹⁵N, ³¹P, ¹⁹F, ³⁵Cl będzie służył monitorowaniu organicznych zanieczyszczeń środowiska. Umożliwi to, dzięki nie niszczącemu charakterowi oraz wysokiej selektywności metody, oznaczanie wielu analitów z jednej próbki i poddanie uzyskanych wyników daleko idącej analizie korelacyjnej. Drugi kierunek rozwoju techniki NMR będzie zapewne polegać na wykorzystaniu nisko rozdzielczych, relatywnie tanich spektrometrów, przy pomocy

których można oznaczać wskaźniki sumaryczne, wykorzystując w tym celu poszczególne zakresy częstotliwości rezonansowych, charakterystyczne dla poszczególnych jąder atomowych, grup funkcyjnych i klas związków.

Cel ćwiczenia:

Ćwiczenie ma pokazać na przykładzie analizy „tabletki od bólu głowy” ( TBG ), zalety i możliwości zastosowania spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w:

- ustalaniu struktury związków organicznych - stwierdzeniu tożsamości związków

- analizie ilościowej składu tabletki

Ćwiczenie ma pokazać również znaczne uproszczenie procedury analitycznej, gdy metody klasyczne w analizie ilościowej składników „tabletki od bólu głowy” takie jak:

- alkalimetryczne oznaczanie kwasu acetylosalicylowego - jodometryczne oznaczanie kofeiny

- azotynometryczne oznaczanie fenacetyny

oraz metody klasycznej analizy jakościowej zastąpi się metodą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego 1H-NMR.

Opis na stronach 3-5 ilustruje nakład pracy przy stosowaniu klasycznych metod analizy.

Opis ćwiczenia:

1. Skład „Tabletki od bólu głowy” ( TBG ) wg Farmakopeii Polskiej:

a) Kwas acetylosalicylowy 0,300g

b) Fenacetyna 0,100g

c) Kofeina 0,050g

Masa tabletki 0,600g

2. Własności fizykochemiczne składników TBG:

Parametr Kwas

acetylosalicylowy Fenacetyna Kofeina

Masa cząsteczkowa 180,16 179,22 194,20

Temperatura topnienia 134-137 134-137 234-237,5

Rozpuszczalność w H2O 1+300 1+1700 1+60

Rozpuszczalność w CHCl3 1+20 1+15 1+8

3. Analiza jakościowa metodami klasycznymi [2]:

Próby fizykochemiczne oraz niektóre reakcje charakterystyczne wymagają rozdziału TBG na składniki. Należą do nich m.in. dla kofeiny – reakcja z roztworem jodu w środowisku kwaśnym i reakcja mureksydowa, natomiast dla fenacetyny – reakcja nitrowania oraz reakcja utleniania dwuchromianem potasowym. Z wymienionymi odczynnikami reaguje zarówno kofeina jak i fenacetyna. Do izolacji składników

tabletek wykorzystano ich rozpuszczalność w eterze, wodzie, roztworze wodorotlenku sodowego i chloroformie. Najpierw ze sproszkowanych Tabletek od bólu głowy

ekstrahuje się kwas acetylosalicylowy i fenacetynę eterem, a następnie z pozostałości kofeinę – wodą. Do rozdziału fenacetyny i kwasu acetylosalicylowego w pozostałości po oddestylowaniu eteru wykorzystano ich rozpuszczalność w roztworze

wodorotlenku sodowego, w którym rozpuszczalny jest tylko kwas acetylosalicylowy.

Przepisy wykonania prób:

2g sproszkowanych TBG ekstrahować trzykrotnie 15 ml eteru. Wyciągi eterowe zawierają kwas acetylosalicylowy i fenacetynę, a pozostałość – kofeinę i składniki masy tabletkowej. Z ekstraktów eterowych oddestylować rozpuszczalnik, a do

pozostałości dodać 15ml 0,5 mol/dm³ roztworu wodorotlenku sodowego, wymieszać i przesączyć. Przesącz zawiera kwas acetylosalicylowy, osad na sączku – fenacetynę.

Kwas acetylosalicylowy.

Identyfikację kwasu acetylosalicylowego można przeprowadzić na podstawie:

1. prób fizykochemicznych: temperatury topnienia, absorpcji promieniowania w zakresie nadfioletu i podczerwieni,

2. reakcji charakterystycznych:

a. reakcji aromatycznych kwasów karboksylowych, do których należy reakcja estryfikacji

b. reakcji pierścienia aromatycznego, do których należą reakcje z odczynnikiem Millona i Marquisa

c. hydrolizy kwasu acetylosalicylowego do kwasu salicylowego i kwasu octowego, izolacji kwasu salicylowego i jego charakterystyki metodami podanymi wyżej dla kwasu acetylosalicylowego

Kwas acetylosalicylowy w roztworze etanolowym wykazuje maksima absorpcji promieniowania przy długości fali 226nm ( =8612, A1cm1%

=478 ) i 276nm.

Fenacetyna.

Osad na sączku zawierający fenacetynę przekrystalizować z 50% roztworu etanolu.

Osad odsączyć i wysuszyć w temperaturze 80^oC.

Identyfikację fenacytyny można przeprowadzić na podstawie:

1. prób fizykochemicznych: temperatury topnienia, absorpcji promieniowania w zakresie nadfioletu.

2. reakcji charakterystycznych:

a. reakcji utleniania produktu hydrolizy dwuchromianem potasowym

b. reakcji dwuazowania, a następnie sprzęgania z 1 lub 2-naftolem produktu hydrolizy w środowisku kwaśnym.

Fenacetyna w roztworze etanolowym wykazuje maksimum absorpcji promieniowania przy długości fali 250nm ( A1cm1%

=868 ).

Kofeina.

Pozostałość po wyekstrahowaniu kwasu acetylosalicylowego i fenacetyny eterem, ekstrahować dwukrotnie 20 cm³ wody. Wyciągi wodne zawierające kofeinę

przesączyć. Przesącz ekstrahować 20 cm³ chloroformu i pozostałość

przekrystalizować z etanolu. Osad odsączyć i wysuszyć w temperaturze 80^oC.

Identyfikację kofeiny można przeprowadzić na podstawie:

1. prób fizykochemicznych: temperatury topnienia, absorpcji promieniowania w zakresie nadfioletu.

2. reakcji charakterystycznych:

a. reakcji mureksydowej b. reakcji zasad organicznych

Kofeina w roztworze etanolowym wykazuje maksimum absorpcji promieniowania przy długości fali 272nm ( A1cm1%

=480 ).

4. Analiza ilościowa metodami klasycznymi.

4.1 Alkalimetryczne oznaczanie kwasu acetylosalicylowego [1].

Odważyć dokładnie około 600mg sproszkowanych tabletek, rozpuścić w 25 cm³ zobojętnionego 95% etanolu i miareczkować 0,1 mol/dm³ roztworem NaOH wobec fenoloftaleiny do różowego zabarwienia.

1 cm³ 0,1 mol/dm³ r-ru NaOH odpowiada 0,1 mM kwasu acetylosalicylowego (18,01 mg ).

4.2 Azotynometryczne oznaczanie fenacetyny [2].

Odważyć dokładnie około 1,4g sproszkowanych tabletek do kolby stożkowej, dodać 20 cm³ 16% kwasu siarkowego i gotować pod chłodnicą zwrotną w ciągu godziny. Po ochłodzeniu przenieść zawartość kolby do zlewki, popłukując kolbę 50 cm³ wody, dodać 10 cm³ 25% kwasu solnego, 2 g bromku potasowego i miareczkować 0,1 mol/

dm³ roztworem azotynu sodowego metodą amperometryczną w układzie dwóch elektrod platynowych spolaryzowanych.

1 cm³ 0,1 mol/dm³ r-ru NaNO2 odpowiada 0,1 mM fenacetyny (17,92 mg ).

4.3 Jodometryczne oznaczanie kofeiny [2].

Odważyć dokładnie około 0,7g sproszkowanych tabletek do zlewki, dodać 20cm³ wody, dokładnie wymieszać i przesączyć przenosząc możliwie cały osad na sączek i zbierając przesącz do kolby miarowej o pojemności 100ml. Osad przemyć ponownie 20 cm³ wod. Następnie do zebranych przesączów dodać 5 cm³ 16% kwasu

siarkowego i 25 cm³ 0,05 mol/dm³ roztworu jodu, uzupełnić wodą do kreski i pozostawić na 15 min. Wydzielony osad odsączyć odrzucając pierwsze 20 cm³ przesączu. 25,0 cm³ przesączu miareczkować 0,1 mol/dm³ roztworem tiosiarczanu sodowego wobec skrobi.

1 cm³ 0,1 mol/dm³ r-ru J2 odpowiada 0,05 mM kofeiny (9,71 mg ).

5. Zastosowanie spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w analizie kwasu acetylosalicylowego, fenacetyny i kofeiny.

5.1. Analiza ilościowa w spektroskopii NMR

Analiza ilościowa opiera się na proporcjonalności natężenia sygnału od liczby protonów. Jako pasma analityczne wybiera się sygnały ( najczęściej singlety lub dublety), dobrze oddzielone od innych sygnałów w próbce.

Oznaczenia można wykonać metodami:

a. kalibracji zewnętrznej b. wzorca wewnętrznego c. normalizacji wewnętrznej Metoda kalibracji zewnętrznej.

W metodzie kalibracji zewnętrznej dla serii roztworów wzorcowych wykonuje się pomiary natężenia sygnału (Pwz) i ustala się zależność Pwz = f(ci%), opisaną równaniem prostej

Pwz = a ^. cwz(%) + b

Stałe a i b oblicza się metodą najmniejszych kwadratów. Następnie dokonuje się pomiaru natężenia sygnału analitycznego dla roztworu badanego ( Pi ) i oblicza zawartość oznaczanego składnika xi w badanym preparacie na podstawie krzywej wzorcowej.

Metoda wzorca wewnętrznego.

W przypadku gdy nie identyfikuje się wszystkich składników próbki lub gdy wiadomo, że w próbce są substancje nie dające sygnałów NMR, korzysta się z metody wzorca wewnętrznego. Wzorzec wewnętrzny musi być tak dobrany, by jego pasmo

analityczne nie nakładało się z żadnym z pasm oznaczanych substancji. Zawartość składnika oznaczanego oblicza się ze wzoru:

100

(%) 







 

p wz wz

wz i i

i P M m

m M x P

Pi – natężenie sygnału analitycznego i-tego składnika mieszaniny w przeliczeniu na jeden proton

Pwz – natężenie sygnału analitycznego wzorca w przeliczeniu na jeden proton Mi - masa cząsteczkowa i-tej substancji

Mwz - masa cząsteczkowa wzorca mp - masa próbki

mwz - masa wzorca

Metoda normalizacji wewnętrznej.

W przypadku gdy można przyjąć założenie upraszczające, że wszystkie składniki próbki mają grupy protonów, których sygnały są dostatecznie rozdzielone, obliczenia prowadzi się zwykle metodą normalizacji wewnętrznej. Stężenie i-tego składnika w mieszaninie n-składnikowej wyrażone w procentach wagowych oblicza się ze wzoru:

100

%

1





 



i

i i

i i i

M P

M x P

Pi - wartość całki i-tej substancji w przeliczeniu na jeden proton Mi - masa cząsteczkowa i-tego składnika

W przypadku nakładania się sygnałów analitycznych wartości Pi można często wyznaczyć rozwiązując układ równań pomocniczych.

Wykonanie ćwiczenia:

Wykonujemy ćwiczenie wg wariantu wskazanego przez prowadzącego (1,2 lub 3).

1.

Do kiuwetki pomiarowej odważyć dokładnie około 60mg dobrze sproszkowanej tabletki TBG i dodać mikropipetą 1 ml deuterochloroformu ( CDCl3 ) zawierający wzorzec TMS. Przed dodaniem chloroformu wyzerować wagę, aby mieć dokładną masę dodanego chloroformu. Probówkę zamknąć, zawartość wstrząsać i łagodnie ogrzać do całkowitego rozpuszczenia się składników czynnych TBG.

Substancje pomocnicze takie jak skrobia i laktoza obecne w tabletce są nierozpuszczalne w deuterochloroformie, wobec czego nie przeszkadzają w oznaczeniu. Zarejestrować widmo protonowe na spektrometrze magnetycznego rezonansu jądrowego Varian o częstotliwości podstawowej 600MHz.

Równolegle przygotować próbkę wzorcowego roztworu kofeiny ( 0,05g w 1 ml CDCl3 ) lub innej substancji zawartej w TBG i zarejestrować widmo.

Na rysunkach 1A, 1B oraz I-C przedstawiono widma 1H-NMR poszczególnych indywidualnych składników tabletek od bólu głowy oraz widmo „całej” tabletki.

Pokazano również wybrane sygnały analityczne do oznaczeń ilościowych

poszczególnych składników. Sygnały wybrane jako analityczne mają następujące przesunięcia chemiczne:

Kwas acetylosalicylowy: singlet przy 2,341 ppm odpowiadający protonom grupy acetylowej CH3CO-.

Fenacetyna: kwartet przy 3,970 ppm odpowiadający protonom CH2 grupy etoksylowej –O-CH -CH lub singlet grupy CH przy 2.108 ppm.

Kofeina: sygnały przy 3.591 i 3.416 ppm odpowiadające protonom grup N-CH3 w pozycji 1 i 3 pierścienia kofeiny.

2.

Przeprowadzić analogiczny pomiar TBG z zastosowaniem dioksanu jako standardu wewnętrznego. Do analogicznie przygotowanej próbki jak w punkcie 1

dodać ściśle określoną ilość dioksanu ( np. 15mg ) i zarejestrować widmo 1H-NMR.

3.

Zarejestrować widma protonowe czystych składników tabletki TBG oraz widmo TBG analogicznie jak w pkt. 1.

Wykonać obliczenia wzajemnego stosunku składników metodą normalizacji wewnętrznej i porównać wyniki ze składem podanym przez producenta.

Wyniki zamieścić w sprawozdaniu.

Literatura:

[1] ZN-60/MPCh/F-77

[2] Szyszko E., Metody badania leków , PZWL, Warszawa, 1974

BHP

Deuterochloroform jest substancją toksyczną o własnościach mutagennych.

Ma własności uczulające. Podejrzewany jest o właściwości kancerogenne.

Literatura dodatkowa:

1. R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kiemle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Warszawa 2007.

2. Praca zbiorowa pod redakcją W. Zielińskiego i A. Rajcy, Metody spektroskopowe i ich zastosowanie do identyfikacji związków organicznych, WNT, Warszawa 2000.

3. H. Günther, Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego, PWN, Warszawa 1983.

Materiały pomocnicze:

O OH

O O

CH₃

N H

O CH₃

C O H₃

N

N N

N CH₃ C

H₃

CH₃ O

O 3.965ppm

3.416ppm

3.591ppm

Kofeina Fenacetyna

Kwas acetylosalicylowy

3.980ppm

2.108ppm

2.341ppm

1.390ppm

Rys.1 Pasma analityczne na widmach 1H-NMR składników „TBG”

Rys. 1A Widmo 1H-NMR kwasu acetylosalicylowego.

Rys. 1B Widmo 1H-NMR fenacetyny.

Rys. 1C Porównanie widm 1H-NMR „tabletki od bólu głowy” i czystych składników.