• Nie Znaleziono Wyników

BADANIA IN VIVO NAD GRANULOPOETYCZNĄ AKTYWNOŚCIĄ TKANEK MYSZY

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Share "BADANIA IN VIVO NAD GRANULOPOETYCZNĄ AKTYWNOŚCIĄ TKANEK MYSZY"

Copied!
6
0
0

Pełen tekst

(1)

DIAGN. LAB., 1978, XIV, nr l .

MACIEJ SZMITKOWSKI

i

BADANIA IN VIVO NAD GRANULOPOETYCZNĄ AKTYWNOŚCIĄ TKANEK MYSZY

Z Zakładu Diagnostyki Klinicznej, Instytutu Fizjologii i Biochemii Akademii Medycznej w Białymstoku

Przeprowadzono badanie aktywności granulopoetycznej homogenatów wątroby, śledziony, nerek i szpiku myszy poprzez dootrzewnowe podanie tych substancji myszom rasy Swiss i śledzenie liczby granulocytów krwi przez okres. 7 dni. Po wykazaniu wysokiej aktywności w homogenacie nerki, narząd ten poddano frakcjonowanemu wirowaniu i stwierdzono, iż najwyższą aktywność granulopoetyczną posiada frakcja mikrosomalna, a zupełnym brakiem tej aktywności cechuje się frakcja jądrowa. Uzy- skane wyniki porównywano z wartościami otrzymanymi podczas do- otrzewnowego podania substancji kontrolnych takich jak 0,9%/e roztwór NaCl, oraz Encorton, powodujący wyrzut puli rezerwowej granulocytów.

Wykazano odmienny i wyraźny ejekt działania badanych substancji w stosunku do NaCl i Emncortonu. Uzyskane wyniki wydają się wska- zywać na nerkę jako narząd, który może być odpowiedzialny га biosyn- tezę substancji zwanej granulopoetyczną. |

Badając obecność substancji odpowiedzialnych 'za liczbę leukocytów, Menkin w 1956 r. stwierdził istnienie leukotoksyny leukocytosis promoting

factor, która wytwarzana w ognisku zapalnym, przechodząc do krążenia

powodowała wzrost liczby leukocytów we krwi (18). Gordon (11) oraz Boggs (2, 3) wykazali istnienie substancji odpowiedzialnej za podwyższe-

nie liczby granuolcytów we krwi i występującej w osoczu psów z neu- tropenią, oraz w osoczu ludzi, którym podano endotoksynę. Bierman

"w 1964 r. opisał podobną substancję w narządach i tkankach wołu, nazy-

wając ją leukopoetyną G (1). Prowadzone jednak przez tego autora ba-

dania polegały na śledzeniu liczby granulocytów we krwi obwodowej

w okresie 24 godzin od momentu dootrzewnowego podania szczurom ba-

danej substancji. |

Wprowadzona w 1966 r. przez Bradley i Metcalf (4) półpłynna agarowa hodowla granulocytów ze szpiku spowodowała, iż ostatnie lata pozwoliły na prowadzenie szeregu prac nad czynnikiem stymulującym wzrost ko- lonii granulocytów in vitro 1 zwanym Colony Stimulating Factor (CSF)

(12, 15, 23). | | |

Nie jest jednak rzeczą wiadomą czy czynnik CSF jest substancją dzia- .

łającą w warunkach in vivo. Dlatego też celem naszej pracy było zbadanie

istnienia aktywności granulopoetycznej działającej in vivo i porównanie,

oraz przedyskutowanie wyników z danymi w piśmiennictwie, dotyczącymi.

CSF, w celu potwierdzenia, lub wykluczenia identyczności tych sub-

stancji.

MATERIAŁ I METODY

,' , Badania prowadzono na myszach, dziewiczych samicach rasy Swiss o wadze

= 20—22 g. | a

(2)

4 M. Szmitkowski | | Мг 1 Wątrobę, śledzionę, nerki i szpik homogenizowano w 0,9970 NaCl w homogeniza- torze szklanym Pottera-Elvehjema i kilkakrotnie zamrażano w suchym lodzie w celu

„rozbicia struktur subkomórkowych. Do badań używano płynu z nad osadu po wiro- waniu przy obrotach 2000 Xg przez 15 min. Wszystkie etapy postępowania pro-

wadzono w warunkach jałowych. |

Frakcje subkomórkowe nerek myszy uzyskiwano poprzez homogenizację narządu w homogenizatorze szklanym Pottera-Elvehjema w 0,25 M roztworze sacharozy dodanym w ilości 6 ml na 18 tkanki i wirowano w ultrawirówce VAG-601. Uzy- skano następujące frakcje subkomórkowe: jądra i błony komórkowe, mitochondria, lizosomy, mikrosomy, cytoplazmę. Otrzymane frakcje kilkakrotnie zamrażano w su- chym lodzie w celu rozbicia struktur subkomórkowych. Postępowanie prowadzono

w warunkach jałowych. | |

Białko w homogenatach i frakcjach subkomórkowych oznaczano metodą biuretową i spektrofotometrycznie przy długości fali 260 i 280 nm.

Aktywność granulopoetyczną in vivo mierzono wstrzykując myszom, w warunkach jałowych, badany materiał (homogenat, frakcja subkomórkowa) w ilości obliczanej na jednakową ilość zawartego w nim białka. Krew od myszy pobierano z ogona w okresie, wyznaczonej uprzednio, największej stabilności liczby granulocytów (24).

Pobrań dokonywano co 24 godz. przez 7 dni. Oznaczano we krwi liczbę leukocytów na automatycznym liczniku krwinek TUR ZG-2 i wykonywano rozmaz na szkiełku podstawowym. Barwiono metodą Pappenheima i oceniano odsetkową zawartość gra- nulocytów. Wyniki podawano jako liczbę granułocytów w 1 ul krwi. Do badania każdego z preparatów używano 10 myszy, obliczając następnie wartość średnią z każdego pobrania krwi. W dalszych obliczeniach posługiwano się wartościami śred-

nimi. Aktywność granulopoetyczną obliczano jako procentowy przyrost liczby gra- nulocytów w badanym okresie w stosunku do wartości wyjściowej.

KZ > ul i __ suma granulocytów z wszystkich pobrań X 1000/

ktywność втаплиороетусита; — wyjściowa liczba granul. X ilość pobrań ^“ AEO w: grupach kontrolnych stosowano 0,9°/o roztwór NaCl, oraz Encorton f-my Polfa (50 mg/ml). Roztwory podawano dootrzewnowo w ilości 1 ml w warunkach jałowych.

WYNIKI

Przeprowadzone badania nad granulopoetyczną aktywnością homogena- tów narządów i tkanek myszy pozwalają ocenić procent przyrostu liczby granulocytów we krwi obwodowej w odniesieniu do wartości wyjścio-

wych. a

W celu wykazania rzeczywistej aktywności badanych substancji zasto- sowano 2 grupy kontrolne. W pierwszej podano. 0,9%/0 roztwór NaCl aby wykazać możliwość wpływu na testowane parametry samego urazu jakim jest dootrzewnowa iniekcja. W drugiej grupie zastosowano Encorton w celu porównania wyrzutu granulocytów pod wpływem testowanych substancji z wyrzutem tych komórek spowodowanych przez związek uży- wany powszechnie 'do: całkowitego uruchamiania puli rezerwowej granu-

locytów szpiku. | |

Rycina 1 przedstawia liczbę granulocytów krwi w okresie 7 dni po dootrzewnowym podaniu 0,9'%/0 roztworu NaCl lub Encortonu w grupach kontrolnych, oraz homogenatu: nerek jako substancji, która wykazuje wysoką aktywność granulopoetyczną w porównaniu z innymi. | Na wszystkich przedstawionych "wykresach widoczny jest wyraźny

„wzrost liczby granulocytów w 6 godz. po iniekcji. Ze względu na. jego nieswoistość uznano, iż jest on wynikiem odpowiedzi na uraz jakim jest iniekcja i jest efektem uruchomienia puli marginalnej granulocytów.

W przypadku Encortonu stwierdzono najwyższy wzrost liczby granulo- cytów 12 godzin po iniekcji, co związane jest z wyrzutem puli granulo- cytów rezerwowych. Z wymienionych względów, przedstawionych na rycinie, zmian zachodzących w ciągu pierwszej doby nie brano pod uwagę.

W dalszych obliczeniach wykorzystano jedynie wyniki uzyskiwane z po-

(3)

Nr 1 -_ Badania nad granulopoetyczną aktywnością tkanek myszy 5

Ow S

8

Liczba granulocyt

Ryc. 1. Zachowanie się liczby. granulocytów w 1 ul krwi myszy w grupach kontrol- nych (0,9076 roztwór NaCl lub Encorton) i po podaniu homogenatu nerek.

brań wykonywanych co 24 godziny. Liczba granulocytów, zarówno

w przypadku Encortonu jak i roztworu NaCl, nie wykazuje wyraźnych odchyleń od wartości wyjściowych przez dalszy okres badania. Wyraźny wzrost liczby granulocytów, począwszy od drugiej doby, widoczny jest po podaniu homogenatu nerek. Powrót do wartości wyjściowych nastę-

puje po około 6 dobach. .

Badania nad aktywnością granulopoetyczną homogenatów tkankowych i wyniki uzyskane w grupach kontrolnych przedstawiono w tabeli I.

"Tabela I. Aktywność granulopoetyczna homogenatów tkanek myszy

- Lp. Badany materiał Alktywność EN LOPOCKYCZNA

1 0,9°/o.-NaCl - 0,0

2 Encorton | 3,0

3 Wątroba 27,0

4 Śledziona | | 52,0

5 Nerka | - 59,0

6 Szpik | 60,0

Uzyskane dane, wyrażone w procentach przyrostu liczby granulocytów ponad wartości prawidłowe, wskazują na obecność najwyższej aktyw- ności w szpiku i nerce a następnie w Śledzionie. Stosunkowo niską aktyw- ność wykazuje wątroba. Encorton jako środek uruchamiający pulę re- zerwową granulocytów szpiku powoduje nieznaczny wzrost liczby granu- locytów we krwi, spowodowany wyrzutem granulocytów po 12 godzinach od iniekcji. Wyrzut ten, nie jest brany pod uwagę przy wyliczaniu aktyw- ności granulopoetycznej. Nie stwierdzono też przyrostu liczby granulo--

cytów po podaniu 0,9%/0 NaCl. s | |

W dalszym postępowaniu postanowiono zbadać aktywność subkomor- kowych frakcji nerek. Szpiku nie poddano dalszemu frakcj onowaniu ze względu na jego zróżnicowany skład komórkowy i znany z piśmiennic-

twa fakt istnienia wysokiej aktywności granulopoetycznej w makrofagach (6, 8, 9, 10), limfocytach (7, 18) i granulocytach (17).

W otrzymanych frakcjach subkomórkowych nerek badano aktywność granulopoetyczng. Wyniki przedstawiono w tabeli IT.

(4)

6 | M. Szmitkowski | | Nr 1

Tabela II. Aktywność granulopoetyczna subkomórkowych frakcji nerek myszy

ada, teri Aktywnosé

Lp. Badany materiał granulopoetyczna

1 Frakcja jądrowa | 1,0

2 Frakcja cytoplazmatyczna 12,0

2 Frakcja mitochondrialna 16,0

4 Frakcja lizosomalna 19,0

5 Frakcja mikrosomalna 28,0

_ Uzyskane dane wskazują jednoznacznie na bardzo wysoką aktywność -

granulopoetyczną frakcji mikrosomalnej. Frakcja lizosomalna nieznacznie przewyższa aktywnością frakcję mitochondrialną i cytoplazmatyczną. Zde- cydowany brak aktywności wykazuje frakcja jądrowa. Uzyskane dane mogą sugerować możliwość biosyntezy w tkance nerkowej, substancji od- ' - powiedzialnej za aktywność granulopoetyczną in vivo i zwanej hipotetycz-

nie — granulopoetyną. |

DYSKUSJA

Zapoczątkowane w latach sześćdziesiątych przez Biermana (1) badania

in .vivo nad granulopoetyczną aktywnością zostały w następnym okresie

"zarzucone na korzyść oznaczeń in vitro. Po okresie intensywnych badań

na agarowej hodowli granulocytów wydaje się, że nie pozwalają one w pełni na przeniesienie uzyskanych wyników na warunki. istniejące w żywym organiźmie. Z tego też względu uznano za stosowne powrócić do badań in vivo. W celu uniknięcia błędów wynikających ze zbyt krót-

kiego okresu śledzenia liczby granulocytów, tak jak to robili inni badacze

(1, 22), przedłużono ten okres do kilku dni, co ze względu na około 6 dnio- we (16) dojrzewanie granulocytów — od komórki niezróżnicowanej do granulocytów z jądrem segmentowym — pozwala niewątpliwie uchwycić efekt granulopoetyczny testowanych substancji. |

W celu uniknięcia błędnych interpretacji zastosowano też substancje

kontrolne, powodujące mobilizację puli marginalnej i rezerwowej granu-

locytów. Wykazano odmienne okresy i efekty działania tych substancji w porównaniu do homogenatów i podfrakcji, potwierdzając tym fakt istnienia poszukiwanej aktywności granulopoetycznej. |

Uzyskane wyniki, dotyczące aktywności in vivo, wydają się być zgodne i pokrywają się z wynikami otrzymanymi przez innych autorów, przy:

pomocy agarowej hodowli granulocytów, stwierdzającymi obecność CSF w wątrobie, śledzionie i nerce (14, 19). Wysoka aktywność CSF w makro- fagach (6, 8, 9, 10), limfocytach (7, 18) i granulocytach (17) wydaje się po- twierdzać nasze wyniki uzyskane przy badaniu aktywności szpiku. Stwier- dzona przez nas wysoka aktywność granulopoetyczna in vivo w homoge- nacie nerek, zlokalizowana jest głównie we frakcji rybosomalnej tego na-

rządu. |.

|. Wyniki te wskazywałyby na białkowy charakter badanej substancji.

Taka właśnie struktura przypisywana jest dla CSF (20, 21). Jednocześnie mogą one sugerować możliwość biosyntezy tej substancji w tkance ner- kowej. Zagadnienie to wymaga jednak dalszych badań i prób lokalizacji

tej aktywności w określonych strukturach nerki.

Pracę otrzymano: 18.II. 1977 r.

(5)

\ . i

1

Nr 1 Badania nad granulopoetyczną aktywnością tkanek myszy 7

М. Шмитковски

ИССЛЕДОВАНИЕ ИН ВИТРО ГРАНУЛОПОЭТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.

| ТКАНЕЙ МЫШИ — | o

Содержание

Автор изучал гранулопоэтическую активность гомогенатов печени, селезенки, почек и костного мозга мыши путем интраперитонеального введения этих суб- станций мышам расы Свисс и прослеживания количества гранулоцитов крови в течение 7 дней. После выявления высокой активности в гомогенате. почки, этот орган подвергался фракционному центрифугированию, причем было уста- новлено, что максимальной гранулопоэтической активностью обладает микро- сомная фракция, а абсолютным отсутствием этой активности характеризуется ядерная фракция. Полученные результаты сравнивались CO значениями полу- ченными при интраперитонеальном введении контрольных субстанций таких, как 0,9%/о раствор МаС\1, энкортон, приводящий к выбрасыванию резервов гра- нулоцитов. По отношению к МаС1 и энкортону изучаемые субстанции проявляли различный и выраженный эффект. Согласно полученным результатам можно предполагать, что почки являются органом, отвечающим за биосинтез субстан-

ции, называемой тгранулопоэтической. |

M. Szmitkowski

IN VIVO INVESTIGATIONS ON THE GRANULOPOETIC ACTIVITY OF MOUSE

| TISSUES |

Summary

Investigations were performed of the granulopoetic activity of liver, spleen, kid- ney and bone marrow homogenates of mice by intraperitoneal administration of these homogenates.to Swiss mice and later obseryation of the peripheral blood gra- nulocyte count during 7 days. After demonstration of high activity of kidney homo- genate this organ was subjected to fractionated centrifugation and it was de- monstrated that the higest granulopoetic activity was present in the microsomal fraction, while the nuclear fraction was completely devoid of this activity. The:

obtained results were compared with those obtained during intraperitoneal admi- nistration of control substances such as 0.9%/6 NaCl solution and prednisone which causes release of reserve pool of granulocytes. A significant differences was de- monstrated in the effect of NaCl and prednisone in relation to the homogenates tested. The obtained results seem to point to the kidney as to the organ which may be responsible for the biosynthesis of granulopoetic factors.

PISMIENNICTWO Bierman H.R.: Ann. N. Y. Acad. Sci., 118, 753, 1964.

Boggs D.R., Cartwright G. E., Wintrobe M.M.: Am. J. Physiol., 211, 51, 1966.

Boggs D.R., Marsh J.C.: Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 127, 689, 1968.

Bradley T.R., Metcalf D.: Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 44, 287, 1966.

Brown C. H., Carbone P. P.: J. Nat. Cancer Inst., 46, 989, 1871.

Chervenick P. A., LoBuglio A. F.: Science, 178, 164, 1972.

Cline M. J., Golde D. W.: Nature, 248, 703, 1974.

Golde D. W., Cline M. J.: J. Clin. Invest., 51, 2981, 1972.

Golde D. W., Cline M.J.: Br. J. Haematol., 26, 235, 1974.

Golde D. W., Finley T. N., Cline M. J.: Lancet, 2, 1397, 1972. |

Gordon A. Ś., Handler E. S., Siegel C. D. i wsp.: Ann. N. Y. Acad. Sci., 113, 766,

1964. | |

Mc Culloch E. A., Gregory C. J., Till J. E.: Haemopoietic Stem Cells (Ciba Foun- dation Symposium 13). Amsterdam, Associated Scientific Publishers, p. 183, 1973.

. Menkin V.: Springfield Illinois. Charles C. Thomas, 1956.

. Metcalf D., Bradley T. R., Robinson W. A.: J. Cell. Physiol., 69, 93, 1976. | Metcalf D., Moore M. A. S.: Frontiers in Biology, vol. 24, Amsterdam, North-Hol-

land Publishing Company, 1971. . |

HSOONODAWIN

a M MH » N nA

tw

(6)

16. 17.

18. 19.

20. 21.

_ 22.

23.

24.

M. Szmitkowski . Nr 1

Perry S., Godwin H. A., Zimmerman T.S.: J.A. M.A., 203, 937 and 1025, 1968.

Robinson W. A., Mangalik A.: Lancet, 2, 742, 1972. i

Ruscetti F. W., Charveniek P..A.: J. Clin. Invest., 55, 520, 1975.

Sheriden J. W., Stanley E. R.: J. Cell. Physiol., 78, 451, 1971.

Stanley E. R., Metcalf D.: Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 47, 467, 1969.

Stanley E. R., Metcalf D.: Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 137, 1029, 1971.

Steinberg B., Martin R. A.: Amer. J. Physiol., 161, 14, 1950..

Stohlman F. J., Quesenberry P., Niskanen E. i wsp.: Ciba Foundation Symposium 13, Amsterdam, Associated Scientific Publishers, p. 205, 197 3. | , Szmitkowski M., Prokopowicz J.: Zwierzęta laboratoryjne (wysłano do druku).

Cytaty

Powiązane dokumenty

W pracy tej otrzymano genomowe profile metylacji DNA dla dwóch modeli regeneracji u ssaków: (i) dorosłej myszy MRL/MpJ, która jest zdolna do zamykania otworów w

Porównanie ekspresji genu Atp7a oraz zawartości miedzi w organach wewnętrznych myszy o genotypie dzikim oraz samców mutantów mosaic Poziom ekspresji genu Atp7a oznaczano w

jąć, że i nasze obserwacje (zmniejszone magazynowanie tylozy przy.. 226 Janusz Szyszko, Stanisław Czuczwar, Daniel Chibowski.. większych dawkach diazepinalu) mogą być wynikiem

Zmiany te są notowane w piśmiennictwie, brak jest natomiast obserwacji nad wpływem azotniaku na narządy wewnętrzne, oraz nad zmianami anatomicznymi, które mogą

Rycina 1 potwierdza słuszność przyjętego pomiaru liczby granulocytów (co 24 godz. od iniekcji) ze względu na widoczny po pierwszych ośmiu godzinach wyrzut puli

Przenoszenie zakażenia COVID-19 z matki na dziecko rzadkie Wieczna zmarzlina może zacząć uwalniać cieplarniane gazy Ćwiczenia fizyczne pomocne w leczeniu efektów długiego

zębatym indukcja LTP jest zależna od aktywacji receptorów NMDA, zwiększenie ilości podjednostek NR2B może być kluczowe dla procesów plastyczności

Przeprowadzone badanie na modelu zwierz cym wykaza o istotny statystycznie wzrost aktywno ci kinazy kreatynowej (CPK) w surowicy oraz obecno mikroskopowych cech uszkodzenia mi