Dendritic cells in melanoma therapy

(1)

Opornoœæ zaawansowanego czerniaka skóry na leczenie konwencjonalny- mi metodami uzasadnia podejmowanie prób wykorzystania mechanizmów od- pornoœciowych chorego do przeciw- dzia³ania powstawaniu przerzutów. Jest to nowotwór potencjalnie immunogen- ny. Wulegaj¹cych regresji zmianach czerniakowych dochodzi do klonalnej ekspansji swoistych cytotoksycznych limfocytów T. Rozliczne próby immunizacji szczepionkami z ca³ych, napromienianych komórek czerniaka lub pre- paratami z rozbitych komórek nie doprowadzi³y, jak dot¹d, do uzyskania znacz¹cego wp³ywu na prze¿ycie chorych [1]. Dopiero poznanie w ostatnich latach roli komórek dendrytycznych (DC) w inicjowaniu odpowiedzi komór- kowej umo¿liwi³o sterowanie swoist¹ odpowiedzi¹ immunologiczn¹ [2]. Pozwo- li³o ponadto zrozumieæ przyczyny uprzednich niepowodzeñ w próbach wywo³ywania reakcji uk³adu odporno- œciowego na antygeny nowotworowe.

S¹ to bowiem antygeny s³abo immunogenne lub tolerowane. Prezentacja an- tygenów nowotworowych przez DC stwarza mo¿liwoœæ prze³amania tolerancji poprzez aktywacjê limfocytów z receptorami o s³abym powinowactwie dla tych antygenów. Zidentyfikowano szereg antygenów ró¿nicowania wspólnych dla komórek czerniaka i melanocytów, jak te¿ antygenów wystêpuj¹cych na komórkach nowotworowych, ale nie- obecnych w tkankach normalnych z wyj¹tkiem tkanki j¹der [3]. Stworzy³o to podstawy do immunizacji oligopeptydami wyosobnionymi z bia³ek czerniaka, podawanymi do komórek wyspecja-

lizowanych w prezentacji antygenów limfocytom T, jak te¿ do immunizacji z u¿yciem komórek, do których wpro- wadzono geny bia³ek nowotworowych.

Receptor dla antygenu na limfocy- cie T CD8⁺ rozpoznaje swoiœcie okre- œlony oligopeptyd, zwi¹zany niekowa- lencyjnie z cz¹steczk¹ zgodnoœci tkankowej MHC klasy I wraz z otaczaj¹cym go fragmentem tej cz¹steczki. Cz¹- steczki MHC klasy I wynosz¹ na po- wierzchniê komórki oligopeptydy pochodz¹ce z bia³ek zdegradowanych wewn¹trz cytoplazmy, w tym równie¿

bia³ek nowotworowych. Aby osi¹gn¹æ zdolnoœæ do rozpoznawania oligopep- tydu zwi¹zanego przez cz¹steczkê MHC klasy I na wszystkich komórkach prezentuj¹cych ten oligopeptyd, naiw- ny limfocyt T CD8⁺ po opuszczeniu grasicy musi najpierw zostaæ uczulony przez komórkê dendrytyczn¹. Inne ko- mórki wyspecjalizowane w prezentacji antygenu, tj. makrofagi i limfocyty B, nie posiadaj¹ zdolnoœci uczulania pier- wotnego naiwnych limfocytów T.

DC pochodz¹ce ze szpiku kostne- go wystêpuj¹ w niewielkiej liczbie, praktycznie we wszystkich tkankach i narz¹dach organizmu. Trudnoœci w wyodrêbnianiu DC sprawi³y, ¿e ich rola w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej zosta³a poznana stosunko- wo póŸno. Dojrza³e funkcjonalnie DC w ludzkiej krwi obwodowej stanowi¹ ok. 1 proc. komórek jednoj¹drzastych.

Odró¿nia je silna ekspresja antygenów zgodnoœci tkankowej HLA-DR i brak markerów charakteryzuj¹cych inne li- Komórki dendrytyczne (DC) s¹ nie

tylko najbardziej skuteczne spo- œród komórek wyspecjalizowanych w prezentacji antygenu, ale te¿ jako jedyne s¹ zdolne do indukowania odpowiedzi pierwotnej naiwnych limfocytów T. Wykorzystanie DC do prezentacji antygenów nowotworowych stwarza mo¿liwoœæ wywo³ania odpowiedzi immunologicznej na s³abo immunogenne antygeny nowotworowe i prze³amania tolerancji immunologicznej. U¿ycie DC eksponowanych na antygeny czerniaka in vitro pozwala w warun- kach hodowli otrzymaæ cytotoksyczne limfocyty T rozpoznaj¹ce swoiœcie oligopeptydy bêd¹ce fragmentami bia³ek czerniaka i zdolne do lizy ko- mórek linii czerniakowych. Za pomo- c¹ DC w badaniach in vitro wykryto szereg nowych epitopów bia³ek nowotworowych, potencjalnie u¿ytecz- nych w immunoterapii czerniaka.

Preinkubacja DC z antygenami no- wotworowymi ex vivo, a nastêpnie u¿ycie ich do szczepienia chorych na czerniaka prowadzi³o u czêœci chorych do ca³kowitych lub czêœcio- wych remisji. W kilku badaniach klinicznych obserwowano regresjê przerzutów do ró¿nych narz¹dów, jak te¿ wzrost liczby cytotoksycznych limfocytów T swoistych dla antyge- nów czerniaka w krwi obwodowej i powstanie nadwra¿liwoœci skórnej typu póŸnego na DC preinkubowane z oligopeptydami czerniaka.

Szczepienia by³y dobrze tolerowane. DC stosowano te¿ do uczulania limfocytów T in vitro w celu przygotowania cytotoksycznych limfocytów T CD8⁺swoistych dla antygenów czerniaka do immunoterapii adoptywnej. Tak otrzymane limfocyty cytotoksyczne preferencyjnie lokalizu- j¹ siê w zmianach nowotworowych i wywo³uj¹ odpowiedŸ antygenowo- -swoist¹, prowadz¹c¹ do eliminacji komórek posiadaj¹cych odpowiednie antygeny. W wyniku tej odpowiedzi dochodzi do regresji poszczegól- nych przerzutów. Dobór antygenów do immunizacji, optymalizacja me- tod otrzymywania DC oraz drogi i czasu ich podawania mog¹ mieæ

W

Wssppóó³³cczzeessnnaa OOnnkkoollooggiiaa ((22000033)) vvooll.. 77;; 88 ((663300––663344))

Wykorzystanie komórek dendrytycznych

w leczeniu czerniaka

Dendritic cells in melanoma therapy

Sergiusz Markowicz

Zak³ad Immunologii, Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Sk³odowskiej-Curie w Warszawie

(2)

nie leukocytów (CD3, CD14, CD16, CD20). Dziel¹ siê na dwie subpopula- cje: mieloidalne DC1 o fenotypie CD11c⁺CD123^–i plazmacytoidalne DC2 o fenotypie CD11c^–CD123⁺. Obie sub- populacje s¹ zdolne do inicjowania odpowiedzi pierwotnej limfocytów T.

Stwierdzenie, ¿e u¿ycie DC wyizo- lowanych z ludzkiej krwi obwodowej, ale nie makrofagów, do prezentacji antygentów podanych w formie oligo- petydów lub bia³ka w pierwszym eta- pie stymulacji naiwnych limfocytów T CD8⁺ in vitro pozwala generowaæ antygenowo-swoiste linie limfocytów cytotoksycznych [4], sta³o siê inspiracj¹ do podjêcia pierwszej próby immunizacji chorych na nowotwory swoistym antygenem nowotworowym z u¿yciem DC jako naturalnego adjuwantu. Szcze- pienie autologicznymi DC wyodrêbnia- nymi z krwi obwodowej i inkubowany- mi ex vivo z bia³kiem idiotypowym doprowadzi³o do ca³kowitej remisji u dwóch spoœród czterech chorych na ch³oniaki z komórek B [5].

Bakker i wsp. [6] przy u¿yciu DC eksponowanych na peptydy czerniakowe HLA-A2-zale¿ne wykazali mo¿liwoœæ generowania limfocytów cytotoksycznych rozpoznaj¹cych antygeny czerniaka z prekursorów obecnych w krwi obwodowej zdrowych dawców. Tak otrzymane limfocyty cytotoksyczne by-

³y zdolne do lizy komórek linii czerniaka. Do prezentacji antygenów u¿yli DC pochodz¹cych z monocytów. Popula- cja DC pochodz¹ca z monocytów uzy- skiwana jest po hodowli komórek przy- legaj¹cych do plastiku. Wtrakcie hodowli przez 7 dni w obecnoœci czynnika stymuluj¹cego kolonie granu- locytarno-monocytarne (GM-CSF) i in- terleukiny 4 (IL-4), w obecnoœci p³odo- wej surowicy cielêcej (FCS) lub w po-

¿ywce niezawieraj¹cej surowicy, czêœæ populacji monocytów CD14⁺ traci ten marker, odlepia siê od plastiku i ujaw- nia na swej powierzchni cz¹steczki CD80 i CD86, upodabniaj¹c siê feno- typowo i funkcjonalnie do subpopula- cji mieloidalnych komórek dendrytycznych. Dodatkowa stymulacja lipopoli- sacharydem (LPS) lub czynnikiem martwicy nowotworów (TNF-α), doda- nym w ostatnim dniu hodowli zwiêksza jeszcze ekspresjê CD80 i CD86, co okreœla siê jako dojrzewanie DC pochodz¹cych z monocytów. Subpopula- cja DC1, pierwotnie obecna w krwi, prze¿ywa w hodowli w obecnoœci GM-CSF i IL-4 i równie¿ odlepia siê od

plastiku. Stanowi domieszkê populacji DC pochodz¹cych z monocytów. Cho- cia¿ wykazano, ¿e DC pochodz¹ce z monocytów, zarówno niedojrza³e, jak i dojrza³e, s¹ mniej skuteczne w indukowaniu swoistej odpowiedzi na antygeny ni¿ oczyszczona populacja DC1 [7], to jednak w praktyce do immunizacji czêœciej stosuje siê DC pochodz¹ce z monocytów, ze wzglêdu na ³a- twoœæ i wiêksz¹ wydajnoœæ ich otrzymywania z krwi.

Nestle i wsp. [8] w pilotowym ba- daniu klinicznym do szczepienia 16 chorych na czerniaka skóry wykorzy- stali DC pochodz¹ce z monocytów krwi obwodowej indukowanych GM-CSF i IL-4 w hodowli z dodatkiem FCS. DC inkubowane by³y – zale¿nie od typu HLA chorego – z oligopeptydami pochodz¹cymi z tyrozynazy, Me- lan-A/MART-1 i bia³ka gp100 wi¹¿¹cymi siê do cz¹steczek HLA-A2 i/lub z oligopeptydami pochodz¹cymi z MA- GE-1 i MAGE-3 wi¹¿¹cymi siê do HLA-A1, albo z lizatem autologicznych komórek czerniaka. DC wstrzykiwano pod kontrol¹ ultrasonograficzn¹ do pa- chwinowych wêz³ów limfatycznych nie- zajêtych nowotworowo. Do szczepienia zastosowano równie¿ hemocjaninê œli- maka morskiego (KLH) jako antygen indukuj¹cy pomocnicze komórki T CD4⁺, a jednoczeœnie pozwalaj¹cy okreœliæ wydolnoœæ uk³adu odporno- œciowego. Jest prawdopodobne, ¿e FCS obecny w po¿ywce równie¿ dzia-

³a³ jako antygen pomocniczy. U dwóch chorych po szczepieniu dosz³o do ca³- kowitej remisji, u trzech do czêœciowej, z regresj¹ przerzutów w ró¿nych narz¹dach. Szczepienie by³o dobrze tolerowane przez wszystkich chorych.

Stwierdzono wystêpowanie nadwra¿li- woœci skórnej typu póŸnego na DC preinkubowane z peptydami i z KLH.

Wykazano te¿ naciekanie swoistych ko- mórek cytotoksycznych w miejscach wstrzykniêcia DC preinkubowanych z peptydami. Chakraborty i wsp. [9]

szczepi¹c chorych DC indukowanymi jedynie przez GM-CSF i preinkubowanymi z lizatem komórek guza wywo³a- li u wiêkszoœci chorych nadwra¿liwoœæ skórn¹ typu póŸnego na komórki preinkubowane lizatem. DC wstrzykiwane by³y œródskórnie w okolicy wêz³ów ch³onnych. Komórki namno¿one z populacji naciekaj¹cej miejsce podania szczepionki by³y swoiœcie cytotoksyczne wobec autologicznych komórek prezentuj¹cych antygen (APC), ekspono- wp³yw na efektywnoœæ szczepionki

opartej na wykorzystaniu DC jako naturalnego adjuwantu.

S³owa kluczowe: komórki dendrytyczne, czerniak skóry, szczepionka przeciwnowotworowa, antygeny nowotworowe, cytokiny, oligopeptydy.

W

(3)

wanych na lizat komórek czerniaka, jak te¿ produkowa³y TNF po stymulacji przez APC inkubowane z peptydami czerniaka. Do czêœciowej remisji dosz³o tylko u jednego z 13 szczepio- nych chorych.

Thurner i wsp. [10] zastosowali DC pochodz¹ce z monocytów, preinkubowane z peptydem MAGE-3 wi¹¿¹cym siê z HLA-A1, do immunizacji 11 chorych na czerniaka w IV stopniu zaawansowania. Wykonywali 3 wstrzykiwania pod- i œródskórne, poprzedzaj¹- ce 2-krotne podawanie do¿ylne.

U 6 spoœród 11 chorych dosz³o do regresji poszczególnych zmian nowotworowych w skórze, wêz³ach limfatycznych, p³ucach i w w¹trobie. Po wstrzy- kiwaniu podskórnym u 8 z 11 chorych stwierdzono znacz¹cy wzrost liczby prekursorów komórek cytotoksycznych we krwi obwodowej. Liczba ich jednak spada³a po do¿ylnym podaniu DC.

Toungouz i wsp. [11] podaj¹c do¿ylnie wzglêdnie du¿¹ iloœæ preinkubowanych z peptydem DC pochodz¹cych z mo- nocytów, równie¿ obserwowali znacz- ny, ale przejœciowy wzrost liczby ob- wodowych limfocytów T wydzielaj¹cych IFN-γ w odpowiedzi na stymulacjê peptydem u¿ytym do szczepienia. Po czwartym cyklu szczepienia poziom peptydowo-swoistych limfocytów T wra- ca³ do wartoœci wyjœciowych obserwo- wanych przed szczepieniem. Wbada- niu tym KLH podawana u czêœci chorych jako antygen wspomagaj¹cy nie mia³a ¿adnego znaczenia dla polep- szenia efektywnoœci immunizacji. Ma³¹ skutecznoœæ szczepienia DC pochodz¹cymi od monocytów, podanymi w du¿ej iloœci do¿ylnie po preinkuba- cji z peptydami wykaza³a Panelli i wsp.

[12]. Ma³a skutecznoœæ tego szczepienia mog³a wynikaæ zarówno ze sposobu przygotowania, jak i podania DC.

Mackensen i wsp. [13] do szczepienia zastosowali DC generowane z ko- mórek macierzystych krwiotworzenia CD34⁺ zbieranych po mobilizacji wywo³anej wstrzykiwaniem czynnika stymuluj¹cego kolonie granulocytarne (G-CSF). Komórki macierzyste by³y sty- mulowane ex vivo w ci¹gu trzech ty- godni w obecnoœci IL-3, IL-6 i czynnika stymuluj¹cego komórki macierzyste (SCF), nastêpnie GM-CSF i IL-4, a ostatecznie ich dojrzewanie by³o in- dukowane przez TNF-α. Szczepionkê podawali do¿ylnie. U dwóch spoœród 14 chorych dosz³o do regresji zaawan- sowanych zmian nowotworowych. Nad-

wra¿liwoœæ typu póŸnego na peptydy czerniakowe wyst¹pi³a u 4 chorych, a u jednego dosz³o do znacz¹cej ekspansji cytotoksycznych limfocytów swoiœcie rozpoznaj¹cych antygeny Melan-A i gp100. U jednego chorego po szczepieniu wyst¹pi³o bielactwo.

Banchereau i wsp. [14] zastosowali do szczepienia DC generowane w ho- dowlach prowadzonych w obecnoœci GM-CSF, Flt3-ligandu i TNF-α z komó- rek macierzystych otrzymywanych po mobilizacji wywo³anej G-CSF. U¿yli do szczepienia czterech HLA-A2-zale¿nych peptydów pochodz¹cych z ró¿nych bia³ek czerniaka. U 9/10 chorych, u których po szczepieniu wyst¹pi³a re- aktywnoœæ na wiêcej ni¿ 2 peptydy, dosz³o do stabilizacji choroby, gdy zaœ u 6/7 chorych, którzy zareagowali na szczepienie na 2 lub mniej peptydy, dosz³o do progresji choroby w ci¹gu 10 tyg. od rozpoczêcia badania. Wy- wo³anie odpowiedzi na KLH u 16/18 chorych œwiadczy³o, ¿e uk³ad odpor- noœciowy u wiêkszoœci tych chorych mimo znacznego stopnia zaawansowania choroby by³ sprawny.

Jonuleit i wsp. [15] porównali efek- tywnoœæ szczepienia chorych na czerniaka w trakcie progresji choroby niedojrza³ymi i dojrza³ymi DC pochodz¹cymi z monocytów. Dojrzewa- nie DC indukowali poprzez dodanie TNFα, IL-6 i IL-1β do hodowli DC po 6 dniach od jej rozpoczêcia. DC preinkubowane z peptydami czerniaka wstrzykiwali do wêz³ów limfatycznych.

Stwierdzili, ¿e dojrza³e DC pochodz¹- ce z monocytów by³y bardziej efektywne w indukowaniu swoistych cytotoksycznych limfocytów T zdolnych do lizy komórek docelowych, mierzonej in vitro uwalnianiem chromu i limfocytów odpowiadaj¹cych produkcj¹ IFN-γ na stymulacjê peptydami czerniaka. Ba- danie to potwierdzi³o, ¿e w IV stopniu zaawansowania czerniaka nie dochodzi do tolerancji na antygeny czerniaka. Na mo¿liwoœæ wyczerpywania siê zdolnoœci uk³adu odpornoœciowego w zaawansowanej chorobie nowotworowej wskazuj¹ badania Andersen i wsp. [16]. Szczepienie 2 chorych na czerniaka z u¿yciem DC preinkubowanych z peptydami doprowadzi³o do uczulenia na te peptydy i do stabilizacji choroby. Po kilku miesi¹cach mimo doszczepiania zdolnoœæ do reakcji na antygeny nowotworowe zaczê-

³a siê zmniejszaæ i dosz³o do progresji choroby.

Dendritic cells (DC) are the most efficient stimulators of T lymphocyte response among professional antigen presenting cells (APC), and the only APC capable to prime naive T lymphocytes with the antigen.

A response to weakly immunogenic and tolerogenic tumor antigens can be achieved with the use of DC as APC. DC pulsed with oligopeptides derived from melanoma antigens induced in vitro antigen-specific cytotoxic T lymphocytes capable to lyse melanoma cells. Primary in vitro immunization with peptide-pulsed DC was used to select melanoma-specific cytotoxic T-lymphocyte epitopes for melanoma immunotherapy. Objective clinical responses were observed in a substantial part of melanoma patients vaccinated with DC pulsed ex vivo with tumor antigens. DC-based vaccinations caused regression of metastases in various organs, and elicited melanoma-specific cytotoxic T lymphocytes and delayed-type hypersen- sitivity to peptide-pulsed DC. The vaccinations were well tolerated and safe. DC were used to generate specific cytotoxic T CD8⁺lymphocytes from metastatic melanoma patients for adoptive therapy.

Adoptively transferred T cell clones preferentially localized to tumor sites and mediated antigen-specific immune response. Antigen-positive tumor cells were eliminated and regression of individual metastases was observed. Appropriate antigen selection for immunization, optimi- zing of methods of DC isolation, culture and administration, and improvement of strategy of vaccine timing and dosage may increase the effectiveness of DC-based vaccination in cancer.

Key words: dendritic cells, melanoma, tumor vaccine, tumor-associated antigens, cytokines, oligopeptides.

W

(4)

Immunogenne peptydy czerniakowe maj¹ powinowactwo do okreœlonych cz¹steczek zgodnoœci tkankowej, co wyklucza ich uniwersalne stosowanie.

Dlatego interesuj¹c¹ alternatyw¹ dla szczepienia DC preinkubowanymi z peptydami stanowi podawanie hybryd komórek czerniaka i DC. Fuzja autologicznych komórek czerniaka z al- logenicznymi DC lub z autologicznymi DC pozwala otrzymaæ hybrydy komór- kowe, zawieraj¹ce wszystkie antygeny pochodz¹ce z komórki nowotworowej, w tym równie¿ w³asne antygeny zgod- noœci tkankowej klasy I, i ca³y aparat komórkowy potrzebny do skutecznej prezentacji antygenów pochodz¹cy z komórki dendrytycznej. Trzeba braæ pod uwagê mo¿liwoœæ utraty antyge- nów zgodnoœci tkankowej przez auto- logiczne komórki czerniaka u¿yte do hybrydyzacji, ale wówczas w ogóle skutecznoœæ immunizacji staje siê pro- blematyczna. Podawanie podskórnie hybryd DC i komórek czerniaka otrzymywanych drog¹ fuzji z u¿yciem gliko- lu polietylenowego [17] lub elektropul- su [18], a nastêpnie napromienianych, pozwoli³o u czêœci chorych uzyskaæ re- misjê lub stabilizacjê choroby. Prowa- dzono równie¿ badania in vitro nad efektywnoœci¹ uczulania limfocytów T na antygeny przez hybrydy DC z ko- mórkami czerniaka [19] i mo¿liwoœci¹ utrzymywania linii hybryd w hodowli [20]. Komórki linii hybryd doœæ szybko traci³y determinanty antygenów zgod- noœci tkankowej charakteryzuj¹ce APC, ale efekt ten mo¿na by³o odwracaæ drog¹ separacji z u¿yciem przeciwcia³ wi¹zanych do kulek magnetycznych.

Metodyka izolacji i hodowli DC, droga i czêstoœæ ich podawania oraz iloœæ DC u¿ytych do szczepienia mog¹ za- pewne w znacznym stopniu determino- waæ skutecznoœæ uczulania z u¿yciem DC jako naturalnego adjuwantu. Proto- ko³y dotychczas przeprowadzonych ba- dañ klinicznych nie s¹ ujednolicone na tyle, by wy¿ej wymienione aspekty me- todyki mo¿na by³o porównaæ. Wdodat- ku kryteria doboru chorych w ró¿nych badaniach by³y odmienne, co nie pozwala w prosty sposób porównywaæ skutecznoœci szczepienia. Osi¹gano po- wodzenie w uczulaniu na antygeny czerniaka zarówno przy zastosowaniu DC niedojrza³ych i dojrza³ych, pochodz¹cych z monocytów, jak i DC gene- rowanych z komórek macierzystych krwiotworzenia CD34⁺. Te ostatnie s¹

bardziej efektywne w indukowaniu lim- focytów cytotoksycznych z prekursorów wystêpuj¹cych z nisk¹ czêstoœci¹ w krwi obwodowej [21], ale ich otrzy- mywanie jest bardziej skomplikowane i wi¹¿e siê z podawaniem chorym cytokin mobilizuj¹cych komórki macierzyste. Wszczepieniach chorych na czerniaka nie stosowano dot¹d mobilizacji DC in vivo przy u¿yciu Flt3-ligandu, któ- rego podawanie stanowi alternatywê dla wstrzykiwania G-CSF i pozwala zwiêk- szyæ liczebnoœæ DC w krwi obwodowej [22]. Ryzyko podawania chorym na czerniaka cytokin indukuj¹cych in vivo komórki macierzyste nie jest w pe³ni okreœlone.

Droga podania DC ma wp³yw na ich lokalizacjê. DC generowane z ko- mórek CD34⁺ podane do¿ylnie przej- œciowo lokalizuj¹ siê w p³ucach, a po- tem trafiaj¹ do œledziony i w¹troby. Po- dane do naczyñ limfatycznych trafiaj¹ do drenuj¹cych wêz³ów limfatycznych [23]. U chorych na czerniaka dojrza³e DC pochodz¹ce z monocytów bardziej efektywnie po wstrzykniêciu œródskór- nym migruj¹ do wêz³ów limfatycznych ni¿ populacja niedojrza³ych DC [24].

Jak dot¹d w badaniach klinicznych jako sposoby eksponowania DC na antygeny czerniaka stosowano inkubacjê DC z oligopeptydami, lizatem komórek nowotworowych i hybrydyzacjê DC z komórkami czerniaka. Inne sposoby ekspozycji na antygen, prowadzonej dla uzyskania prezentacji epitopów czerniakowych przez DC, takie jak in- kubacja DC z zabitymi komórkami czerniaka [25–27] lub wprowadzanie genów bia³ek czerniaka do DC za po- moc¹ wektorów wirusowych [28], by³y dotychczas wykorzystywane w badaniach in vitro.

Celowoœæ prób indukowania reak- tywnoœci na antygeny czerniaka poprzez generowanie DC ex vivo i podawanie ich do miejsc niezajêtych nowotworowo uzasadniaj¹ obserwacje, wskazuj¹ce na upoœledzanie dojrzewa- nia populacji DC przez komórki czerniaka [29], jak te¿ upoœledzanie funk- cji DC przez cytokiny wydzielane przez komórki czerniaka [30]. DC izolowane z guzów ulegaj¹cych regresji silniej sty- mulowa³y odpowiedŸ proliferacyjn¹ lim- focytów T na alloantygeny ni¿ DC izolowane z guzów w trakcie progresji.

DC izolowane z guzów w trakcie progresji powodowa³y anergiê syngenicz- nych limfocytów T CD4⁺ [30].

Alternatywê dla prób uczulania poprzez podanie DC preinkubowanych z antygenem stanowi immunoterapia adoptywna, polegaj¹ca na wstrzykiwa- niu cytotoksycznych limfocytów T uczu- lonych in vitro. Postêp w rozwijaniu immunoterapii adoptywnej by³ równie¿

warunkowany przez u¿ycie DC. Za po- moc¹ DC mo¿na indukowaæ cytotoksyczne limfocyty T z receptorami o s³a- bym powinowactwie do epitopów an- tygenowych. Mo¿na te¿ testowaæ in vitro immunogennoœæ poszczególnych epitopów z u¿yciem oligopeptydów, jak te¿ ujawniæ epitopy potencjalnie immunogenne, nie rozpoznawane w normal- nej odpowiedzi immunologicznej i wy- magaj¹ce odpowiedniej prezentacji przez DC [31, 32]. Limfocyty T uczu- lone in vitro przez DC eksponowane na peptydy czerniakowe i podane chorym do¿ylnie, preferencyjnie lokalizowa³y siê w zmianach nowotworowych i poœred- niczy³y w niszczeniu komórek czerniaka posiadaj¹cych odpowiednie antygeny, co prowadzi³o to regresji niektórych zmian nowotworowych [33]. Wzmia- nach nowotworowych pozostawa³y jednak komórki czerniaka nieposiadaj¹ce antygenu rozpoznawanego przez uczu- lone limfocyty. Wskazuje to, ¿e immunoterapia adoptywna wymaga stoso- wania mieszanki limfocytów T, rozpoznaj¹cych mo¿liwie jak najbardziej ró¿norodny zakres epitopów. Odnosi siê to w tym samym stopniu do prób immunizacji opartej na podawaniu DC preinkubowanych z antygenem, gdzie zestaw antygenów podawanych do DC równie¿ powinien byæ jak najszerszy, aby utrudniæ ucieczkê nowotworu.

Wiêksza skutecznoœæ wykorzystania DC w terapii chorych na czerniaka bê- dzie warunkowana przez zwiêkszenie iloœci antygenów czerniaka stosowa- nych do immunizacji, ulepszenie me- tod wyodrêbniania i hodowli DC, stra- tegii i sposobu podawania DC eksponowanych na antygeny, a tak¿e przez stosowanie szczepionki u chorych w ni¿szym stopniu zaawansowania.

PIŒMIENNICTWO

1. Schadendorf D, Paschen A, Sun Y.

Autologous, allogeneic tumor cells or genetically engineered cells as cancer vaccine against melanoma. Immunology Letters 2000; 74: 67-74.

2. Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 1998; 392: 245-52.

Wykorzystanie komórek dendrytycznych w leczeniu czerniaka

633

(5)

3. Rosenberg SA. A new era for cancer immunotherapy based on the genes that encode cancer antigens. Immunity 1999;

10: 281-7.

4. Mehta-Damani A, Markowicz S, Engleman EG. Generation of antigen-specific CD8⁺ CTLs from naive precursors. J Immunol 1994; 153: 996-1003.

5. Hsu FJ, Benike C, Fagnoni F, Liles TM, Czerwinski D, Taidi B, Engleman EG, Levy R. Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous

antigen-pulsed dendritic cells. Nature Med 1996; 2: 52-8.

6. Bakker ABH, Marland G, de Boer AJ, Huijbens RJF, Danen EHJ, Adema GJ, Figdor CG. Generation of antimelanoma cytotoxic T lymphocytes from healthy donors after presentation of

melanoma-associated antigen-derived epitopes by dendritic cells in vitro. Cancer Res 1995; 55: 5330-4.

7. Osugi Y, Vuckovic S, Hart DNJ. Myeloid blood CD11c⁺dendritic cells and monocytedendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes. Blood 2002;

100: 2858-66.

8. Nestle FO, Alijagic S, Gilliet M, Sun Y, Grabbe S, Dummer R, Burg G, Schadendorf D. Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor

lysate-pulsed dendritic cells. Nature Med 1998; 4: 328-32.

9. Chakraborty NG, Sporn JR, Tortora AF, Kurtzman SH, Yamase H, Ergin MT, Mukherji B. Immunization with a tumor-cell-lysate-loaded autologous- antigen-presenting-cell-based vaccine in melanoma. Cancer Immunol Immunother 1998; 47: 58-64.

10. Thurner B, Haendle I, Roder C, et al.

Vaccination with Mage-3A1 peptide-pulsed mature, monocyte-derived dendritic cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma. J Exp Med 1999; 190: 1669-78.

11. Toungouz M, Libin M, Bulte F, et al.

Transient expansion of peptide-specific lymphocytes producing IFN-γ after vaccination with dendritic cells pulsed with MAGE peptides in patients with mage- A1/A3-positive tumors. J Leukoc Biol 2001; 69: 937-43.

12. Panelli MC, Wunderlich J, Jeffries J, Wang E, Mixon A, Rosenberg SA, Marincola FM.

Phase 1 study in patients with metastatic melanoma of immunization with dendritic cells presenting epitopes derived from the melanoma-associated antigens MART-1 and gp100. J Immunother 2000; 23: 487-98.

13. Mackensen A, Herbst B, Chen J-L, et al. Phase I study in melanoma patients of a vaccine with peptide-pulsed dendritic cells generated in vitro from CD34⁺ hematopoietic progenitor cells. Int J Canc 2000; 86: 385-92.

14. Banchereau J, Palucka AK, Dhodapkar M, et al. Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34⁺progenitor-derived dendritic cell vaccine. Cancer Res 2001; 61: 6451-8.

15. Jonuleit H, Giesecke-Tuettenberg A, Tuting T, et al. A comparison of two types of dendritic cell as adjuvants for the induction of melanoma-specific T-cell responses in humans following intranodal injection. Int J Canc 2001; 93: 243-51.

16. Andersen MH, Keikavoussi P, Brocker E-B, et al. Induction of systemic CTL responses in melanoma patients by dendritic cell vaccination: cessation of CTL responses is associated with disease progression. Int J Canc 2001; 94: 820-4.

17. Krause SW, Neumann C, Soruri A, Mayer S, Peters JH, Andreesen R. The treatment of patients with disseminated malignant melanoma by vaccination with autologous cell hybrids of tumor cells and dendritic cells. J Immunother 2002; 25: 421-8.

18. Trefzer U, Weingart G, Chen Y, et al.

Hybrid cell vaccination for cancer immune therapy: first clinical trial with metastatic melanoma. Int J Canc 2000; 85: 618-26.

19. Soruri A, Fayyazi A, Neumann C, et al.

Ex vivo generation of human

anti-melanoma autologous cytolitic T cells by dendritic cell/melanoma cell

hybridomas. Cancer Immunol Immunother 2001; 50: 307-14.

20. Jantscheff P, Spagnoli G, Zajac P, Rochlitz CF. Cell fusion: an approach to generating constitutively proliferating human tumor antigen-presenting cells. Cancer Immunol Immunother 2002; 51: 367-75.

21. Mortarini R, Anichini A, Di Nicola M, et al.

Autologous dendritic cells derived from CD34⁺progenitors and from monocytes are not functionally equivalent

antigen-presenting cells in the induction of MelanA/Mart-127–35-specific CTLs from peripheral blood lymphocytes of melanoma patients with low frequency of CTL precursors. Cancer Res 1997;

57: 5534-41.

22. Maraskovsky E, Daro E, Roux E, et al.

In vivo generation of human dendritic cell subsets by Flt3 ligand. Blood 2000; 96:

878-84.

23. Mackensen A, Krause T, Blum U, Uhrmeister P, Mertelsmann R, Lindemann A. Homing of intravenously and

intralymphatically injected human dendritic cells generated in vitro from CD34⁺ hematopoietic progenitor cells. Cancer Immunol Immunother 1999; 48: 118-22.

24. de Vries IJM, Krooshoop DJEB, Scharenborg NM, et al. Effective migration of antigen-pulsed dendritic cells to lymph nodes in melanoma patients is determined by their maturation state.

Cancer Res 2003; 63; 12-17.

25. Berard F, Blanco P, Davoust J, et al.

Cross-priming of naive CD8 T cells against melanoma antigens using dendritic cells

loaded with killed allogeneic melanoma cells. J Exp Med 2000; 192: 1535-43.

26. Jenne L, Arrighi J-F, Jonuleit H, Saurat J-H, Hauser C. Dendritic cells containing apoptotic melanoma cells prime human CD8⁺T cells for efficient tumor cell lysis.

Cancer Res 2000; 60: 4446-52.

27. Russo V, Tanzarella S, Dalerba P, Rigatti D, Rovere P, Villa A, Bordignon C, Traversari C. Dendritic cells acquire the MAGE-3 human tumor antigen from apoptotic cells and induce a class I-restricted T cell response. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 2185-90.

28. Perez-Diez A, Butterfield LH, Li L, Chakraborty NG, Economou JS, Mukherji B. Generation of CD8⁺and CD4⁺T-cell response to dendritic cells genetically engineered to express the MART-1/Melan- -A gene. Cancer Res 1998; 58: 5305-9.

29. Berthier-Vergnes O, Gaucherand M, Peguet-Navarro J, Plouet J, Pageaux J-F, Schmitt D, Staquet M-J. Human melanoma cells inhibit the earliest differentiation steps of human Langerhans cell precursors but failed to affect the functional maturation of epidermal Langerhans cells. Br J Canc 2001; 85; 1944-51.

30. Enk AH, Jonuleit H, Saloga J, Knop J.

Dendritic cells as mediators of tumor- -induced tolerance in metastatic

melanoma. Int J Canc 1997; 73: 309-16.

31. Tsai V, Southwood S, Sidney J, Sakaguchi K, Kawakami Y, Appella E, Sette A, Celis E. Identification of subdominant CTL epitopes of the gp100 melanoma-associated tumor antigen by primary in vitro

immunization with peptide-pulsed dendritic cells. J Immunol 1997; 158: 1796-802.

32. Kawashima I, Tsai V, Southwood S, Takesako K, Celis E, Sette A.

Identification of gp100-derived, melanoma specific cytotoxic T-lymphocyte epitopes restricted by HLA-A3 supertype molecules by primary in vitro immunization with peptide-pulsed dendritic cells. Int J Cancer 1998; 78: 518-24.

33. Yee C, Thompson JA, Byrd D, Riddell SR, Roche P, Celis E, Greenberg PD. Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8⁺ T cell clones for the treatrment of patients with metastatic melanoma: in vivo

persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 16168-173.

ADRES DO KORESPONDENCJI dr n. przyr. SSeerrggiiuusszz MMaarrkkoowwiicczz Zak³ad Immunologii

Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Sk³odowskiej-Curie ul. Roentgena 5

02-781 Warszawa

tel. 0 (prefiks) 22 546 26 60 e-mail: sergiusz@coi.waw.pl

634

Wspó³czesna Onkologia